Summary
PCR combinée à l'analyse de fusion à haute résolution (AGRH) est démontré comme une méthode rapide et efficace de déterminer le génotype du poisson zèbre.
Abstract
Le poisson zèbre est un système de modèle vertébré puissant pour étudier le développement, la modélisation de la maladie, et en effectuant le criblage de médicaments. Récemment, une variété d'outils génétiques ont été mis en place, y compris des stratégies multiples pour induire des mutations et de générer des lignées transgéniques. Cependant, le dépistage à grande échelle est limitée par des méthodes de génotypage traditionnels, qui prennent beaucoup de temps et de main-d'œuvre. Nous décrivons ici une technique pour analyser les génotypes de poisson zèbre par PCR combinées avec l'analyse à haute résolution fusion (AGRH). Cette approche est rapide, sensible et peu coûteux, avec un risque plus faible d'objets de contamination. Le génotypage par PCR avec HRMA peut être utilisé pour des embryons ou des poissons adultes, y compris dans des protocoles de criblage à haut débit.
Introduction
Poisson zèbre (Danio rerio) est un système de modèle vertébré largement utilisé pour les études de développement et de modélisation de la maladie. Récemment, de nombreuses technologies transgéniques et de mutation ont été développés pour le poisson zèbre. Techniques de transgénèse rapides, généralement basés sur un système de transposon Tol2 1, ont été combinées avec une amélioration des options de clonage multiple pour l'assemblage de fragments d'ADN 2. Nucléases à doigts de zinc (ZFN) et transcription nucléases effectrices activateur comme (Talens) ont été utilisées pour cibler les lieux dans les cellules somatiques et germinales chez le poisson zèbre 3,4. Ces techniques peuvent générer efficacement des animaux génétiquement modifiés, avec la création de mutation à haute fréquence et la transmission de la lignée germinale 3,4.
Malgré ces avancées, les techniques de génotypage traditionnels chez le poisson zèbre limiter la puissance des outils de mutagenèse et la transgenèse. PCR suivie d'une électrophorèse sur gel, parfois combinée à RESTRICTIOn digestion avec des enzymes, est largement utilisée pour détecter la modification du génome, mais est longue et moins sensible pour identifier de petites insertions ou délétions. essais de sonde TaqMan ont des coûts initiaux élevés et nécessitent une optimisation soignée. Le séquençage des produits de PCR peut prendre plusieurs jours et n'est pas pratique pour le dépistage à grande échelle. longueur des fragments de restriction (RFLP) analyse ne peut discriminer SNP affectant un nombre limité de sites de reconnaissance des enzymes de restriction.
Analyse à haute résolution fusion (HRMA), un post-PCR méthode d'analyse en tube fermé, est un procédé récemment mis au point qui est rapide, sensible, peu coûteux, et aptes à la sélection de grands nombres d'échantillons. HRMA peut être utilisé pour détecter des SNP, les mutations et les transgènes 7.5. HRMA est basé sur la dénaturation thermique des ADN double brin, et chaque amplicon de PCR a une dissociation uniques (fondre) caractéristique 5. Les échantillons peuvent être victimes de discrimination en raison to leur composition différente de nucléotides, contenu GC, ou longueur, généralement en combinaison avec un colorant fluorescent qui se lie uniquement l'ADN double brin 8. Ainsi, HRMA peut distinguer différents génotypes sur la base des caractéristiques différentes à l'état fondu de courbe. Parce que HRMA utilise des réactifs à faible coût et est un processus post-PCR en une seule étape, il peut être utilisé pour des stratégies à haut débit. HRMA est non destructive, si suite à l'analyse des amplicons PCR peuvent être utilisés pour d'autres applications. HRMA a été appliqué dans de nombreux organismes, y compris les systèmes et les lignées cellulaires, les souris et les humains 9-11. Son utilisation a été récemment décrit dans le poisson zèbre pour détecter des mutations induites par les nucléases à doigt de zinc (ZFN) et Talens 6,12,13.
Dans cet article, nous décrivons comment effectuer HRMA basée sur la PCR chez le poisson zèbre embryonnaire et adulte (figure 1). Ce protocole est adapté pour détecter des SNP, les transgènes et les mutations, notamment single changements de paires de bases, des insertions ou des suppressions.
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Protocol
Une. Préparation de l'ADN
- Préparer le tampon de lyse de l'ADN: 50 mM de KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,3% de Tween 20, 0,3% de NP40. Ajouter fraîche protéinase K à une concentration finale de 1 mg / ml le jour de l'utilisation 12.
- collecte des tissus:
- Pour adultes pince poisson nageoire:
- Anesthésier les poissons: Placer le poisson dans 0,004% MS-222 (tricaine) solution. Attendez jusqu'à ce que le mouvement des branchies ralentit.
- Mettez le poisson sur une pile de 5-10 Kimwipes et couper un petit morceau de la nageoire caudale, environ 2-3 mm, avec une lame de rasoir stérile.
- Placer rapidement le poisson dans un réservoir de l'étiquette à l'eau douce pour la récupération; étiqueter soigneusement la fois le réservoir et le tube correspondant qui contiendra la nageoire. Changez l'eau et nourrir les poissons tous les jours.
- Ramassez la nageoire avec une pointe de pipette stérile et le transférer dans un tube rempli de 100 tampon de lyse ADN ul.
- Jeter la pointe de la pipette, et jeter la lame de rasoir dans un récipient pour objets tranchants.
- Pour embryon queue clip:
- Placez embryons dans 0,004% MS-222 (tricaine) solution. Attendez 2 min.
- Coupez un morceau de queue avec une pince sous un microscope à dissection.
- Mettez la queue dans un tube étiqueté rempli de 30 tampon de lyse d'ADN ul.
- Mettre rapidement à l'embryon dans un tube contenant 100 ul de paraformaldehyde à 4%.
- Identifier les tubes avec des embryons et leurs tubes de queue correspondantes.
- Stockez les tubes avec des embryons à 4 ° C pendant la nuit pour la fixation.
- Nettoyez les pinces avec de l'eau Milli-Q et Kimwipes entre chaque embryon pour minimiser la contamination.
- Pour les embryons entiers:
- Placez embryons dans 0,004% MS-222 (tricaine) solution. Attendez 2 min.
- Mettez 1-5 embryons dans un tube rempli de 100 tampon de lyse ADN ul. Dechorionation n'est pas nécessaire.
- Pour adultes pince poisson nageoire:
- Digestion de l'ADN
Incuber les tubes avec le tissu (nageoires ou de la queue des clips ou des embryons) à 55 ° Cpendant 4 heures jusqu'à la nuit 12. - Inactiver la protéinase K
tubes à chaleur à 95 ° C pendant 15 min 12. ADN doit être utilisée pour la PCR immédiatement, ou conservée à -20 ° C pendant jusqu'à 3 mois.
2. PCR
- Concevoir des amorces soit manuellement ou par logiciel de conception d'amorce (par exemple Lightscanner Primer logiciel de conception-Biofire). Les produits de PCR pour HRMA sont généralement 50-200 pb; produits de PCR pour la détection de SNP devraient être plus petits, généralement 50-80 pb.
- PCR
- Effectuer réaction de PCR dans une plaque de 96 puits ou 384 puits.
- Utilisez 10 pi volume total: 4 master mix de LightScanner pi (0,1 U chaud Commençons Taq-AB polymérase, tampon, 0,2 mM dNTPs, le chlorure de magnésium 2 mM, et 1x colorant fluorescent d'ADN double brin contraignante); 5 pmol de chaque amorce, et 1 pl matrice d'ADN génomique extrait de queue adulte aileron ou 3 pl de l'ADN génomique de la queue embryonnaire 13.
- échantillons de couverture avec 30 ul d'huile minérale. Couvrir la plaque avec un joint adhésif optiquement transparent.
- Optimiser PCR vélo conditions-typiques conditions sont 95 ° C pendant 5 min et 30 cycles de 10 s à 95 ° C, 25 sec à 60 ° C, 30 secondes à 72 ° C, se terminant par 95 ° C pendant 30 sec et refroidi à 15 ° C.
- Magasin plaques PCR à 4 ° C ou continuent directement à AGRH.
- Confirmer notre produit de PCR par analyse de sa dimension en utilisant une électrophorèse sur gel d'agarose pendant l'optimisation initiale de la PCR, et, si indiqué, par séquençage du produit de PCR.
3. HRMA
- chauffer les assiettes
- Placer la plaque dans un système d'analyse à l'état fondu.
- Ouvrez le logiciel (Software LightScanner Call-IT 2.0).
- Faites chauffer les assiettes de 60 à 95 ° C.
- Créer un nouveau fichier de stockage de données.
- Analyser les données de HRMA (Figure 2).
Plusieurs étapes d'analyse sont possibles. Nous montrons l'ensemble le plus couramment utilisé de données manipulations.- réglage de sous-ensemble
Cliquez sur l'onglet Sous-ensemble. Sélectionnez les puits avec des échantillons. - Normalisation
- Sélectionnez l'onglet Normaliser dans le panneau de gauche. Pour éliminer la fluorescence variance, positionner manuellement la double ligne parallèle en pré-(initiale) et les régions poste (finale)-fusion comme illustré (figure 2C, pointes de flèches) et normaliser préfusion et de fluorescence post-fusion des signaux de tous les échantillons de 1 et 0 , respectivement 14.
- Ajuster le positionnement des lignes de sorte que la région de fusion est dans la région entre les pré-et post-fusion des lignes, mais pas sélectionné. En général, la Basse-Min et Max Basse (et supérieur Min et Max supérieur) lignes de température doivent être placés à environ 1 ° C dehors.
- Choisissez positions de température de normalisation tels que tous les échantillons ont (100%) fluorescence maximale ou totale de la région de première fusion et un minimum ou pas (0%) fluorescence pour la région post-fusion (mieux que possible). La normalisation devrait conduire à une ligne presque horizontale à la fluorescence maximale de 1 qui s'étend jusqu'au point de fusion, puis une ligne presque horizontale à partir du point de la fluorescence minimum de 0 à l'état fondu, il ne devrait pas y avoir des niveaux de fluorescence supérieures à 1 ou inférieures à 0 . Par exemple, sur la figure 2C, normaliser les courbes de préfusion en utilisant des plages de températures de 79-80 ° C.
- Groupement / Clustering
Distinguer les génotypes en fonction de leur température de fusion (figure 2C, boîte verte). Sélectionnez Groupement.- Sélectionnez Autogroup de la liste de sélection des normes dans la section Groupement.
- Sélectionnez Normal ou Haut pour la fusion des profils avec des transitions simples ou multiples transitions respectivement dans la liste de sélection de sensibilité dans la section Groupement.
- Sélectionnez ComputeGroupes sous la section Groupement.
- Allez dans le menu Fichier et cliquez sur Enregistrer pour enregistrer les résultats.
- réglage de sous-ensemble
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Representative Results
Le protocole peut être effectué pendant une seule journée ou dans des étapes séparées sur plusieurs jours (diagramme de flux de travail est représentée sur la figure 1). extraction de l'ADN est suivie par la fusion et l'analyse des amplicons PCR. Les températures pour la fusion de l'amplicon dépendent de la taille et de GC-contenu, mais en général, et de commencer à des températures de 50 ˚ C et 95 ˚ C terminales sont appropriées (figures 2A et 2B). Une fois que la masse fondue est effectuée, l'analyse des courbes de fusion de fluorescence nécessite généralement la normalisation de la variation des courbes différentes de l'échantillon, en utilisant des régions post-pré-melt et en tant que normes (Figure 2C). Ceci améliore la comparaison des résultats provenant de différents échantillons dans lesquels la variation de fluorescence est liée à des variations expérimentales mineures. Chaque paire de lignes de température pour la normalisation doit être placé à environ 1 ˚ C d'intervalle (figure 2C, les pointes de flèche).; Groupement des résultats de données est représenté de deux manières différentes: un graphique supérieur montre que les profils fusion de la courbe, et un graphique qui montre un faible tracé de différence soustractive par rapport à un échantillon de référence (figure 2D).
analyse de HRMA peut être utilisée pour détecter des mutations (Figures 3A et 3B) ou transgènes (Figure 3C). Sur la figure 3A, deux mutations différentes dans le gène eif2b5 sont présentés (courbes rouges et bleues de la figure 3A) en soustrayant les données de fluorescence de l'échantillon normalisé de type sauvage. Il n'est pas question que le génotype est choisie pour référence. Des différences plus subtiles ou prêtant à confusion dans les fusions de courbes peuvent être distingués en utilisant le tracé de différence soustractive. Sur la figure 3B, un exemple de quatre génotypes différents dans une seule collection des embryons est signalée.
Figure 1. Contour de protocole pour HRMA de l'ADN génomique du poisson zèbre à base de PCR. Extraction d'ADN à partir de tissu entier (ailette de la cassette ou de l'embryon) est suivie d'une amplification par PCR en présence d'un colorant fluorescent à double brin liaison à l'ADN. L'amplicon de PCR est dénaturé et le signal de fluorescence est enregistré, à l'état fondu suivi d'une analyse de la courbe, pour détecter l'amplicon et / ou pour différencier les génotypes.
Figure 2. Captures d'écran de logiciel pour effectuer l'AGRH et analyser les résultats. A. Capture d'écran du logiciel LightScanner;. boîte jaune est amplifié dans "B" B. Agrandie vue de la région de boîte en «A». Réglage de début et de fin sont indiquées Temp (flèches). C. Placez la première fusion et des lignes parallèles post-fusion pour la normalisation (pointes de flèches). Notez la variance de fluorescence en pré-et post-fusion des régions (boîte rouge). Graphique inférieur (boîte verte) montre fusion courbes issues des parcelles de données brutes suivante normalisation. D. Du haut montre le graphique fondent profils de courbe après regroupement automatique; différents génotypes sont illustrés dans différentes couleurs (boîte rouge). Graphique inférieur (boîte verte) montre la courbe de différence de fluorescence. Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 3. Utilisation des ressources humaines. MA pour identifier les mutations et transgènes courbes de différence de fluorescence sont présentés; changement de fluorescence (axe des y) à la température (axe des x) reçoit un.. HRMA a été utilisé pour détecter les poissons portant des mutations dans le gène de eif2b5. Type sauvage est représentée en gris (flèche). Les couleurs rouges et bleues représentent deux mutations eif2b5 différents, confirmés par séquençage du produit de PCR. B. Quatre allèles mutants FOXP2 différents sont identifiés par AGRH. Rouge: zc82 / + (8 pb suppression), vert: zc83 / + (17 pb suppression), bleu: zc82/zc83 (8pb deletion/17bp suppression), gris:. Zc83/zc83 (de 17 pb homozygotes de suppression) C. Poissons transgéniques Gal4 (courbes en gris) peut être distingué de type sauvage (courbe marron, flèche). Notez que pour la détection du transgène, la normalisation ne doit pas être effectuée. Cliquez ici pour agrandir l'image.
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Discussion
PCR combinée avec HRMA est une technologie puissante pour le génotypage du poisson zèbre. Les avantages de cette approche sont sa vitesse, la robustesse et la sensibilité à détecter même des mutations ponctuelles. L'ensemble du protocole, à partir de la cassette d'analyse ailette pour faire fondre la courbe, peut être effectuée en moins de huit heures par une seule personne. De plus, la technique est susceptible de criblage à haut débit, ne nécessite pas l'utilisation de bromure d'éthidium, et est scellé pour PCR et toutes les étapes d'analyse qui permet de minimiser les problèmes de contamination.
Une étape critique de cette technique est amplicon PCR et la conception d'amorce. Longueur typique pour les produits de PCR dans HRMA est 50-200 pb. Amplicons courts augmentent la sensibilité et sont idéales pour détecter des changements de nucléotides simples. Si courbes fondre des espèces de produits de PCR sont étroitement liées ne peuvent être distingués facilement, un petit oligonucléotide complémentaire de la SNP et bloqué à l'extrémité 3 'peut être incluse dans la réaction PCR (Lunaprobes; sondes). Les sondes sont générées par PCR asymétrique en utilisant une concentration différente de la amorces directe et inverse, avec une 3 'C3 bloqueur pour empêcher l'extension de la sonde dans le HRMA PCR subséquente. La sonde est ensuite incluse dans la réaction PCR HRMA. HRMA se produit alors avec la sonde, dans lequel la sonde se lie à l'asymétrie du produit de PCR et génère des duplex sonde-cible avec l'état fondu différentes courbes qui peuvent être utilisés pour distinguer les allèles.
Plusieurs compagnies offrent des systèmes d'analyse par fusion courbe. Il s'agit notamment de la Biofire Lightscanner, la Roche LightcyclerVR 480 et la Qiagen Rotor-Gene Q. Plusieurs, colorants de liaison d'ADN fluorescentes sont disponibles, y compris LC vert PLUS et SYT09 EvaGreen. Il existe une certaine variation de la sensibilité dans la détection de mutation sur la base de différents colorants fluorescents et des machines à l'état fondu 8,15 courbe. Nonsaturating colorants, par exemple, SYBR Green I, ne conviennent pas pour la plupart des applications HRMA: à des concentrations élevées, le SYBR Green I qui concets de l'activité de l'ADN polymérase, et à des concentrations plus faibles, SYBR Green I ne peut pas mesurer avec précision le comportement de fusion en raison de sa redistribution des zones fondues vers les régions du ADNds 16. En général plateformes PCR en temps réel les plus actuels sont capables de préformage HRMA l'aide d'un logiciel add-on et un colorant fluorescent liaison à l'ADN de deuxième génération. Bien que les détails techniques du logiciel et la séquence des étapes expérimentales varient légèrement entre les plates-formes, les concepts scientifiques généraux sont essentiellement identiques.
Notre laboratoire et d'autres ont démontré que HRMA peut être utilisé à la fois dans le poisson-zèbre embryonnaire et adulte pour détecter les transgènes et les mutations induites par ZFNs et TALENs 6,12,13. HRMA a été utilisé pour découvrir polymorphismes chez le poisson zèbre 6,12. Notre laboratoire utilise HRMA tant pour le dépistage initial des mutations TALEN induites ainsi que pour le tri des lignes établies (TSQ et JLB, non publié). Autres applicat potentielions qui pourraient être appliquées à poisson zèbre sont sensible à la méthylation AGRH (ms-AGRH) 17, quantification de nombre de copies variantes 5 et détection de pathogènes dans des vivariums 18.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions les membres des Blaschke, Grunwald, et Wittwer laboratoires pour obtenir des conseils et une assistance technique. Ce travail est soutenu par la Fondation PCMC, NIH R01 MH092256 et DP2 MH100008, et le Mars de Dimes Foundation subvention de recherche n ° 1-AF13-425, à JLB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com |
| Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9665 | www.bio-rad.com |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | www.bio-rad.com |
| 96-well LightScanner Instrument | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com |
| LightScanner Software with Call-IT 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| High-resolution Melting Analysis 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| LightScanner Primer Design Software | BioFire | www.biofiredx.com | |
| Vector NTI Software | Invitrogen | www.invitrogen.com | |
| Tricaine | |||
| Paraformaldehyde |
References
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