Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Utarbeidelse av segment mikrotubuli å studere bevegelser drevet av demontering mikrotubulus Ends

Published: March 15, 2014 doi: 10.3791/51150
Automatic Translation
1,2, 3, 3
1Center for Theoretical Problems of Physicochemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences, 2Federal Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Moscow, Russia, 3Physiology Department, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

Summary

Mikrotubuli er iboende ustabile polymerer, og deres veksling mellom vekst og forkortelse er stokastisk og vanskelig å kontrollere. Her beskriver vi protokoller ved hjelp av segmenterte mikrotubuli med photoablatable stabiliserende caps. Depolymerization av segmenterte mikrotubuli kan utløses med høy tidsmessig og romlig oppløsning, og dermed hjelpe analyse av bevegelser med demontering microtubule endene.

Abstract

Microtubule depolymerisering kan gi kraft til å transportere forskjellige proteinkomplekser og protein-belagte perler in vitro. De underliggende mekanismene er antatt å spille en viktig rolle i de microtubule avhengige kromosom bevegelser under celledeling, men de relevante proteiner og deres eksakte roller er dårlig definert. Således er det et økende behov for å utvikle analyser som brukes til å studere slike motility in vitro ved hjelp av rensede komponenter og definert biokjemiske miljø. Mikrotubuli, derimot, er iboende ustabile polymerer, deres veksling mellom vekst og forkortelse er stokastisk og vanskelig å kontrollere. Protokollene vi beskriver her dra nytte av segmenterte mikrotubuli som er gjort med den photoablatable stabiliserende caps. Depolymerization av slike segmenterte mikrotubuli kan utløses med høy tidsmessig og romlig oppløsning, og dermed hjelpe studier av motilitet ved demontering microtubule endene. Denne teknikken kan brukes til carry med en kvantitativ analyse av antallet molekyler i fluorescently merkede protein komplekser, som beveger processively med dynamisk microtubule ender. For å optimalisere et signal-til-støy-forholdet i denne og andre kvantitative fluorescerende analyser, bør dekkglass behandles for å redusere ikke-spesifikk absorpsjon av løselige fluorescensmerket-merkede proteiner. Detaljerte protokoller er anordnet for å ta hensyn til ujevnheter av fluorescerende lys, og å bestemme intensiteten av en enkelt fluorofor ved hjelp av like langt gaussisk form. Til slutt beskriver vi bruk av segmenterte mikrotubuli å studere microtubule avhengige bevegelser av protein-belagt microbeads, og gir innsikt i evnen til ulike motor-og nonmotor proteiner til par microtubule depolymerization til processive cargo bevegelse.

Introduction

Mikrotubuli er svært konservert cytoskeletal strukturer som er viktige for cellulær arkitektur, cellemotilitet, celledeling, og intracellulær transport en. Disse dynamiske polymerer montere fra tubulin i nærvær av GTP, og de ​​slår spontant mellom vekst og forkorte 2. Mikrotubuli er meget tynn (bare 25 nm i diameter) derfor spesielle optiske teknikker for å forbedre kontrasten bør brukes til å observere mikrotubuli med et lysmikroskop. Tidligere arbeid med disse polymerer undersøkt deres dynamiske oppførsel ved hjelp av kontrast differensial forstyrrelser (DIC) 3. Denne og lignende studier in vitro viste at under typiske eksperimentelle forhold, mikrotubuli gjennomgå katastrofe og bryteren til depolymerization bare sjelden, en gang hver 5-15 min (denne frekvensen er for 7-15 mm løselig tubulin konsentrasjon undersøkt ved 28-32 ° C ) 4.. Forskjellige teknikker har således vært foreslått å induce microtubule depolymerisering på en kontrollert måte. Microtubule matfett kan utløses ved å vaske vekk oppløselig tubulin 5,6, skjære mikrotubuli med en laserstråle 7, eller ved hjelp av segmenterte mikrotubuli 8, slik det er beskrevet her. Tidligere arbeid ved bruk av segmenterte mikrotubuli, i tillegg til stokastisk koblings polymerer har funnet at små intracellulære last, slik som kromosomer, vesikler, og protein-belagte perler, kan bevege seg ved endene av matfettet mikrotubuli 9-13. Dette fenomenet er antatt å ha en direkte implikasjon for kromosom bevegelser i mitotiske celler, og de ​​underliggende mekanismene er for tiden under aktiv etterforskning 14-16.

Nylig har fluorescerende-baserte teknikker, inkludert total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi, blitt ansatt for å studere motilitet med dynamisk microtubule ender 17-24. Fordelen med denne metoden er at den tillater undersøkelse av interaksjonens mellom mikrotubuli og microtubule bindende proteiner i sanntid ved hjelp av proteiner merket med forskjellige fluorophores. Flere protein komplekser ble funnet å flytte processively med elongating og / eller forkorte microtubule ender. De omfatter microtubule-assosiert proteiner Dam1 10,12,18, Ska1 19, og XMAP215 20, samt kinesin motorer Kif18A 21,22, MCAK 23 og CENP-E 24. Disse proteinene vise processive tip-sporing, noe som er fundamentalt forskjellig fra de klassiske tip-sporing proteiner som EB1 25. Selv EB1 molekyler og de ​​tilhørende partnere ser ut til å være stabilt forbundet med dynamisk microtubule ender, kan de individuelle molekyler forblir bundet til microtubuli spissen for bare ~ 0,8 sek, i rask utveksling med det oppløselige bassenget 26.. I kontrast, processive tip-trackere, som Dam1, reise med microtubule ender for mange mikron, og deres tilknytning til microtubule tips kan vare for mnoen sekunder. Spissen krets tid, i tillegg til den resulterende hastighet på sporing, avhenger sterkt av hvor mange molekyler som danner spiss-sporing kompleks 27. Større protein ensembler er vanligvis mye bedre tip-trackere. For eksempel kan slike komplekse sammenstillinger som de isolerte gjær kinetochores forbli koblet til microtubule ender i timevis 28. Noen microtubule-bindende proteiner, f.eks Ndc80 kinetochore proteinkompleks, har blitt funnet å være ute av stand til å følge med microtubule ender ved en enkelt molekyl-nivå, men Ndc80 er svært effektiv i å kople bevegelsen av vulsten last 19,29-31. Derfor, for å forstå mekanismen for tip-sporing av forskjellige proteinkomplekser, så vel som deres biologiske roller, er det viktig å undersøke tip-sporing som en funksjon av antallet molekyler i tupp-sporing kompleks, så vel som for å fastslå evnen til disse kompleksene for å oppvise kollektiv motilitet på overflaten av vulsten last.

(Figur 1a). For det første er de kommersielt tilgjengelige glassplater modifisert for å feste korte polyetylenrør (protokoll 1). Den gjenbrukmikros flyt kammeret er deretter satt sammen fra en slik sklie og kjemisk eller plasma-renset og silanbehandlet dekkglass (protokoll 2) 32-34. Den resulterende kammervolum er bare 20 til 25 pl (eller så lite som 15 pl, note 3 i protokoll 1), inklusive volumet av innløpsslangen. Kommersielt tilgjengelige strømningskamrene kan også benyttes, men deres volum er vanligvis større, noe som fører til unødvendig sløsing av proteiner. Hvis et større kammer anvendes, bør volumet av alle løsninger i protokollene nedenfor skaleres proporsjonalt. Microtubule frø blir deretter fremstilt for eksempel ved bruk av langsomt hydrolyserbar GTP analog, GMPCPP (Guanosine-5'-[(α, β)-methyleno] trifosfat) (protokoll 3, se også Hyman <em> et al. 35). Frøene blir immobilisert på en renset dekkglass og overflaten deretter blir sperret for å forhindre ikke-spesifikk absorpsjon av andre proteiner 32 (protokoll 4 beskriver frø immobilisering ved hjelp av Digoxigenin). De segmenterte mikrotubuli kan deretter fremstilles ved bruk av Protocol 5. Den viktigste begrunnelsen for denne tilnærmingen er at dynamiske microtubule polymerer, som danner i nærvær av GTP, kan stabiliseres midlertidig ved å legge de korte "caps" av stabile tubulin segmenter, som inneholder GMPCPP. Disse hetter også inneholde Rhodamine merkede tubulin, slik at de kan fjernes ganske enkelt ved å lyse opp synsfelt med en 530 til 550 nm laser eller kvikksølv buelampen (Protokoll 6) 36. Fluorescens intensiteten av tip-sporing signal kan deretter brukes til å beregne antallet molekyler som reiser med demontering microtubule endene, tar hensyn til ujevnheter i mikroskop feltet belysning (Protokoll 7). En tilsvarende metode kan benyttesfor å studere interaksjoner mellom depolymerisering av mikrotubuli og protein-belagte perler, fremstilt som beskrevet i 27 (protokoll 8). Noen proteiner lett vil binde seg til veggene av segmenterte mikrotubuli, men laser pinsett kan også brukes til å holde vulsten i nærheten av mikrotubulus veggen, for derved å fremme binding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Nødvendig utstyr: Eksperimentene beskrevet nedenfor krever et lysmikroskop utstyrt for DIC, og fluorescens-avbildning (tabell 1). Bright feltet LED-belysning kan brukes til å forbedre oppdagelse av dekk-festet microtubule frø 37, som er vanskelig å observere med en vanlig halogenlampe. For å kontrollere væskestrøm i mikros kamre, bør oppløsningene omsettes med en peristaltisk pumpe som kan strømningshastigheter 10-100 mL / min. En sprøytepumpe kan også brukes, men forsiktighet må utvises for å unngå luftlommer som kan dannes når strømningshastigheten endres brått. For håndtering av protein-belagte perler, for eksempel for å bringe dem i nærheten av den segmenterte microtubule vegg, kan en 1064 nm kontinuerlig bølgelaserstråle føres inn i mikroskopet optiske akse og rettet med høy numerisk apertur objektiv (1,3 eller høyere) for å produsere en felle. For kvantitativ analyse av det fluorescerendeIntensiteten av enkle molekyler eksiteringslyset skal leveres av en laser-basiskilde ettersom intensiteten av denne lyskilden er mer stabil enn den som genereres av en kvikksølvlampe. For å minimalisere mekaniske vibrasjoner, bør mikroskopet plasseres på et optisk bord. Mer sofistikert utstyr er nødvendig for å undersøke bevegelsen av kulene ved depolymerisering av mikrotubuli ender under en konstant kraft, og til å måle de enkeltskudd styrkesignaler 11,38,39, vil disse fremgangsmåter beskrives andre steder.

En. Manufacturing Gjenbruk Flow Chambers

Glass for gjenbrukbare strømnings kamre kan bestilles fra en lokal glass produksjonsanlegg ved hjelp av skjematisk i figur 1B (se tabell 2 for detaljer om vår leverandør). Med ultralyd fresing modifisere vanlige objektglass (75 mm x 25 mm, 1,0 mm tykke) for å gjøre to spor 15 ± 1 mm lang, 1,0 ± 0,1 mm bred og 0,8 ± 0,05 mm dype.Avstanden mellom de nærmeste endene skal være 14 ± 1 mm, denne avstanden er optimal for et kammer sammen med 22 mm x 22 mm dekkglass. Se tabell 2 for en liste over andre materialer.

  1. Plasser en 100 mm lang polyetylen-rør (OD 0,61 mm, tabell 2) i hvert spor i dekselet, og etterlater ~ 5 mm overheng på de indre ender av sporene. Rørene legges inni sporene med cyanoakrylat lim, embedding rørene helt inne i sporene.
  2. Fylle sporene med epoksy-lim, og samtidig unngå søl av limet inne i rørene. La limet tørke for ~ en dag.
  3. Med et skarpt barberblad kutte størknet lim massen 3-4 mm fra den distale ende av hver festestedet, å fjerne de deler proksimalt til midten av lysbildet. Rørene bør forbli i sine spor. Fjerne proksimale deler vil også kutte og fjerne de indre overheng, og skaper et flatt underlag med to tube åpninger.
  4. Fyll en sprøyte med vann og testom rørene fungerer som de skal. Hvis væsken strømmer fritt, sette en dråpe av epoksy-lim (~ 5 mm i diameter) ved de ytre ender av de lunder, tørre etter 1 dag (Fig. 1D). Dette vil gjøre kamrene mer holdbare, slik at de kan brukes flere ganger for flere måneder.
    Note 1: For å lage et kammer for en invertert mikroskop, bør skinnene modifiseres i tillegg til å gjøre to små hull i de motsatte ender av sporene (figur 1C). Sett rørene gjennom hullene i raset, bøyer rør og passe dem tett inne i sporene (Figur 1E). Følg trinn 1,2 til 1,4, men fjerner epoksylim fra hele overflaten, som vil bli brukt til å lage en strømningskammeret.
    Merknad 2: For å redusere kammervolum, bruker fresing å lage to fordypninger 0,050 ± 0,005 mm dype, forlater den sentrale delen av raset 5,0 ± 0,5 mm bred og litt forhøyet (se "etset områder" på figurene 1B og 1C). Når than flyte kammer er montert (som beskrevet nedenfor), plasser dobbeltsidig tape inni disse fordypningene.
    Note 3: For å gjenbruke disse modifiserte lysbilder, etter å ha avsluttet forsøkene fjerne dekkglass og dobbeltsidig tape med et barberblad. Fjern tetningsmasse ved å skrelle den av og ved å tørke lysbildet med 70% etanol. Plasser lysbildet i en beholder med 1-2% av en lab oppvaskmiddel, feste slangen til en peristaltisk pumpe og perfuse 50-70 ml, følger med tilsvarende volum av avionisert vann, tørke og lagre i et støvfritt rommet.

2. Utarbeidelse av Dekk

Denne protokollen tar 6-8 timer og vil bidra til å forberede 12 dekkglass. Du vil trenge en keramisk dekkholder og tre dekk flekker krukker med lokk, jar volumet skal være 15 ml, slik at hver vil holde fire Dekk stablet sammen. Et glass med et lokk (250 ml) skal brukes for å inkubere Dekkglass med silan. Bruk vanlige No.1 glass dekkglass (22 mm x 22 mm eller to2 mm x 30 mm, se tabell 2 og 3 for en liste over materialer). Alle trinn skal utføres i et avtrekksskap, mens iført hansker.

  1. Sett Dekk inn i glass dekkglass flekker krukker og fylle glassene med aceton. Inkuber i 1 time, vaskes 10 ganger med avionisert vann.
  2. Inkuber Dekkglass 10 min med etanol og vaskes på nytt 10 ganger med avionisert vann.
  3. Forbered "piraja" løsning. Sett 60 ml hydrogenperoksidoppløsning (30% i vann) i en varmebestandig glassbeholder og langsomt tilsett 100 ml svovelsyre (sluttforhold mellom syre og hydrogenperoksidløsning er 05:03). Løsningen vil varme opp, dette er normalt, men vær forsiktig. Piranha løsning er ekstremt etsende! Bruk tykk laboratoriefrakk, hansker og vernebriller!
  4. Fyll dekk flekker krukker med "piraja" løsning, lukke lokkene og sett glassene i et vannbad forvarmet til 90 ° C i 1 time.
  5. Hell av "piraja" solutipå og forkaste som instruert av sikkerhetsbestemmelsene på din arbeidsplass. Vask Dekk 10x med avionisert vann.
  6. Fyll dekk flekker krukker med 0,1 M KOH, inkuber 10 min, og vaske 10x med avionisert vann. Dette vil nøytralisere eventuelle syrerester igjen på Dekk etter "piraja" behandling.
  7. Tørre Dekk ett om gangen ved å holde hver dekkglass med teflonbehandlede flate kanter pinsett (for å minimere skader på en glassflate) og samtidig blåser komprimert tørr nitrogen. Pass på at dekkglass er tørket helt, fordi silanløsning er svært reaktive med vann.
  8. Stable tørkede Dekk i keramiske holdere (12 Dekk pr holder), som skal være grundig predried med nitrogen. Hold den keramiske holdere dekket for å unngå støv fester seg til dekkoverflaten.
  9. Dekk bunnen av 250 ml glasskrukke (6 cm i diameter) med Molecular Sieves, Grade 564, for vann-absorpsjon.
  10. Fyll glasset med 200 mlPlusOne Repel silanløsningen og sakte dyppe en keramisk holder med dekkglass i en krukke, lukker lokket og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur. Dette vil skape hydrofobt belegg på dekkflaten.
  11. Sakte fjerne holderen med dekkglass fra glasset og overføring Dekk en av gangen inn i dekk flekker krukker fylt med metanol.
  12. Plasser en metall-eller glass søyle inn i vannreservoaret i et sonisk bad, slik at dekk farging glasset er neddykket til 2/3 av høyden. Sonicate ved 70 V i 20 minutter, endre metanolløsning hver 5 min, og deretter tørkes 10 ganger med avionisert vann. Hvis silanization arbeidet riktig, vil Dekk vises tørr når fjernet fra vannet.
  13. Grundig fjerne eventuelt gjenværende vann ved hjelp av nitrogen, som ovenfor.
  14. Interlay Dekkglass med Kimwipes å unngå bakke-til-overflate kontakt mellom dekkglass. Dekk kan lagres i en lukket beholder i flere uker i romtemperatur.
    Note 1: Trinn 02.01 til 02.06 kan erstattes ved å rense Dekkglass med Plasma Cleaner for 15 min på 30 W, noe som reduserer den totale forberedelsestid. Trykket inne i rengjøringskammeret er innstilt på 100 til 200 mTorr. Både atmosfærisk og komprimert oksygen kan anvendes. Stable plasma-renset Dekk i keramiske holdere og fortsett til trinn 2.7.

Tre. Utarbeidelse av GMPCPP-stabilisert microtubuli Seeds

Denne fremgangsmåten vil ta ~ 1 time, og de resulterende microtubule frøene er stabile i 1-2 dager ved romtemperatur. Se tabell 4 for en liste av reagenser.

  1. Bland på is:
    • 10 mL umerkede tubulin (100 mikrometer, Tabell 4) i BRB-80 buffer (80 mm rør, en EGTA, 4 mM MgCl 2, pH 6,9 med KOH; supplement med 1-2 mM DTT hjelp frisk porsjon for hvert forsøk).
    • 2,6 mL Digoxigenin-merket tubulin (Tabell 4). Juster volumet avhengig av forberedelse,slik at det endelige forhold mellom stemplet til umerket tubulin er ~ 1:10. Bland godt med pipettering.
    • 1,4 pl 10 mM GMPCPP (sluttkonsentrasjon 1 mM)
  2. Inkuber 15 min ved 35 ° C, vil frøene vokse 2-3 um lang. Juster tid hvis forskjellig microtubule lengde er nødvendig.
  3. Legg 35 mL BRB-80 (forvarmet til 35 ° C), blandes ved pipettering, og sentrifuger i 15 min ved 25 000 x g for å pelletere frøene ved romtemperatur.
  4. Kast supernatant, vask pelleten ved å forsiktig legge til og fjerne 50 mL av varm BRB-80.
  5. Resuspender pellet godt i 25 mL BRB-80.

4. Vedlegg av microtubule frø til Dekk

Protokoller 4 og 5 krever 2-3 timer, slik at to strømningskammere er brukt per dag.

  1. Monter strømningskammeret i henhold til produsentens instruksjoner ved hjelp silanbehandlede Dekk og fortsett til trinn 4.2. Hvis du bruker spesiallagde dekkglass (protokoll 1), følg trinnene below.
    1. Fest to stykker av dobbeltsidig tape (5 mm x 30 mm) langs den sentrale ~ 5 mm bredt område, sette silanbehandlet dekk fast på toppen av båndet, trykk.
    2. Fylle kammeret med BRB-80 gjennom et av rørene, og koble begge rør med rund tannpirkere.
    3. Klem en liten dråpe to-farget Kwik Cast fugemasse på toppen av en liten plast petriskål, og bland raskt, men grundig med en tannpirker. Fugemassen blir grønt, gjelder umiddelbart, nøye tetting av alle kanter av dekkglass. Hvis tette penetrerer også dypt under dekkglass, åpne en av rørene ved å fjerne tannpirker pluggen og trykk forsiktig for å hindre fugemasse lekker inne i rørene.
    4. La kammeret tørke i 10 min, og bekrefter at strømmen ikke er begrenset før du fortsetter videre.
  2. Plasser kammeret i et objektbord forvarmet til 32 ° C, og feste av en av rør til en pumpe, som pumper væsken ut. Lengden av innløpsrøretbør minimaliseres for å unngå unødvendig tap av reagenser: Anbefalt lengde er 5-7 cm. Fordyp dette ende i en 0,5 ml hetteglass med BRB-80 buffer. Dette og alle løsningene nedenfor bør forvarmet til 32-35 ° C.
  3. Bruke et lett trykk med en pumpe eller bare løfte enden av utløpsrøret for å presse ut de luftbobler, som kan danne noen ganger når innløpsrøret plugg.
  4. Sett pumpehastighet på 100 mL / min. Vask med to kammer volumer av anti-Digoxigenin antistoffer utvannet 01:30 i BRB-80, inkuber 15 min å tillate antistoff adsorpsjon.
  5. Vask med 5-10 volumer av varmt kammer BRB-80, inkuberes 10 minutter med 1% Pluronic F-127 i BRB-80 for å blokkere den hydrofobe overflaten av silanbehandlet dekkglass.
  6. Vask med 5-10 kammervolumer motilitet buffer (BRB-80 supplert med 0,4 mg / ml kasein).
  7. Reduser pumpehastigheten til 10 mL / min og perfuse microtubule frø utvannet 1:200-1:600 ​​i 30-40 mL motilitet buffer. Inkuber 15 kmn å fremme binding av frøene til dekkglass-adsorbert antistoffer.
  8. Vask kammeret ved 100 mL / min med 400 ul av motilitet buffer for å fjerne alt ubundet materiale.
    Note 1: Den resulterende densitet av frø bør være 10-30 per mikroskop felt (figur 2A). For å feilsøke, bruker fluorescensmerkede tubulin under polymerisasjon (trinn 3.1) for enklere påvisning av dekk-festet frø.
    Note 2: Axonemes fremstilt fra Chlamydomonas 40 eller andre biologiske kilder, i tillegg til de pellicles av lyserte og deciliated Tetrahymena-celler 41 kan også brukes som microtubule nukleatorer. Disse nukleatorer er nyttig for å lage små microtubule matriser, og er å foretrekke når mikrotubuli med bestemt antall protofilamenter er ønskelig (GMPCPP seedet nucleates en microtubule som inneholder ≥ 14 protofilaments 42). Disse konstruksjoner kan festes til de rensede Dekkglass med ikke-spesifikk absorpsjon, men attachment er vanligvis mindre stabilt sammenlignet med antistoff-basert vedlegg, spesielt når du bruker de silanbehandlede Dekk.

5. Utarbeidelse av segmentert mikrotubuli

Alle løsningsvolum nedenfor er for kammervolum 15-20 jil, øke proporsjonalt hvis større kammer benyttes.

  1. Prewarm umerket tubulin blanding (45 pl motilitet buffer supplert med 1 mM Mg-GTP og med 10 til 15 uM umerket tubulin) i 30 sekunder ved 35 ° C. Perfuse på 30 mL / min.
  2. Monitor microtubule vekst med DIC optikk (figur 2B, Video 1). I løpet av 5-7 min inkubasjon mikrotubuli vokser vanligvis ~ 10 mikrometer lang.
  3. Forbered Rhodamine-tubulin blanding (65 pl motilitet buffer supplert med 0,5 mM GMPCPP og 2-5 uM av Rhodamine merkede tubulin med 0,5-1 molare forholdet mellom Rhodamine til tubulin), og varme opp-løsning ved 35 ° C i 30 sek.
  4. Perfuse umiddelbart på 30 μl / min. Inkuber i 8-10 min å fremme dannelsen av stabile fluorescerende caps på microtubule tips. Stabile microtubule segmentene vil også nucleate spontant og vil være synlig med DIC optikk.
  5. Vask kammeret godt med 100 mL av motilitet buffer ved 20 mL / min for å fjerne tubulins og nukleotider, så vel som oppløselige microtubule fragmenter.
  6. Med DIC, bekrefter at mikrotubuli er synlig (figur 2D); sine tall, men bør reduseres fordi mange mikrotubuli demontere under tildekking (Video 2 viser et typisk felt med segmenterte mikrotubuli).
    Note 1: Segmented mikrotubuli er meget stabilt og kan brukes i minst 2 timer. Imidlertid er levetiden til disse mikrotubuli synker med overdreven oppløsning utveksling, eller dersom 2-merkaptoetanol brukes i bildebufferen.

6. Eksperimentell Observasjon av Protein Tracking med depolymerisering mikrotubulus Ends

  1. Introduce 30-50 pl av fluorescerende protein (0,1 til 20 nM) inn i kammeret ved 10 mL / min. Hvis proteinet stikker til dekkglass er tydelig, supplere motilitet buffer med 4-8 mg / ml BSA. Alexa488-Dam1 tip-sporing i tillegg krever 10 mM DTT eller 0,5-1% βME 10.
  2. Begrens belysning feltet ved hjelp av et mikroskop feltblenderen å unngå unødvendig bleking og demontering av mikrotubuli.
  3. Begynn video innsamlingen med GFP filter kube, deretter bytte til Rhodamin filter kube uten å avbryte bildeopptak. De røde segmenter ved microtubule endene skal være godt synlig, de vil begynne å falme og gå i oppløsning raskt (Video 3).
  4. Fortsett å lyse før caps nesten forsvinner (vanligvis i 10-20 sek, men denne gangen blir lengre for de caps vokst med en lavere Rhodamin merking ratio), og bytte tilbake til GFP kanal for å ta opp protein sporing med microtubule demontering.
  5. Analyserresulterende sekvenser ved å konstruere kymographs, det vil si to-dimensjonale bilder som viser fluorescens-intensiteten langs aksen microtubule for forskjellige tidspunkt i løpet av observasjons) ved hjelp MetaMorph, fritt tilgjengelig ImageJ eller annen bildebehandling (figur 2E).
    Note 1: Oppkjøp Hastigheten bør justeres avhengig av timingen av de observerte hendelsene. Den anbefalte prisen er 2-3 bilder per sekund (fps) for saktegående, ring-sized Dam1 komplekser 27, men oppkjøpet tid for enkle molekyler bør være> 20 fps 19.
    Note 2: En svært følsom EMCCD, f.eks ANDOR iXon3, er nødvendig for rask registrering av tip-sporing hendelser med depolymerisering mikrotubuli. De anbefalte innstillingene for Andor iXon3 kamera er: gain 5x, EM får 200, 1 MHz avlesning hastighet, 16-bit sensor modus, 80 msek eksponeringstid.
    Note 3: Ved hjelp av TIRF mikros vil forbedre signal-til-støy-forhold, men kortere mikrotubuli som skal brukes, for eksempel that fluorescerende stabiliserende caps holde seg innenfor rekkevidden av flyktige feltet.

7. Kvantitativ analyse av den molekylære størrelsen av microtubule Tip-sporing Komplekser

Begrunnelsen for denne fremgangsmåte er å bestemme antall molekyler i et tip-sporing kompleks ved å finne forholdet mellom total fluorescerende intensitet av spissen sporings kompleks til intensiteten av en enkelt fluorofor. Denne tilnærmingen kan brukes til GFP-protein fusjoner og proteiner merket med fluorescerende fargestoffer, men det kan undervurdere antall molekyler i tip-sporing komplekser hvis noen proteinmolekyler i forberedelsene er ikke selvlysende.

  1. Rekordfotobleking kinetikk for fluorescensmerkede proteinmolekyler.
    1. Monter vanlig mikroskammeret ved hjelp av en nonmodified glass, to strimler av dobbeltsidig tape, og en ren dekkglass, som kan være forberedt på å bruke hele protokoll 2, eller bare noen skritt 2,1-2,6 av detteprotokoll.
    2. Legg ca 50 nM protein i motilitet buffer, vaske kort med motilitet buffer og forsegle kammeret med VALAP (Tabell 4). Optimalproteinkonsentrasjon for å oppnå feltet med jevnt dispergerte flekker (figur 3A), som representerer enkle molekyler og deres små aggregater (trimerer og tetramerer, som kan dannes spontant i oppløsning eller kan forekomme når flere enkelt-molekyler er nær hverandre, og kan ikke løses) . Dette trinn er meget viktig for å oppnå en multi-peak fordeling av photobleaching trinn og nøyaktig bestemmelse av en trinnstørrelse (se nedenfor).
    3. Minimer belysning laser intensitet der de enkelte fluorescerende flekker er fortsatt synlig, med lavere belysning av fotobleking tiden blir forlenget, kan så lenger photobleaching spor oppnås. Også minimalisere eksponeringstiden for å redusere sannsynligheten for mer enn en fluorofor bleking i løpet av en ramme. Anbefalt innstillingfor Andor iXon3 kamera: gain 5,0 x, EM få 999, 10 MHz avlesning hastighet, 50-100 msek eksponeringstid.
    4. Fokus på overflaten av dekkglass, lukke belysning lukker, flytte til en frisk felt, åpne belysning lukker og hente bilder til alle komplekser har bleket (deretter kalt img (x, y)).
  2. Korriger de oppkjøpte bilder for ujevnheter i belysning (Figur 3B).
    1. Forbered løsning på noe Fluoroforen, f.eks en mikrometer Fluorescein (FITC) i BRB-80. En slik løsning kan være forberedt på forhånd, alikvoteres og lagret ved -20 ° C.
    2. Sett sammen et kammer som i avsnitt 7.1.1, men bruker en vanlig dekkglass. Legg Fluoroforen løsning og forsegle kammeret ved hjelp VALAP.
    3. Samle> 50 bilder av hele mikroskop feltet: flytte scenen til et nytt ubleket området mens belysningen lukkeren er lukket, og skaffe bildene umiddelbart etter åpning av lukkeren.
      4. (Figur 3C). Det resulterende bilde representerer fordelingen av lysintensiteten av feltet (Illum (x, y), hvor x-og y svarer til piksel koordinater).
    4. Bestem maksimal pixel lysstyrke av dette bildet (Max (Illum)).
    5. Med den lukkede belysning lukkeren og bruke samme kamerainnstillinger som i punkt 7.2.3 erverve ett bilde, bestemme den gjennomsnittlige pikselintensiteten av dette bildet, denne verdien tilsvarer CN, kamerastøy.
    6. Bruke de ovennevnte verdier og bilde (Illum (x, y)) for å normalisere den eksperimentelle bilde (img (x, y)) ved bruk av følgende uttrykk:

      Bruk det resulterende bildet img norm (x, y) for den kvantitative analyse av brightness av de stasjonære fluorescerende komplekser, og også for å normalisere bilder med tips Slående komplekser (Figur 3D).
  3. Bestem intensitet av en enkelt fluorofor.
    1. Ved hjelp av normaliserte bilder img norm (x, y) og en hvilken som helst bildebehandlingsprogram velge et fluorescerende sted med en sirkulær region (5-6 piksler i diameter) og bestemme dens integrert intensitet for alle rammer, generering av fotobleking spor. Unngå svært lyse prikker (> 5 ganger lysere enn de dimmer seg).
    2. Bruke samme sirkulær region verktøy, velge minst tre stikkfrie områder, generere de tilsvarende fotobleking spor, gjennomsnitt og passer med eksponentiell.
    3. Tabulere denne bakgrunn intensitetskurven for å matche de eksperimentelle tidspunkter og trekke det fra fotobleking kurver.
    4. Glatt fotobleking kurver (gjennomsnitt med skyvevindu på 3-5 poeng). Inspiser de resulterende kurver ogforkaste enhver kurve som viser en brå økning i fluorescens eller mangel på åpenbare bleke (figur 3E).
    5. For hver av de gjenværende kurver (vanligvis 50-70% av det totale antall kurver), visuelt å velge den endelige vidde, da det fluorescerende flekk er bleket. Forkorte dette segmentet å forlate bare ~ 100 poeng og gjennomsnittlig disse intensiteter. Trekk fra denne verdi fra den forkortede fotobleking kurve for å minimalisere små variasjoner er bakgrunnsnivå, og for å redusere størrelsen av bakgrunns peak (nedenfor).
    6. Plott et histogram av intensitetene for alle tidspunkter fra 20 eller flere fotobleking kurver (> 1000 time poeng). Histogrammet skal fremvise minst fire tydelige topper (se note 2).
    7. Monter histogram med like langt Gaussian distribusjon 10,43 MATLAB, Mathematica eller lignende programvare (Figur 3F):

      wher en i og σ i, d og n er passende parametre. Parametere A I og σ i svarer til amplitude og bredde i-te topp, d er avstanden mellom toppene, n er heltall, som svarer til det totale antall topper i fordelingen. Ved sentrene for de første tre eller flere topper viser et visuelt godt samsvar montert linje, vil avstanden mellom toppene (parameter d) svarer til en fluorescerende intensitet av en enkelt fluorofor.
      Merknad 1: Antall undersøkte punkter (§ 7.3.6) bør økes dersom mikros system avslører så store vibrasjoner eller det er en annen kilde til støy (f.eks ustabil laserstråle).
      Merknad 2: Det er viktig å få> 3 topper for nøyaktig analyse med like langt Gaussian passform. Dersom færre topper oppnås, kan den falske (f.eks dobbel) trinnstørrelse oppnåsnår belysning forholdene ikke er optimale, er f.eks når prikkene bleke altfor raske og enkle trinn som ikke løses godt.
  4. Bestem den molekylære størrelse av spissen sporings kompleks.
    1. Bruk bilder samlet inn med protokoll 6 og velg de første 2-4 rammer som ble overtatt umiddelbart etter åpning av lukkeren. Dersom feltet er belyst i noen tid før spissen sporing ble observert, anslå den opprinnelige intensitet av kinetikken av fotobleking under de samme eksperimentelle betingelser.
    2. Gjennomsnittlig de markerte rammer og normalisere det resulterende bildet som i § § 7.2.5-7.2.7.
    3. Mål integrert intensitet av den fluorescerende tip-sporing kompleks bruker samme region størrelse som i avsnitt 7.3.1.
    4. Mål integrert intensitet av tre bakgrunnsområder som ligger nær tuppen-sporing kompleks og bruker samme region, gjennomsnittlig disse verdiene og trekke fra intensiteten av tip-sporing kompleks av § 7.4.3. Beregn antall fluoroformolekyler i komplekset ved å dividere den fluorescerende intensitet erholdt i avsnitt 7.4.4 av intensiteten av det indre fluoroforen erholdt i avsnitt 7.3.5.
      Merknad 1: Det er ønskelig at innstillingene for belysning og oppkjøp for protokoll 7.4 er de samme som i protokoll 7.1. Hvis enten eksponeringstid eller laserintensiteten ble justert i løpet av denne fremgangsmåten, bør de resulterende fluorescerende verdiene skalert deretter. Imidlertid bør nøyaktigheten av en slik skalering verifiseres av tenkelig samme prøve (for eksempel fluorescerende tid) under disse forskjellige forhold, og beregning av forholdet mellom de resulterende intensiteter.

8. Microtubuli Tip-sporing av Protein Coated Perler

  1. Gjennomføre forsøk med tip-sporing perler ved å utløse MT demontering som i protokollen seks. Intensitet av DIC lyskilde bør reduseres for å tillate visning av Rhodamine fluorescens samtidig medDIC bildebehandling.
  2. Klargjør perlene som i Grishchuk et al. 10 og Asbury et al. 11. Innføre 30-50 pl av perlesuspensjon inn i kammeret ved 10 mL / min. Den foreslåtte perle konsentrasjonen er 10 -16 -10 -17 M.
  3. Hvis du bruker oppreist mikroskop, fjerne kammeret fra mikroskopet scenen og snu det for 5-10 min å tillate perler å sedimentere på dekkglass. Dette fremmer en bedre binding av vulsten til mikrotubuli tjoret til dekkglass, men denne fremgangsmåte er ikke vellykket med 0,5 mikrometer polystyren-perler, som viser liten tyngdekraft-baserte sedimentering i løpet av så kort tid.
  4. Velg en limstreng som er festet til dekkglass-bundet microtubule; vulsten skal bevege seg i en klar bue 44 (fig. 4A). Den tethered Listen skal være plassert 1-3 mikrometer vekk fra dekkoverflaten, som er godt synlig på grunn av sporadisk dekk-festet perler som forblir motionless.
  5. Bytt til Rhodamin filter kube og begynne å samle inn bilder mens du bruker DIC belysning.
  6. Åpen lukker å belyse imaging-feltet (begrenset med et feltblender) med en kvikksølvlampe eller 530-550 nm laser. Fortsett opptaket til bead løsner eller beveger seg med demontering microtubule slutten (Tall 4D, 4F, og 4G).
    Note 1: Optisk felle kan anvendes for å fremme samvirke mellom microtubule veggen og protein-belagte perler. Dette er spesielt nyttig når du arbeider med perler belagt med kinesin motorer (Tall 4E-G). Følg samme protokollene som ovenfor, men supplere bevegelighet buffer med 2 mM Mg-ATP. I trinn 8.3, fange en frittflytende perle med 1064 nm laserstråle, flytte scenen for å bringe fanget perle nærmere segmentert microtubuli veggen. Begynn bildebehandling med lite lys DIC og via Rhodamin filter kuben og vente på perle å begynne å gå mot avkortet microtubule slutten. AkterER det rettet perle bevegelse blir observert, lukke lukkeren for fangst bjelke og åpne lukkeren for fluorescerende belysning. Fortsett opptaket til bead løsner eller spor med demontering microtubule slutten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protein sporing med depolymerisering microtubule ender. Gjær kinetochore komponent Dam1 er uten tvil den beste spissen-tracker av depolymerisering microtubule slutter 14. Denne 10-subenheten kompleks merket med GFP kan lett uttrykk og renset fra bakterieceller 18,38, så vi anbefaler å bruke det som en positiv kontroll for tipset-sporing analysen. En fluoriserende protein som sporer med depolymerisering enden av en microtubule blir sett på som en lys fluorescerende flekk stadig beveger seg mot dekk-festet frø (Video 3). Det vil også vises som en skrå linje på en tilsvarende kymograph (figur 2E). I kontrast, dersom proteinet ikke klarer å tippe-spor, forkorter microtubule uten å vise anrikning i fluorescerende signal på mikrotubulus enden, slik som vist for human Ndc80-GFP-komplekset 19 (fig. 2F). Når processive sporing er observert, frekvensen av microtubule kortking kan bli bestemt ved å spore det bevegelige punkt eller ved å måle helningen av den skrå linje på den tilsvarende kymograph. Dette kan gi informasjon om styrken på protein-microtubule end bindende 45. Proteiner som binder seg sterkt til microtubuli, som Dam1 ring komplekse, senke hastigheten av microtubule depolymerization. Denne effekten er imidlertid sterkt avhengig av størrelsen på tip-sporing kompleks og de ​​små komplekser kan utøve liten eller ingen virkning på hastigheten av microtubule demontering 27.. Således bør endringen i frekvensen av microtubule matfettet tolkes i lys av størrelsen på tip-sporing kompleks. Under visse forhold kan sporing være ledsaget av en økning i lyshet på tip-sporing kompleks, ettersom den depolymerisering end "samler" the protein som var bundet til microtubuli gitteret. I dette tilfellet frekvensen av depolymerization bremser ofte ned samtidig med den økende størrelsen på spissen-tracking kompleks. I andre tilfeller kan forholdet er mer komplisert. For eksempel er mange subenheter av Dam1 proteinkompleks, hvori GFP ble konjugert ved N-terminus av Dam1 subenhet, kan samles opp ved slutten av matfettet microtubule (figur 2G). Microtubule demontering slutt boder, antagelig fordi den kraft microtubule depolymerization er ikke sterk nok til å flytte komplekser som er for store. Demontering ofte gjenopptas etter en nedgang i spissen lysstyrke, noe som indikerer dissosiasjon av noen av tip-forbundet Dam1 subunits 10. Grundig undersøkelse av disse forholdene er viktig fordi microtubule bindende proteiner som ikke sporer processively kan også senke hastigheten av microtubule demontering 19,31,46.

Bead sporing med depolymerisering microtubule ender. Mange microtubule bindende proteiner har allerede blitt identifisert som koblinger for microbead bevegelse med dynamisk microtubule ender 5,11,27,39,47. Påfallende, kan selv de Ndc80 protein kompleks opprett microtubuli slutten tip-sporing av perlene 29,30. Vanligvis binding mellom protein-belagt perler og mikrotubuli er sterk, så når perler er lagt til mikroskammeret de binder seg lett til de segmentert, dekk-festet mikrotubuli (Figur 4A). Det er ikke alltid mulig å definitivt se med DIC enten vulsten ble festet til bare én microtubule. Vi har utviklet flere kriterier for å unngå å ta opp perlene som har dannet vedlegg til flere mikrotubuli. Først bør en vulst som er festet til en microtubule viser en lysbue-lignende bevegelse, som microtubuli dreies litt rundt området for sin vekst fra dekselet sikkert festet frø (figur 4B). For det andre, når den stabiliserende hetten er tent, bare ett rødt segment bør sees distalt fra frø og vulsten (figur 4C). Hetten kan ofte sees following perlen sin bue-lignende bevegelse før hetten blekemidler (Video 4). For det tredje, bør vulsten motion (eller dets løsgjøring) observeres kort etter at hetten er bleket og retningen av vulsten bevegelse bør være i samsvar med microtubule orientering, som ble utledet basert på de ovenfor angitte observasjoner. For det fjerde, siden microtubule forkorter og perlen beveger seg mot frø, bør amplituden av de bue-lignende oscillasjoner redusere (figur 4D).

Ved sporing av vulsten er meget processive, som vist i figur 4D, er disse kriteriene er ofte tilfredsstilt. Men hvis perlen sporing er ikke processive, etter noen innledende rettet bevegelse perlen løsner og begynner å spre tilfeldig. Ved større perler, for eksempel 1 um glassperler, er dette termisk bevegelse langsom nok til at det kan mistolkes som en bue-inneholdende bevegelse med matfettet microtubule ende. En formell kriterium basert på omfanget avvulsten kan avvike fra det lineære spor kan brukes for å diskriminere slike hendelser 29. I vårt tidligere arbeid vi beregnet gjennomsnitts perle utflukter over microtubule aksen og anslått at dersom denne verdien overskredet 0,4 mikrometer / 1 mikrometer av microtubule-parallell perle bevegelse, perlen var sannsynlig å spre tilfeldig med 95% sikkerhet. Ved hjelp av dette tiltaket fant vi at selv i "kontroll" kulepreparater, f.eks kuler belagt med ikke-spesifikk eller streptavidin-belagte perler brukes i forbindelse med biotinylerte mikrotubuli, 5% av perler ble dømt til å flytte processively. Hvis større nøyaktighet er ønskelig å overvåke bevegelser av perler med lav processivity, anbefaler vi å bruke en laser felle, der de rettet perle bevegelser er lettere å identifisere.

Laser felle bør også brukes hvis perlene ikke klarer å danne varige vedlegg til stabile mikrotubuli. Vi brukte en laserstråle for å fange kuler belagt med ulike protein konstruerer av PLUs-end-regisserte kinesin CENP-E og til "Launch" slike perler på segmentert microtubule vegger (figur 4E) 24. I nærvær av ATP disse perlene beveger seg raskt (20-25 um / min) mot avkortet microtubule pluss ender, på en kymograph, slik bevegelse resulterer i en skrå linje rettet mot hetten (figurene 4F og 4G). Etter at hetten er ødelagt, en vulst belagt med den avkortede CENP-E-protein løsner fra microtubuli (grønn pil på figur 4F). Imidlertid kan den fulle lengde CENP-E protein opprett perle bevegelse i motsatt retning, dvs. mot minus microtubule slutten (Video 5). Som et resultat av den kymograph for slike perler viser en sikk-sakk-mønster, som indikerer tilstedeværelse av både pluss-og minus-ende ende rettet bevegelser av kuler belagt med full lengde, og ikke avkortet CENP-E. Vi forventer at andre microtubule avhengige motorer kan utvise lignende motilitet 5,13

Figur 1
Figur 1. Flow kammer for in vitro studier med segmenterte eller dynamiske mikrotubuli. A. Diagram av et segmentert microtubule (MT). Stabile MT frø er forberedt med Digoxigenin (DIG)-merket tubulin og GMPCPP, festet til dekk via anti-DIG antistoffer. Ikke-spesifikk binding til tubulin, og andre proteiner som er blokkert med Pluronic F127. Mikrotubuli er utvidet fra frøene ved hjelp umerket tubulin og GTP, og disse utvidelsene er avkortet med korte segmenter som inneholder Rhodamin merket tubulin og GMPCPP (i rødt). MT Plus end (merket med +) kan vanligvis være distinguished av en mye kortere end minus (-)-B-og C-.. Detaljerte ordninger for den endrede strømningskammeret glir å bruke med oppreist og invertert mikroskop. Sonic plasser er vist i gult. Tallene er i millimeter. D og E. Visninger siden av modifiserte lysbilder (ikke i målestokk) med tilhørende rør;. Tykke piler indikerer væskestrøm gjennom rørene etter kamrene er ferdig montert (ikke vist) Klikk her for å se større bilde.

Fig. 2
Figur 2. Utarbeidelse av segmenterte mikrotubuli og typisk protein tip-sporing av resultater. A. Dekkglass-festet microtubule frø visualized med DIC optikk (trinn 4.8 i protokollen), piler peker på noen av frøene. Bildet er et gjennomsnitt av 10 rammer avsøkt sekvensmessig (100 msek eksponering hver). B. Samme mikroskop banen etter tubulin-og GTP ble inkubert i 8 minutter ved 32 ° C, blir mikrotubuli sett stråler ut fra frøene (trinn 5.2 i protokollen). C. En pseudo-farget bilde som viser en segmentert mikrotubulus sett i DIC (grønt) og de ​​Rhodamin-merket stabiliserende caps (piler), sett med epifluorescence (rød). D. Samme trykk som i panel C, men med et større synsfelt. Noen rhodamin holdig microtubule fragmenter, som nucleate spontant i løsningen under trinn 5.2 av protokollen, er også sett (pilspisser). E. Kymograph av Dam1-GFP protein spore demontering microtubule slutten. Fargekodede barer til venstre viser et fluorescerende kanalen som brukes for erverv av den tilsvarende delen av kymograph. VertiCal fluorescerende linjer er opprettet av de Dam1-GFP komplekser som binder seg til microtubuli veggen og viser liten bevegelse til microtubuli slutten kommer av. F. Kymograph som på E men med GFP merket Ndc80 kompleks 19. I utgangspunktet er mikrotubulus dekorert jevnt, selv om økt GFP fluorescens observeres ved avkortet ende etter Rhodamine eksitasjon. Denne økningen er avhengig av den oppløselige pool av Ndc80-GFP protein, men den underliggende mekanisme er ikke kjent. Etter hetten går i oppløsning, blir microtubule forkorte tydelig, men det er lite berikelse av fluorescens ved mikrotubulus spissen, som indikerer en mangel på tip-sporing. G. Avstanden fra tuppen-sporing Dam1 flekken til axoneme, som ble brukt for microtubule nucleation i dette eksperimentet 10, ble målt ved hjelp av MetaMorph sporpunktene.Du drop-in. Den opprinnelige hvithet på det bevegelige kompleks svarer til omtrent 15 subenheter: nok til å danne en enkelt Dam1 ring. Lysstyrken på the flytte komplekset ble normalisert til intensiteten av dekkglass-festet, urørlig fluorescerende flekker å korrigere for bleking. Horisontale skala barer: panelene A, B, D (10 mikrometer), paneler C, F, E (3 mm). Vertikale skala barer: 10 sek. Klikk her for å se større bilde.

Figur 3
Figur 3. Kvantitativ analyse av fluorescerende signaler. A. Eksempel bilde av mikroskop feltet med Dam1-Alexa488 komplekser bundet nonspecifically til dekkoverflaten. Merk heterogenitet i punkter lysstyrke og ujevnheter i belysning. Målestokk er 2 mikrometer. B. Kvantitativ representasjon av det samme bilde som i panel A. C D. Normalisert bilde fra panel A plottet som intensitet overflaten ved hjelp av Mathematica 9 (Wolfram forskning). Legg merke til at denne flaten er flatere enn på B og toppene er mindre heterogen i høyde. E. Eksempler på fotobleking kurvene oppnådd med CENP-E-GFP protein. Den integrerte intensitet for hvert punkt ble samlet inn, normalisert å ta hensyn til ujevnheter i belysningen og kurver ble glattet (gjennomsnitt med skyvevindu av 5 poeng). Signaler i den øverste raden ble ekskludert fra videre analyse av grunner som er beskrevet i punkt 7.3.4. Kurver som de som vises i den nederste raden ble videre bearbeidet og brukt til å bygge et histogram på panel F, som beskrevet i punkt 7.3.4-7.3.5. F ng>. Histogram av integrerte intensiteter samlet inn fra 22 bleking CENP-E-GFP prikker (totalt 1900 datapunkter). Rød linje er passende med like langt Gaussisk funksjon; fem tydelige topper blir sett. Den integrerte intensitet av en enkelt GFP fluorofor bestemmes ut fra dette histogram ble (64,7 ± 1,1) x 10 4 au G. Typisk fotobleking kurve for Dam1-Alexa488, behandles som beskrevet i protokollen 7.3.5. H. Histogram av integrerte intensiteter samlet inn fra 48 photobleaching Dam1-Alexa488 prikker (totalt 1548 datapunkter), 4 forskjellige toppene er sett. Den integrerte intensiteten av en Alexa488 molekyl under disse forholdene var (17,4 ± 0,8) x 10 3 au Klikk her for å se større bilde.

es/ftp_upload/51150/51150fig4.jpg "/>
Figur 4. Illustrasjon av bevegelser av microtubule-assosiert perler. A. Skjematisk av forsøket med kuler belagt med microtubule bindende proteiner. Tykke piler indikerer retningen av microtubule demontering. B. Maksimal intensitet projeksjon av DIC bilder av en GFP-Dam1 belagt perle, som er stabilt festet til en segmentert microtubule (basert på 26 bilder). Bead viste bue-lignende bevegelse (pil), noe som tyder på at det var knyttet til en microtubule orientert som vist med en stiplet linje. C. Enkelt bilde av samme vulsten som i panel B, men tatt under trinn 8.6 i protokollen umiddelbart etter det fluorescerende lukkeren åpnet. Pilen peker til den fluorescerende cap ligger nær perle, men på motsatt side fra microtubuli festestedet. D. En maksimal intensitet projeksjon viser banen perlen bevegelse med disassembling microtubule. Bilde ble opprettet fra 115 rammer ervervet sekvensielt fra starten av imaging (merk buelignende projeksjon) og inntil perle sin avløsning (Video 4). E. Skjematisk av forsøket med kuler belagt med pluss-end-regisserte kinesin CENP-E. Vulsten er brakt i kontakt med microtubule ved hjelp av laser-felle. Fellen er da slått av og perlen begynner å bevege seg mot microtubule pluss slutten. Etter microtubuli-stabiliserende cap er fjerne og mikrotubulus demonteres, reverserer perle retning av sin bevegelse. F. Kymograph viser en 0,5 mikrometer perle belagt med avkortet X. laevis CENP-E kinesin beveger seg mot microtubule pluss slutten 24. Etter perlen reiste ca 1 mikrometer, ble fluorescerende lukkeren åpnes (rød søyle), og den stabiliserende cap ble synlig (rød pilspiss). Perlen frittliggende plutselig (grønn pilspiss), formodentlig når motoren påtraff forkorte microtubule slutten. G Klikk her for å se større bilde.

Video 1. Utarbeidelse av segmenterte mikrotubuli. Video viser DIC bilder av et mikroskop feltet under utarbeidelse av segmenterte mikrotubuli. Imaging starter etter microtubuli frø har allerede festet til dekkglass. Små runde prikker er fra partikler som finnes i vår forberedelse av anti-Digoxigenin antistoffer. Etter tubulin og GTP er lagt, mikrotubuli begynne å forlenge fra frøene (trinn 5.2). Etter de når ønsket lengde (8-15 mm), er løsningen utveksles raskt å innføre Rhodaminated tubulin og GMPCPP. Under utveksling, microtubule polymerer sving i direction av strømning, men etter at pumpen er stoppet, antar de den unstrained retning. Under den følgende "capping" stadium, begynner noen tubulin til å polymerisere spontant og små microtubule fragmenter er sett flytende i kammeret. De er fjernet under den etterfølgende vaske (trinn 5.5), som også fjerner all oppløselig tubulin og nukleotider. I løpet av disse stadiene noen mikrotubuli ikke klarer å sette sammen de robuste caps, og når løselig tubulin er vasket bort de demontere raskt. De avkortet mikrotubuli, men er stabil i flere timer med mindre de er opplyst; når Rhodamin er spent, caps bli fragmentert, og de uavdekkede microtubule segmentene blir utsatt. Bildene ble kjøpt hvert sekund, spilt på 30 fps.

Video to. Uncapping av segmenterte mikrotubuli. Videoen viser en ferdig montert segmentert mikrotubulus via DIC, etterfulgt av fluorescerende bilder av samme microtubule via Rhodamin filter kube. En briktig rødt segment ved enden av microtubule (pil) beveger seg i bue og blekner fort på grunn av foto-bleking. Bilder kjøpt til 6 fps og spilt på 10 fps.

Video 3. Protein sporing med depolymerisering microtubule slutten. En segmentert mikrotubulus (MT) er synlige takket være design av GFP-merket Dam1, som danner atskilte punkter (grønne bilder). Rhodamine fluorescens blir da spent og den røde hetten blir synlig, beveger seg i en slak bue ved enden av microtubule (rød-bilder), resten av mikrotubulus er ikke synlig, fordi den merkede tubulin ble innarbeidet bare ved polymer ende. Hetten bleker raske, begynner å smuldre, og fluorescerende kuben er byttet tilbake til GFP, akkurat i tide til å se starten av forkorting av microtubule segment som ikke har Rhodaminated tubulin og GMPCPP. Når depolymerisering slutten når de Dam1 prikker, blir microtubuli slutten lyse grønt. Deretter, en grønn fluorescensnt sted er sett beveger seg med demontering microtubuli, illustrerer processive tip-sporing. Konsentrasjon av Dam1 var 3 nM, bildene ble kjøpt og spilt på 0,4 fps. Scale bar 5 mikrometer.

Video 4. Perle sporing med depolymerisering microtubule ender. Glass perle belagt med Dam1 er sett beveger seg i en bue, noe som indikerer at det er tjoret til dekkglass av en microtubule. Når Rhodamin fluorescens er opphisset, er den røde hetten sett distalt fra perle og beveger seg synkront med perle bevegelse (bilder i rødt). Snart begynner vulsten bevegelige retnings, mens dens bue-lignende bevegelse avtar i amplitude (figur 4D). DIC bildene ble anskaffet via Rhodamin filter kube hver 300 msek og spilte 6 fps; perle er en mikrometer, skala bar 5 mikrometer.

Video fem. Kinesin belagt perle flytte begge veier på den segment microtubule. Imaging starter etter perlen coated med full lengde CENP-E kinesin ble plassert på microtubuli (MT) vegg. Arrow poeng til den første perle posisjon. Perlen er sett beveger seg bort fra pilen, som motoren går mot pluss microtubule slutten. Kort tid etter at pluss-endedeksel lyser (pilspiss, røde bilde), begynner vulsten til å bevege seg i motsatt retning. Bare full lengde CENP-E kinesin kan par bevegelse av vulsten til forkortelse microtubule ende. Kuler belagt med avkortet CENP-E kan gå mot pluss-MT slutten, men de løsner snart etter microtubuli depolymerization utløses (sammenlign Tall 4F og 4G). DIC bildene ble kjøpt hver 1 sek og spilt på 16 fps; perle er 0,5 mikrometer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mange eneste molekyl analyser i dag rutinemessig bruker spesialbehandlede Dekk å drastisk redusere uspesifikke protein stikker. Prosedyren vi beskriver her er en endring av den opprinnelige protokoll utviklet i Howard lab 32, og vi finner at silanizing Dekkglass er vel verdt innsatsen selv med DIC-basert perle analyser, som ikke bruker fluorescens. Chambers sammenføyd med en slik dekk viser mye renere flater, og de oppnådde resultater i nærvær av løselige mikrotubulus-bindende protein er mer reproduserbar, særlig hvis en meget lav proteinkonsentrasjon anvendes.

De mest kritiske trinnene for vellykket utarbeidelse av segmenterte MTS er:

  1. optimalisering av tubulin konsentrasjon og inkubasjonstid (trinn 05.01 til 05.02). Tidene og konsentrasjoner gitt i protokollen er omtrentlige og kan variere på grunn av forskjeller i tubulin preparater, kammervolum osv.
  2. spesifikke og stramfeste av microtubule nukleatorer for dekkglass, og
  3. evnen til å kontrollere strømningshastigheten nøyaktig. I våre hender, er de beste resultatene oppnås når forsøk er utført i de forseglede flyt kamre.

Den største fordelen med denne protokollen er at microtubule depolymerization kan utløses med høy tidsmessig og romlig oppløsning, og dermed hjelpe analyse av bevegelser på demontering microtubule endene. Med denne teknikken kan buffere endres hurtig og microtubule-bindende proteiner og perler kan tilsettes i en rekke buffere etter mikrotubuli har dannet. Dette gir mulighet for å studere virkningene av et protein på microtubule depolymerization atskilt fra dens mulige roller i microtubule montering. Dette er nyttig hvis proteinet kan også samhandle med løselig tubulin, som kan maskere sine interaksjoner med mikrotubuli. Imidlertid, siden fri, upolymerisert tubulin er til stede i cellen, må det utvises forsiktighet whøne tolke fysiologiske betydningen av slike resultater.

Den viktigste begrensningen av segmentert microtubule tilnærming er at det ikke er egnet til å studere bevegelser under microtubule montering, eller effekten av sporing proteiner på microtubule katastrofe og redning. For disse spørsmålene analyser med dynamiske mikrotubuli som dyrkes i nærvær av oppløselige tubulin er mer hensiktsmessig. En annen begrensning ved denne metoden er at motilitet buffere bør være fri for oxygen-scavenging enzymer. Slike enzymblandinger, kan for eksempel basert på katalase-og glukose-oksidase 48, i betydelig grad forbedrer levetiden av fluorescerende molekyler. Men hvis disse reagensene brukes i den segmenterte microtubule analysen, er den foto-induksjon av demontering sjelden fordi microtubule caps blekemiddel uten desintegrering. I kvantitative fluorescens-analyser, bør frekvensen av bleke alltid tas hensyn til, som beskrevet ovenfor, eller for eksempel i referanse23, spesielt hvis anti-blekemidler ikke er i bruk.

Flere microtubule bindende proteiner testet i segmentert microtubule analysen viste fortrinnsrett binding til de Rhodamin-merket stabiliserende caps vs de umerkede microtubule segmenter. Binding til hettene kan redusere fraksjonen av processive perler, da hetten assosierte perler ofte løsne fra microtubuli når kapselen oppløses. Til slutt konstaterer vi at dersom motor-belagte perler går mot pluss microtubuli ender veldig fort, de ofte nå de røde caps før microtubule depolymerization utløses, og da vil de også distansere fra microtubuli og slikt eksperiment vil ikke være produktiv .

I sammendrag, evne til microtubule-bindende proteiner uten iboende motorisk aktivitet til å følge matfettet enden av en microtubule er en interessant, men dårlig forstått fenomen. De protokoller som er beskrevet her skulle bistå studier av slike proteins og deres egenskaper i vitro. Microtubuli depolymerization avhengig transport spiller en viktig rolle i kromosom segregering under mitose. Dermed håper vi at teknikkene som beskrives her vil til slutt bidra til å få mer innsikt i mekanismene for celledeling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke FI Ataullakhanov for å bidra til å utvikle og produsere gjenbruk flyt kamre, N. Dashkevich, N. Gudimchuk og A. Korbalev for å gi bilder for tall, N. Gudimchuk og P. Zakharov for å utvikle en protokoll og gi reagenser til forberede Digoxigenin-merket microtubule frø, A. Potapenko for hjelp med tekstredigering og andre medlemmer av Grishchuk lab for tips og diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet delvis av NIH gi GM R01-098389 og en pilot stipend fra Pennsylvania Muscle Institute til ELG, som er en Kimmel Scholar, etter RFBR bevilger 12-04-00111-en 13-04-40190-H og 13 -04-40188-H, Russian Academy of Sciences Presidiet Grants (Mekanismer av Molecular Systems Integration and Molecular and Molecular Cell Biology programmer) til FI Ataullakhanov, NIH gi GM R01 GM033787 til JR McIntosh, og en Dmitry Zimin dynastiet Foundation postdoktorstilling til VAV

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Table 1. Microscopy and other equipment.
Microscope Zeiss
Nikon		 Axio Imager 2
Eclipse Ti		 other microscope models capable of DIC and epifluorescence-imaging can be used
Objective Zeiss
Nikon		 420490-9900-000
CFI Apo 100x Oil 1.49		 100X, DIC, 1.3-1.49 NA
Objective heater Bioptechs 150803, 150819-19
Fluorescent filter cube Chroma 49004 or 49008
41017 or 49020		 optimized for Rhodamine fluorescence 
optimized for GFP fluorescence
Acquisition software freeware MicroManager
Molecular Devices		 not applicable
MetaMorph 7.5		 http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/
other software can be used to acquire images and for a particle tracking
EMCCD camera Andor iXon3, DU-897E-cs0-#BV Highly sensitive EMCCD camera
Trapping laser IPG Photonics YLR-10-1064-LP 1,064 nm laser, 10 W
Fluorescence excitation lasers Coherent, Inc.
Coherent, Inc.		 Sapphire 488 LP
Sapphire 552 LP		 excitation of green fluorophores
excitation of red fluorophores
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-001
Commercial flow chambers Warner Instruments RC-20 or RC-30
Perfusion pump Cole Palmer
Harvard Apparatus		 Masterflex 77120-52
Pico Plus		 Both pumps provide the required rate of liquid flow but a peristaltic pump may pulse at very slow speed. The flow with a syringe pump is more consistent for a wide range of rates but this pump has inertia. 
Table 2. Microscopy chamber preparation.
Modified microscope slides for reusable chambers Precision Glassblowing of Colorado Custom order www.precisionglassblowing.com Sonic slots in slides using schematics in Figure 1
Polyethylene tubing Intramedic 427410 I.D. 0.58 mm, O.D. 0.965 mm; use these tubes to connect assembled chamber to the pump and waste container
Polyethylene tubing Intramedic 427400 I.D. 0.28 mm, O.D. 0.61 mm; use these tubes to make the reusable chamber
Regular microscope slides VWR 48312-003 Other similar slides can be used
Coverslips VWR 48393-150, 48366-067 Other similar coverslips can be used
Silicon sealant World Precision Instruments KIT, SILICON SEALANT 5 MIN CURE
Epoxy glue Loctite 83082
Cyanoacrylate adhesive Scotch 3M AD114 Or cyanoacrylate adhesive from other manufacturers
Table 3. Coverslips cleaning and coating.
Molecular Sieves, Grade 564 Macron 4490-04
Coverglass Staining Jar Ted Pella, Inc. 21036
Coverslip Ceramic Holder Thomas Scientific 8542e40
PlusOne Repel Silane GE Healthcare Biosciences 17-1332-01
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
Anti-digoxigenin AB Roche Applied Science 11093274910
Table 4. Preparation of seeds and segmented microtubules.
Tubulin purified from cow brains
Cytoskeleton, Inc
T238P		 For purification protocols see 49–51
Unlabeled porcine tubulin
Labeled tubulin Cytoskeleton, Inc
Invitrogen
Invitrogen		 TL590M
C1171 (Rhodamine)
A-2952 (Digoxigenin)		 Rhodamine-labeled porcine tubulin
Tubulin can be labeled with any amine-reactive dye as in reference52.
GMPCPP Jena Biosciences NU-405 Aliquot and store at -70 °C
VALAP Vaseline, lanolin, and paraffin at 1:1:2 by mass see reference9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 13, 83-117 (1997).
  2. Mitchison, T. M., Kirschner, M. W. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (15), 237-242 (1984).
  3. Walker, R. A., Brien, O., et al. Dynamic Instability of Individual Microtubules Analyzed by Video Light Microscopy: Rate Constants and Transition Frequencies. J. Cell Biol. 107, 1437-1448 (1988).
  4. Gardner, M. K., Zanic, M., Gell, C., Bormuth, V., Howard, J. Depolymerizing Kinesins Kip3 and MCAK Shape Cellular Microtubule Architecture by Differential Control of Catastrophe. Cell. 147 (5), 1092-1103 (2011).
  5. Lombillo, V. A., Stewart, R. J., McIntosh, J. R. Minus-end-directed motion of kinesin-coated microspheres driven by microtubule depolymerization. Nature. 373, 161-164 (1995).
  6. Franck, A. D., Powers, A. F., Gestaut, D. R., Gonen, T., Davis, T. N., Asbury, C. L. Tension applied through the Dam1 complex promotes microtubule elongation providing a direct mechanism for length control in mitosis. Nat. Cell Biol. 9 (7), 832-837 (2007).
  7. Tran, P. T., Walker, R. A., Salmon, E. D. A metastable intermediate state of microtubule dynamic instability that differs significantly between plus and minus ends. J. Cell Biol. 138 (1), 105-117 (1997).
  8. Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R. Force production by disassembling microtubules. Nature. 438, 384-388 Forthcoming.
  9. Coue, M., Lombillo, A., Richard, J. Microtubule Depolymerization Promotes Particle and Chromosome Movement In Vitro. J. Cell Biol. 112 (6), 1165-1175 (1991).
  10. Grishchuk, E. L., Spiridonov, I. S., et al. Different assemblies of the DAM1 complex follow shortening microtubules by distinct mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (19), 6918-6923 (2008).
  11. Asbury, C. L., Gestaut, D. R., Powers, A. F., Franck, A. D., Davis, T. N. The Dam1 kinetochore complex harnesses microtubule dynamics to produce force and movement. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (26), 9873-9878 (2006).
  12. Westermann, S., Wang, H. -W., Avila-Sakar, A., Drubin, D. G., Nogales, E., Barnes, G. The Dam1 kinetochore ring complex moves processively on depolymerizing microtubule ends. Nature. 440 (7083), 565-569 (2006).
  13. Grissom, P. M., Fiedler, T., Grishchuk, E. L., Nicastro, D., West, R. R., Mcintosh, J. R. Kinesin-8 from Fission Yeast A Heterodimeric , Plus-End – directed Motor that Can Couple Microtubule Depolymerization to Cargo Movement. Mol. Biol. Cell. 20, 963-972 (2009).
  14. McIntosh, J. R., Volkov, V., Ataullakhanov, F. I., Grishchuk, E. L. Tubulin depolymerization may be an ancient biological motor. J. Sci. 123, 3425-3434 (2010).
  15. Grishchuk, E. L., McIntosh, J. R., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I. Force generation by dynamic microtubule polymers. Compr. Biophys. 4, 93-117 (2012).
  16. Asbury, C. L., Tien, J. F., Davis, T. N. Kinetochores' gripping feat: conformational wave or biased diffusion. Trends Cell Biol. (1), 38-46 (2011).
  17. Tien, J. F., Umbreit, N. T., et al. Cooperation of the Dam1 and Ndc80 kinetochore complexes enhances microtubule coupling and is regulated by aurora B. Cell Biol. 189 (4), 713-723 (2010).
  18. Gestaut, D. R., Graczyk, B., et al. Phosphoregulation and depolymerization-driven movement of the Dam1 complex do not require ring formation. Nat. Biol. 10 (4), 407-414 (2008).
  19. Schmidt, J. C., Arthanari, H., et al. The Kinetochore-Bound Ska1 Complex Tracks Depolymerizing Microtubules and Binds to Curved Protofilaments. Dev. Cell. 23 (5), 968-980 (2012).
  20. Brouhard, G. J., Stear, J. H., et al. XMAP215 is a processive microtubule polymerase. Cell. 132 (1), 79-88 (2008).
  21. Stumpff, J., Du, Y., et al. A Tethering Mechanism Controls the Processivity and Kinetochore-Microtubule Plus-End Enrichment of the Kinesin-8 Kif18A. Mol. Cell. 43 (5), 764-775 (2011).
  22. Su, X., Qui, W., Gupta, M., Pereira-Leal, J., Reck-Peterson, S. L., Pellman, D. Mechanisms underlying the dual-mode regulation of microtubule dynamics by Kip3/kinesin-8. Mol. Cell. 43 (5), 751-763 (2011).
  23. Helenius, J., Brouhard, G., Kalaidzidis, Y., Diez, S., Howard, J. The depolymerizing kinesin MCAK uses lattice diffusion to rapidly target microtubule ends. Nature. 441 (7089), 115-119 (2006).
  24. Gudimchuk, N., Vitre, B., et al. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive bi-directional tracker of dynamic microtubule tips. Nat. Cell Biol. 15 (9), 1079-1088 (2013).
  25. Akhmanova, A., Steinmetz, M. Microtubule +TIPs at a glance. J. Sci. 20 (Pt 20), 3415-3419 (2010).
  26. Dixit, R., Barnett, B., Lazarus, J., Tokito, M., Goldman, Y., Holzbaur, E. Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (2), 492-497 (2009).
  27. Grishchuk, E. L., Efremov, A. K., et al. The Dam1 ring binds microtubules strongly enough to be a processive as well as energy-efficient coupler for chromosome motion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (40), 15423-15428 (2008).
  28. Akiyoshi, B., Sarangapani, K. K., et al. Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments. Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).
  29. McIntosh, J. R., Grishchuk, E. L., et al. Fibrils Connect Microtubule Tips with Kinetochores A Mechanism to Couple Tubulin Dynamics to Chromosome Motion. Cell. 135 (2), 322-333 (2008).
  30. Powers, A. F., Franck, A. D., et al. The Ndc80 kinetochore complex forms load-bearing attachments to dynamic microtubule tips via biased diffusion. Cell. 136 (5), 865-875 (2009).
  31. Umbreit, N. T., Gestaut, D. R., et al. The Ndc80 kinetochore complex directly modulates microtubule dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (40), 16113-16118 (2012).
  32. Gell, C., Bormuth, V., et al. Microtubule Dynamics Reconstituted In Vitro and Imaged by Single-Molecule Fluorescence Microscopy. Methods Biol. 95, 221-245 (2010).
  33. Dixit, R., Ross, J. L. Studying Plus-End Tracking at Single Molecule Resolution Using TIRF Microscopy. Methods Cell Biol. 95, 543-554 (2010).
  34. Beausang, F. J., Sun, Y., Quinlan, E. M., Forkey, N. J., Goldman, Y. Construction of Flow Chambers for Polarized Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (polTIRFM). Cold Spring Harbour Protoc. 6, 712-715 (2012).
  35. Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D. N., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP Hydrolysis in Microtubule Dynamics: Information from a Slowly Hydrolyzable Analogue, GMPCPP. Mol. Biol. Cell. 3, 1155-1167 (1992).
  36. Grishchuk, E. L., Ataullakhanov, F. I. In Vitro Assays to Study the Tracking of Shortening Microtubule Ends and to Measure Associated Forces. Methods Cell Biol. 95, 657-676 (2010).
  37. Gutiérrez-Medina, B., Block, S. M. Visualizing individual microtubules by bright field microscopy. Am. J. Phys. 78 (11), 1152-1159 (2010).
  38. Volkov, V. A., Zaytsev, A. V., et al. Long tethers provide high-force coupling of the Dam1 ring to shortening microtubules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (19), 7708-7713 (2013).
  39. Laan, L., Pavin, N., et al. Cortical dynein controls microtubule dynamics to generate pulling forces that position microtubule asters. Cell. 148 (3), 502-514 (2012).
  40. Myster, S. H., Knott, J. A., O'Toole, E., Porter, M. E. The Chlamydomonas Dhc1 gene encodes a dynein heavy chain subunit required for assembly of the I1 inner arm complex. Mol. Biol. Cell. 8, 607-620 (1997).
  41. Lombillo, V. A., Coue, M., McIntosh, J. R. In vitro motility assays using microtubules tethered to Tetrahymena pellicles. Methods Cell Biol. 39, 149-165 (1993).
  42. Hyman, A., Chrétien, D., Arnal, I., Wade, R. Structural changes accompanying GTP hydrolysis in microtubules: information from a slowly hydrolyzable analogue guanylyl-(alpha,beta)-methylene-diphosphonate. J. Cell Biol. 128 (1-2), 117-125 (1995).
  43. Park, M., Kim, H., Kim, D., Song, N. W. Counting the Number of Fluorophores Labeled in Biomolecules by Observing the Fluorescence-Intensity Transient of a Single Molecule. Bull. Chem. Soc. Jap. 78, 1612-1618 (2005).
  44. Welburn, J. P. I., Grishchuk, E. L., Backer, C. B., Wilson-Kubalek, E. M., Yates, J. R., Cheeseman, I. M. The human kinetochore Ska1 complex facilitates microtubule depolymerization-coupled motility. Dev. Cell. 16 (3), 374-385 (2009).
  45. Efremov, A., Grishchuk, E. L., Mcintosh, J. R., Ataullakhanov, F. I. In search of an optimal ring to couple microtubule depolymerization to processive chromosome motions. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (48), 19017-19022 (2007).
  46. Itoh, T., Hisanaga, S., Hosoi, T., Kishimoto, T., Hotani, H. Phosphorylation states of microtubule-associated protein 2 (MAP2) determine the regulatory role of MAP2 in microtubule dynamics. Biochemistry. 36 (41), 12574-12582 (1997).
  47. Oguchi, Y., Uchimura, S., Ohki, T., Mikhailenko, S. V., Ishiwata, S. The bidirectional depolymerizer MCAK generates force by disassembling both microtubule ends. Nat. Biol. (6), 1-8 (2011).
  48. Kishino, A., Yanagida, T. Force measurements by micromanipulation of a single actin filament by glass needles. Nature. 334, 74-76 (1988).
  49. Borisy, G. G., Marcum, J. M., Olmsted, J. B., Murphy, D. B., Johnson, K. A. Purification of tubulin and associated high molecular weight proteins from porcine brain and characterization of microtubule assembly in vitro. Ann. NY Acad. Sci. 253, 107-132 (1975).
  50. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S., Kirschner, M. W. A Protein Factor Essential for Microtubule Assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72 (5), 1858-1862 (1975).
  51. Widlund, P. O., Podolski, M., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Mol. Biol. Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
  52. Hyman, A., Drechsel, D., et al. Preparation of Modified Tubulins. Methods Enzymol. 196, 478-485 (1991).

Tags

Grunnleggende Protocol mikros flyt kammer single-molekyl fluorescens laser felle mikrotubulus-bindende protein mikrotubulus avhengig motor microtubule tip-sporing
Utarbeidelse av segment mikrotubuli å studere bevegelser drevet av demontering mikrotubulus Ends
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Volkov, V. A., Zaytsev, A. V.,… More

Volkov, V. A., Zaytsev, A. V., Grishchuk, E. L. Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends. J. Vis. Exp. (85), e51150, doi:10.3791/51150 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter