Summary
PCR combinada com a análise de fusão de alta resolução (HRMA) é demonstrado como um método rápido e eficiente para a genotipagem de peixe-zebra.
Abstract
Zebrafish é um poderoso sistema modelo para o estudo de vertebrados desenvolvimento, modelagem de doenças, e realizar a triagem de drogas. Recentemente, uma variedade de ferramentas genéticas foram introduzidas, incluindo várias estratégias para induzir mutações e gerar linhagens transgênicas. No entanto, o rastreio em larga escala é limitada pelos métodos de genotipagem tradicionais, que são consumidoras de tempo e de trabalho intensivo. Aqui nós descrevemos uma técnica para analisar genótipos zebrafish por PCR combinada com análise de alta resolução de fusão (HRMA). Esta abordagem é rápida, sensível e de baixo custo, com menor risco de artefatos de contaminação. A genotipagem por PCR com HRMA pode ser usado para embriões e peixes adultos, incluindo protocolos de triagem de alto rendimento.
Introduction
Peixe-zebra (Danio rerio) é um sistema de modelo animal vertebrado amplamente utilizado para estudos de desenvolvimento e modelagem de doenças. Recentemente, várias tecnologias transgênicas e mutação foram desenvolvidos para zebrafish. Técnicas de transgenia rápidos, geralmente com base em um sistema de transposon Tol2 1, foram combinados com melhores opções de clonagem para uma montagem múltipla fragmento de DNA 2. Nucleases de dedos de zinco (ZFNs) e de transcrição nucleases efectoras activadores do tipo (TALENS) têm sido utilizadas para direccionar loci em ambas as células somáticas e germinais em peixes-zebra 3,4. Estas técnicas podem gerar de forma eficiente animais geneticamente modificados, com alta freqüência de criação e transmissão de mutação germinal 3,4.
Apesar destes avanços, técnicas de genotipagem tradicionais em zebrafish limitar o poder das ferramentas de mutagênese e transgenia. PCR, seguida por electroforese em gel, por vezes combinados com DISSEMINAÇdigestão enzimática n, é amplamente utilizado para detectar a modificação do genoma, mas é demorada e menos sensível à identificação de pequenas inserções ou deleções. Ensaios de sonda TaqMan têm altos custos iniciais e requerem otimização cuidadosa. A sequenciação de produtos de PCR pode levar vários dias e não é prática para a triagem em grande escala. Análise do polimorfismo de fragmentos de restrição (RFLP) só pode discriminar SNPs que afetam um número limitado de sítios de reconhecimento de enzimas de restrição.
A análise de alta resolução de fusão (HRMA), um tubo fechado, o método de análise pós-PCR, é um método recentemente desenvolvido que é rápido, sensível, pouco dispendioso, e passíveis de rastreio de grandes números de amostras. HRMA pode ser utilizado para detectar SNPs, mutações e transgenes 5-7. HRMA é baseada em desnaturação térmica de ADN de cadeia dupla, e cada fragmento amplificado de PCR tem um único dissociação (derreter) característica 5. As amostras podem ser discriminados devido to a sua composição de nucleótidos diferente, teor de GC, ou comprimento, tipicamente em combinação com um corante fluorescente que se liga somente o ADN de cadeia dupla 8. Assim, HRMA pode distinguir diferentes genótipos com base nas diferentes características de fusão-curva. Porque HRMA utiliza reagentes de baixo custo e é um processo de pós-PCR de etapa única, que pode ser usado para as estratégias de alto rendimento. HRMA é não destrutiva, de modo que após a análise dos produtos de amplificação de PCR podem ser usados para outras aplicações. HRMA foi aplicado em muitos organismos e sistemas, incluindo linhas celulares, ratos e seres humanos 9-11. Seu uso foi recentemente descrito no peixe-zebra para detectar mutações induzidas por nucleases dedo de zinco (ZFNs) e Talens 6,12,13.
Neste artigo, descrevemos como executar HRMA baseado em PCR em zebrafish embrionárias e adultas (Figura 1). Este protocolo é adequado para a detecção de SNPs, os transgenes e mutações, incluindo simudanças ngle de pares de bases, inserções ou exclusões.
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Protocol
1. Preparação de DNA
- Preparar tampão de lise de ADN: 50 mM de KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 0,3% de Tween 20, 0,3% de NP40. Adicionar fresco proteinase K para uma concentração final de 1 mg / mL, no dia da utilização 12.
- Coleção de tecidos:
- Para o adulto clipe fin fish:
- Anestesiar peixe: Coloque o peixe em 0,004% solução (tricaina) MS-222. Espere até que o movimento de emalhar diminui.
- Coloque os peixes em uma pilha de 5-10 Kimwipes e cortar um pequeno pedaço da barbatana caudal, cerca de 2-3 mm, com uma lâmina de barbear estéril.
- Colocar rapidamente o peixe em um tanque rotulado com água fresca para a recuperação; rotular cuidadosamente tanto o tanque e correspondente tubo que contém o clipe de fin. Troque a água e alimentar os peixes todos os dias.
- Pegue o clipe fin com uma ponta de pipeta estéril e transferi-lo para um tubo preenchido com 100 mL tampão de lise de DNA.
- Descarte a ponta da pipeta, e descartar a lâmina de barbear em um recipiente apropriado.
- Por cauda embrião clipe:
- Coloque embriões em 0,004% solução (tricaina) MS-222. Espere 2 min.
- Corte um pedaço da cauda com uma pinça sob um microscópio de dissecação.
- Coloque a cauda para um tubo rotulado cheio com 30 uL de tampão de lise de ADN.
- Rapidamente colocar o embrião para um tubo contendo 100 jil de 4% de paraformaldeído.
- Tubos etiqueta com embriões e seus tubos de cauda correspondentes.
- Armazenar os tubos com embriões a 4 ° C durante a noite para a fixação.
- Limpar os fórceps usando água Milli-Q e Kimwipes entre cada embrião para minimizar a contaminação.
- Para embriões inteiros:
- Coloque embriões em 0,004% solução (tricaina) MS-222. Espere 2 min.
- Colocar 1-5 embriões num tubo cheio com 100 ul de tampão de lise de ADN. Dechorionation não é necessário.
- Para o adulto clipe fin fish:
- Digestão do DNA
Incubar os tubos com o tecido (ou nadadeira da cauda clips ou embriões) a 55 ° Cpara 4 horas até durante a noite 12. - Desativar o Proteinase K
Tubos de calor a 95 ° C durante 15 minutos 12. DNA deve ser utilizado para a PCR imediatamente ou armazenada a -20 ° C durante até 3 meses.
2. PCR
- Projeto Primers manualmente ou por software de desenho de primer (por exemplo Lightscanner Primer Projeto Software-Biofire). Os produtos de PCR para HRMA são geralmente de 50-200 pb, os produtos de PCR para a detecção de SNP pode ser menor, tipicamente 50-80 pb.
- PCR
- Realizar a reacção de PCR em um de 96 poços ou de 384 poços da placa.
- Utilizar 10 mL volume total: 4 ul de mistura principal LightScanner (0,1 L quente iniciar a Taq-polimerase AB, tampão, dNTP 0,2 mM, cloreto de magnésio 2 mM, 1x e corante de ligação a ADN de cadeia dupla fluorescente), 5 pmol de cada iniciador, e 1 uL de ADN genómico extraído de modelo de barbatana adulto ou 3 ul de DNA genómico a partir de cauda embrionária 13.
- Amostras de cobertura com 30 mL de óleo mineral. Cobrir a placa com um selo adesivo opticamente transparentes.
- Optimizar PCR condições de ciclismo típicos, são condições de 95 ° C durante 5 min, e 30 ciclos de 10 seg a 95 ° C, 25 seg a 60 ° C, 30 seg a 72 ° C, terminando com 95 ° C durante 30 seg e arrefecida a 15 ° C.
- Armazene PCR placas a 4 ° C ou continuar diretamente para HRMA.
- Confirmar nosso produto de PCR por análise do seu tamanho utilizando electroforese em gel de agarose durante a optimização inicial de PCR e, se indicado, por sequenciação do produto de PCR.
3. HRMA
- Placas de calor
- Coloque a placa em um sistema de análise de fusão.
- Abra o software (Software LightScanner Chame-IT 2.0).
- Placas de calor 60-95 ° C.
- Crie um novo arquivo de armazenamento de dados.
- Analisar dados HRMA (Figura 2).
Várias etapas de análise são possíveis. Mostramos o conjunto mais comumente usado de dados manipulations.- Definição de subconjunto
Clique na aba subconjunto. Selecione os poços com amostras. - Normalização
- Selecione a guia Normalize no painel à esquerda. Para eliminar variação de fluorescência, posicionar manualmente a dupla linha paralela na pré-(inicial) e pós regiões (final) derreter como ilustrado (Figura 2C, pontas de seta) e normalizar os sinais de fluorescência premelt e pós-fusão de todas as amostras a 1 e 0 , respectivamente 14.
- Ajustar o posicionamento das linhas de modo que a região de fusão é, na região entre as linhas de pré-e pós-melt, mas não seleccionado. Em geral, quanto menor Min e Baixa Max (e Superior Min e Max superior) linhas de temperatura deve ser colocado cerca de 1 ° C à parte.
- Escolha posições de temperatura para a normalização de tal forma que todas as amostras têm (100%) de fluorescência máxima ou total para a região premelt e mínima ou nenhuma (0%) de fluorescência para a região pós-fusão (da melhor forma posvel). A normalização deve resultar em uma linha quase horizontal na parte de fluorescência máxima de 1 que se estende até ao ponto de fusão e, em seguida, uma linha quase horizontal a partir do ponto de fusão na fluorescência mínima de 0, não deve haver níveis de fluorescência acima ou abaixo de 1 0 . Por exemplo, na figura 2C, normalizar as curvas premelting usando gamas de temperatura de 79-80 ° C.
- Agrupamento / Clustering
Distinguir os genótipos com base na sua temperatura de fusão (Figura 2C, caixa verde). Selecione Agrupamento.- Selecione autogroup na lista de seleção Padrões na seção Agrupamento.
- Selecione Normal ou Alta para a fusão de perfis com transições individuais ou várias transições, respectivamente, na lista de seleção de sensibilidade na seção Agrupamento.
- Selecione ComputeGrupos na seção Agrupamento.
- Vá para o menu Arquivo e clique em Salvar para salvar os resultados.
- Definição de subconjunto
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Representative Results
O protocolo pode ser realizada durante um único dia ou separada em passos ao longo de vários dias (diagrama de fluxo de trabalho é mostrado na Figura 1). Extracção de ADN é seguida pela análise de fusão e de produtos de amplificação de PCR. As temperaturas para a fusão do fragmento amplificado dependerá do tamanho e conteúdo GC, mas geralmente iniciar e as temperaturas finais de 50 ˚ C e 95 ˚ C são adequados (Figuras 2A e 2B). Uma vez que a fusão é realizada, a análise das curvas de fusão de fluorescência requer tipicamente normalização da variação das diferentes curvas de amostra, através de pré-e pós-regiões de fusão como padrões (Figura 2C). Isto melhora a comparação dos resultados de diferentes amostras, em que a variação de fluorescência é relativa a variações experimentais menores. Cada par de linhas de temperatura para a normalização deve ser colocado aproximadamente 1 ˚ C distante (Figura 2C, pontas de seta).; Agrupamento de resultados de dados está representada de dois modos diferentes: um gráfico superior que mostra os perfis da curva de fusão, e um gráfico de baixo que mostra uma parcela diferença subtractivo, em comparação com uma amostra de referência (Figura 2D).
HRMA análise pode ser utilizado para detectar mutações (Figuras 3A e 3B), ou os transgenes (Figura 3C). Na Figura 3A, dois diferentes mutações no gene eif2b5 são mostrados (curvas vermelhas e azuis na Figura 3A), subtraindo os dados de fluorescência normalizados da amostra de tipo selvagem. Não importa qual o genótipo é escolhido para referência. Diferenças mais sutis ou confusas em melt-curvas podem ser distinguidos utilizando a diferença enredo subtrativo. Na Figura 3B, por exemplo, de quatro genótipos diferentes de um único conjunto de embriões é mostrada.
Figura 1. Descrição do protocolo para HRMA baseada em PCR de ADN genómico do peixe-zebra. Extracção de ADN a partir de tecido inteiro (fin-grampo ou embrião) é seguido por amplificação por PCR na presença de um corante de ligação a ADN de cadeia dupla fluorescente. O fragmento amplificado por PCR é desnaturado e o sinal de fluorescência é registada, seguido por análise de curva de fusão, para detectar o fragmento amplificado e / ou para diferenciar genótipos.
Figura 2. Screen-shots de software para executar HRMA e analisar os resultados. Uma. Captura de tela do software LightScanner;. Caixa amarela é ampliada em "B" B. Visualização ampliada da região encaixotado em "A". Definir início e fim Temp são mostrados (setas). C. Posicione o premelt e linhas paralelas de pós-fusão para a normalização (setas). Observe a variação de fluorescência em pré-e pós-regiões de fusão (caixa vermelha). Menor gráfico (caixa verde) mostra fusão curvas derivadas das parcelas de dados brutos seguinte normalização. D. Mostra o gráfico superior derreter perfis curva após agrupamento automático; diferentes genótipos são ilustradas em cores diferentes (caixa vermelha). Menor gráfico (caixa verde) mostra a curva de diferença de fluorescência. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 3. Usando HR. MA para a identificação de mutações e transgenes curvas de diferença de fluorescência são apresentados; alteração da fluorescência (eixo-y) à temperatura (eixo dos x) é mostrado um.. HRMA foi utilizado para detectar peixes que transportam mutações no gene eif2b5. Tipo selvagem é mostrado em cinza (seta). As cores vermelhas e azuis representam duas mutações eif2b5 diferentes, confirmados por seqüenciamento do produto de PCR. B. Quatro alelos mutantes FOXP2 diferentes são identificados com HRMA. Vermelho: zc82 / + (8 bp supressão), verde: zc83 / + (17 bp supressão), azul: zc82/zc83 (8BP deletion/17bp supressão), cinza:. Zc83/zc83 (homozigotos 17BP supressão) C. Peixes transgénicos Gal4 (curvas de cinzentos) pode ser distinguido do tipo selvagem (curva castanho, seta). Observe que para a detecção do transgene, a normalização não deve ser realizada. Clique aqui para ver imagem ampliada.
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Discussion
PCR combinada com HRMA é uma tecnologia poderosa para a genotipagem do peixe-zebra. As vantagens desta abordagem são a sua velocidade, robustez, e a sensibilidade para detectar mesmo mutações pontuais. O protocolo de todo, a partir de aleta-grampo análise para derreter-curva, pode ser realizada em menos de oito horas, por um único indivíduo. Além disso, a técnica é tratável através de rastreio de alto rendimento; não requer a utilização de brometo de etídio, e é selada por todas as etapas de PCR e de análise, que ajuda a minimizar os problemas de contaminação.
Um passo crítico para esta técnica é amplicon de PCR e design primer. Comprimento típico para produtos de PCR em HRMA é 50-200 pb. Amplicons curtos aumentam a sensibilidade e são ideais para detectar mudanças de nucleotídeo único. Se curvas de fusão de produtos de espécies estreitamente relacionadas de PCR não pode ser facilmente distinguida, de um pequeno oligonucleótido complementar ao SNP e bloqueados na extremidade 3 'pode ser incluída na reacção de PCR (Lunaprobes; sondas). As sondas são gerados por PCR assimétrica usando diferentes concentrações do iniciadores directos e inversos, com um 3 "C3 bloqueador para evitar a extensão da sonda na subsequente HRMA PCR. A sonda é então incluída na reacção HRMA PCR. HRMA então ocorre com a sonda, em que a sonda se liga assimétrica para o produto de PCR e gera duplexes de sonda-alvo com diferentes curvas de fusão-que podem ser utilizados para distinguir os alelos.
Várias empresas oferecem sistemas de análise de fusão de curva. Estes incluem o Biofire Lightscanner, a Roche LightcyclerVR 480 ea Qiagen Rotor-Gene Q. Diversas, corantes de ligação a DNA fluorescentes estão disponíveis, incluindo LC Green Plus e SYT09 EvaGreen. Existe alguma variação na sensibilidade na detecção de mutações com base em diferentes corantes fluorescentes e máquinas de derreter-curva 8,15. Nonsaturating corantes, por exemplo, SYBR Green I, não são adequados para a maioria das aplicações HRMA: em altas concentrações, SYBR Green I inibidorests a atividade da DNA polimerase, e em concentrações mais baixas, SYBR Green I não pode medir com precisão o comportamento de fusão, devido à sua redistribuição de regiões derretido volta a regiões do dsDNA 16. Em geral plataformas Real Time PCR mais existentes são capazes de pré-formação HRMA usando um pacote de software add-on e um corante fluorescente ligação ao DNA de segunda geração. Embora os detalhes técnicos do software e seqüência de passos experimentais variar ligeiramente entre as plataformas, os conceitos científicos em geral são essencialmente idênticas.
O nosso laboratório e outros demonstraram que HRMA pode ser utilizado tanto em peixes-zebra embrionários e adultos para detectar transgenes, e mutações induzidas por ZFNs e TALENS 6,12,13. HRMA foi usado para descobrir polimorfismos em peixes-zebra 6,12. Nosso laboratório utiliza HRMA tanto para triagem inicial de mutações induzidas TALEN, bem como para a classificação de linhas estabelecidas (tsq e JLB, não publicado). Outros Applicat potencialíons que poderiam ser aplicadas ao peixe-zebra incluem sensíveis à metilação HRMA (ms-HRMA) 17, a quantificação do cópia-número variantes 5 e detecção de patógenos em viveiros 18.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a membros das Blaschke, Grunwald, e Wittwer laboratórios para aconselhamento e assistência técnica. Este trabalho é apoiado pela Fundação PCMC, NIH R01 MH092256 e DP2 MH100008, ea Marcha de Dimes Foundation bolsa de investigação # 1-FY13-425, a JLB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com |
| Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9665 | www.bio-rad.com |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | www.bio-rad.com |
| 96-well LightScanner Instrument | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com |
| LightScanner Software with Call-IT 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| High-resolution Melting Analysis 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| LightScanner Primer Design Software | BioFire | www.biofiredx.com | |
| Vector NTI Software | Invitrogen | www.invitrogen.com | |
| Tricaine | |||
| Paraformaldehyde |
References
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