Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Voorbereiding van Segmented Microtubules om Motions Gedreven door het demonteren uiteinden van microtubuli Studie

Published: March 15, 2014 doi: 10.3791/51150
Automatic Translation
1,2, 3, 3
1Center for Theoretical Problems of Physicochemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences, 2Federal Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Moscow, Russia, 3Physiology Department, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

Summary

Microtubules zijn inherent instabiel polymeren en hun schakelen tussen groei en bakvet stochastische en moeilijk te controleren. Hier beschrijven we protocollen gebruiken gesegmenteerde microtubuli met photoablatable stabiliserende caps. Depolymerisatie van gesegmenteerde microtubuli kan worden geactiveerd met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie, waardoor het bijstaan ​​van de analyse van bewegingen met de demontage uiteinden van microtubuli.

Abstract

Depolymerisatie van microtubuli kan werking bieden aan verschillende eiwitcomplexen en met eiwit beklede korrels transporteren in vitro. De onderliggende mechanismen worden verondersteld om een ​​belangrijke rol spelen in het microtubuli-afhankelijke chromosoom bewegingen tijdens de celdeling, maar de betrokken eiwitten en hun exacte rollen zijn slecht gedefinieerd. Er is dus een groeiende behoefte aan assays waarmee dergelijke motiliteit in vitro bestuderen met gezuiverde componenten en gedefinieerde biochemische milieu te ontwikkelen. Microtubules zijn echter inherent instabiel polymeren, alsmede schakelen tussen groei en bakvet stochastische en moeilijk te controleren. De protocollen beschrijven we hier gebruik maken van de gesegmenteerde microtubuli die zijn gemaakt met de photoablatable stabiliserende caps. Depolymerisatie van dergelijke gesegmenteerde microtubuli kan worden geactiveerd met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie, waardoor het bijstaan ​​van studies van de beweeglijkheid bij de demontage uiteinden van microtubuli. Deze techniek kan worden gebruikt om caRRY een kwantitatieve analyse van het aantal moleculen in het fluorescentie-gemerkte eiwitcomplexen die processively met microtubulus uiteinden bewegen. Een signaal-ruisverhouding in deze en andere kwantitatieve fluorescentie assays optimaliseren, moet dekglaasjes worden behandeld om niet-specifieke absorptie van oplosbare fluorescent gelabelde eiwitten te verminderen. Gedetailleerde protocollen worden voorzien om rekening te houden met de ongelijkheid van fluorescentieverlichting, en bepalen de intensiteit van een enkele fluorofoor met equidistante Gaussische fit. Tenslotte beschrijven we het gebruik van gesegmenteerde microtubuli microtubuli-afhankelijke bewegingen van de met eiwit beklede microkorrels bestuderen, die inzicht in het vermogen van verschillende motorische en niet-motorische eiwitten te koppelen microtubule depolymerisatie te processive lading beweging.

Introduction

Microtubuli sterk geconserveerd cytoskelet structuren die belangrijk zijn voor de cellulaire architectuur, celbeweeglijkheid, celdeling, en intracellulair transport 1 zijn. Deze dynamische polymeren samenstellen uit tubuline in de aanwezigheid van GTP en schakelen ze spontaan tussen groei en verkorting 2. Microtubules zijn zeer dun (slechts 25 nm in diameter) derhalve speciale optische technieken om het contrast moet worden gebruikt om microtubuli waarnemen met een lichtmicroscoop. Eerdere werk met deze polymeren onderzocht hun dynamisch gedrag met behulp van differentieel interferentie contrast (DIC) 3. Deze en soortgelijke studies in vitro aangetoond dat onder normale experimentele omstandigheden, de microtubuli catastrofe en schakelaar om de depolymerisatie ondergaan slechts zelden, eens in de 5-15 min (deze frequentie is voor 7-15 mM oplosbaar tubuline concentratie bij 28-32 ° C onderzocht ) 4. Verschillende technieken zijn dus voorgesteld induce microtubule depolymerisatie op een gecontroleerde manier. Microtubuli verkorting kan worden geactiveerd door wegwassen oplosbare tubuline 5,6, snijden microtubuli met een laserbundel 7, of met gesegmenteerde microtubules 8, zoals hier beschreven. Contract met gesegmenteerde microtubules, evenals stochastisch schakelen polymeren, heeft gevonden dat kleine intracellulaire ladingen, zoals chromosomen, blaasjes en met eiwit beklede korrels, aan de uiteinden van de verkorting microtubuli 9-13 bewegen. Dit fenomeen wordt gedacht aan een rechtstreekse gevolgen voor chromosoom bewegingen in mitotische cellen hebben, en de onderliggende mechanismen worden momenteel actief onderzoek 14-16.

Onlangs hebben-tl-gebaseerde technieken, met inbegrip van de totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie, zijn gebruikt om de beweeglijkheid te studeren met dynamische microtubuli eindigt 17-24. Het voordeel van deze benadering is dat het onderzoek van interacties tussen microtubuli en microtubuli bindende eiwitten in real time via eiwitten gelabeld met verschillende fluoroforen. Verschillende eiwitcomplexen bleken processively bewegen verlengen en / of verkorten uiteinden van microtubuli. Zij omvatten het met microtubuli geassocieerde eiwitten Dam1 10,12,18, Ska1 19 en XMAP215 20, alsmede kinesine motor Kif18A 21,22, MCAK 23 en CENP-E 24. Deze eiwitten vertonen processive tip-tracking, die fundamenteel verschilt van die van de klassieke-tip bijhouden eiwitten zoals EB1 25. Hoewel EB1 moleculen en de geassocieerde partners lijken te blijven stabiel geassocieerd met dynamische uiteinden van microtubuli, de individuele moleculen blijven gebonden aan de microtubuli tip voor slechts ~ 0,8 sec, snel uit te wisselen met de oplosbare zwembad 26. In tegenstelling processieve tip-trackers, zoals Dam1, reizen met microtubuli eindigt voor veel micron, en hun associatie met microtubuli tips kan duren voor menige seconden. De tip vereniging tijd, en de resulterende snelheid tracking, hangt sterk af van het aantal moleculen die de tip bijhouden complex 27 gevormd. Groter eiwit ensembles zijn meestal veel betere tip-trackers. Zo kunnen dergelijke complexe samenstellingen de geïsoleerde gist kinetochores gekoppeld blijven microtubuli uiteinden voor 28 uur. Sommige microtubule-bindende eiwitten, bijv. Ndc80 kinetochore eiwitcomplex, bleken niet te volgen met microtubuli te eindigt bij een enkel molecuul, maar Ndc80 zeer efficiënt koppelen van de beweging van de kraal lading 19,29-31. Dus, om het mechanisme van tip-volgen door verschillende eiwitcomplexen, evenals hun biologische rollen begrijpen, is het belangrijk tip tracking onderzocht als functie van het aantal moleculen in de tip bijhouden complex, en bepalen het vermogen van deze complexen collectieve motiliteit vertonen op het oppervlak van de kraal lading.

(Figuur 1A). Eerst worden de handel verkrijgbare objectglaasjes gemodificeerd korte polyethyleen buis (Protocol 1) bevestigen. De herbruikbare microscopie stroom kamer wordt vervolgens geassembleerd uit zo'n glijbaan en het chemisch of plasma gereinigd en gesilaniseerd dekglaasje (protocol 2) 32-34. Het resulterende volume kamer is slechts 20-25 pi (of zo klein als 15 pl, zie opmerking 3 in Protocol nr. 1), met inbegrip van het volume van de inlaat slang. Commercieel verkrijgbare stroomkamers kan worden gebruikt, maar hun omvang gewoonlijk groter, waardoor onnodige verspilling van eiwitten. Indien een grotere kamer wordt toegepast, moet het volume van alle oplossingen in onderstaande protocollen evenredig geschaald. Microtubuli zaden worden vervolgens bereid, bijvoorbeeld met langzaam hydrolyseerbare GTP analoog, GMPCPP (guanosine-5'-[(α, β)-methyleno] trifosfaat) (protocol 3, zie ook Hyman <em> e.a.. 35). De zaden worden geïmmobiliseerd op een schoon dekglaasje en het oppervlak wordt vervolgens geblokkeerd om niet-specifieke absorptie van andere eiwitten voorkomen 32 (protocol 4 beschrijft zaden immobilisatie met behulp van digoxigenine). De gesegmenteerde microtubuli kan dan worden voorbereid met behulp van Protocol 5. De belangrijkste reden voor deze benadering is dat de microtubulus polymeren, die in aanwezigheid van GTP vormen, tijdelijk worden door toevoeging van de korte "caps" stabiele tubuline segmenten die GMPCPP bevatten gestabiliseerd. Deze kappen bevatten ook Rhodamine-gelabeld tubuline, zodat ze kunnen eenvoudig worden verwijderd door het verlichten van het gezichtsveld met een 530-550 nm laser of kwik booglamp (Protocol 6) 36. Fluorescentie-intensiteit van de punt-spoorvolgsignaal kan dan worden gebruikt voor het schatten van het aantal moleculen die reizen met de demontage microtubuli uiteinden, gezien de ongelijkheid van de microscoop field verlichting (Protocol 7). Een soortgelijke aanpak kan worden gebruiktinteracties tussen microtubuli depolymeriseren en eiwit beklede parels, bereid zoals beschreven in 27 (protocol 8) te bestuderen. Sommige eiwitten zullen binden gemakkelijk aan de wanden van gesegmenteerde microtubuli, maar laserpincet kan ook worden gebruikt om de hiel bij de microtubule muur houden, waardoor de binding bevorderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Benodigde apparatuur: De hieronder beschreven experimenten vereisen een lichtmicroscoop uitgerust voor DIC en fluorescentie beeldvorming (tabel 1). Helderveld LED verlichting kan worden gebruikt om aanzienlijke verbetering van de detectie van het dekglaasje bijgevoegde microtubuli zaden 37, die moeilijk waar te nemen met een gewone halogeenlamp zijn. Om vloeistofstroom in de microscopie kamers regelen, moet de oplossing worden uitgewisseld met een peristaltische pomp kan stroomsnelheden 10-100 ul / min. Een spuit pomp kan ook worden gebruikt, maar zorg moet worden genomen om luchtbellen die kunnen ontstaan ​​wanneer de stroomsnelheid plotseling verandert voorkomen. Voor de behandeling met eiwit beklede korrels, bijvoorbeeld om ze dicht bij de gesegmenteerde microtubule muur brengen, kan een 1064 nm continue golf laserstraal worden geïntroduceerd in de microscoop optische as en zich met een hoge numerieke apertuur objectief (1.3 of hoger) te produceren val. Voor kwantitatieve analyse van de fluorescentieintensiteit van enkele moleculen het excitatielicht worden door een laser-basebron omdat de intensiteit van de lichtbron stabieler dan die opgewekt door een kwiklamp. Om de mechanische trillingen te minimaliseren, moet de microscoop op een optische tafel geplaatst. Meer geavanceerde apparatuur nodig om de beweging van de kralen met de microtubuli depolymeriseren eindigt onder een constante kracht bestuderen, en de enkelvoudige krachtsignalen 11,38,39 meten, zullen deze werkwijzen elders beschreven.

1. Productie Herbruikbare Flow Chambers

Glasplaten voor herbruikbare stromingskamers kan van een lokale glas fabriek worden besteld met behulp van schema's in figuur 1B (zie tabel 2 voor meer informatie over onze leverancier). Met ultrasone frezen wijzigen gewone microscoop dia's (75 mm x 25 mm, 1,0 mm dik) twee groeven 15 ± 1 mm lang te maken, 1,0 ± 0,1 mm breed en 0,8 ± 0,05 mm diep.Afstand tussen de dichtst uiteinden moet 14 ± 1 mm, deze afstand is optimaal voor een kamer geassembleerd met 22 mm x 22 mm dekglaasje. Zie tabel 2 voor een lijst van andere materialen.

  1. Plaats 100 mm polyethyleen buis (OD 0,61 mm, tabel 2) in elke groef in de schuif, waardoor ~ 5 mm overhang aan de binnenste uiteinden van de groeven. Bevestig de buizen in de groeven met cyaanacrylaatlijm, het inbedden van de buizen volledig in de groeven.
  2. Vullen de groeven met epoxy lijm, terwijl het vermijden van morsen de lijm in de buizen. Laat de lijm drogen voor ~ 1 dag.
  3. Met een scherp scheermes stuurde de gestolde lijmmassa 3-4 mm vanaf het distale einde van elke bevestigingsplaats, proximaal verwijderen van de onderdelen in het midden van de dia. De buizen moeten in hun groeven blijven. Het verwijderen van de proximale delen zal ook af en haal het binnenste overhangen, het creëren van een vlak oppervlak met twee buis openingen.
  4. Vul een spuit met water en testenof de buizen goed werken. Als de vloeistof vrijelijk een druppel epoxy lijm (~ 5 mm diameter) aan de uiteinden van de bosjes, droge 1 dag (figuur 1D). Dit zal kamers duurzamer te maken, zodat ze kunnen herhaaldelijk worden gebruikt voor vele maanden.
    Opmerking 1: Aan een kamer voor een omgekeerde microscoop, dienen de objectglaasjes bovendien worden aangepast om twee kleine gaatjes aan de tegenoverliggende einden van de groeven (figuur 1C). Steek de buizen door de gaten in de schuif, buig de buizen en passen ze stevig in de groeven (figuur 1E). Volg stappen 1.2-1.4, maar verwijdert de epoxy van het gehele oppervlak, dat wordt gebruikt om een ​​stromingskamer maken.
    Opmerking 2: Om kamer volume te verminderen, gebruikt frezen twee inkepingen 0,050 ± 0,005 mm diep te maken, waardoor het centrale deel van de dia 5,0 ± 0,5 mm breed en licht verhoogd (zie "geëtste gebieden" op figuren 1B en 1C). Als thij stromingskamerinfusie wordt geassembleerd (zoals hieronder beschreven), plaatst u de dubbelzijdige tape binnen deze inkepingen.
    Noot 3: Om deze gewijzigde dia's opnieuw, na het beëindigen van de experimenten verwijder het dekglaasje en dubbelzijdige tape met behulp van een scheermesje. Verwijder de kit met het schillen van hem uit en door de dia met 70% ethanol te vegen. Plaats de dia in een container met 1-2% van een lab afwasmiddel, hechten slang aan een peristaltische pomp en perfuse 50-70 ml, volgen met gelijk volume van gedemineraliseerd water, droog en bewaar in een stofvrije ruimte.

2. Bereiding van Coverslips

Dit protocol duurt 6-8 uur en zal helpen om 12 dekglaasjes bereiden. U zult een keramische dekglaasje houder en 3 dekglaasje kleurbakjes nodig met deksel; pot volume moet 15 ml, dus elke houdt 4 dekglaasjes op elkaar gestapeld. Een glazen pot met een deksel (250 ml) moet worden gebruikt om dekglaasjes broeden met silaan. Gebruik gewone No.1 dekglaasjes (22 mm x 22 mm of 22 mm x 30 mm, zie de tabellen 2 en 3 voor een lijst van materialen). Alle stappen moeten in een zuurkast worden uitgevoerd, terwijl het dragen van handschoenen.

  1. Zet de dekglaasjes in het glas dekglaasje kleurbakjes en vul de potten met aceton. Incubeer gedurende 1 uur, wassen 10x met gedemineraliseerd water.
  2. Incubeer de dekglaasjes 10 min met ethanol en was weer 10x met gedemineraliseerd water.
  3. Bereid "piranha" oplossing. Doe 60 ml waterstofperoxide-oplossing (30% in water) in een hittebestendige glazen vat en voeg langzaam 100 ml zwavelzuur (uiteindelijke verhouding tussen zuur en waterstofperoxide oplossing is 5:03). Oplossing zal opwarmen, dit is normaal, maar wees voorzichtig. Piranha-oplossing is zeer corrosief! Gebruik dikke laboratoriumjas, handschoenen en een veiligheidsbril!
  4. Vul het dekglaasje kleuring potten met "piranha" oplossing, sluit de deksels en zet de potten in een waterbad verwarmd tot 90 ° C gedurende 1 uur.
  5. Giet het "piranha" solutiop en gooi ze weg volgens de instructies van de veiligheidsvoorschriften op uw werkplek. Wassen coverslips 10x met gedemineraliseerd water.
  6. Vul het dekglaasje kleurbakjes met 0,1 M KOH, incubeer 10 min, en was 10x met gedemineraliseerd water. Dit zal alle zure resten op de dekglaasjes na "piranha" behandeling te neutraliseren.
  7. Droge coverslips een voor een door te oordelen elke dekglaasje met teflon beklede platte randen pincet (om beschadiging van een glazen oppervlak te minimaliseren) en terwijl het blazen gecomprimeerd droge stikstof. Controleer of dekglaasjes volledig gedroogd, want silaan oplossing is zeer reactief met water.
  8. Stapel de gedroogde dekglaasjes in keramische houders (12 dekglaasjes per houder), die grondig moeten worden voorgedroogd met stikstof. Houd de keramische houders afgedekt om stof van het vasthouden aan het dekglaasje oppervlak te voorkomen.
  9. Bedek de bodem van 250 ml glazen pot (6 cm in diameter) met moleculaire zeven, Grade 564, voor wateropname.
  10. Vul de pot met 200 mlPlusOne Repel silaanoplossing en langzaam dompelen een keramische houder met dekglaasjes in een pot, sluit het deksel en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Dit hydrofobe coating ontstaat op het dekglaasje oppervlak.
  11. Verwijder langzaam de houder met dekglaasjes van de pot en de overdracht coverslips een voor een in het dekglaasje kleurbakjes gevuld met methanol.
  12. Plaats een metalen of glazen voetstuk in het waterreservoir van een sonisch bad, zodat het dekglaasje kleuring pot wordt ondergedompeld voor 2/3 van zijn hoogte. Ultrasone trillingen bij 70 W gedurende 20 min, het veranderen van methanol oplossing om de 5 minuten, spoel dan 10x met gedemineraliseerd water. Als de silanisatie werkte goed, zal de dekglaasjes droog lijken als ze uit het water.
  13. Grondig ontdaan van water met behulp van stikstof, zoals hierboven.
  14. Interlay de dekglaasjes met Kimwipes aan oppervlakte-oppervlaktecontact tussen de dekglaasjes voorkomen. Dekglaasjes kan in een afgesloten houder worden bewaard verscheidene weken bij kamertemperatuur.
    Noot 1: Stappen 2,1-2,6 kan worden vervangen door het schoonmaken van de dekglaasjes met Plasma Cleaner gedurende 15 min bij 30 W, de totale voorbereidingstijd sterk verminderen. Druk in de schoonmaak kamer wordt ingesteld op 100-200 mTorr. Zowel atmosferische en gecomprimeerde zuurstof kan worden gebruikt. Stapel de plasma gereinigd dekglaasjes in keramische houders en ga verder met stap 2.7.

3. Bereiding van GMPCPP-gestabiliseerde microtubuli Seeds

Deze procedure wordt ~ 1 uur duren en de resulterende microtubule zaden stabiel gedurende 1-2 dagen bij kamertemperatuur. Zie Tabel 4 voor een lijst van de reagentia.

  1. Meng op ijs:
    • 10 pl unlabeled tubuline (100 uM, tabel 4) bij BRB-80 buffer (80 mM Pipes, 1 mM EGTA, 4 mM MgCl2, pH 6,9 met KOH, supplement met 1-2 mM DTT met verse hoeveelheid voor elk experiment).
    • 2.6 ul-digoxigenine gelabeld tubuline (Tabel 4). Stel het volume afhankelijk van de voorbereiding,zodat de uiteindelijke verhouding van gemerkte ongelabelde tubuline is ~ 01:10. Meng goed door pipetteren.
    • 1.4 ul 10 mM GMPCPP (eindconcentratie 1 mM)
  2. Incubeer 15 min bij 35 ° C, zal de zaden 2-3 urn lang worden. Stel tijd als verschillende microtubuli lengte gewenst is.
  3. Voeg 35 ul BRB-80 (voorverwarmd tot 35 ° C), meng door pipetteren en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 25.000 xg om de zaden pellet bij kamertemperatuur.
  4. Gooi supernatant, was de pellet door voorzichtig toevoegen en verwijderen van 50 pi warm BRB-80.
  5. Resuspendeer pellet goed in 25 ul BRB-80.

4. Bevestiging van microtubuli Seeds aan de Coverslips

Protocollen 4 en 5 wordt 2-3 uur vereist, zodat beide stroomkamers gebruikt per dag.

  1. Monteer stromingskamer volgens de instructies van de fabrikant met behulp van gesilaniseerd dekglaasjes en ga verder met stap 4.2. Bij gebruik van op maat gemaakte dekglaasjes (protocol nr. 1), volg de stappen below.
    1. Bevestig twee stukjes dubbelzijdige tape (5 mm x 30 mm) langs de centrale ~ 5 mm breed gebied, zet gesilaniseerd dekglaasje bovenop de band, stevig aandrukken.
    2. Vul de kamer met BRB-80 door een van de buizen en sluit beide buizen met ronde tandenstokers.
    3. Knijp een kleine daling van twee gekleurde Kwik Cast kit op de top van een klein plastic petrischaal, en meng snel maar grondig met een tandenstoker. De kit wordt groen onmiddellijk van toepassing, zorgvuldig afdichten van alle randen van het dekglaasje. Als de kit dringt ook diep onder het dekglaasje, opent u een van de buizen door het verwijderen van de tandenstoker plug en zachte druk om kit te voorkomen dat lekken in de buizen van toepassing.
    4. Laat de kamer droog gedurende 10 min en bevestigen dat de stroom niet alvorens verder te gaan is beperkt.
  2. Plaats de kamer op een microscoop podium voorverwarmd tot 32 ° C en voeg een van de buizen een pomp, die de vloeistof pompen. De lengte van de inlaatbuisdient te worden geminimaliseerd om het onnodig reagentia vermijden: de aanbevolen lengte is 5-7 cm. Dompel daartoe in een 0,5 ml flacon met BRB-80 buffer. Dit en alle hieronder oplossingen moeten worden voorverwarmd tot 32-35 ° C.
  3. Breng een lichte druk met een pomp of gewoon hef het uiteinde van de afvoerbuis te persen uit de luchtbellen, die af en toe kan vormen wanneer de inlaatbuis stekker is verwijderd.
  4. Zet de pomp snelheid 100 pl / min. Wassen met 2 kamervolumes van anti-digoxigenine antilichamen verdund 1:30 in BRB-80, incubeer 15 min naar antilichamencoatings staan.
  5. Wassen met 5-10 kamervolumes van warm BRB-80, incubeer 10 min met 1% Pluronic F-127 in BRB-80 aan het hydrofobe oppervlak van gesilaniseerd dekglaasje blokkeren.
  6. Wassen met 5-10 kamervolumes van beweeglijkheid buffer (BRB-80 aangevuld met 0,4 mg / ml caseïne).
  7. Verminder het toerental van de pomp tot 10 pl / min en perfuse microtubuli zaden verdund 1:200-1:600 ​​in 30-40 pi beweeglijkheid buffer. Incubeer 15 min bevorderen binding van de zaden het dekglaasje geadsorbeerde antilichamen.
  8. Was de kamer bij 100 pl / min met 400 ul van beweeglijkheid buffer om eventuele ongebonden materiaal te verwijderen.
    Noot 1: De resulterende dichtheid van zaden moet 10-30 per microscoopveld (Figuur 2A) zijn. Problemen op te lossen, gebruik fluorescent gelabelde tubuline tijdens de polymerisatie (stap 3.1) voor eenvoudiger detectie van de dekglaasje bevestigd zaden.
    Noot 2: Axonemes bereid uit Chlamydomonas 40 of andere biologische bronnen, alsmede de vliezen van gelyseerd en deciliated Tetrahymena cellen 41 kan ook worden gebruikt als microtubuli kiemvormende. Deze kiemvormers zijn handig voor het creëren van kleine microtubuli arrays, en hebben de voorkeur wanneer microtubuli met specifiek aantal protofilamenten gewenst (GMPCPP zaad nucleates een microtubuli die ≥ 14 protofilamenten 42 bevat). Deze structuren kunnen worden bevestigd aan de gereinigde dekglaasjes door niet-specifieke absorptie, maar de attachment is meestal minder stabiel in vergelijking met antilichamen gebaseerde gehechtheid, vooral bij gebruik van de gesilaniseerd dekglaasjes.

5. Voorbereiding van Segmented Microtubules

Alle oplossing volumes hieronder zijn voor Kamer volume 15-20 pl; evenredig stijgen als er grotere kamer wordt gebruikt.

  1. Voorverwarmen ongelabelde tubuline mix (45 ul motiliteit buffer aangevuld met 1 mM Mg-GTP en 10-15 uM ongelabelde tubuline) gedurende 30 seconden bij 35 ° C. Perfuseren van 30 pl / min.
  2. Monitor microtubuli groei met DIC optiek (Figuur 2B, Video 1). Gedurende 5-7 minuten incubatie de microtubuli groeien meestal ~ 10 micrometer lang.
  3. Bereid Rhodamine-tubuline mix (65 pl motiliteit buffer aangevuld met 0,5 mM GMPCPP en 2-5 uM Rhodamine-gelabeld tubuline met 0,5-1 molverhouding Rhodamine aan tubuline) en verwarm de oplossing bij 35 ° C gedurende 30 sec.
  4. Onmiddellijk Perfuseren bij 30 μl / min. Incubeer gedurende 8-10 min tot vorming van stabiele fluorescerende caps te bevorderen op de microtubuli tips. Stabiele microtubuli segmenten zullen ook spontaan nucleëren en zichtbaar met DIC optiek zal zijn.
  5. Was de kamer en met 100 ul van motiliteit buffer bij 20 pl / min tot tubuline en nucleotiden, evenals oplosbare microtubuli fragmenten te verwijderen.
  6. Met DIC, bevestigen dat de microtubuli zichtbaar zijn (figuur 2D), hun aantal echter moeten dalen omdat veel microtubuli uit elkaar te halen tijdens aftopping (Video 2 toont een typische veld met gesegmenteerde microtubuli).
    Noot 1: Gesegmenteerde microtubules zijn zeer stabiel en kunnen gedurende ten minste 2 uur. De levensduur van deze microtubuli vermindert overmatige oplossing uitwisseling, of 2-mercapto-ethanol wordt gebruikt in de beeldvormende buffer.

6. Experimentele waarneming van de Protein Tracking met depolymeriseren uiteinden van microtubuli

  1. Introduce 30-50 ul van fluorescerend eiwit (0,1-20 nM) in de kamer op 10 pl / min. Als eiwit vasthouden aan het dekglaasje blijkt, vullen de motiliteit buffer met 4-8 mg / ml BSA. Alexa488-Dam1 tip-bijhouden vereist bovendien 10 mM DTT of 0,5-1% pME 10.
  2. Beperk het veld verlichting met behulp van een microscoop velddiafragma om de onnodige bleken en demontage van de microtubuli te voorkomen.
  3. Start video acquisitie met behulp van GFP filter kubus, schakel dan over naar Rhodamine filter kubus zonder onderbreking van de beeldopname. De rode segmenten aan de uiteinden van microtubuli moet duidelijk zichtbaar blijven, ze zullen beginnen te vervagen en snel te desintegreren (Video 3).
  4. Blijven branden totdat de doppen bijna verdwijnen (meestal gedurende 10-20 sec, maar deze keer zal het langer voor de caps gegroeid met een lagere Rhodamine etikettering verhouding), en terug te schakelen naar het GFP-kanaal eiwit opnemen tracking met microtubuli demontage.
  5. Analyseer deverkregen sequenties door het construeren kymographs, waarbij de twee-dimensionale beelden die fluorescentie-intensiteit langs microtubuli as tonen verschillende momenten tijdens observatie) met MetaMorph kenbare ImageJ of andere beeldverwerkingssoftware (figuur 2E).
    Opmerking 1: Acquisitie tarief moet worden aangepast afhankelijk van de timing van de waargenomen gebeurtenissen. De aanbevolen dosis 2-3 frames per seconde (fps) voor de trage, ring-en kleinbedrijf Dam1 complexen 27 maar acquisitie tijd voor enkele moleculen moet> 20 fps 19.
    Noot 2: Een zeer gevoelige EMCCD, bijvoorbeeld ANDOR iXon3, is nodig voor de snelle opname van-tip bijhouden evenementen met depolymeriseren microtubuli. De aanbevolen instellingen voor Andor iXon3 camera zijn: winst 5x, EM krijgen 200, 1 MHz uitlezing snelheid, 16-bits sensor-modus, 80 msec belichtingstijd.
    Noot 3: TIRF microscopie zal signaal-ruisverhouding te verbeteren, echter korter microtubuli worden gebruikt, zoals that de fluorescerende stabiliserende caps blijven binnen het bereik van verdwijnende veld.

7. Kwantitatieve analyse van de moleculaire grootte van microtubuli Tip-bijhouden Complexen

De reden voor deze benadering is het aantal moleculen bepalen een tip bijhouden complex door het vinden van de verhouding van de totale fluorescentie intensiteit van de tip volgen complex om de intensiteit van een fluorofoor. Deze benadering kan worden toegepast op GFP-eiwit fusies en eiwitten gelabeld met fluorescente kleurstoffen, maar het kan het aantal moleculen onderschatten de tip-tracking-complexen als sommige eiwitmoleculen in de preparaten niet fluorescerend.

  1. Record fotobleken kinetiek voor de fluorescente eiwitmoleculen.
    1. Monteer regelmatige microscopie kamer met een nonmodified glasplaatje, twee stroken dubbelzijdig plakband, en een schoon dekglaasje, die kunnen worden bereid met de volledige protocol 2, of slechts stappen 2.1-2.6 dezeprotocol.
    2. Voeg ongeveer 50 nM eiwit in beweeglijkheid buffer, kort wassen met beweeglijkheid buffer en sluit de kamer met valap (tabel 4). Optimaliseer eiwitconcentratie van het veld te verkrijgen met gelijkmatig verspreide plekken (figuur 3A), wat neerkomt op enkele moleculen en hun kleine aggregaten (trimeren en trameren, die spontaan kunnen vormen in de oplossing of kan verschijnen wanneer meerdere afzonderlijke moleculen dicht bij elkaar en kunnen niet worden opgelost) . Deze stap is zeer belangrijk voor het verkrijgen van een multi-piek verdeling van fotobleken stappen en nauwkeurige bepaling van een stapgrootte (zie hieronder).
    3. Minimaliseer de verlichting laser intensiteit waarmee de individuele fluorescerende vlekken zijn nog steeds zichtbaar, met lagere verlichting de photobleaching tijd wordt verlengd, kan dus langer photobleaching sporen worden verkregen. Ook minimaliseren van de blootstellingstijd aan de waarschijnlijkheid van meer dan een fluorofoor bleken te verminderen tijdens een frame. De aanbevolen instellingvoor Andor iXon3 camera: winst 5.0x, EM krijgen 999, 10 MHz uitleessnelheid, 50-100 msec belichtingstijd.
    4. Focus op het oppervlak van het dekglaasje, sluit de verlichting sluiter, verhuizen naar een nieuw veld, open de verlichting sluiter en het verwerven van beelden totdat alle complexen zijn gebleekt (daarna genoemd img (x, y)).
  2. Corrigeer de verkregen beelden oneffenheden van verlichting (Figuur 3B).
    1. Pesticide van een fluorofoor, bijv. 1 uM fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) in BRB-80. Deze oplossing kan worden voorbereid, in hoeveelheden verdeeld en opgeslagen bij -20 ° C.
    2. Monteer een kamer als in paragraaf 7.1.1, maar met een gewone dekglaasje. Voeg fluorofoor oplossing en sluit de kamer met behulp van valap.
    3. Verzamel> 50 beelden van de gehele microscoop veld: verplaats het podium om een ​​nieuwe ongebleekt gebied, terwijl de verlichting klepje gesloten is, en de beelden te verwerven onmiddellijk na het openen van de sluiter.
      4. (Figuur 3C). Het resulterende beeld vertegenwoordigt de verdeling van de verlichtingssterkte van de veld (Illum (x, y), waarbij x en y komen overeen met coördinaten pixel).
    4. Bepaal de maximale pixel helderheid van deze afbeelding (Max (Illum)).
    5. Met de gesloten sluiter verlichting en het gebruik van dezelfde camera-instellingen als in paragraaf 7.2.3 verwerven een afbeelding, bepaal de gemiddelde pixel intensiteit van deze afbeelding, dit komt overeen met GN, camera lawaai.
    6. Gebruik de bovenstaande waarden en beeld (Illum (x, y)) naar de experimentele afbeelding (img (x, y)) normaliseren met de volgende formule:

      Gebruik het resulterende beeld img norm (x, y) voor de kwantitatieve analyse van de brightness van de stationaire fluorescente complexen, alsmede de beelden met tip tacking complexen (figuur 3D) normaliseren.
  3. Bepaal de intensiteit van een enkele fluorofoor.
    1. Met genormaliseerde afbeeldingen img norm (x, y) en alle beeldverwerkingssoftware selecteer een fluorescerende vlek met een cirkelvormig gebied (5-6 pixels in diameter) en bepaal de geïntegreerde intensiteit voor alle frames, genereert het fotobleken sporen. Vermijd zeer heldere puntjes (> 5 maal helderder dan de dimmer zijn).
    2. Met dezelfde cirkelvormig gebied gereedschap Selecteren tenminste 3-spot gebieden, het genereren van de bijbehorende photobleaching sporen, gemiddelde en fit met exponentiële verval functie.
    3. Tabulate deze achtergrond intensiteit curve aan de experimentele tijd punten match en trek het uit de photobleaching bochten.
    4. Strijk de photobleaching curves (gemiddeld met het schuifraam van 3-5 punten). Inspecteer de resulterende krommen enelke curve die een abrupte stijging in fluorescentie of gebrek aan duidelijke bleken (figuur 3E) toont weggooien.
    5. Voor elk van de overige bochten (gewoonlijk 50-70% van het totale aantal bochten), selecteert visueel de uiteindelijke plateau, wanneer de fluorescerende vlek gebleekt. Verkort dit segment slechts ~ 100 punten vertrekken en het gemiddelde van deze intensiteiten. Trek deze waarde van de verkorte fotobleken curve kleine variaties beperken de achtergrondniveaus en de grootte van de achtergrond piek (hieronder) verminderen.
    6. Maak een histogram van de intensiteiten voor alle tijdstippen van 20 of meer photobleaching curves (> 1000 tijdstippen). Het histogram moet tenminste 4 verschillende pieken (zie noot 2) vertonen.
    7. Breng het histogram met equidistante Gauss-verdeling 10,43 behulp van MATLAB, Mathematica of soortgelijke software (Figuur 3F):

      whier een i en σ i, d en N zijn aanpasparameters. Parameters Ai en σ i overeen met amplitude en breedte van de i-de piek, d is de afstand tussen de pieken, N geheel getal, dat overeenkomt met het totale aantal pieken in de verdeling. Als centra van de eerste 3 of meer pieken vertonen een visueel goede match het gemonteerde lijn, de afstand tussen deze pieken (parameter d) overeenkomt met een fluorescentie-intensiteit van een fluorofoor.
      Opmerking 1: Aantal onderzochte punten (paragraaf 7.3.6) moet worden verhoogd als de microscopie systeem vertoont aanzienlijke trillingen of er is een andere bron van geluidsoverlast (met name instabiele laserstraal).
      Opmerking 2: Het is essentieel om te verkrijgen> 3 pieken voor nauwkeurige analyse met equidistante Gaussische fit. Als er minder pieken worden verkregen, kon de valse (bijv. dubbele) stapgrootte worden verkregenwanneer de verlichting niet optimaal zijn, zijn bijvoorbeeld wanneer de puntjes bleken te snel en enkele stappen niet goed opgelost.
  4. Bepaal de moleculaire grootte van de tip volgen complex.
    1. Gebruik beelden verzameld met Protocol nr. 6 en selecteer de eerste 2-4 frames, die onmiddellijk na het openen van de sluiter werden verworven. Als het veld verlicht werd enige tijd voordat de tip tracking waargenomen schatten de oorspronkelijke intensiteit van de kinetiek van fotobleken onder dezelfde experimentele omstandigheden.
    2. Het gemiddelde van de geselecteerde frames en normaliseren het resulterende beeld als in de punten 7.2.5-7.2.7.
    3. Meet integraal intensiteit van het fluorescerende-tip volgen complex met dezelfde regio grootte als in paragraaf 7.3.1.
    4. Meet integraal intensiteit van 3 achtergrond gebieden gelegen nabij het-tip bijhouden complex en met dezelfde regio, gemiddeld deze waarden en aftrekken van de intensiteit van de-tip bijhouden complex uit paragraaf 7.4.3. Bereken het aantal fluorofoor moleculen in het complex door deling van het fluorescentie-intensiteit in punt 7.4.4 verkregen door de intensiteit van de enkele fluorofoor verkregen paragraaf 7.3.5.
      Opmerking 1: Het is wenselijk dat de verlichting en verkrijging instellingen protocol 7.4 zijn dezelfde als in protocol 7.1. Indien een van de belichtingstijd of laser intensiteit tijdens deze stappen werd aangepast, moet de resulterende fluorescerende waarden dienovereenkomstig worden aangepast. Echter, de nauwkeurigheid van deze schalen worden geverifieerd door beeldvorming hetzelfde monster (bijvoorbeeld fluorescerende tijd) onder deze verschillende omstandigheden en berekenen van de verhouding van de verkregen intensiteiten.

8. Microtubuli Tip-volgen door de Protein Coated Kralen

  1. Uit te voeren experimenten met tip-volgen kralen door het triggeren van MT demontage als in protocol 6. Intensiteit van DIC lichtbron moet worden teruggebracht, zodat het bekijken van Rhodamine fluorescentie gelijktijdig metDIC imaging.
  2. Bereid de kralen als in Grishchuk et al.. 10 en Asbury et al.. 11 Introduceer 30-50 ul van kraal schorsing in de kamer op 10 pl / min. De voorgestelde kraal concentratie is 10 -16 -10 -17 M.
  3. Bij gebruik rechtop microscoop, verwijder de kamer van de microscoop podium en keer gedurende 5-10 minuten om kralen naar sediment op het dekglaasje. Dit bevordert een betere binding van de hiel aan de microtubuli vastgebonden aan het dekglaasje, maar deze procedure niet succesvol met 0,5 urn polystyreen kralen, die weinig zwaartekracht gebaseerde sedimentatie vertonen tijdens zo'n korte tijd.
  4. Selecteer een kraal die aan de dekglaasje aangebonden microtubuli is bevestigd, de kraal moet in een duidelijke boog 44 (Figuur 4A) bewegen. De vastgemaakte kraal moet zich 1-3 urn van het dekglaasje oppervlak, dat duidelijk zichtbaar dankzij de toe-gevoegd dekglaasje kralen die m blijvenotionless.
  5. Schakel over naar Rhodamine filter kubus en beginnen met het verzamelen beelden tijdens het gebruik van DIC verlichting.
  6. Open blind naar het veld beeldvorming (beperkt met een velddiafragma) verlichten met een kwiklamp of 530-550 nm laser. Blijven opnemen totdat de hiel loskomt of beweegt met het demonteren microtubuli einde (figuren 4D, 4F en 4G).
    Noot 1: Optische trap kan worden gebruikt om de interactie tussen de muur en microtubule-eiwit beklede kraal bevorderen. Dit is vooral handig bij het ​​werken met kralen bekleed met kinesine motors (figuren 4E-G). Volg dezelfde protocollen als hierboven maar vullen motiliteit buffer met 2 mM Mg-ATP. In stap 8.3, het veroveren van een vrij zwevende kraal met de 1064 nm laserstraal, verplaatst het podium om de gevangen kraal dichter bij de gesegmenteerde microtubuli muur te brengen. Begin beeldvorming met weinig licht DIC en via de Rhodamine filter kubus en wacht op de kraal om te beginnen met lopen naar de bedekte microtubuli einde. Achteruiter de gerichte kraal beweging wordt waargenomen, sluit de sluiter voor het vangen balk en open het klepje voor TL verlichting. Blijven opnemen totdat de hiel loskomt of tracks met het demonteren van microtubuli einde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eiwit tracking met depolymeriseren microtubuli eindigt. Gist kinetochoor component Dam1 is veruit de beste tip-tracker van de depolymeriseren microtubuli eindigt 14. Deze 10-subunit complex gelabeld met GFP kan gemakkelijk worden uitgedrukt en gezuiverd van bacteriële cellen 18,38, dus we raden het gebruik ervan als een positieve controle voor de tip volgen assay. Een fluorescerend eiwit dat meeloopt met het depolymeriseren na een microtubule wordt gezien als een heldere fluorescerende vlek steeds richting het dekglaasje bijgevoegde zaaigoed (Video 3). Het zal ook verschijnen als een schuine lijn op een overeenkomstige kymograaf (figuur 2E). Als daarentegen het eiwit niet aan-spoor tip, de microtubule verkort zonder dat verrijking fluorescentiesignaal aan het einde microtubuli, zoals gezien humane Ndc80 GFP-complex 19 (figuur 2F). Wanneer de processive volgen wordt waargenomen, de snelheid van microtubuli kortesterking kan worden bepaald door volgen van de bewegende stip of door meting van de helling van de schuine lijn op de overeenkomstige kymograaf. Dit kan informatie over de sterkte van eiwit microtubuli-end binding 45 geven. Eiwitten die sterk binden aan de microtubuli, zoals de Dam1 ring complex, vertragen het tempo van de microtubuli depolymerisatie. Dit effect is echter sterk afhankelijk van de grootte van de tip volgen complex en kleine complexen weinig of geen effect op de snelheid van microtubuli demontage 27 uitoefenen. Daarom moet de verandering in de snelheid van microtubuli verkorting worden geïnterpreteerd in de context van de omvang van de tip volgen complex. Onder bepaalde omstandigheden kan de tracking vergezeld van de toename in de helderheid van de tip bijhouden complex als depolymeriseren end "verzamelt" het eiwit dat was gebonden aan de microtubule rooster. In dit geval geldt het depolymerisatie vertraagt ​​vaak neer gelijktijdig met de toenemende grootte van de tip-tracking complex. In andere gevallen is de relatie is complexer. Bijvoorbeeld, veel subeenheden van de Dam1 eiwitcomplex, waarin GFP werd geconjugeerd aan de N-terminus van Dam1 subeenheid, kan worden verzameld aan het einde van de verkorting microtubuli (figuur 2G). Microtubuli demontage uiteindelijk kramen, vermoedelijk omdat de kracht van de microtubuli depolymerisatie is niet sterk genoeg om complexen die te groot bewegen. De demontage vaak hervat na een afname van helderheid tip die dissociatie van enkele-punt geassocieerde Dam1 subeenheden 10 aangeeft. Zorgvuldig onderzoek van deze relaties is belangrijk omdat de microtubuli-bindende eiwitten die niet processively niet houden ook kan vertragen het tempo van de microtubuli demontage 19,31,46.

Kraal tracking met depolymeriseren uiteinden van microtubuli. Veel microtubuli-bindende eiwitten zijn al geïdentificeerd als koppelaars voor de microbead beweging met dynamische microtubule eindigt 5,11,27,39,47. Opvallend is dat zelfs de Ndc80 eiwitcomplex de microtubuli einde tip tracking ondersteunen door de kralen 29,30. Gewoonlijk binding tussen eiwit beklede kralen en microtubuli sterk, dus als parels worden toegevoegd aan de microscopie kamer ze binden gemakkelijk aan de gesegmenteerde, dekglaasje verbonden microtubuli (Figuur 4A). Het is niet altijd mogelijk definitief te zien met DIC of de kraal werd bevestigd aan slechts een microtubulus. We hebben een aantal criteria ontwikkeld om het opnemen van de kralen die bijlagen hebben gevormd om verschillende microtubuli voorkomen. Ten eerste moet een kraal die een microtubule hierbij een boogvormige beweging tonen de microtubuli zwenkt enigszins rond de plaats van de groei van het dekglaasje verbonden seed (Figuur 4B). Ten tweede, wanneer de stabiliserende dop verlicht, maar een rood segment moet worden gezien distaal van het zaad en hiel (figuur 4C). De kap kan vaak followi zichtbaarng arc-achtige beweging van de kraal totdat de dop bleekmiddelen (Video 4). Ten derde moet de kraal beweging (of haar onthechting) in acht worden genomen kort nadat de dop heeft gebleekt en de richting van de kraal beweging moet stroken met microtubuli oriëntatie, die werd afgeleid op basis van de bovenstaande opmerkingen zijn. Ten vierde, als de microtubuli verkort en de kraal beweegt in de richting van het zaad, de amplitude van de boog-achtige oscillaties zou afnemen (Figuur 4D).

Bij het ​​volgen van de kraal is zeer processive, zoals getoond in figuur 4D, die criteria vaak voldaan. Indien de kraal tracking is niet processive na aanvankelijke gerichte beweging van de hiel los en begint verspreiden willekeurig. Bij grotere kralen, bijv. 1 micrometer glasparels, dit thermische beweging is langzaam genoeg dat het kan worden geïnterpreteerd als een boog die beweging met de verkorting microtubuli einde. Een formeel criterium gebaseerd op de omvang vanbead van afwijking van de lineaire spoor kan worden gebruikt om te discrimineren dergelijke gebeurtenissen 29. In onze vorige werk berekende we gemiddeld kraal excursies over de microtubuli as en geschat dat als deze waarde overschreden 0,4 micrometer / 1 micrometer van het microtubuli-parallelle kraal beweging, de kraal was waarschijnlijk willekeurig verspreiden met een betrouwbaarheid van 95%. Met deze maatregel vonden we dat zelfs in "control" bead preparaten, bijv. korrels bekleed met niet-specifiek antilichaam of streptavidine beklede parels in combinatie met gebiotinyleerd microtubuli, 5% korrels werden beoordeeld aan processively bewegen. Als een grotere nauwkeurigheid gewenst is om bewegingen van kralen met lage processivity monitoren, adviseren wij het gebruik van een laser val, waar de gerichte kraal bewegingen zijn makkelijker te identificeren.

Laser val moet ook worden gebruikt als de kralen niet blijvende gehechtheid aan stabiele microtubuli vormen. We gebruikten een laserstraal aan korrels bekleed met verschillende eiwit constructen van plu vangens-end gerichte kinesine CENP-E en "launch" zoals kralen op de gesegmenteerde microtubuli muren (figuur 4E) 24. In aanwezigheid van ATP deze kralen snel optreden (20-25 um / min) naar de afgedekte microtubuli plus einden, op een kymograaf dergelijke beweging resulteert in de schuine lijn gericht naar de dop (fig. 4F en 4G). Na de kap wordt vernietigd, een kraal bekleed met de afgeknotte CENP-E eiwit los van de microtubuli (groene pijl op Figuur 4F). Echter, de volledige lengte CENP-E eiwit kraal beweging te houden in de omgekeerde richting, dat wil zeggen in de richting van de min microtubuli einde (Video 5). Dientengevolge, de kymograaf dergelijke kralen toont een zigzagpatroon, waaruit de aanwezigheid van zowel plus-en min-end end gerichte bewegingen van de parels gecoat met volledige lengte, afgeknot en niet CENP-E. We verwachten dat andere microtubuli-afhankelijke motoren vergelijkbaar beweeglijkheid 5,13 kunnen vertonen

Figuur 1
Figuur 1. Stroomkamer in vitro onderzoeken met gesegmenteerde of dynamische microtubuli. A. Diagram van een gesegmenteerde microtubuli (MT). Stabiele MT zaden worden bereid met digoxigenine (DIG)-gemerkte tubuline en GMPCPP, verbonden aan dekglaasje via anti-DIG antilichamen. Niet-specifieke binding van tubuline en andere eiwitten wordt geblokkeerd met Pluronic F127. Microtubuli worden verlengd van de zaden met behulp van ongelabelde tubuline en GTP, en deze uitbreidingen zijn afgedekt met korte segmenten met Rhodamine gelabeld tubuline en GMPCPP (in het rood). MT Plus eind (gelabeld met +) kan meestal worden disonderscheidde van een veel kortere minteken (-). B en C. Gedetailleerde schema's van de gemodificeerde stromingskamer dia te gebruiken met rechtop en ondersteboven microscopen. Sonic-plaatsen worden weergegeven in het geel. Getallen zijn in millimeters. D en E. Zijdelings uitzicht op de gewijzigde dia's (niet op schaal) met aangehechte buizen;. Dikke pijlen geven vloeistofstroom door de buizen na de kamers worden volledig gemonteerd (niet getoond) Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 2
Figuur 2. Voorbereiding van de gesegmenteerde microtubuli en typische eiwit tip-traceerresultaten A.. Dekglaasje-gehecht microtubuli zaden visualized met DIC optiek (stap 4.8 van het protocol); pijlen wijzen naar een aantal van de zaden. Het beeld is een gemiddelde van 10 frames verworven sequentieel (100 msec blootstelling elk). B. Dezelfde objectiefveld na tubuline en GTP werden gedurende 8 minuten bij 32 ° C, worden microtubuli gezien afkomstig van de zaden (stap 5.2 van het protocol). C. Een image-pseudo gekleurd met een gesegmenteerde microtubuli bekeken in DIC (groen) en de Rhodamine-gelabelde stabiliserende caps (pijlen), bekeken met epifluorescentie (rood). D. Hetzelfde beeld als op paneel C, maar met een groter gezichtsveld. Sommige-Rhodamine met microtubuli fragmenten, die spontaan nucleëren in de oplossing tijdens stap 5.2 van het protocol, worden ook gezien (pijlpunten). E. Kymograaf van de Dam1-GFP-eiwit bijhouden van het demonteren van microtubuli einde. Kleurcode bars op de links tonen een fluorescerende kanaal dat wordt gebruikt voor de verwerving van het overeenkomstige deel van de kymograaf. Vertical fluorescerende lijnen zijn gemaakt door de Dam1-GFP complexen die zich binden aan de microtubuli muur en tonen weinig beweging totdat de microtubuli einde komt door. F. Kymograaf Op E maar met GFP-gelabelde Ndc80 complex 19. Aanvankelijk wordt microtubuli gelijkmatig ingericht, zij het dat GFP-fluorescentie wordt waargenomen op het bedekte eindigen na Rhodamine excitatie. Deze toename hangt af van de pool van oplosbare Ndc80-GFP-eiwit, maar het onderliggende mechanisme niet bekend. Na de kap desintegreert, microtubuli verkorten wordt duidelijk maar er is weinig verrijking van fluorescentie op de microtubuli tip, wat wijst op een gebrek aan tip-tracking. G. Afstand tussen de tip volgen Dam1 plek om de axoneme, die werd gebruikt voor microtubuli nucleatie in dit experiment 10 werd gemeten met MetaMorph routepunten drop-in. De aanvankelijke helderheid van de bewegende complex overeen met ongeveer 15 subeenheden: genoeg om een ​​Dam1 ring. De helderheid van the bewegende complex werd genormaliseerd op de intensiteit van dekglaasje gehecht onbeweeglijk fluorescerende vlekken te corrigeren voor het bleken. Horizontale schaal bars: panelen A, B, D (10 micrometer), panelen C, F, E (3 pm). Verticale schaal bars:. 10 sec Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 3
Figuur 3. Kwantitatieve analyse van fluorescentiesignalen. A. Voorbeeld beeld van het veld microscoop met Dam1-Alexa488 complexen gebonden niet-specifiek aan het dekglaasje oppervlak. Opmerking heterogeniteit in dots helderheid en oneffenheden van de verlichting. Schaal bar is 2 micrometer. B. Kwantitatieve vertegenwoordiging van het zelfde beeld als in panel A. C D. Genormaliseerde afbeelding van paneel A uitgezet als intensiteit oppervlak met behulp van Mathematica 9 (Wolfram Research). Merk op dat oppervlak vlakker dan op B en de pieken minder heterogeen hoogte. E. Voorbeelden van het fotobleken curves verkregen met CENP-E-GFP eiwit. De geïntegreerde intensiteit van elke stip werd verzameld, genormaliseerd om rekening te houden met oneffenheden van verlichting en de curven werden afgevlakte (gemiddeld met schuifraam van 5 punten). Signalen in de bovenste rij werden uitgesloten van verdere analyse om redenen paragraaf 7.3.4 beschreven. Curves zoals die getoond in de onderste rij werden verder verwerkt en gebruikt om een histogram op paneel F bouwen, zoals beschreven in de punten 7.3.4-7.3.5. F ng>. Histogram van integrale intensiteiten verzameld van 22 bleken CENP-E-GFP punten (totaal 1900 datapunten). Rode lijn is passend met equidistante Gaussische functie; 5 verschillende pieken worden gezien. De integrale intensiteit van een enkele GFP fluorofore bepaald uit dit histogram was (64,7 ± 1,1) x 10 4 au G. Typische photobleaching curve voor Dam1-Alexa488, verwerkt zoals beschreven in het protocol 7.3.5. H. Histogram van integrale intensiteiten verzameld van 48 photobleaching Dam1-Alexa488 punten (totaal 1548 datapunten); 4 verschillende pieken worden gezien. De integrale intensiteit van een Alexa488 molecuul onder deze omstandigheden was (17,4 ± 0,8) x 10 3 au Klik hier voor grotere afbeelding.

es/ftp_upload/51150/51150fig4.jpg "/>
Figuur 4. Illustratie van de bewegingen van met microtubuli geassocieerde kralen. A. Schema van het experiment met kralen bekleed met microtubule-bindende eiwitten. Dikke pijlen geven de richting van microtubuli demontage. B. Maximale intensiteit projectie van de DIC beelden van een GFP Dam1-coated kraal, die stabiel was bevestigd aan een gesegmenteerde microtubuli (gebaseerd op 26 beelden). Kraal toonde de arc-achtige beweging (pijl), wat suggereert dat het werd bevestigd aan een microtubule georiënteerd zoals getoond met een stippellijn. C. Enkel beeld van dezelfde kraal als in panel B, maar die tijdens stap 8.6 van het protocol direct na de fluorescerende sluiter werd geopend. Pijl wijst naar de fluorescerende dop gelegen nabij de hiel, maar aan de andere kant van het microtubule toedieningsplaats. D. Een maximale intensiteit projectie toont het traject van de beweging van de kraal met de disassembling microtubuli. Beeld werd van 115 frames opeenvolgend verworven vanaf het begin van de beeldvorming (let op de arc-achtige projectie) en tot bead's detachement (Video 4). E. Schematische voorstelling van het experiment met kralen bekleed met plus-end gericht kinesine CENP-E. De kraal wordt in contact gebracht met microtubuli met behulp van laser val. De val is dan uitgeschakeld en de kraal start op weg naar microtubuli plus einde. Na de microtubuli-stabiliserende dop te verwijderen en microtubuli uit elkaar gehaald, de kraal keert de richting van zijn beweging. F. Kymograaf toont een 0,5 urn kraal bedekt met afgeknotte X. laevis CENP-E kinesine weg naar microtubuli plus einde 24. Na de kraal reisde ongeveer 1 micrometer, werd fluorescent sluiter geopend (rode balk), en de stabiliserende dop zichtbaar werd (rode pijl). De kraal vrijstaande plotseling (groene pijl), vermoedelijk wanneer de motor in aanraking met de verkorting microtubuli einde. G Klik hier voor grotere afbeelding.

Video 1. Voorbereiding van de gesegmenteerde microtubuli. Toont Video DIC beelden van een microscoop veld tijdens de bereiding van gesegmenteerde microtubuli. Imaging begint na de microtubuli zaden reeds bevestigd aan het dekglaasje. Kleine ronde stippen zijn van deeltjes gevonden in onze voorbereiding van anti-digoxigenine antilichamen. Na tubuline en GTP toegevoegd, microtubuli begint te rekken uit de zaden (stap 5.2). Nadat ze de gewenste lengte (8-15 micrometer) te bereiken, is de oplossing snel uitgewisseld om Rhodaminated tubuline en GMPCPP introduceren. Tijdens de uitwisseling microtubuli polymeren bocht in de direction van stroom, maar nadat de pomp is gestopt ze aannemen dat de ongedwongen oriëntatie. Tijdens de volgende "aftopping" stage, sommige tubuline begint spontaan en kleine microtubuli fragmenten zijn te zien zweven in de kamer polymeriseren. Zij worden tijdens de volgende wasbeurt (stap 5,5), die ook verwijdert alle oplosbare tubuline en nucleotiden verwijderd. Tijdens deze fasen een aantal microtubuli niet aan de robuuste doppen monteren, en als oplosbare tubuline wordt weggespoeld demonteren ze snel. De afgedekte microtubuli echter stabiel gedurende enkele uren, tenzij ze worden verlicht, wanneer Rhodamine is opgewekt, de kappen gefragmenteerd en de afgetopte microtubule segmenten worden blootgesteld. Beelden werden verworven per seconde, gespeeld op 30 fps.

Video 2. Ontzegeld van gesegmenteerde microtubuli. Video toont een volledig geassembleerde gesegmenteerde microtubuli via DIC, gevolgd door fluorescerende beelden van dezelfde microtubuli via de Rhodamine filter kubus. A brechts rode segment aan het einde van de microtubuli (pijl) beweegt in boog en verdwijnt snel door de foto-bleken. Beelden die op 6 fps en afgespeeld op 10 fps.

Video 3. Eiwit tracking met depolymeriseren microtubuli eind. A gesegmenteerde microtubuli (MT) is zichtbaar dankzij de decoratie van GFP-gelabelde Dam1, die stippen (groen beelden) vormt. Rhodamine fluorescentie wordt vervolgens opgewonden en de rode dop zichtbaar, bewegen in een zachte boog aan het einde van de microtubuli (rode beelden), de rest van de microtubuli niet zichtbaar omdat de gemerkte tubuline werd opgenomen alleen aan het einde van de polymeer. De dop bleekmiddelen snel begint af te brokkelen en de tl-kubus wordt teruggeschakeld naar GFP, net op tijd om de start van de verkorting van de microtubuli segment dat niet beschikt over de Rhodaminated tubuline en GMPCPP zien. Wanneer depolymeriseren einde de Dam1 puntjes bereikt, de microtubuli einde wordt helder groen. Vervolgens werd een groen fluorescerennt spot is te zien bewegen met de demontage van microtubuli, ter illustratie van de processieve tip-tracking. Concentratie van Dam1 was 3 nM, beelden werden verkregen en speelde op 0,4 fps. Schaalbalk 5 micrometer.

Video 4. Kraal tracking met depolymeriseren microtubuli eindigt. Glaskraal gecoat met Dam1 wordt gezien beweegt in een boog, wat aangeeft dat het is gebonden aan het dekglaasje door een microtubuli. Wanneer Rhodamine fluorescentie wordt opgewekt, wordt de rode dop distaal gezien vanaf de hiel en bewegen synchroon met de kraal de motie (beelden in rood). Binnenkort, de hiel begint te bewegen directioneel, terwijl de arc-achtige beweging afneemt in amplitude (Figuur 4D). DIC beelden werden verkregen via Rhodamine filter kubus elke 300 msec en speelde 6 bps; kraal is 1 micrometer, schaal bar 5 micrometer.

Video 5. -Kinesine coated kraal bewegen in twee richtingen op de gesegmenteerde microtubuli. Imaging begint na de kraal coated met volledige lengte CENP-E kinesine werd op de microtubuli (MT) wand geplaatst. Pijl wijst naar de eerste kraal positie. De kraal is te zien af ​​te stappen van de pijl, als de motor loopt naar de plus microtubuli einde. Kort na de plus-eindkap brandt (pijlpunt, rood beelden), de hiel begint te bewegen in de tegenovergestelde richting. Alleen volledige lengte CENP-E kinesine kunnen terugkoppelen beweging van de kraal naar de verkorting microtubuli einde. Kralen bekleed met afgeknotte CENP-E kan bewegen in de richting van de plus-MT-end maar ze los te snel na de microtubuli depolymerisatie wordt geactiveerd (vergelijk figuren 4F en 4G). DIC beelden werden elke 1 sec verworven en speelde bij 16 fps; kraal is 0,5 urn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Veel single molecule assays tegenwoordig routinematig gebruik speciaal behandeld dekglaasjes om aspecifieke eiwit plakken drastisch te verminderen. De procedure die we hier beschrijven is een wijziging van het oorspronkelijke protocol ontwikkeld in Howard lab 32, en we vinden dat silaniseren de dekglaasjes is de moeite waard, zelfs met DIC-gebaseerde kraal assays, die geen gebruik maken van fluorescentie. Chambers geassembleerd dergelijke dekglaasjes tonen veel schoner oppervlak en de verkregen in de aanwezigheid van oplosbare microtubule bindingseiwit resultaten zijn reproduceerbaar, vooral als een zeer lage eiwitconcentratie wordt gebruikt.

De meest kritische stappen voor een succesvolle voorbereiding van gesegmenteerde MT's zijn:

  1. optimalisatie van tubuline concentratie en incubatie tijden (stappen 5,1-5,2). De tijden en de concentraties die in het protocol zijn bij benadering en kunnen afwijken als gevolg van verschillen in tubuline voorbereidingen, kamer volume, enz.
  2. specifieke en strakkebevestiging van de microtubule kiemvormende het dekglaasje en
  3. het vermogen om stroomsnelheden controleert nauwkeurig. In onze handen, worden de beste resultaten bereikt wanneer experimenten worden uitgevoerd in de verzegelde stromingskamers.

Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat microtubule depolymerisatie kan worden geactiveerd met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie, waardoor assisteren analyse van bewegingen bij de demontage uiteinden van microtubuli. Met deze techniek kunnen buffers snel worden veranderd en microtubule-bindende eiwitten en kralen kunnen worden toegevoegd in verschillende buffers nadat de microtubuli gevormd. Dit maakt de studie van de effecten van een eiwit op microtubule depolymerisatie los van de mogelijke rollen in de assemblage van microtubuli. Dit is handig als het eiwit ook kunnen communiceren met oplosbare tubuline, die haar interacties kunnen maskeren met de microtubuli. Echter, aangezien gratis, niet-gepolymeriseerd tubuline in de cel aanwezig is, moet voorzichtigheid worden betracht wduivin interpreteren fysiologische betekenis van deze resultaten.

De grootste beperking van de gesegmenteerde microtubule benadering is dat het niet geschikt ontwerp bestuderen tijdens assemblage van microtubuli, en de effecten van het bijhouden eiwitten op microtubuli catastrofe redden. Om deze vragen, assays met dynamische microtubuli gekweekt in aanwezigheid van oplosbare tubuline geschikter. Een andere beperking van deze werkwijze is dat motiliteit buffers vrij van zuurstof wegvangen enzymen moeten zijn. Dergelijke enzymmengsel kan bijvoorbeeld op basis van catalase en glucose-oxidase 48, een aanzienlijke verbetering van de levensduur van fluorescerende moleculen. Indien deze reagentia worden in de gesegmenteerde microtubuli assay, de foto-inductie van demontage zeldzaam omdat microtubule caps bleekmiddel zonder desintegratie. In kwantitatieve fluorescentie assays, de snelheid van bleken altijd rekening worden gehouden, zoals hierboven of bijvoorbeeld beschreven in referentie23, vooral als anti-bleekmiddelen niet gebruikt.

Verscheidene microtubuli bindende eiwitten getest in de gesegmenteerde microtubuli assay toonde voorkeursverbinding aan de Rhodamine-gemerkte stabiliseren caps versus ongelabelde microtubule segmenten. Binding aan de doppen kan de fractie van processive kralen verminderen, aangezien de dop geassocieerde korrels vaak los van de microtubule wanneer de kap desintegreert. Tot slot merken we op dat als de motor beklede parels lopen richting de plus microtubuli einde zeer snel, ze vaak de rode kappen bereiken voordat microtubuli depolymerisatie wordt geactiveerd, in welk geval zij ook zullen distantiëren van de microtubuli en dergelijk experiment zal niet productief zijn .

Samengevat, het vermogen van microtubuli bindende eiwitten zonder inherente motoriek tot het verkorten einde van een microtubule volgen is een interessant, maar slecht begrepen fenomeen. De hier beschreven protocollen te onderzoeken van deze pr helpenoteins en hun eigenschappen in vitro. Depolymerisatie van microtubuli-afhankelijk transport speelt een belangrijke rol bij chromosoomscheiding tijdens mitose. Zo hopen we dat de hier beschreven technieken uiteindelijk zullen helpen om meer inzicht te krijgen in de mechanismen van celdeling te krijgen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs willen graag FI Ataullakhanov bedanken voor het helpen bij het ontwerpen en vervaardigen herbruikbare stromingskamers, N. Dashkevich, N. Gudimchuk en A. Korbalev voor het verstrekken van afbeeldingen voor figuren, N. Gudimchuk en P. Zakharov voor het ontwikkelen van een protocol en het verstrekken van reagentia bereiden digoxigenine-gelabelde microtubuli zaden, A. Potapenko voor hulp bij het bewerken van tekst en andere leden van Grishchuk lab voor tips en discussies. Dit werk werd mede ondersteund door NIH te verlenen GM R01-098389 en een pilot subsidie ​​van Pennsylvania Muscle Instituut voor ELG, die een Kimmel Scholar, door RFBR verleent 12-04-00111-a, 13-04-40190-H en 13 -04-40188-H, de Russische Academie van Wetenschappen presidium Subsidies (Mechanismen van de Molecular Systems Integration en Moleculaire en Moleculaire Celbiologie programma's) naar FI Ataullakhanov, NIH verlenen GM R01 GM033787 JR McIntosh, en een Dmitry Zimin Dynasty Stichting postdoctoraal fellowship aan VAV

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Table 1. Microscopy and other equipment.
Microscope Zeiss
Nikon		 Axio Imager 2
Eclipse Ti		 other microscope models capable of DIC and epifluorescence-imaging can be used
Objective Zeiss
Nikon		 420490-9900-000
CFI Apo 100x Oil 1.49		 100X, DIC, 1.3-1.49 NA
Objective heater Bioptechs 150803, 150819-19
Fluorescent filter cube Chroma 49004 or 49008
41017 or 49020		 optimized for Rhodamine fluorescence 
optimized for GFP fluorescence
Acquisition software freeware MicroManager
Molecular Devices		 not applicable
MetaMorph 7.5		 http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/
other software can be used to acquire images and for a particle tracking
EMCCD camera Andor iXon3, DU-897E-cs0-#BV Highly sensitive EMCCD camera
Trapping laser IPG Photonics YLR-10-1064-LP 1,064 nm laser, 10 W
Fluorescence excitation lasers Coherent, Inc.
Coherent, Inc.		 Sapphire 488 LP
Sapphire 552 LP		 excitation of green fluorophores
excitation of red fluorophores
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-001
Commercial flow chambers Warner Instruments RC-20 or RC-30
Perfusion pump Cole Palmer
Harvard Apparatus		 Masterflex 77120-52
Pico Plus		 Both pumps provide the required rate of liquid flow but a peristaltic pump may pulse at very slow speed. The flow with a syringe pump is more consistent for a wide range of rates but this pump has inertia. 
Table 2. Microscopy chamber preparation.
Modified microscope slides for reusable chambers Precision Glassblowing of Colorado Custom order www.precisionglassblowing.com Sonic slots in slides using schematics in Figure 1
Polyethylene tubing Intramedic 427410 I.D. 0.58 mm, O.D. 0.965 mm; use these tubes to connect assembled chamber to the pump and waste container
Polyethylene tubing Intramedic 427400 I.D. 0.28 mm, O.D. 0.61 mm; use these tubes to make the reusable chamber
Regular microscope slides VWR 48312-003 Other similar slides can be used
Coverslips VWR 48393-150, 48366-067 Other similar coverslips can be used
Silicon sealant World Precision Instruments KIT, SILICON SEALANT 5 MIN CURE
Epoxy glue Loctite 83082
Cyanoacrylate adhesive Scotch 3M AD114 Or cyanoacrylate adhesive from other manufacturers
Table 3. Coverslips cleaning and coating.
Molecular Sieves, Grade 564 Macron 4490-04
Coverglass Staining Jar Ted Pella, Inc. 21036
Coverslip Ceramic Holder Thomas Scientific 8542e40
PlusOne Repel Silane GE Healthcare Biosciences 17-1332-01
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
Anti-digoxigenin AB Roche Applied Science 11093274910
Table 4. Preparation of seeds and segmented microtubules.
Tubulin purified from cow brains
Cytoskeleton, Inc
T238P		 For purification protocols see 49–51
Unlabeled porcine tubulin
Labeled tubulin Cytoskeleton, Inc
Invitrogen
Invitrogen		 TL590M
C1171 (Rhodamine)
A-2952 (Digoxigenin)		 Rhodamine-labeled porcine tubulin
Tubulin can be labeled with any amine-reactive dye as in reference52.
GMPCPP Jena Biosciences NU-405 Aliquot and store at -70 °C
VALAP Vaseline, lanolin, and paraffin at 1:1:2 by mass see reference9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 13, 83-117 (1997).
  2. Mitchison, T. M., Kirschner, M. W. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (15), 237-242 (1984).
  3. Walker, R. A., Brien, O., et al. Dynamic Instability of Individual Microtubules Analyzed by Video Light Microscopy: Rate Constants and Transition Frequencies. J. Cell Biol. 107, 1437-1448 (1988).
  4. Gardner, M. K., Zanic, M., Gell, C., Bormuth, V., Howard, J. Depolymerizing Kinesins Kip3 and MCAK Shape Cellular Microtubule Architecture by Differential Control of Catastrophe. Cell. 147 (5), 1092-1103 (2011).
  5. Lombillo, V. A., Stewart, R. J., McIntosh, J. R. Minus-end-directed motion of kinesin-coated microspheres driven by microtubule depolymerization. Nature. 373, 161-164 (1995).
  6. Franck, A. D., Powers, A. F., Gestaut, D. R., Gonen, T., Davis, T. N., Asbury, C. L. Tension applied through the Dam1 complex promotes microtubule elongation providing a direct mechanism for length control in mitosis. Nat. Cell Biol. 9 (7), 832-837 (2007).
  7. Tran, P. T., Walker, R. A., Salmon, E. D. A metastable intermediate state of microtubule dynamic instability that differs significantly between plus and minus ends. J. Cell Biol. 138 (1), 105-117 (1997).
  8. Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R. Force production by disassembling microtubules. Nature. 438, 384-388 Forthcoming.
  9. Coue, M., Lombillo, A., Richard, J. Microtubule Depolymerization Promotes Particle and Chromosome Movement In Vitro. J. Cell Biol. 112 (6), 1165-1175 (1991).
  10. Grishchuk, E. L., Spiridonov, I. S., et al. Different assemblies of the DAM1 complex follow shortening microtubules by distinct mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (19), 6918-6923 (2008).
  11. Asbury, C. L., Gestaut, D. R., Powers, A. F., Franck, A. D., Davis, T. N. The Dam1 kinetochore complex harnesses microtubule dynamics to produce force and movement. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (26), 9873-9878 (2006).
  12. Westermann, S., Wang, H. -W., Avila-Sakar, A., Drubin, D. G., Nogales, E., Barnes, G. The Dam1 kinetochore ring complex moves processively on depolymerizing microtubule ends. Nature. 440 (7083), 565-569 (2006).
  13. Grissom, P. M., Fiedler, T., Grishchuk, E. L., Nicastro, D., West, R. R., Mcintosh, J. R. Kinesin-8 from Fission Yeast A Heterodimeric , Plus-End – directed Motor that Can Couple Microtubule Depolymerization to Cargo Movement. Mol. Biol. Cell. 20, 963-972 (2009).
  14. McIntosh, J. R., Volkov, V., Ataullakhanov, F. I., Grishchuk, E. L. Tubulin depolymerization may be an ancient biological motor. J. Sci. 123, 3425-3434 (2010).
  15. Grishchuk, E. L., McIntosh, J. R., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I. Force generation by dynamic microtubule polymers. Compr. Biophys. 4, 93-117 (2012).
  16. Asbury, C. L., Tien, J. F., Davis, T. N. Kinetochores' gripping feat: conformational wave or biased diffusion. Trends Cell Biol. (1), 38-46 (2011).
  17. Tien, J. F., Umbreit, N. T., et al. Cooperation of the Dam1 and Ndc80 kinetochore complexes enhances microtubule coupling and is regulated by aurora B. Cell Biol. 189 (4), 713-723 (2010).
  18. Gestaut, D. R., Graczyk, B., et al. Phosphoregulation and depolymerization-driven movement of the Dam1 complex do not require ring formation. Nat. Biol. 10 (4), 407-414 (2008).
  19. Schmidt, J. C., Arthanari, H., et al. The Kinetochore-Bound Ska1 Complex Tracks Depolymerizing Microtubules and Binds to Curved Protofilaments. Dev. Cell. 23 (5), 968-980 (2012).
  20. Brouhard, G. J., Stear, J. H., et al. XMAP215 is a processive microtubule polymerase. Cell. 132 (1), 79-88 (2008).
  21. Stumpff, J., Du, Y., et al. A Tethering Mechanism Controls the Processivity and Kinetochore-Microtubule Plus-End Enrichment of the Kinesin-8 Kif18A. Mol. Cell. 43 (5), 764-775 (2011).
  22. Su, X., Qui, W., Gupta, M., Pereira-Leal, J., Reck-Peterson, S. L., Pellman, D. Mechanisms underlying the dual-mode regulation of microtubule dynamics by Kip3/kinesin-8. Mol. Cell. 43 (5), 751-763 (2011).
  23. Helenius, J., Brouhard, G., Kalaidzidis, Y., Diez, S., Howard, J. The depolymerizing kinesin MCAK uses lattice diffusion to rapidly target microtubule ends. Nature. 441 (7089), 115-119 (2006).
  24. Gudimchuk, N., Vitre, B., et al. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive bi-directional tracker of dynamic microtubule tips. Nat. Cell Biol. 15 (9), 1079-1088 (2013).
  25. Akhmanova, A., Steinmetz, M. Microtubule +TIPs at a glance. J. Sci. 20 (Pt 20), 3415-3419 (2010).
  26. Dixit, R., Barnett, B., Lazarus, J., Tokito, M., Goldman, Y., Holzbaur, E. Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (2), 492-497 (2009).
  27. Grishchuk, E. L., Efremov, A. K., et al. The Dam1 ring binds microtubules strongly enough to be a processive as well as energy-efficient coupler for chromosome motion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (40), 15423-15428 (2008).
  28. Akiyoshi, B., Sarangapani, K. K., et al. Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments. Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).
  29. McIntosh, J. R., Grishchuk, E. L., et al. Fibrils Connect Microtubule Tips with Kinetochores A Mechanism to Couple Tubulin Dynamics to Chromosome Motion. Cell. 135 (2), 322-333 (2008).
  30. Powers, A. F., Franck, A. D., et al. The Ndc80 kinetochore complex forms load-bearing attachments to dynamic microtubule tips via biased diffusion. Cell. 136 (5), 865-875 (2009).
  31. Umbreit, N. T., Gestaut, D. R., et al. The Ndc80 kinetochore complex directly modulates microtubule dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (40), 16113-16118 (2012).
  32. Gell, C., Bormuth, V., et al. Microtubule Dynamics Reconstituted In Vitro and Imaged by Single-Molecule Fluorescence Microscopy. Methods Biol. 95, 221-245 (2010).
  33. Dixit, R., Ross, J. L. Studying Plus-End Tracking at Single Molecule Resolution Using TIRF Microscopy. Methods Cell Biol. 95, 543-554 (2010).
  34. Beausang, F. J., Sun, Y., Quinlan, E. M., Forkey, N. J., Goldman, Y. Construction of Flow Chambers for Polarized Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (polTIRFM). Cold Spring Harbour Protoc. 6, 712-715 (2012).
  35. Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D. N., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP Hydrolysis in Microtubule Dynamics: Information from a Slowly Hydrolyzable Analogue, GMPCPP. Mol. Biol. Cell. 3, 1155-1167 (1992).
  36. Grishchuk, E. L., Ataullakhanov, F. I. In Vitro Assays to Study the Tracking of Shortening Microtubule Ends and to Measure Associated Forces. Methods Cell Biol. 95, 657-676 (2010).
  37. Gutiérrez-Medina, B., Block, S. M. Visualizing individual microtubules by bright field microscopy. Am. J. Phys. 78 (11), 1152-1159 (2010).
  38. Volkov, V. A., Zaytsev, A. V., et al. Long tethers provide high-force coupling of the Dam1 ring to shortening microtubules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (19), 7708-7713 (2013).
  39. Laan, L., Pavin, N., et al. Cortical dynein controls microtubule dynamics to generate pulling forces that position microtubule asters. Cell. 148 (3), 502-514 (2012).
  40. Myster, S. H., Knott, J. A., O'Toole, E., Porter, M. E. The Chlamydomonas Dhc1 gene encodes a dynein heavy chain subunit required for assembly of the I1 inner arm complex. Mol. Biol. Cell. 8, 607-620 (1997).
  41. Lombillo, V. A., Coue, M., McIntosh, J. R. In vitro motility assays using microtubules tethered to Tetrahymena pellicles. Methods Cell Biol. 39, 149-165 (1993).
  42. Hyman, A., Chrétien, D., Arnal, I., Wade, R. Structural changes accompanying GTP hydrolysis in microtubules: information from a slowly hydrolyzable analogue guanylyl-(alpha,beta)-methylene-diphosphonate. J. Cell Biol. 128 (1-2), 117-125 (1995).
  43. Park, M., Kim, H., Kim, D., Song, N. W. Counting the Number of Fluorophores Labeled in Biomolecules by Observing the Fluorescence-Intensity Transient of a Single Molecule. Bull. Chem. Soc. Jap. 78, 1612-1618 (2005).
  44. Welburn, J. P. I., Grishchuk, E. L., Backer, C. B., Wilson-Kubalek, E. M., Yates, J. R., Cheeseman, I. M. The human kinetochore Ska1 complex facilitates microtubule depolymerization-coupled motility. Dev. Cell. 16 (3), 374-385 (2009).
  45. Efremov, A., Grishchuk, E. L., Mcintosh, J. R., Ataullakhanov, F. I. In search of an optimal ring to couple microtubule depolymerization to processive chromosome motions. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (48), 19017-19022 (2007).
  46. Itoh, T., Hisanaga, S., Hosoi, T., Kishimoto, T., Hotani, H. Phosphorylation states of microtubule-associated protein 2 (MAP2) determine the regulatory role of MAP2 in microtubule dynamics. Biochemistry. 36 (41), 12574-12582 (1997).
  47. Oguchi, Y., Uchimura, S., Ohki, T., Mikhailenko, S. V., Ishiwata, S. The bidirectional depolymerizer MCAK generates force by disassembling both microtubule ends. Nat. Biol. (6), 1-8 (2011).
  48. Kishino, A., Yanagida, T. Force measurements by micromanipulation of a single actin filament by glass needles. Nature. 334, 74-76 (1988).
  49. Borisy, G. G., Marcum, J. M., Olmsted, J. B., Murphy, D. B., Johnson, K. A. Purification of tubulin and associated high molecular weight proteins from porcine brain and characterization of microtubule assembly in vitro. Ann. NY Acad. Sci. 253, 107-132 (1975).
  50. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S., Kirschner, M. W. A Protein Factor Essential for Microtubule Assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72 (5), 1858-1862 (1975).
  51. Widlund, P. O., Podolski, M., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Mol. Biol. Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
  52. Hyman, A., Drechsel, D., et al. Preparation of Modified Tubulins. Methods Enzymol. 196, 478-485 (1991).

Tags

Basis Protocol microscopie stroom kamer enkel-molecuul fluorescentie laser val microtubuli-bindend eiwit microtubuli-afhankelijke motor microtubuli tip tracking
Voorbereiding van Segmented Microtubules om Motions Gedreven door het demonteren uiteinden van microtubuli Studie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Volkov, V. A., Zaytsev, A. V.,… More

Volkov, V. A., Zaytsev, A. V., Grishchuk, E. L. Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends. J. Vis. Exp. (85), e51150, doi:10.3791/51150 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter