PCR结合高分辨率的熔融分析(HRMA)被证明是一种快速,有效的方法,以斑马鱼的基因型。
斑马鱼是研究开发,造型疾病,并进行药物筛选功能强大的脊椎动物模型系统。最近的各种遗传工具的相继出台,其中包括诱导突变并产生转基因株系多种策略。然而,大规模的筛选是通过传统的基因分型方法,这是耗时耗力的限制。在这里,我们描述的技术来分析斑马鱼的基因型PCR结合高分辨率熔解分析(HRMA)。这种方法快速,灵敏,而且价格便宜,具有污染器物风险较低。基因分型的PCR与HRMA可以用于胚胎或成年鱼,包括高通量筛选的协议。
斑马鱼( 斑马鱼 )是脊椎动物模型系统广泛用于开发和疾病模型的研究。最近,众多的转基因和基因突变技术已经开发了斑马鱼。快速的转基因技术,通常根据一个TOL2座子系统1中,已合并为多个DNA片段组件2改进的克隆选择。锌指核酸酶(ZFN)和转录活化因子样效应物核酸酶(TALENS)已被用于靶向基因座在两个体细胞和生殖系细胞,斑马鱼3,4。这些技术可以有效地产生转基因动物,具有高频突变的创建和种系传递3,4。
尽管取得了这些进展,在传统的斑马鱼基因分型技术限制的诱变和转基因工具的全部功能。 PCR然后进行凝胶电泳,有时结合不受限制。Ñ酶消化,被广泛用于检测基因组的修饰,但很费时,并确定小插入或缺失不敏感。 TaqMan探针检测具有较高的初始成本,需要仔细优化。 PCR产物的测序可能需要几天时间,并且是不实用的大规模筛选。限制性片段长度多态性(RFLP)分析,只能判别影响的限制性内切酶识别位点的一个有限的范围内的SNP。
高分辨率熔解分析(HRMA),封闭管后的PCR分析方法,是一种最近开发的方法,该方法快速,灵敏,价格低廉,适合于筛选大量样品。 HRMA可用于检测单核苷酸多态性,突变,和转基因5-7。 HRMA是基于双链DNA热变性,并且每个PCR扩增子具有唯一的解离(熔体)特性5。样品可以分辨由于吨ø其不同的核苷酸组成,GC含量,或长度,通常在用荧光染料的组合,只有结合双链DNA 8。因此,HRMA可以基于不同的熔融曲线的特征区分不同基因型。因为HRMA使用廉价的试剂和是一个单步PCR后的过程中,它可用于高通量的策略。 HRMA是破坏性的,所以下面的分析将PCR扩增子可以用于其他应用。 HRMA已在许多生物和系统,包括细胞系,小鼠和人类9-11中得到应用。它的使用最近在斑马鱼被描述检测由锌指核酸酶(ZFN)和塔伦斯6,12,13突变。
在本文中,我们将描述如何在胚胎和成年斑马鱼进行基于PCR的HRMA( 图1)。这个协议是适合于检测单核苷酸多态性,转基因,和基因突变,包括SIngle碱基对的改变,插入或缺失。
PCR结合HRMA是一种功能强大的技术,斑马鱼基因分型。这种方法的优点是它的速度,鲁棒性,以及灵敏度来检测偶数的点突变。整个协议,从翅片夹熔化曲线分析,可在少于八小时由个人执行的。此外,该技术是适合于高通量筛选;不需要使用溴化乙锭;和密封所有PCR和分析步骤,这有助于减少污染的问题。
这种技术的一个关键步骤是PCR扩增子和引物设计。典型的长度为PCR?…
The authors have nothing to disclose.
我们感谢布拉施克,格伦沃尔德和WITTWER实验室的咨询和技术援助的成员。这项工作是由PCMC基金会,美国国立卫生研究院R01 MH092256和DP2 MH100008和优生优育基金会的研究经费#1-FY13-425的3月,为广东健力宝的支持。
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