Introduction
Smitsomme sygdomme forårsaget af arter af den intracellulære bakterie Chlamydia fremkalde en større byrde på global sundhed, herunder seksuelt overført sygdom, underlivsbetændelse, blindhed, lungebetændelse og muligvis åreforkalkning 1-4. Evnen af Chlamydia at interagere med værtscellen, fra et vacuole (betegnet optagelse), er en kritisk determinant for en vellykket infektion af celler og værten. Medtagelsen er et nyt patogen rum, der muliggør chlamydia vækst og er dynamisk modificeret hele 2-3 dages udviklingsmæssige cyklus af Chlamydia 5. Den obligat intracellulære natur chlamydiae præsenterer en lang række udfordringer for forskningsverdenen, navnlig for direkte at studere den unikke biologi integration. En større handicap har været den manglende evne til effektivt at visualisere enten intracellulært Chlamydia eller deres optagelse ved fluorescerende tilganges i levende celler. En nylig opdagelse har endelig afsløret de midler til GFP udtrykke C. trachomatis 6; Men dette resultat har endnu ikke ført til særlig mærkning af optagelsen. Nogle teknikker er blevet beskrevet til mærkning af bakterier og inklusioner 7,8, men de lider af mangler, såsom ikke-specifikke, transiency og tilbøjelighed til fotoblegning. En vigtig opdagelse, som vores gruppe etableret en ny strategi til belysning af optagelsen ved hjælp af GFP udtrykkende værtsceller 9. Denne strategi rationelt udnytter den iboende uigennemtrængelighed for optagelse membran til molekyler større end 520 Da 10. Når celler er konstrueret til stabilt udtrykker et bestemt cytosolisk fluorescerende protein (f.eks GFP eller mCherry), Chlamydia inklusioner er synlige med bemærkelsesværdig klarhed ved deres fuldstændige udelukkelse af fluorescens. Denne omvendte imaging strategi gør det muligt omgående visualisering af inklusioner for alle Chlamydia arter, og det kan let tilpasses til de fleste værtceller af interesse. Som en demonstration af sin nytte, blev denne metode anvendt tidligere til at afsløre og definere de cellulære exit veje for Chlamydia spp 9.
Her har vi demonstrerer endvidere, hvorledes denne metode udføres, og kan udnyttes til at udlede vigtige kvantitative data om vækst integration dynamik. Endvidere kan det effektivt erstatte dyre antistofbaserede tælling metoder og kan anvendes sammen med andre fluorescerende mærker, såsom mKate2-udtrykkende Chlamydia 11. Denne kraftfulde kombination af værktøjer muliggør udforskning af de fysiske egenskaber af chlamydia integration membran inde levende værtsceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene | Sigma | H9268 | |
| 0.45 µm filters | Fisher | 09-719D | |
| G418 | Invitrogen | 10131 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | |
| RPMI 1640 w/o phenol red | Cellgro | 17-105-CV | |
| Penicillin G | Sigma | 13752 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Chamber slides, Lab-Tek II | Nunc | 154526, 154534 |
References
- Stamm, W. E. Chlamydia trachomatis infections: progress and problems. The Journal of Infectious Diseases. 179, Suppl 2. S380-S383 (1999).
- Schachter, J. Infection and disease epidemiology. Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. Stephens, R. S. , ASM Press. 139-169 (1999).
- Campbell, L. A., Kuo, C. C. Chlamydia pneumoniae--an infectious risk factor for atherosclerosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (1), 23-32 (2004).
- Darville, T., Hiltke, T. J. Pathogenesis of genital tract disease due to Chlamydia trachomatis. The Journal of Infectious Diseases. 201, Suppl 2. S114-S125 (2010).
- Hackstadt, T. Cell biology. Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. Stephens, R. S. , ASM Press. 101-138 (1999).
- Wang, Y., Kahane, S., Cutcliffe, L. T., Skilton, R. J., Lambden, P. R., Clarke, I. N. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector). PLoS Pathogens. 7 (9), e1002258 (2011).
- Hackstadt, T., Scidmore, M. A., Rockey, D. D. Lipid metabolism in Chlamydia trachomatis-infected cells: directed trafficking of Golgi-derived sphingolipids to the chlamydial inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
- Boleti, H., Ojcius, D. M., Dautry-Varsat, A. Fluorescent labelling of intracellular bacteria in living host cells. Journal of Microbiological Methods. 40 (3), 265-274 (2000).
- Hybiske, K., Stephens, R. S. Mechanisms of host cell exit by the intracellular bacterium Chlamydia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11430-11435 (2007).
- Heinzen, R. A., Hackstadt, T. The Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuolar membrane is not passively permeable to low-molecular-weight compounds. Infection and Immunity. 65 (3), 1088-1094 (1997).
- Wickstrum, J., Sammons, L. R., Restivo, K. N., Hefty, P. S. Conditional gene expression in Chlamydia trachomatis using the tet system. PLoS One. 8 (10), 10-1371 (2013).
- Chin, E., Kirker, K., Zuck, M., James, G., Hybiske, K. Actin recruitment to the Chlamydia inclusion is spatiotemporally regulated by a mechanism that requires host and bacterial factors. PLoS One. 7 (10), e46949 (2012).
- Agaisse, H., Derré, I. A C. trachomatis cloning vector and the generation of C. trachomatis strains expressing fluorescent proteins under the control of a C. trachomatis promoter. PLoS One. 8 (2), e57090 (2013).
