ويتجلى PCR جنبا إلى جنب مع تحليل ذوبان عالية الدقة (HRMA) كوسيلة سريعة وفعالة إلى التركيب الوراثي الزرد.
الزرد هو نظام نموذجي الفقاريات قوية لدراسة التنمية، والنمذجة المرض، وإجراء فحص المخدرات. وقد تم مؤخرا عرض مجموعة متنوعة من الأدوات الجينية، بما في ذلك استراتيجيات متعددة لإحداث طفرات وتوليد خطوط المعدلة وراثيا. ومع ذلك، وفحص واسعة النطاق محدودة بسبب أساليب التنميط الجيني التقليدية، والتي هي مضيعة للوقت وكثيفة العمالة. نحن هنا وصف تقنية لتحليل الأنماط الجينية الزرد بواسطة PCR جنبا إلى جنب مع تحليل عالية الدقة ذوبان (HRMA). هذا النهج هو سريعة وحساسة، وغير مكلفة، مع خطر أقل من التحف التلوث. التنميط الجيني بواسطة PCR مع HRMA يمكن استخدامها لأجنة الأسماك أو الكبار، بما في ذلك بروتوكولات الفرز الفائق الإنتاجية.
الزرد (دانيو rerio) هو نظام نموذجي الفقارية المستخدمة على نطاق واسع لدراسات التنمية والنمذجة المرض. مؤخرا، تم تطوير العديد من التقنيات المعدلة وراثيا وتحور لالزرد. تقنيات نقل الجينات السريع، وعادة ما يعتمد على نظام ينقول Tol2 1، وقد تم جنبا إلى جنب مع تحسين خيارات متعددة لاستنساخ الحمض النووي التجمع جزء 2. وقد استخدمت nucleases الزنك الاصبع (ZFNs) والنسخ مثل المنشط nucleases المستجيب (TALENs) لاستهداف مواضع في كل من الخلايا الجسمية وسلالة الجرثومية في الزرد 3،4. ويمكن لهذه التقنيات بكفاءة توليد الحيوانات المعدلة وراثيا، مع خلق طفرة عالية التردد، ونقل خط الجرثومية 3،4.
على الرغم من هذه التطورات، وتقنيات التنميط التقليدي في الزرد لحد من القوة الكاملة للالطفرات ونقل الجينات الأدوات. يتبع PCR بواسطة الكهربائي للهلام، جنبا إلى جنب في بعض الأحيان مع restrictioن انزيم الهضم، ويستخدم على نطاق واسع للكشف عن تعديل الجينوم، ولكن هو مضيعة للوقت وأقل حساسية لتحديد الإدراج أو الحذف صغيرة. المقايسات TaqMan التحقيق ديك التكاليف الأولية عالية وتتطلب حذرا الأمثل. تسلسل المنتجات PCR يمكن أن يستغرق عدة أيام وليس عملية لفحص واسعة النطاق. تقييد جزء طول تعدد الأشكال (RFLP) التحليل يمكن أن تميز فقط تعدد الأشكال التي تؤثر على مجموعة محدودة من المواقع الاعتراف انزيم التقييد.
تحليل عالية الدقة ذوبان (HRMA)، مغلقة أنبوب آخر-PCR تحليل الأسلوب، هو طريقة تم تطويرها مؤخرا أن يكون سريعا وحساسة، وغير مكلفة، وقابلة للفحص عدد كبير من العينات. HRMA يمكن استخدامها للكشف عن تعدد الأشكال، والطفرات، والجينات المحورة 5-7. ويستند HRMA على تمسخ الحرارية للسلطات الوطنية المعينة المزدوج تقطعت بهم السبل، ولكل AMPLICON PCR لديه تفارق فريد (تذوب) مميزة 5. عينات يمكن تمييز بسبب رس بهم تكوين مختلف النوكليوتيدات، والمحتوى GC، أو طول، وعادة في تركيبة مع صبغة الفلورسنت التي تربط فقط المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي 8. وبالتالي، يمكن التمييز بين الأنماط الجينية HRMA المختلفة استنادا إلى خصائص مختلفة تذوب منحنى. لأن HRMA يستخدم الكواشف منخفضة التكلفة ويبعد خطوة واحدة بعد PCR العملية، فإنه يمكن استخدامها لاستراتيجيات عالية الإنتاجية. HRMA هو غير تدميري، لذلك بعد تحليل يمكن استخدام amplicons PCR لتطبيقات أخرى. وقد تم تطبيق HRMA في العديد من الكائنات الحية والنظم، بما في ذلك خطوط الخلايا والفئران والبشر 9-11. وقد تم مؤخرا وصفت استخدامه في الزرد للكشف عن الطفرات المستحثة بواسطة nucleases إصبع الزنك (ZFNs) وTALENs 6،12،13.
في هذه الورقة، ونحن تصف كيفية تنفيذ HRMA PCR القائم في الزرد الجنينية والكبار (الشكل 1). هذا البروتوكول هو مناسبة للكشف عن تعدد الأشكال، الجينات المحورة، والطفرات، بما في ذلك الاشتراكيةngle التغييرات قاعدة الزوج، والإدراج، أو حذف.
PCR جنبا إلى جنب مع HRMA هي تقنية قوية لالتنميط الجيني الزرد. مزايا هذا النهج هي سرعته، متانة، وحساسية للكشف عن الطفرات حتى النقطة. بروتوكول بأكمله، من زعنفة كليب التحليل لتذوب منحنى، لا يمكن أن يؤديها في أقل من ثماني ساعات من قبل فرد واحد. بالإضافة إلى ذلك، والتقنية هي ق?…
The authors have nothing to disclose.
نشكر أعضاء Blaschke، جرونوالد، وتوير مختبرات للحصول على المشورة والمساعدة التقنية. ويدعم هذا العمل من قبل مؤسسة PCMC، المعاهد الوطنية للصحة R01 MH092256 وDP2 MH100008، ومارس من الدايمات مؤسسة منحة بحثية # 1-FY13-425، لJLB.
100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com | Store at -20 °C |
Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9665 | www.bio-rad.com | |
Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | www.bio-rad.com | |
96-Well LightScanner Instrument | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com | |
LightScanner Software with Call-IT 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | ||
High-Resolution Melting Analysis 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | ||
LightScanner Primer Design Software | BioFire | www.biofiredx.com | ||
Vector NTI Software | Invitrogen | www.invitrogen.com | ||
Tricaine | ||||
Paraformaldehyde |