Yüksek çözünürlüklü Melt Analizi ile PCR kullanarak hızlı ve verimli Zebra Genotiplemesi
Summary
Yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRMA) ile bir araya PCR zebrafish genotip için hızlı ve etkili bir yöntem olarak gösterilmiştir.
Abstract
Zebra balığı, geliştirme eğitimi hastalık modelleme ve uyuşturucu taraması gerçekleştirmek için güçlü bir omurgalı model sistem. En son genetik araçlar çeşitli mutasyonlar neden olan ve transgenik çizgiler üretmek için çeşitli stratejiler de dahil olmak üzere, getirilmiştir. Bununla birlikte, büyük ölçekli tarama zaman alıcı ve emek yoğun olan geleneksel genotipleme yöntemleri ile sınırlıdır. Burada yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRMA) ile birlikte PCR ile Zebrafish genotipleri analiz etmek için bir tekniği açıklar. Bu yaklaşım, kirlenme eserler düşük riski, hızlı, hassas ve ucuzdur. HRMA ile PCR ile genotipleme yüksek verimli tarama protokolleri de dahil olmak üzere, embriyo veya yetişkin balıklar için kullanılabilir.
Introduction
Zebrafish (Br.rerio) yaygın gelişimi ve hastalığın modelleme çalışmaları için kullanılan bir omurgalı bir model sistem. Son zamanlarda çok sayıda transgenik ve mutasyon zebrabalıkları teknolojileri geliştirilmiştir. Genellikle Tol2 transpozon sistemi 1 göre hızlı transgenesis teknikleri, birden fazla DNA fragmanı düzeneği 2 için gelişmiş klonlama seçenekleri ile kombine edilmiştir. Çinko-Parmak nükleazlar (ZFNs) ve transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazlar (TALENS) zebra balığı 3,4 hem somatik hem de germlin hücrelerinde mahalleri hedeflemek üzere kullanılmıştır. Bu teknikler, etkili bir şekilde yüksek frekanslı mutasyon oluşturulması ve germ-hattı iletim 3,4 olan, genetik olarak modifiye edilmiş hayvanlar oluşturabilir.
Bu ilerlemelere rağmen, zebrabalıkları geleneksel genotip teknikleri mütajeni ve Transgenesis araçlarının tam gücünü sınırlamak. PCR bazen KISITLAMAL ile birlikte, jel elektroforezi, ardındann enzim sindirimi, yaygın genom değişiklik tespit etmek için kullanılır, ancak zaman alıcı ve küçük eklemeleri veya silmeleri tanımlamak için daha az hassas olmasıdır. TaqMan probu tahliller yüksek başlangıç maliyetleri ve dikkatli optimizasyon gerektirir. PCR ürünlerinin dizileme birkaç gün sürebilir ve büyük ölçekli tarama için pratik değildir yapabilirsiniz. RFLP (RFLP) analizi sadece kısıtlama enzimi tanıma siteleri, sınırlı etkileyen SNP ayırt edebilir.
Yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRMA), kapalı-tüp post-PCR analiz yöntemi, hızlı, hassas, ucuz ve örneklerin çok sayıda tarama için müsait bir yeni geliştirilen bir yöntemdir. HRMA SNP, mutasyonlar ve transgenlerin 5-7 tespit etmek için kullanılabilir. HRMA çift sarmallı DNA 'ların termik denatürasyona göre ve her bir PCR amplikonu karakteristik benzersiz bir ayrışma (erime) 5 vardır. Numuneler nedeniyle t ayrımcılık olabiliro Farklı nükleotid bileşim olup, GC içeriği veya uzunluğu, tipik olarak, bir floresan boya ile kombinasyon halinde, sadece çift sarmallı DNA 8 bağlar. Böylece, HRMA farklı erime eğrisi özelliklerine göre farklı genotipleri ayırt edebilir. HRMA düşük maliyetli reaktifler kullanır ve bir tek aşamalı post-PCR işlemi olduğu için, yüksek verimli stratejileri için kullanılabilir. HRMA böylece analiz aşağıdaki PCR amplikonları diğer uygulamalar için de kullanılabilir, yıkıcı olmayan bir. HRMA hücre çizgileri, fare ve insan da dahil olmak üzere pek çok, 9-11 organizmalar ve sistemleri, uygulanmıştır. Kullanımı son çinko parmak nükleazlara (ZFNs) ve TALENS 6,12,13 neden mutasyonları tespit etmek için zebrabalıkları tarif edilmiştir.
Bu yazıda, (Şekil 1), embriyonik ve yetişkin zebrabalıkları PCR tabanlı HRMA gerçekleştirmek için nasıl açıklar. Bu protokol si de dahil olmak üzere, SNP, transgenlerin ve mutasyonları tespit etmek için uygundurngle temel-çift değişiklikler, eklemeler veya silmeler.
Protocol
Representative Results
Discussion
HRMA ile birlikte PCR Zebra balığı genotiplendirebilmek güçlü bir teknolojidir. Bu yaklaşımın avantajı, hız, sağlamlık, ve hatta nokta mutasyonları tespit etmek için hassasiyet vardır. Tüm protokol, fin-klip için eritilerek eğri analizi, tek bir kişi tarafından daha az sekiz saat içinde gerçekleştirilebilir. Buna ek olarak, teknik, yüksek miktarda madde taraması için müsait olan, etidyum bromid kullanımını gerektirmeyen ve kirlenme sorunları en aza indirir ve her PCR analizi adımları i?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz tavsiye ve teknik yardım için Blaschke, Grunwald ve Wittwer laboratuarları üyelerine teşekkür ederim. Bu çalışma JLB için PCMC Vakfı, NIH R01 MH092256 ve DP2'deki MH100008 ve Dimes Vakfı araştırma bursu # 1-FY13-425, Mart, tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 100 Reaction LightScanner Master Mix | BioFire | HRLS-ASY-0002 | www.biofiredx.com | Store at -20 °C |
| Hard-Shell PCR 96-well BLK/WHT Plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9665 | www.bio-rad.com | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | www.bio-rad.com | |
| 96-Well LightScanner Instrument | BioFire | LSCN-ASY-0040 | www.biofiredx.com | |
| LightScanner Software with Call-IT 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| High-Resolution Melting Analysis 2.0 | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| LightScanner Primer Design Software | BioFire | www.biofiredx.com | ||
| Vector NTI Software | Invitrogen | www.invitrogen.com | ||
| Tricaine | ||||
| Paraformaldehyde |
References
- Kawakami, K., Takeda, H., Kawakami, N., Kobayashi, M., Matsuda, N., Mishina, M. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev. Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Sander, J. D., Cade, L., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
- Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat. Biotechnol. 29 (8), 699-700 (2011).
- Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence variant screening. Hum. Mutation. 30 (6), 860-866 (2009).
- Dahlem, T. J., Hoshijima, K., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8 (8), (2012).
- Liew, M., Pryor, R., et al. Genotyping of single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons. Clin. Chem. 50 (7), 1156-1164 (2004).
- Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Bromley, L. K., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping: cross-platform comparison of instruments and dyes. Clin. Chem. 52 (3), 494-503 (2006).
- Carrillo, J., Martínez, P., et al. High resolution melting analysis for the identification of novel mutations in DKC1 and TERT genes in patients with dyskeratosis congenita. Blood Cell. Mol. Dis.. 49 (3-4), 140-146 (2012).
- Thomsen, N., Ali, R. G., Ahmed, J. N., Arkell, R. M. High resolution melt analysis (HRMA); a viable alternative to agarose gel electrophoresis for mouse genotyping. PloS one. 7 (9), (2012).
- Vorkas, P. A., Poumpouridou, N., Agelaki, S., Kroupis, C., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. PIK3CA hotspot mutation scanning by a novel and highly sensitive high-resolution small amplicon melting analysis method. J. Mol. Diagn. 12 (5), 697-704 (2010).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Dev. Dyn. 238 (12), 3168-3174 (2009).
- Xing, L., Hoshijima, K., et al. Zebrafish foxP2 zinc finger nuclease mutant has normal axon pathfinding. PloS one. 7 (8), (2012).
- Raghavendra, A., Siji, A., Sridhar, T. S., Phadke, K., Vasudevan, A. Evaluation of High Resolution Melting analysis as an alternate tool to screen for risk alleles associated with small kidneys in Indian newborns. BMC Nephrol. 12 (1), 60 (2011).
- Herrmann, M. G., Durtschi, J. D., Wittwer, C. T., Voelkerding, K. V Expanded instrument comparison of amplicon DNA melting analysis for mutation scanning and genotyping. Clin. Chem. 53 (8), 1544-1548 (2007).
- Wittwer, C. T. High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen. Clin. Chem. 49 (6), 853-860 (2003).
- Dimitrakopoulos, L., Vorkas, P. A., Georgoulias, V., Lianidou, E. S. A closed-tube methylation-sensitive high resolution melting assay (MS-HRMA) for the semi-quantitative determination of CST6 promoter methylation in clinical samples. BMC Cancer. 12, 486-48 (2012).
- Jeng, K., Gaydos, C. A., et al. Comparative analysis of two broad-range PCR assays for pathogen detection in positive-blood-culture bottles: PCR-high-resolution melting analysis versus PCR-mass spectrometry. J. Clin. Microbiol. 50 (10), 3287-3292 (2012).
