Introduction
Infectieziekten veroorzaakt door species van de intracellulaire bacterie Chlamydia wekken grote belasting voor wereldwijde gezondheid, waaronder seksueel overgebrachte ziekte, eileiderontsteking, blindheid, longontsteking en eventueel atherosclerose 1-4. Het vermogen van Chlamydia om met de gastheercel, vanuit een vacuole (genaamd de opname), is een bepalende factor voor hun succesvolle infectie van cellen en de gastheer. De opname is een nieuwe pathogene compartiment dat chlamydia groei mogelijk maakt en wordt dynamisch aangepast gedurende de hele 2-3 dag ontwikkelings cyclus van Chlamydia 5. De obligate intracellulaire aard van chlamydiae presenteert talrijke uitdagingen voor de onderzoeksgemeenschap, in het bijzonder voor het direct bestuderen van de unieke biologie van de integratie. Een grote handicap is het onvermogen om efficiënt te visualiseren ofwel intracellulaire Chlamydia of hun opname door TL-aanpakes in levende cellen. Een recente ontdekking heeft eindelijk onthuld de middelen om GFP tot expressie C. genereren trachomatis 6; echter, is deze bevinding nog niet geleid tot de specifieke kenmerken van de integratie. Sommige technieken zijn beschreven voor labeling van bacteriën en insluitsels 7,8, maar ze vertonen tekortkomingen zoals niet-specificiteit, vergankelijkheid en gevoeligheid voor fotobleken. Een belangrijke ontdekking door onze groep werd een nieuwe strategie voor het verlichten van de opname met behulp van GFP tot expressie gastheercellen 9. Deze strategie rationeel exploiteert de intrinsieke ondoordringbaarheid van de opname membraan moleculen groter dan 520 Da 10. Wanneer cellen worden gemanipuleerd om stabiel drukken een bepaald cytosolische fluorescent eiwit (bijvoorbeeld GFP of mCherry), Chlamydia insluitsels zichtbaar met opmerkelijk heldere hun volledige uitsluiting van fluorescentie. Deze omgekeerde beeldvorming strategie maakt directe visualisatie van insluitsels voor alle Chlamydia species en kan gemakkelijk worden aangepast voor de meeste gastheercellen van belang. Als een demonstratie van het nut ervan, werd deze methode eerder gebruikt te onthullen en te definiëren de cellulaire exit routes voor Chlamydia spp 9.
Hier hebben we verder aan te tonen hoe deze methode wordt uitgevoerd, en kan worden benut om belangrijke kwantitatieve gegevens over de groei inclusie dynamiek ontlenen. Bovendien kan het effectief vervangen dure antilichamen gebaseerde inventarisatie werkwijzen en kan worden gebruikt in combinatie met andere fluorescente labels, zoals mKate2-expressie Chlamydia 11. Deze krachtige combinatie van instrumenten mogelijk maakt onderzoek van de fysische eigenschappen van de chlamydiale membraan integratie binnen levende gastheercellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generatie van Fluorescent gastheercellijnen
- Dag 1. Plaat 293T cellen (of andere retrovirale verpakkingslijn) op 6-putjes platen bij 2 x 10 6 cellen / putje, worden ~ 75% confluent de volgende dag. Desgewenst plaat duplo putjes voor elk retrovirus te gebruiken.
- Dag 2. Zuig cellen en voeg 2 ml vers groeimedium (DMEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamine). Transfecteren van cellen met 5-8 ug per retrovirale vector (bevattende GFP) en verpakkingsvector (bv., PVSVg) met gebruik van Lipofectamine 2000 of soortgelijke reagentia en de instructies van de fabrikant.
- Incubeer de cellen met DNA voor 4-6 uur in een 37 ° C CO2 incubator, en vervolgens vervangen door medium met 1 ml groeimedium.
- Incubeer cellen gedurende 48 uur bij 37 ° C CO 2 incubator.
- Dag 3. Plaat doelcellen (bv., HeLa) op 6-putjes platen bij een geschatte dichtheid van 10 5 cellen / putje, worden ~ 50% confluent dede volgende dag. Controleer positieve transfectie in 293T-cellen door het volgen GFP fluorescentie op een omgekeerde microscoop.
- Dag 4. Collect retrovirus-bevattende supernatanten uit 293T cellen met behulp van een pipet en filtreer de bovenstaande vloeistof door een 0,45 urn spuitfilter celluloseacetaat.
- Verwijder medium uit HeLa-cellen en voeg 0,5 ml kweekmedium dat 16 ug / ml polybreen. Voeg ~ 0,5 ml gefiltreerd retrovirus cellen druppelsgewijs en incubeer cellen in een 37 ° C CO2 incubator gedurende 24 uur. Slaan alle resterende retrovirus (dwz van zowel het dupliceren) bij 4 ° C.
- Dag 5. Indien duploputjes werden gemaakt om extra retrovirus Herhaal stap 1,7 genereren om serieel te infecteren met de rest van retrovirale deeltjes.
- Dag 6. Passage getransfecteerde HeLa-cellen 1: 1 in een 10 cm schotel met selectie antibioticum (bijvoorbeeld 500 ug / ml neomycine).
- Wacht voldoende tijd getransduceerde cellen om terug te groeien in aanwezigheid van selectie antibiotic, waarna de cellen kunnen worden vermeerderd door standaardtechnieken met een lagere concentratie selectie antibioticum (bv., 200 ug / ml neomycine).
Opmerking: Cellen kunnen ook klonaal worden gekozen voor een optimale helderheid op dit moment, indien nodig.
2. Genereren van GFP tot expressie Chlamydia trachomatis
- Bereid 2x CaCl2 buffer (20 mM Tris pH 7,4, 100 mM CaCl 2) en 4SP buffer (0,4 M sucrose, 16 mM Na 2 HPO 4).
- Dag 1. Ontdooi bevroren C. trachomatis voorraad op ijs en onmiddellijk verdunnen 10 pi bacteriën in 50 ul 2x CaCl2 buffer. Voeg 3 ug plasmide DNA (bv., PASK-GFP-mKate2-L2), mengen en incuberen gedurende 30 min bij 25 ° C.
- Tijdens deze stap te bereiden gastheercellen door trypsinizing een T-75 kolf van McCoy-cellen in een centrifugebuis. Centrifugeer de celsuspensie bij 50 x g gedurende 5 minuten en de bovenstaande vloeistof. Resuspend celpellet in zodanige hoeveelheid van 1 x CaCl2 buffer tot een eindconcentratie van 4 x 10 7 cellen / ml.
- Na 30 min incubatie (uit stap 2.2), voeg 100 ul bereid McCoy cellen transformatiemengsel buis (totaal volume 200 ui) en incubeer nog eens 20 min bij 25 ° C. Voeg 100 ul van deze getransformeerde cel mengsel tot een enkel putje van een 6-wells plaat en overlay met 2 ml groeimedium. Incubeer bij 37 ° C in een CO2 incubator gedurende 2 dagen.
- Dag 3. Lyse McCoy cellen geïnfecteerd met C. trachomatis door medium vervangen door 1 ml dH 2 O en schrapen cellen met een gebogen 1000 ui pipet tip. Voeg 1 ml 4SP buffer en passeren suspensie door een 27,5 G naald ~ 5 keer voor een efficiënte cellysis en afgifte van C. trachomatis.
- Overdracht 2 ml van het cellysaat bevattende C. trachomatis een T-75 kolf die een confluente monolaag van vers uitgeplaat McCoy cellen; voeg 8 ml DMEM (zonder FBS) en incubeer gedurende 2 uur bij 25 ° C C. toestaan trachomatis te houden aan cellen.
- Aspireren cellen en voeg vers medium growth gesupplementeerd met 10 U / ml penicilline G en 1 ug / ml cycloheximide. Incubeer kolf gedurende 48 uur in een 37 ° C CO 2 incubator.
- Dag 4. Controleer met lichtmicroscopie dat cellen worden besmet en insluitsels bevatten afwijkende Chlamydia. Identificeren insluitsels zo helder vacuoles op een standaard lichtmicroscoop, en afwijkende Chlamydia organen ring-achtige objecten binnen insluitsels die groter zijn dan 2 micrometer doorsnede.
- Dag 5. Lyse cultuur door het medium vervangen met 2 ml dH 2 O en schraap cellen in een suspensie. Voeg 2 ml 4SP buffer en passeren suspensie door een 27,5 G naald ~ 5 keer.
- Gebruik 2 ml cellysaat een nieuwe monolaag van McCoy-cellen te infecteren in een enkel putje in een 6-wells plaat. Incubeer cellen met lysaat gedurende 2 uur bij 25 ° C, aspireren en voeg verse groeimedium met penicilline G en cycloheximide.
- Incubeer cellen in een 37 ° C CO2 incubator gedurende 3-5 dagen, afhankelijk van de algemene gezondheid van de cellen.
- Herhaal stap 2,9-2,10 één of meer keren, indien nodig, passage culturen in verse putjes in een 6-wells plaat tot normaal uitziende insluitsels (zonder afwijkende instellingen) ontstaan. Op dit moment gebruik maken van een omgekeerde fluorescentie microscoop om te controleren of C. trachomatis uiten mKate2 (rood).
- Opschalen geïnfecteerde kweken voor het genereren van hoge titer Chlamydia voorraden, bijvoorbeeld door het oogsten Chlamydia transformanten van geïnfecteerde McCoy of HeLa-cellen gekweekt in T-150 kolven.
3. Infecteren Cellen met Chlamydia
- Plate GFP-HeLa cellen op gewenste kweekvat, bijvoorbeeld glazen bodem gerechten of kamer objectglaasjes voor hoge resolutie beeldvorming of 24-well platen voor IFU bepalen en multiwell screening.
- Dooi weerzen buis met C. trachomatis, C. muridarum of C. pneumoniae op ijs en verdund in HBSS gewenste multipliciteit van infectie (MOI), bijvoorbeeld MOI = 1.
- Voer statisch of centrifugeren aided infecties op basis van de specifieke Chlamydia stam die wordt gebruikt.
- Voor infecties met C. trachomatis LGV serovar L2 of C. muridarum, was GFP-HeLa-cellen met HBSS en geïncubeerd met verdunde bacteriën gedurende 2 uur bij 25 ° C. Aspireren en wassen cellen met HBSS, en incubeer cellen in groeimedium bij 37 ° C CO 2 incubator.
- Voor infecties met C. trachomatis serovar D of C. pneumoniae, was GFP-HeLa-cellen met HBSS en voeg verdunde bacteriën aan cellen. Plaats multiwell plaat of een glazen bodem schaal (vastgezet met tape in een multiwell plaat deksel) in een multiwell plaat houder van een swingende emmer rotor bijlage in een benchtop centrifuge.
- Centrifugeer cellen bij 900 xg bij 25 ° C gedurende 1 uur. Kweekvaten verwijderen uit centrifuge en plaats in een 37 ° C CO 2 incubator gedurende 1 uur.
- Aspiraat cellen in een bioveiligheid kast, wassen cellen tweemaal met HBSS en voeg vers groeimedium. Plaats cellen in een 37 ° C CO 2 incubator.
4. Levende Cell Visualisatie van Chlamydia Inbegrepen
- Verwijder Chlamydia besmet GFP-HeLa-cellen van CO 2 incubator en vervangen door medium met RPMI zonder fenolrood + 5% FBS.
- Mount cellen op een omgekeerde fluorescentie microscoop (Nikon Eclipse Ti-E of vergelijkbaar) met behulp van een 20X of hoger olie doelstelling.
- Met behulp van imaging software (Volocity 6 of iets dergelijks), gericht op het identificeren en Chlamydia besmet GFP-HeLa-cellen: groene cellen met grote zwarte gaten (Chlamydia inclusies).
- Markeer de xyz locaties van gebieden met Chlamydia geïnfecteerde cellen van belang het gebruik van imaging software (Volocity 6 of iets dergelijks). Uitvoeren van deze door het handmatig 'toevoegen Points', terwijl in de XY Stage weergavemodus. Op deze wijze worden XYZ coördinaten opgeslagen voor elke gemarkeerde positie.
- In het dialoogvenster Overname doos, software configureren naar groen (GFP, HeLa cytosol) en rode (mKate2, C. trachomatis) kanalen, en met een snelheid van nieuwe frames per kanaal om de 5 min te verwerven.
- Verwerven van de beeldsequentie met de overname protocol hierboven opgegeven door te klikken op de "Capture Record /" knop.
5. kwantificering van Inclusie Groei Parameters in levende cellen
- Op gewenste tijden na de infectie (bv., 24, 48 HPI) verwijder Chlamydia GFP geïnfecteerde HeLa-cellen uit incubator en monteren op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. Opmerking: een objectief met een hoge NA 20x of 40x air is het best geschikt voor 24-wells platen en een 40x olie doelstelling wordt aanbevolen voor Kamer slides. Kweek cellen aan beide substraat voor deze ezelay.
- Focus op midplanes van de cellen, waar de insluitsels zijn op hun maximale diameter en op scherpe randen.
- Acquire afbeeldingen voor vele gebieden in elk putje (minimaal 10 per well); putten vertegenwoordigen doorgaans herhalingen of experimentele variabelen.
- Inventariseer het aantal insluitingen handmatig, door het oog (insluitsels zijn zwart compartimenten in GFP-HeLa-cellen) of gebruik maken van imaging software algoritmen om insluitsels automatisch te identificeren en te tellen.
- Vind GFP-HeLa-cellen door fluorescentie-intensiteit ('vind Objects' commando) en stel fluorescentie drempel intensiteit op basis van relatieve intensiteiten van de cellen.
- Filter geselecteerde objecten met behulp van grootte richtlijnen van het houden van die slechts groter is dan 5 micrometer 2. Dit is 'populatie 1'.
- Solliciteer 'Vul Gaten in Objects' opdracht met 'bevolking 1' als de input. Deze stap genereert 'populatie 2'.
- Aftrekken 'bevolking 1' van 'population 2 'om de opbrengst positief gemarkeerd Chlamydia inclusies, aangeduid als' de bevolking 3 '.
- Toepassen size filter van "populatie 3" ("Filter Population" command) bijvoorbeeld houden voorwerpen groter dan 25 urn 2 van insluitingen in geïnfecteerde cellen gedurende 24 uur of langer. Voor de vroege infectie maal, bijvoorbeeld vóór 18 uur, stellen grootte filter om objecten groter dan 4 urn 2 te houden, omdat deze inclusies veel kleiner. Grootte filtering resulteert in een populatie van objecten als 'inclusies'.
- Bereken kwantitatieve gegevens uit afbeeldingen, bijvoorbeeld nummer opnemen, grootte integratie en inclusie omtrek, met behulp van beeldbewerkingssoftware.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zoogdiercellen tot expressie cytosolische fluorescerende eiwitten (bijvoorbeeld GFP) kan worden gemanipuleerd om verlichting van Chlamydia inclusies mogelijk in levende, geïnfecteerde celkweken. Na infectie met Chlamydia, insluitsels gemakkelijk zichtbaar als zwarte vlekken in de gastheercellen (figuur 1). De helderheid van fluorescentie ontbrekende insluitsels kan worden benut voor het automatisch identificeren van insluitsels op talloze gezichtsvelden en / of behandelingen (figuur 1). Zodra fluorescente gastheercellen zijn gegenereerd, is een krachtige werkstroom ingeschakeld voor snelle, kwantitatieve analyse van chlamydia niveaus in experimentele monsters. Een belangrijke toepassing is de bepaling van Chlamydia insluiting eenheden (IFU) in levende, geïnfecteerde cellen (Figuur 2). Deze experimentele strategie vermijdt de behoefte aan immunofluorescentie procedures die routinematig worden gebruikt in het veld, die zowel tijdrovend enkostbaar.
Een ander belangrijk kenmerk van de beschreven imaging aanpak is dat het gemakkelijk kan worden toegepast op elk Chlamydia species of stam, en bovendien kan worden benut voor het afleiden van belangrijke biologische kenmerken van Chlamydia inclusies. Als voorbeeld, een tijdverloop analyse van GFP-HeLa-cellen geïnfecteerd met C. trachomatis LGV serovar L2, C. trachomatis serovar D, C. muridarum en C. pneumoniae werd uitgevoerd bij 16, 24 en 48 hpi (figuur 3). Voor elk van deze Chlamydia species en stammen werden insluitsels gemerkt en geanalyseerd om de gemiddelde oppervlakte te berekenen, omtreklengte en het aantal per cel soms aangeduid (figuur 4). Deze attributen geven belangrijke informatie over de biologie van chlamydia insluitingen en informeren hoe ze omgaan met de gastheercel. De beschreven werkwijze verschaft een gemakkelijke benadering voor de toegang tot deze informatie op een manier die su rpasses wat kan worden bewerkstelligd door andere experimentele technieken. Een uiteindelijke nut van de omgekeerde labeling strategie voor real-time imaging van Chlamydia inclusies in levende cellen. Een voorbeeld hiervan wordt getoond in Film 1.
Figuur 1. Automatische detectie van C. trachomatis insluitsels. (A) GFP-HeLa-cellen werden geïnfecteerd met (B) mKate2 tot expressie C. trachomatis L2 en live afgebeeld op 24 hpi. Een imaging software gebaseerde algoritme werd gebruikt om chlamydia insluitsels automatisch te identificeren door (C) het selecteren van zwarte gaten in het GFP-HeLa-cellen, gemarkeerd in oranje. (D) een samengesteld beeld van geïnfecteerde cellen uit panelen A en B wordt ook getoond. Schaal bar = 20 pm. .jove.com / files / ftp_upload / 51.131 / 51131fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Kwantificering van Chlamydia insluiting eenheden (IFU) in GFP-HeLa-cellen. GFP-HeLa-cellen werden geïnfecteerd met C. trachomatis L2 op twee verschillende veelvouden van infectie en afgebeeld op 24 hpi. Insluitsels voor 10 velden per infectie werden gedetecteerd en geteld met behulp van geautomatiseerde software en resultaten worden gegeven (n = 3). Fout balken geven de standaard fout van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
OAD / 51.131 / 51131fig3.jpg "/>
Figuur 3. Tijd loop van C. trachomatis serovar L2, C. trachomatis serovar D, C. muridarum en C. pneumoniae infectie bij GFP-HeLa-cellen. werden GFP-HeLa-cellen geïnfecteerd met C. trachomatis LGV serovar L2 en afgebeeld levend fluorescentiemicroscopie op (A) 16 HPI, (B) 24 HPI, en (C) 48 HPI. GFP-HeLa-cellen geïnfecteerd met C. trachomatis serovar D werden belicht bij (D) 16 HPI, (E) 24 HPI, en (F) 48 HPI. GFP-HeLa-cellen geïnfecteerd met C. muridarum werden afgebeeld bij (G) 16 HPI, (H) 24 HPI, en (I) 48 HPI. GFP-HeLa-cellen geïnfecteerd met C. pneumoniaewerd afgebeeld bij (J) 16 HPI, (K) 24 HPI, en (L) 48 HPI. Representatieve beelden worden getoond van alle infecties en tijden. Schaal bars = 20 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Vertegenwoordiger van kwantitatieve gegevens afkomstig van tijdsverloop experimenten. Insluitsels van GFP-HeLa-cellen geïnfecteerd met (A) C. trachomatis LGV serovar L2, (B) C. trachomatis serovar D, (C) K. muridarum en (D) K. pneumoniae werden gedetecteerd en geteld op 16, 24 en 48 hpi (5 velden per tijdsinterval, n = 3). Fysieke kenmerken van chlamydial insluitsels werden gekwantificeerd voor opname oppervlak opneming omtreklengte en het aantal insluitingen per cel. Fout balken geven de SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Klik hier om deze video te bekijken. Film 1. Time lapse video van mCherry-HeLa-cellen geïnfecteerd met GFP C. trachomatis L2, genomen op 48 hpi. Video is samengesteld uit een reeks van time-lapse beelden genomen op 5 min intervallen gedurende 125 min. Lus video plaatsvervangers over mCherry-HeLa-cellen (rood), C. trachomatis L2 (groen) en een fusie van beide velden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we de experimentele strategie voor het genereren van fluorescente gastheercellen voor real time visualisatie en analyse van Chlamydia inclusies. Deze vacuole visualisatie benadering verleent het krachtige vermogen te verlichten, volgen en kwantitatief meten van de dynamische eigenschappen van Chlamydia inclusies tussen populaties van cellen of enkele cellen in de tijd. Chlamydia inclusies in fluorescent eiwit gelabelde cellen opvallend goed gedefinieerd, zodat ze gemakkelijk geïdentificeerd zonder de noodzaak van aanvullende verwerking immunofluorescentie. Bovendien is deze benadering gevoelig genoeg om handtekening morfologische verschillen verschillende Chlamydia species en stammen bezitten, zoals getallen van vacuolen per cel en integratie kromming lossen. Daarnaast hebben we zien hoe beeldverwerkingssoftware kunnen worden aangepast inclusies in GFP tot expressie gastheercellen automatisch te identificeren. De obviation van immunofluorescentie etikettering stappen voor illumination van Chlamydia inclusies resulteert in aanzienlijke tijd- en kostenbesparingen voor de gebruiker voor het eindpunt assays, zoals de bepaling van de opname eenheden (IFU). Bovendien is de mogelijkheid om beelden inclusies in levende cellen mogelijk maakt dezelfde populatie van geïnfecteerde cellen worden geanalyseerd exacte momenten via chlamydia ontwikkelingscyclus, waardoor het aantal putjes of platen nodig tijdsverloop studies verminderen. Cytosolische GFP, mCherry, enz., Op een heldere, stabiele signaal dat geen last heeft van fotobleken; Deze functie is van cruciaal belang voor de lange time-lapse imaging experimenten. Tenslotte, omdat de techniek onafhankelijk van Chlamydia ontwikkeling genexpressie, is even effectief in alle stadia van cellulaire infectie door Chlamydia.
Vergeleken met bestaande strategieën voor labeling intracellulaire Chlamydia en membranen 7,8 Deze techniek biedt eenvoud en flexibiliteit voor een experimentelepplications. Fluorescerende gastheercellen geïnfecteerd met Chlamydia kan onmiddellijk worden afgebeeld, zonder dat kleurstof laden etikettering of andere cellulaire manipulaties. Deze benadering duidelijk verlicht en worden de randen van de opname terwijl de luminale ruimte van de opname (de bacteriën) unlabeled. Ten behoeve van het verlichten en opsommen van Chlamydia geïnfecteerde cellen, het voordeel van deze aanpak ligt vooral in de verenigbaarheid met levende culturen en daarom aanzienlijke tijdsbesparing biedt. Echter, voor de etikettering en de afleiding van kwantitatieve parameters van de Chlamydia met vacuole zelf, commerciële antilichamen voor dit compartiment zijn niet op grote schaal beschikbaar. Bijgevolg is de omgekeerde GFP aanpak blijft de meest gemakkelijke en directe middelen voor het afbakenen van het membraan van deze ziekteverwekker compartiment.
Er zijn belangrijke overwegingen voor de toepassing van deze beeldvorming methode om een Chlamydia visualization workflow. Het is belangrijk dat gastheer cellijnen met stabiele expressie van GFP, mCherry, etc, worden vooraf gegenereerd. Hoewel chlamydia insluitsels gemakkelijk gedetecteerd in gastheercellen die kortstondig zijn getransfecteerd met fluorescerende eiwitten, cellen die op deze wijze lijdt onvolledige transfectie hele bevolking als variabele expressieniveaus. Bovendien transfectie voegt onnodige stappen om de algemene procedure. Een andere beperking van de beschreven werkwijze is dat insluitsels afgeleid van verschillende Chlamydia spp. kan opvallend verschillend in hun morfologische uiterlijk en de wijze waarop zij samenwerken met de gastheercel. Deze beeldvorming aanpak is zeer robuust voor het opsporen en imaging insluitsels bevatten C. trachomatis, C. muridarum of C. pneumoniae; echter enkele Chlamydia species (met name C. psittaci en C. caviae) insluitsels zijn minder kan uitsluiten GFP uit hun luminale ruimte. Insluitsels met C. psittaci of C. caviae zijn direct zichtbaar in GFP-HeLa-cellen, maar het binnendringen van een aantal GFP in deze insluitsels verhoogt de foutenmarge van software gebaseerde detectie van insluitingen.
Zodra de algemene experimentele strategie goed is ingevoerd, worden nieuwe mogelijkheden gecreëerd voor de kwantitatieve analyse van Chlamydia inclusies in levende cellen. We zien hoe deze techniek zorgt voor een gestroomlijnde workflow voor opname opsomming - hetzij op een geautomatiseerde wijze met beeldverwerkingssoftware of handmatig scoren. Een nieuwe toepassing van deze benadering voor het afleiden van zinvolle kwantitatieve gegevens over de opname, bijvoorbeeld specifieke integratie, volume en vorm. Tenslotte, deze visualisatie methode is zeer flexibel en kan worden gebruikt in combinatie met andere fluorescente markers om meer inzicht te onthullen in de biologie van Chlamydia geïnfecteerde gastheercellen, bijvoorbeeldGFP of mKate2 expressie Chlamydia 6,11, fluorescerende actine 12 of GFP getagd Inc eiwitten 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene | Sigma | H9268 | |
| 0.45 µm filters | Fisher | 09-719D | |
| G418 | Invitrogen | 10131 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | |
| RPMI 1640 w/o phenol red | Cellgro | 17-105-CV | |
| Penicillin G | Sigma | 13752 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Chamber slides, Lab-Tek II | Nunc | 154526, 154534 |
References
- Stamm, W. E. Chlamydia trachomatis infections: progress and problems. The Journal of Infectious Diseases. 179, Suppl 2. S380-S383 (1999).
- Schachter, J. Infection and disease epidemiology. Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. Stephens, R. S. , ASM Press. 139-169 (1999).
- Campbell, L. A., Kuo, C. C. Chlamydia pneumoniae--an infectious risk factor for atherosclerosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (1), 23-32 (2004).
- Darville, T., Hiltke, T. J. Pathogenesis of genital tract disease due to Chlamydia trachomatis. The Journal of Infectious Diseases. 201, Suppl 2. S114-S125 (2010).
- Hackstadt, T. Cell biology. Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. Stephens, R. S. , ASM Press. 101-138 (1999).
- Wang, Y., Kahane, S., Cutcliffe, L. T., Skilton, R. J., Lambden, P. R., Clarke, I. N. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector). PLoS Pathogens. 7 (9), e1002258 (2011).
- Hackstadt, T., Scidmore, M. A., Rockey, D. D. Lipid metabolism in Chlamydia trachomatis-infected cells: directed trafficking of Golgi-derived sphingolipids to the chlamydial inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
- Boleti, H., Ojcius, D. M., Dautry-Varsat, A. Fluorescent labelling of intracellular bacteria in living host cells. Journal of Microbiological Methods. 40 (3), 265-274 (2000).
- Hybiske, K., Stephens, R. S. Mechanisms of host cell exit by the intracellular bacterium Chlamydia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11430-11435 (2007).
- Heinzen, R. A., Hackstadt, T. The Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuolar membrane is not passively permeable to low-molecular-weight compounds. Infection and Immunity. 65 (3), 1088-1094 (1997).
- Wickstrum, J., Sammons, L. R., Restivo, K. N., Hefty, P. S. Conditional gene expression in Chlamydia trachomatis using the tet system. PLoS One. 8 (10), 10-1371 (2013).
- Chin, E., Kirker, K., Zuck, M., James, G., Hybiske, K. Actin recruitment to the Chlamydia inclusion is spatiotemporally regulated by a mechanism that requires host and bacterial factors. PLoS One. 7 (10), e46949 (2012).
- Agaisse, H., Derré, I. A C. trachomatis cloning vector and the generation of C. trachomatis strains expressing fluorescent proteins under the control of a C. trachomatis promoter. PLoS One. 8 (2), e57090 (2013).
