Introduction
Doenças infecciosas causadas por espécies da bactéria intracelular Chlamydia provocar um grande fardo para a saúde global, incluindo doença sexualmente transmissível, doença inflamatória pélvica, cegueira, pneumonia e possivelmente aterosclerose 1-4. A capacidade de Chlamydia para interagir com a célula hospedeira, a partir de dentro de um vacúolo (denominado a inclusão), constitui um factor determinante para a sua infecção bem sucedida de células e o hospedeiro. A inclusão de um compartimento é patogénico romance que permite o crescimento e clamídia é dinamicamente modificada ao longo de todo o ciclo de desenvolvimento de 2-3 dias de Chlamydia 5. A natureza intracelular obrigatório de clamídias apresenta inúmeros desafios para a comunidade de pesquisa, em especial para estudar diretamente a biologia única da inclusão. A grande desvantagem tem sido a incapacidade de visualizar de forma eficiente, quer intracelular Chlamydia ou a sua inclusão pela abordagem fluorescentees em células vivas. Uma descoberta recente revelou finalmente os meios de produção de GFP expressando C. trachomatis 6; no entanto, esta constatação não conduziu ainda a rotulagem específica da inclusão. Algumas técnicas têm sido descritas para a rotulagem de bactérias e inclusões de 7,8, mas eles sofrem de deficiências, como a não-especificidade, transitoriedade e susceptibilidade à fotodegradação. Uma descoberta chave do nosso grupo estabeleceu uma nova estratégia para iluminar a inclusão usando GFP expressando células hospedeiras 9. Esta estratégia explora a impermeabilidade racionalmente intrínseca da membrana inclusão a moléculas maiores do que 520 Da 10. Quando as células são manipuladas para expressar estavelmente uma proteína fluorescente cytosolic particular (por exemplo, ou GFP mCherry), inclusões de clamídia são visíveis com uma nitidez notável por sua exclusão completa de fluorescência. Esta estratégia de imagem inversa permite a visualização imediata das inclusões para todos Chlespécies amydia e pode ser facilmente adaptado para a maioria das células hospedeiras de interesse. Como uma demonstração da sua utilidade, este método foi utilizado anteriormente para revelar e definir as vias celulares de saída para Chlamydia spp 9.
Aqui, nós ainda demonstrar como esse método é realizado, e pode ser explorado para obter dados quantitativos chave sobre dinâmica de crescimento inclusão. Além disso, pode substituir de forma eficaz para a enumeração métodos baseados em anticorpos dispendiosos e pode ser usado em conjunto com outros marcadores fluorescentes, tais como mKate2-11 expressando Chlamydia. Esta poderosa combinação de ferramentas permite a exploração das propriedades físicas da membrana de clamídia inclusão dentro das células hospedeiras de estar.
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Protocol
1. Geração de linhas celulares hospedeiras fluorescente
- Dia 1. Placa células 293T (ou outra linha de empacotamento retroviral) em placas de 6 poços a 2 x 10 6 células / poço, para ser ~ 75% confluentes no dia seguinte. Se desejado, placa de poços duplicados para cada um retrovírus para ser utilizado.
- Dia 2. células Aspirar e adicionar 2 ml de meio de crescimento fresco (DMEM + 10% de FBS + 2 mM de L-glutamina). Transfectar células com 5-8 ug de cada vector retroviral (contendo GFP) e vector de embalagem (por exemplo., PVSVg) usando Lipofectamine 2000 ou reagente semelhante, e seguindo as instruções do fabricante.
- Incubar as células com ADN de 4-6 h num banho a 37 ° C incubadora de CO 2, e subsequentemente substituir meio com 1 ml de meio de crescimento.
- Incubar as células durante 48 h em 37 ° C incubadora de CO 2.
- Dia 3. Placa células alvo (por exemplo., HeLa) em placas de 6 poços a uma densidade aproximada de 5 a 10 células / poço, para ser ~ 50% confluentes apróximo dia. Verifique transfecção positiva em células 293T por monitorização de fluorescência de GFP em um microscópio invertido.
- Dia 4. Recolher as células sobrenadantes 293T usando uma pipeta e filtrar o sobrenadante através de um filtro de celulose de 0,45 um seringa de etilo contendo retrovírus.
- Remova o meio a partir de células HeLa e adicionar 0,5 ml de meio de crescimento contendo 16 ug / ml de polibreno. Adicionar ~ 0,5 ml de retrovírus filtrado às células gota a gota, e incuba-se as células num banho a 37 ° C incubadora de CO 2 durante 24 horas. Armazenar quaisquer retrovírus restantes (isto é, a partir do duplicar poço) a 4 ° C.
- Dia 5. Se poços duplicados foram feitas para gerar retrovírus extra, repita o passo 1.7 para infectar em série com os restantes partículas retrovirais.
- Dia 6. Passagem transfectadas células HeLa 1: 1 num prato contendo selecção de antibiótico 10 cm (por exemplo, 500 ug / ml de neomicina).
- Aguarde tempo suficiente para que as células transduzidas para voltar a crescer na presença de selecção antibiotlc, após o qual as células podem ser propagadas por técnicas padrão com uma concentração mais baixa de antibiótico de selecção (por exemplo., 200 ug / ml de neomicina).
Nota: As células podem também ser seleccionadas por clonagem de brilho ideal neste momento, se necessário.
2. Geração de-expressando GFP Chlamydia trachomatis
- Prepare 2x tampão de CaCl2 (20 mM de Tris pH 7,4, 100 mM CaCl2) e tampão 4SP (0,4 M de sacarose, 16 mM de Na 2 HPO 4).
- Dia 1. Descongele congelados C. estoque trachomatis no gelo e diluir imediatamente 10 bactérias ul em 50 ul 2x CaCl2 buffer. Adiciona-se 3 ug de ADN de plasmídeo (por exemplo., PASK-GFP-mKate2-L2), misturar bem e incubar durante 30 min a 25 ° C.
- Durante esta etapa, preparar células hospedeiras por trypsinizing um frasco T-75 de células McCoy em um tubo de centrífuga. Centrifugar a suspensão de células a 50 xg durante 5 min e desprezar o sobrenadante. Resuspend sedimento de células num volume apropriado de tampão 1x CaCl 2 para dar uma concentração final de 4 x 10 7 células / ml.
- Após a incubação de 30 minutos (a partir do passo 2.2), adicionar 100 ul de células McCoy preparadas para transformação tubo de mistura (volume total de 200 uL) e incubar 20 min a 25 ° C. Adicionar 100 ul desta mistura de células transformadas para um único poço de uma placa de 6 poços e sobreposição com 2 ml de meio de crescimento. Incubar a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 durante 2 dias.
- Dia 3. lise de células infectadas com C. McCoy trachomatis, substituindo meio com 1 ml de dH2O e raspar as células com uma inclinação de 1.000 ul pipeta de ponta. Adicione 1 ml de tampão 4SP e passar a suspensão através de uma agulha de 27,5 G ~ 5 vezes para a lise celular eficiente e liberação de C. trachomatis.
- Transferir 2 ml do lisado celular contendo C. trachomatis para um frasco T-75 contendo uma monocamada confluente de recém-banhado McCcélulas oy; adicionar 8 mL de DMEM (sem FBS) e incubar durante 2 horas a 25 ° C para permitir C. trachomatis para aderir às células.
- Aspirar as células e adicionar meio de crescimento fresco, suplementado com 10 U / ml de penicilina G e 1 ug / ml de ciclo-heximida. Incubar o balão durante 48 h numa incubadora a 37 ° C, CO 2.
- Dia 4. Verifique por microscopia de luz que as células são infectadas e inclusões contêm Chlamydia aberrante. Identificar inclusões como vacúolos brilhantes em um microscópio de luz padrão e organismos Chlamydia aberrantes como objetos em forma de anel dentro inclusões que são maiores que 2 mm de diâmetro.
- Dia 5. Lise de cultura por meio de substituição com 2 ml de dH2O e raspar as células numa suspensão. Adicionar 2 ml de tampão 4SP e passar a suspensão através de uma agulha de 27,5 G ~ 5 vezes.
- Utilizar 2 ml de lisado celular para infectar uma monocamada fresca de células McCoy em um único poço de uma placa de 6 poços. Incubar as células com lisado durante 2 horas a 25 ° C, aspirado e adicionar crescimento frescomeio contendo penicilina G e ciclo-heximida.
- Incubar as células em uma incubadora a 37 ° C de CO2 durante 3-5 dias, dependendo do estado de saúde geral das células.
- Repita os passos 2.9-2.10 uma ou mais vezes, conforme necessário, culturas Passaging em poços frescas em uma placa de 6 poços até inclusões normais que procuram (desprovidos de corpos aberrantes) têm surgido. Neste momento usar um microscópio de fluorescência invertido para verificar se C. trachomatis expressar mKate2 (vermelho).
- Intensificar as culturas infectadas para geração de stocks por clamídia título elevado, por exemplo colhendo transformantes Chlamydia partir de células de McCoy ou HeLa infectadas cultivadas em frascos T-150.
3. infectar as células com Chlamydia
- Placa células GFP-HeLa no recipiente de cultura desejada, por exemplo pratos com fundo de vidro ou lâminas de câmara para a imagem latente de alta resolução, ou placas de 24 poços para determinação IFU e triagem com vários poços.
- Descongele frozen tubo contendo C. trachomatis, C. muridarum, ou C. pneumoniae em gelo e diluído em HBSS a desejada multiplicidade de infecção (MOI), por exemplo MOI = 1.
- Realizar infecções estáticos ou auxiliado por centrifugação, com base na estirpe de Chlamydia em particular que irá ser utilizado.
- Para as infecções com C. trachomatis serovar L2 LGV ou C. muridarum, lavar as células GFP-HeLa com HBSS e incubar com bactérias diluídas durante 2 horas a 25 ° C. Aspirar e lavar as células com HBSS, e incuba-se as células em meio de crescimento com 37 ° C incubadora de CO 2.
- Para as infecções com C. trachomatis serovar D ou C. pneumoniae, lavar as células GFP-HeLa com HBSS e adicionar bactérias diluídas para as células. Coloque placa com múltiplas cavidades ou prato fundo de vidro (fixo por fita em uma placa da tampa com vários poços) em um suporte de placa com múltiplas cavidades de um anexo de rotor de caçamba móvel em uma centrífuga de bancada.
- Células centrifugar a 900 xg a 25 ° C durante 1 h. Remover os recipientes de cultura a partir de centrifugação e colocar numa incubadora a 37 ° C de CO2 durante 1 hora.
- Aspirar células em uma cabine de segurança biológica, lave as células duas vezes com HBSS, e adicionar meio de crescimento fresco. Células lugar em um C incubadora de CO 2 37 °.
4. Ao vivo Visualization celular de clamídia Inclusões
- Remover Chlamydia infectadas células GFP-HeLa de incubadora de CO 2 e substituir meio com RPMI sem vermelho de fenol + 5% FBS.
- Células montar em um microscópio de fluorescência invertido (Nikon Eclipse Ti-E ou similar) usando uma objectiva 20X ou superior petróleo.
- Usando o software de imagem (Volocity 6 ou similar), o foco em identificar e Chlamydia infectados células GFP-HeLa: verde células que contêm grandes buracos negros (inclusões de clamídia).
- Marque os locais xyz de regiões que contêm células infectados por clamídia de interesse usando software de imagem (Volocity 6 ou semelhante). Realizar isso manualmente "Adicionando Points 'enquanto no modo de exibição XY Stage. Deste modo, as coordenadas XYZ são guardadas para cada local marcado.
- Na caixa de diálogo Configuração de Aquisição, configurar o software para adquirir verde (GFP, HeLa citosol) e vermelho (mKate2, C. trachomatis) canais, e em uma taxa de novos quadros por canal a cada 5 min.
- Adquirir a sequência de imagens utilizando a aquisição protocolo estabelecido acima, clicando no botão "Capture / Record".
5. A quantificação da inclusão parâmetros de crescimento em células vivas
- Às vezes desejadas pós-infecção (ex., 24, 48 hpi) Chlamydia remover células infectadas GFP-HeLa da incubadora e montar em um microscópio de fluorescência invertido. Nota: Um dos objectivos 20X ou 40X ar com uma NA elevada é melhor adequada para placas de 24 poços, e uma objectiva de 40X óleo é recomendado para lâminas de câmara. Cultivar células em qualquer substrato para este burroay.
- Concentre-se em midplanes de células, onde inclusões estão em seu diâmetro máximo e produzir bordas nítidas.
- Aquisição de imagens para muitos campos em cada poço (pelo menos 10 por poço); poços normalmente representam repetições ou variáveis experimentais.
- Enumerar o número de inclusões manualmente, por olho (inclusões são compartimentos negros em células HeLa-GFP) ou usar algoritmos de software de imagem para identificar e contar automaticamente inclusões.
- Encontre células GFP-HeLa por intensidade de fluorescência ('encontrar' Objetos de comando) e ajustar a intensidade limiar de fluorescência baseada em intensidades relativas de células.
- Filtro de objetos selecionados usando diretrizes de tamanho de manter somente aqueles superior a 5 m 2. Esta é a população 1 '.
- Aplicar 'tapar buracos em objetos' de comando usando "população 1 'como a entrada. Esta etapa gera 'população 2'.
- Subtrair 'população 1' de 'pOPULAÇÃO 2 'para produzir marcado positivamente inclusões de clamídia, designadas por "população 3'.
- Aplicar filtro de tamanho de 'população 3' ('Filtro População' comando), por exemplo, tratar de objectos maiores do que 25 um para 2 inclusões nas células infectadas durante 24 horas ou mais. Para tempos de início da infecção, tais como antes de 18 horas, conjunto de filtros de tamanho para manter objectos maiores do que 4 mm 2, uma vez que estas inclusões são muito menores. Tamanho de filtragem resulta numa população de objectos designados como inclusões ''.
- Calcular dados quantitativas de imagens, por exemplo, o número de inclusão, inclusão tamanho e circunferência inclusão, usando software de imagem.
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Representative Results
As células de mamífero que expressam as proteínas citosólicas fluorescentes (por exemplo, GFP) pode ser modificado para permitir a iluminação de inclusões de clamídia em células infectadas, culturas vivas. Após a infecção com clamídia, as inclusões são facilmente visíveis como pontos negros nas células hospedeiras (Figura 1). A clareza das inclusões-falta de fluorescência pode ser explorada para a identificação automática de inclusões em numerosos campos de visão e / ou tratamentos (Figura 1). Uma vez que células hospedeiras fluorescentes foram gerados, um novo e poderoso fluxo de trabalho está habilitado para rápida análise, quantitativa dos níveis de infecção por clamídia em amostras experimentais. Uma aplicação importante é a determinação de unidades formadoras de inclusão de clamídia (IFU) em células vivas, infectados (Figura 2). Esta estratégia experimental obvia a necessidade de procedimentos de imunofluorescência que são rotineiramente utilizados na área, que são ambos demorados edispendiosa.
Outra característica-chave da abordagem de imagem descrito é que ele pode ser facilmente aplicado a qualquer espécie ou estirpe de Chlamydia, e, além disso, pode ser explorada para a derivação de características biológicas importantes de inclusões por clamídia. Como um exemplo, uma análise de curso de tempo de células de GFP-HeLa infectadas com C. trachomatis LGV serovar L2, C. trachomatis serovar D, C. muridarum, e C. pneumoniae foi realizada a 16, 24, e 48 hpi (Figura 3). Para cada uma destas espécies e estirpes de Chlamydia, inclusões foram marcados e analisados para calcular a sua área média, comprimento do perímetro, e número por célula nos tempos indicados (Figura 4). Esses atributos fornecem informações importantes sobre a biologia de inclusões por clamídia e informar como eles interagem com a célula hospedeira. O método descrito fornece uma abordagem simplista para acessar essas informações de uma maneira que su rpasses que pode ser realizado por outras técnicas experimentais. A utilidade final da estratégia de marcação inversa é para imagiologia em tempo real de inclusões de clamídia em células vivas. Um exemplo disto é mostrado em um filme.
Figura 1. automatizado detecção de C. inclusões trachomatis. células (A) GFP-HeLa foram infectadas com (B) mKate2-expressando C. trachomatis L2 e fotografada ao vivo em 24 de HPI. Um algoritmo baseado em software de imagem foi usada para identificar automaticamente inclusões clamídia por (C) seleccionando buracos negros em células GFP-HeLa, marcados em laranja. (D) Uma imagem composta a partir de células infectadas painéis A e B, também é mostrada. Barra de escala = 20 mm. .jove.com / files / ftp_upload / 51131 / "target =" _ blank 51131fig1large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. A determinação quantitativa de inclusão formando unidades de clamídia (IFU) em células de HeLa-GFP. As células GFP-HeLa foram infectadas com a C. trachomatis L2 em duas diferentes multiplicidades de infecção e fotografada a 24 hpi. Inclusões de 10 campos por infecção foram detectados e enumerada utilizando o software automatizado e os resultados são dados (n = 3). As barras de erro representam o erro padrão da média. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3. Tempo de curso C. trachomatis serovar L2, C. trachomatis serovar D, C. muridarum, e C. pneumoniae infecção em células HeLa-GFP. As células GFP-HeLa foram infectadas com a C. trachomatis serovar L2 LGV e fotografada por microscopia de fluorescência ao vivo no (A) 16 hpi, (B) 24 hpi, e (C) 48 hpi. GFP células HeLa infectadas com C. trachomatis serovar D foram fotografadas em (D) 16 hpi, (E) 24 hpi, e (F) 48 hpi. GFP células HeLa infectadas com C. muridarum foram fotografadas em (G) 16 hpi, (H) 24 hpi, e (I) 48 hpi. GFP células HeLa infectadas com C. pneumoniaeforam fotografadas em (J) 16 hpi, (K) 24 hpi, e (G) 48 hpi. Imagens representativas são mostradas para todos os tempos e infecções. Barras de escala = 20 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. dados quantitativos representativos derivados das experiências curso de tempo. Inclusões de células GFP-HeLa infectadas com (A) C. trachomatis serovar L2 LGV, (B) C. trachomatis serovar D, (C) C. muridarum, e (D) C. pneumoniae foram detectados e enumerada em 16, 24, e 48 hpi (5 campos por intervalo de tempo, n = 3). As características físicas de chlamforam quantificados inclusões ydial para a área de superfície de inclusão, a inclusão comprimento do perímetro, e número de inclusões por célula. As barras de erro representam o SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Por favor clique aqui para ver este vídeo. Filme 1. Tempo de vídeo lapso de células mCherry-HeLa infectadas com GFP C. trachomatis L2, tomada em 48 hpi. Vídeo foi compilado a partir de uma série de imagens de lapso de tempo tomadas em intervalos de 5 min para 125 min. Suplentes vídeo em looping em todo células mCherry-HeLa (vermelho), C. trachomatis L2 (verde) e uma mesclagem de ambos os campos.
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Discussion
Aqui nós descrevemos a estratégia experimental para a geração de células hospedeiras fluorescentes para visualização em tempo real e análise de inclusões de clamídia. Esta abordagem visualização vacúolo confere a poderosa capacidade de iluminar, controlar e medir quantitativamente as propriedades dinâmicas de inclusões por clamídia entre as populações de células ou em células isoladas ao longo do tempo. Inclusões de clamídia em células proteína marcada fluorescentes são notavelmente bem definido, de tal modo que eles são facilmente identificados sem a necessidade de processamento adicional de imunofluorescência. Além disso, esta abordagem é sensível o suficiente para resolver assinatura morfológico diferenças que diferentes espécies de clamídia e estirpes possuem, tais como números de vacúolos por célula e inclusão curvatura. Além disso, demonstram como o software de imagens pode ser adaptado para identificar automaticamente inclusões nas células hospedeiras que expressam GFP. O obviation de medidas em matéria de rotulagem de imunofluorescência para illumination de inclusões clamídia resulta em tempo e economia de custos significativos para o usuário para ensaios de ponto de extremidade, como a determinação das unidades formadoras de inclusão (IFU). Além disso, a capacidade de inclusões da imagem em células vivas permite para a mesma população de células infectadas para ser analisada em momentos precisos no ciclo do desenvolvimento por clamídia, reduzindo assim o número de poços ou placas necessárias para estudos de evolução no tempo. Citosólica GFP, mCherry, etc, rendimento, um sinal luminoso estável que não sofre de fotobranqueamento; esse recurso é fundamental para experiências longas de imagem time-lapse. Por fim, porque a técnica é independente de Chlamydia expressão do gene de desenvolvimento, é igualmente eficaz em todas as fases de infecção celular por Chlamydia.
Em comparação com as estratégias existentes para a rotulagem intracelular Chlamydia e membranas 7,8, esta técnica oferece simplicidade e flexibilidade para uma experimentals pedidos. Fluorescentes células hospedeiras infectadas com Chlamydia podem ser visualizados imediatamente, sem necessidade de carregamento corante, rotulagem ou outras manipulações celulares. Esta abordagem ilumina claramente e define os bordos da inclusão, mantendo o espaço luminal da inclusão (e as bactérias) não marcado. Para efeitos de iluminar e enumerando as células infectadas por clamídia, a vantagem dessa abordagem reside principalmente na sua compatibilidade com culturas vivas, e portanto a economia de tempo significativa que ele proporciona. No entanto, para a derivação de rotulagem e parâmetros quantitativos da Chlamydia vacúolo que contém em si, os anticorpos comerciais para este compartimento não estão amplamente disponíveis. Consequentemente, a abordagem GFP invertido continua a ser o meio mais fáceis e diretos para a demarcação da membrana deste compartimento patógeno.
Existem considerações-chave para a aplicação deste método de imagem a um visualizat Chlamydiafluxo de iões. É importante que as linhas de células hospedeiras com uma expressão estável de GFP, mCherry, etc, são geradas antecipadamente. Embora inclusões são facilmente detectados por clamídia em células hospedeiras que são transientemente transfectadas com proteínas fluorescentes, as células preparadas desta forma sofrem de transfecção incompleta por meio da população, bem como níveis variáveis de expressão. Além disso, a transfecção acrescenta etapas desnecessárias para o processo global. Uma outra limitação do método descrito é que as inclusões derivadas de diferentes Chlamydia spp. pode ser notavelmente diferente na sua aparência morfológica e a maneira pela qual eles interagem com a célula hospedeira. Esta abordagem de imagem é bastante robusto para detectar e inclusões de imagem contendo C. trachomatis, C. muridarum ou C. pneumoniae; no entanto, para algumas espécies de clamídia (principalmente C. psittaci e C. caviae) inclusões são menos capazes de excluir GPQ do seu espaço luminal. Inclusões contendo C. psittaci ou C. caviae são facilmente visíveis em células HeLa-GFP, mas a intrusão de GFP em algumas destas inclusões aumenta a taxa de erro de detecção de inclusões de software baseada.
Uma vez que a estratégia global experimental foi adequadamente implementado, novas oportunidades são criadas para a análise quantitativa de inclusões de clamídia em células vivas. Nós demonstramos como esta técnica permite um fluxo de trabalho simplificado para inclusão enumeração - ou de forma automatizada usando software de imagem, ou pelo placar manual. Uma nova aplicação desta abordagem é para a derivação dos dados quantitativos significativas sobre a inserção, por exemplo, a área de inclusão, volume e forma. Finalmente, este método de visualização é altamente flexível e pode ser usado em combinação com outros marcadores fluorescentes para revelar esclarecimentos adicionais sobre a biologia das células hospedeiras infectadas por clamídia, por exemploGFP ou mKate2-expressando Chlamydia 6,11, actina fluorescente 12 ou proteínas marcadas com GFP Inc 13.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene | Sigma | H9268 | |
| 0.45 µm filters | Fisher | 09-719D | |
| G418 | Invitrogen | 10131 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | |
| RPMI 1640 w/o phenol red | Cellgro | 17-105-CV | |
| Penicillin G | Sigma | 13752 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Chamber slides, Lab-Tek II | Nunc | 154526, 154534 |
References
- Stamm, W. E. Chlamydia trachomatis infections: progress and problems. The Journal of Infectious Diseases. 179, Suppl 2. S380-S383 (1999).
- Schachter, J. Infection and disease epidemiology. Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. Stephens, R. S. , ASM Press. 139-169 (1999).
- Campbell, L. A., Kuo, C. C. Chlamydia pneumoniae--an infectious risk factor for atherosclerosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (1), 23-32 (2004).
- Darville, T., Hiltke, T. J. Pathogenesis of genital tract disease due to Chlamydia trachomatis. The Journal of Infectious Diseases. 201, Suppl 2. S114-S125 (2010).
- Hackstadt, T. Cell biology. Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. Stephens, R. S. , ASM Press. 101-138 (1999).
- Wang, Y., Kahane, S., Cutcliffe, L. T., Skilton, R. J., Lambden, P. R., Clarke, I. N. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector). PLoS Pathogens. 7 (9), e1002258 (2011).
- Hackstadt, T., Scidmore, M. A., Rockey, D. D. Lipid metabolism in Chlamydia trachomatis-infected cells: directed trafficking of Golgi-derived sphingolipids to the chlamydial inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
- Boleti, H., Ojcius, D. M., Dautry-Varsat, A. Fluorescent labelling of intracellular bacteria in living host cells. Journal of Microbiological Methods. 40 (3), 265-274 (2000).
- Hybiske, K., Stephens, R. S. Mechanisms of host cell exit by the intracellular bacterium Chlamydia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11430-11435 (2007).
- Heinzen, R. A., Hackstadt, T. The Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuolar membrane is not passively permeable to low-molecular-weight compounds. Infection and Immunity. 65 (3), 1088-1094 (1997).
- Wickstrum, J., Sammons, L. R., Restivo, K. N., Hefty, P. S. Conditional gene expression in Chlamydia trachomatis using the tet system. PLoS One. 8 (10), 10-1371 (2013).
- Chin, E., Kirker, K., Zuck, M., James, G., Hybiske, K. Actin recruitment to the Chlamydia inclusion is spatiotemporally regulated by a mechanism that requires host and bacterial factors. PLoS One. 7 (10), e46949 (2012).
- Agaisse, H., Derré, I. A C. trachomatis cloning vector and the generation of C. trachomatis strains expressing fluorescent proteins under the control of a C. trachomatis promoter. PLoS One. 8 (2), e57090 (2013).
