Summary
PCR结合高分辨率的熔融分析（HRMA）被证明是一种快速，有效的方法，以斑马鱼的基因型。
Abstract
斑马鱼是研究开发，造型疾病，并进行药物筛选功能强大的脊椎动物模型系统。最近的各种遗传工具的相继出台，其中包括诱导突变并产生转基因株系多种策略。然而，大规模的筛选是通过传统的基因分型方法，这是耗时耗力的限制。在这里，我们描述的技术来分析斑马鱼的基因型PCR结合高分辨率熔解分析（HRMA）。这种方法快速，灵敏，而且价格便宜，具有污染器物风险较低。基因分型的PCR与HRMA可以用于胚胎或成年鱼，包括高通量筛选的协议。
Introduction
斑马鱼（ 斑马鱼 ）是脊椎动物模型系统广泛用于开发和疾病模型的研究。最近，众多的转基因和基因突变技术已经开发了斑马鱼。快速的转基因技术，通常根据一个TOL2座子系统1中，已合并为多个DNA片段组件2改进的克隆选择。锌指核酸酶（ZFN）和转录活化因子样效应物核酸酶（TALENS）已被用于靶向基因座在两个体细胞和生殖系细胞，斑马鱼3,4。这些技术可以有效地产生转基因动物，具有高频突变的创建和种系传递3,4。
尽管取得了这些进展，在传统的斑马鱼基因分型技术限制的诱变和转基因工具的全部功能。 PCR然后进行凝胶电泳，有时结合不受限制。Ñ酶消化，被广泛用于检测基因组的修饰，但很费时，并确定小插入或缺失不敏感。 TaqMan探针检测具有较高的初始成本，需要仔细优化。 PCR产物的测序可能需要几天时间，并且是不实用的大规模筛选。限制性片段长度多态性（RFLP）分析，只能判别影响的限制性内切酶识别位点的一个有限的范围内的SNP。
高分辨率熔解分析（HRMA），封闭管后的PCR分析方法，是一种最近开发的方法，该方法快速，灵敏，价格低廉，适合于筛选大量样品。 HRMA可用于检测单核苷酸多态性，突变，和转基因5-7。 HRMA是基于双链DNA热变性，并且每个PCR扩增子具有唯一的解离（熔体）特性5。样品可以分辨由于吨ø其不同的核苷酸组成，GC含量，或长度，通常在用荧光染料的组合，只有结合双链DNA 8。因此，HRMA可以基于不同的熔融曲线的特征区分不同基因型。因为HRMA使用廉价的试剂和是一个单步PCR后的过程中，它可用于高通量的策略。 HRMA是破坏性的，所以下面的分析将PCR扩增子可以用于其他应用。 HRMA已在许多生物和系统，包括细胞系，小鼠和人类9-11中得到应用。它的使用最近在斑马鱼被描述检测由锌指核酸酶（ZFN）和塔伦斯6,12,13突变。
在本文中，我们将描述如何在胚胎和成年斑马鱼进行基于PCR的HRMA（ 图1）。这个协议是适合于检测单核苷酸多态性，转基因，和基因突变，包括SIngle碱基对的改变，插入或缺失。
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Protocol
1。 DNA的制备
- 制备的DNA的裂解缓冲液：50mM的KCl，10mM的Tris-盐酸的pH 8.3，0.3％吐温20，0.3％NP40。加入新鲜的蛋白酶K至对使用12的天1毫克/毫升的最终浓度。
- 组织收集：
- 对于成年鱼翅夹：
- 麻醉鱼：将鱼在0.004％的MS-222（三卡因）解决方案。等到鳃运动减慢。
- 把鱼放在一摞5-10的Kimwipes切一小片尾翼，约2-3毫米，用无菌刀片的。
- 迅速将鱼与淡水回收标记罐;仔细标注两个油箱和相应的管道将包含翅夹。换水及隔日喂鱼。
- 拿起翅片夹，用无菌移液管尖端，并将其转移到充满100μl的DNA的裂解缓冲液的管中。
- 丢弃枪头，并丢弃刀片成锐器容器。
- 胚胎长尾夹：
- 把胚胎成0.004％的MS-222（三卡因）溶液。等待2分钟。
- 切下一块尾部用解剖显微镜下用镊子。
- 把尾巴放入盛有30微升的DNA裂解液标记管。
- 赶紧把胚胎成含100微升4％多聚甲醛管。
- 标签管与胚胎和相应的尾管中。
- 存储与胚胎试管在4℃过夜固定。
- 使用，以减少污染的每个胚胎之间的Milli-Q水和清洁的Kimwipes的钳子。
- 对于整个胚胎：
- 把胚胎成0.004％的MS-222（三卡因）溶液。等待2分钟。
- 放1-5胚胎在充满100微升DNA的裂解缓冲液的管中。 Dechorionation是没有必要的。
- 对于成年鱼翅夹：
- DNA酶切
孵育组织（鳍或尾巴夹或胚胎）试管在55℃下4小时到过夜12。 - 灭活蛋白酶K
热管至95℃15分钟12。 DNA应立即用于PCR，或储存在-20℃下长达3个月。
2。 PCR
- 手动或通过引物设计软件（ 如 Lightscanner引物设计软件-Biofire）设计引物。 PCR产物为HRMA通常50-200个基点; PCR产物进行SNP检测应该是较小的，通常50-80个基点。
- PCR
- 进行PCR反应在96孔或384孔板。
- 使用10μl的总体积：4微升LightScanner母液（0.1ü热启动Taq-AB聚合酶，缓冲液，0.2mM的dNTPs浓度，2mM的氯化镁，和1x荧光双链DNA结合染料）; 5pmol的各引物，从成年尾鳍或胚胎尾部13 3微升基因组DNA提取1微升基因组DNA模板。
- 盖样品与30μl的矿物油。 用光学透明粘合剂密封覆盖板。
- 优化的PCR循环条件，典型的条件是95℃5分钟，10秒30个循环的95℃，25秒，60℃，30秒，72℃，结束与95℃30秒，并冷却至15℃。
- 商店PCR板在4℃或直接继续HRMA。
- 通过在PCR过程中的初始优化利用琼脂糖凝胶电泳的大小的分析证实了我们的PCR产物，以及如果所述，通过PCR产物的测序。
3。 HRMA
- 热板
- 放置板在熔融分析系统。
- 打开软件（LightScanner软件呼叫的IT 2.0）。
- 从60-95℃，热板
- 创建一个新的数据存储文件。
- 分析HRMA数据（ 图2）。
分析的多个步骤是可能的。我们显示最常用的一组数据米anipulations。- 子集设置
单击子集标签。选择井样品。 - 正常化
- 在左边的面板中选择标准化选项卡。消除荧光方差，手动定位平行双线路的预（初始）和后（最终）熔融区域如图所示（ 图2C，箭头）和归一化所有样品的预熔融后和熔融的荧光信号，以1和0 ，分别为14。
- 调整线的定位，以使熔化区是在该区域的前，后熔线之间，但没有被选中。在一般情况下，下民，下最大（和上最小和上最大）温度线应放置约1°C分开。
- 选择温度职位正常化，使得所有样品具有最大或满（100％）的荧光的预熔区和最小或无（0％）荧光为后熔融区域（尽量将POSsible）。正常化应该导致近水平线以1延伸，直到熔点，然后近水平线从在0的最小荧光熔融点的最大荧光;不应该有荧光水平高于1或0以下。例如，在图2C中 ，用79-80℃，温度范围内归一化的预熔化曲线
- 分组/集群
区分基于其熔化温度（ 图2C，绿框）的基因型。选择分组 。- 从下分组部分中的标准选择列表中选择Autogroup。
- 选择正常或高的单转换或多个过渡分别从灵敏度选择列表下的分组部分熔解图谱。
- 选择计算根据分组节组。
- 转到文件菜单，然后单击保存以保存结果。
- 子集设置
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Representative Results
可以在一天内进行，或在步骤分离出的协议数天（工作的流程图示于图1）。 DNA提取之后，通过PCR扩增子的熔化和分析。的温度为扩增子的熔化取决于大小和GC含量，但一般就50˚C和95˚C端的温度是适当的（ 图2A和2B）。一旦熔体被执行时，荧光熔融曲线的分析通常需要不同的样本曲线的变化的归一化，使用前和后的熔融区域作为标准（ 图2C）。这提高了来自不同样品的结果，其中荧光的变化与次要试验变化的比较。每对温线正常化应放置约1˚C分开（ 图2C，箭头）。;分组的数据的结果被表示在两种不同的方式：上部曲线图，表示熔融曲线的档案和下部曲线图，表示在比较的参比样品（ 图2D）减色差曲线图。
HRMA分析可以用来检测突变（ 图3A和3B）或转基因（ 图3C）。在图3A中，在EIF2B5基因两个不同的突变是通过减去野生型样品的归一化的荧光数据所示（ 图3A中的红色和蓝色曲线）。不要紧其中基因型被选择以供参考。在熔融曲线更细微的或混乱的差异可以通过使用减色差值曲线进行区分。在图3B中，示出了四种不同的基因型在单个收集胚胎的一个例子。
图1。协议的斑马鱼基因组DNA的PCR为基础的HRMA的轮廓。从整个组织（翅片段或胚胎）的DNA提取之后，通过PCR扩增的荧光双链DNA结合染料的存在。将PCR扩增子是变性和荧光信号被记录，随后通过熔融曲线分析，以检测扩增子和/或分化的基因型。
图2：屏幕截图软件来执行HRMA和分析结果，一个 。截屏LightScanner软件;。黄框被放大的“B”B。放大检视盒装地区的“A”。设置开始和结束温度显示（箭头）。Ç。定位预熔融和正常化后熔体的平行线（箭头）。请注意，在预处理和后熔化区域（红色框）的荧光变化。下图（绿框）显示了从原始数据曲线以下正常化。ð派生熔融曲线。上图显示自动分组后熔解曲线轮廓;不同基因型说明了不同的颜色（红色框）。下图（绿框）显示荧光差异曲线 。 点击这里查看大图。
图3。使用HR马以确定突变和转基因荧光差异曲线显示，改变荧光（y轴）对温度（x轴）被出示一张。 HRMA被用于检测鱼携带突变的EIF2B5基因。野生型中示出的灰色（箭头）。红色和蓝色的颜色代表两个不同的EIF2B5的突变，通过PCR产物。 乙测序证实。四种不同的FOXP2突变等位基因均标记有HRMA。红色：zc82 / +（8 bp缺失），绿色环保：zc83 / +（17 bp缺失），蓝色：zc82/zc83（8BP deletion/17bp删除），灰色：zc83/zc83（17bp缺失纯合子）：C。 GAL4转基因鱼（灰色曲线）可以从野生型（褐色曲线，箭头）区别开来。请注意，对于转基因检测，归一化不应该被执行。 点击这里查看大图。
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Discussion
PCR结合HRMA是一种功能强大的技术，斑马鱼基因分型。这种方法的优点是它的速度，鲁棒性，以及灵敏度来检测偶数的点突变。整个协议，从翅片夹熔化曲线分析，可在少于八小时由个人执行的。此外，该技术是适合于高通量筛选;不需要使用溴化乙锭;和密封所有PCR和分析步骤，这有助于减少污染的问题。
这种技术的一个关键步骤是PCR扩增子和引物设计。典型的长度为PCR产物在HRMA是50-200 bp之间。短扩增子提高灵敏度，非常适合检测单核苷酸的变化。如果紧密相关的PCR产物物种熔融曲线不能容易地区别，一个小的寡核苷酸互补的SNP和阻止在3'端可以包括在该PCR反应（Lunaprobes;探针S）。通过不对称PCR，使用不同浓度的正向的生成和反向引物，用3'C3阻断剂以防止在随后的HRMA PCR探针延伸的探针。然后将探针包括在HRMA PCR反应。 HRMA然后发生与探针，其中，所述非对称探针结合的PCR产物，并生成探针 - 靶双链体具有不同的熔融曲线可以用于区分等位基因。
有几家公司提供熔点曲线分析系统。这些措施包括Biofire Lightscanner，罗氏LightcyclerVR 480和Qiagen公司Rotor-Gene的问几个荧光，DNA结合染料可供选择，包括LC绿色PLUS和SYT09 EvaGreen。有一些变化灵敏度在突变检测的基础上不同的荧光染料和熔融曲线机8,15。 Nonsaturating染料，例如SYBR绿I，不适合于大多数HRMA的应用：在高浓度时，SYBR Green I的抑制剂TS DNA聚合酶的活性，以及在较低的浓度下，SYBR Green I的不能精确地测量熔化行为由于其重新分配从熔化区回双链DNA 16的区域。一般来说大多数现有的实时定量PCR平台上都能够使用软件包加载项和第二代荧光DNA结合染料预成型HRMA的。虽然实验步骤的软件和序列的技术细节略有不同平台之间，整体的科学概念基本上是相同的。
我们的实验室和其他人已经证明，HRMA可以在胚胎和成年斑马鱼可用于检测转基因，和基因突变引起的ZFN和TALENS 6,12,13。 HRMA已经被用于发现在斑马鱼6,12多态性。我们的实验室使用HRMA既为TALEN诱发突变初步筛选以及对既定线路（TSQ和健力宝，未发表）排序。其他潜在APPLICAT这可以应用到斑马鱼的离子包括甲基化敏感HRMA（MS-HRMA）17的拷贝数的定量变异体5;和病原体检测中vivariums 18。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢布拉施克，格伦沃尔德和WITTWER实验室的咨询和技术援助的成员。这项工作是由PCMC基金会，美国国立卫生研究院R01 MH092256和DP2 MH100008和优生优育基金会的研究经费＃1-FY13-425的3月，为广东健力宝的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com |
| Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9665 | www.bio-rad.com |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | www.bio-rad.com |
| 96-well LightScanner Instrument | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com |
| LightScanner Software with Call-IT 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| High-resolution Melting Analysis 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | |
| LightScanner Primer Design Software | BioFire | www.biofiredx.com | |
| Vector NTI Software | Invitrogen | www.invitrogen.com | |
| Tricaine | |||
| Paraformaldehyde |
References
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