Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Preparación de segmentados microtúbulos para estudiar las mociones impulsadas por las que desmontan microtúbulos Ends

Published: March 15, 2014 doi: 10.3791/51150
Automatic Translation
1,2, 3, 3
1Center for Theoretical Problems of Physicochemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences, 2Federal Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Moscow, Russia, 3Physiology Department, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

Summary

Los microtúbulos son polímeros inherentemente inestables, y su conmutación entre el crecimiento y acortamiento es estocástico y difícil de controlar. Aquí se describen los protocolos que utilizan microtúbulos segmentados con tapones estabilizadores fotoescindible. La despolimerización de los microtúbulos segmentados puede ser activado con una alta resolución temporal y espacial, ayudando de este modo el análisis de los movimientos con los extremos de los microtúbulos desmontaje.

Abstract

Despolimerización de microtúbulos puede proporcionar la fuerza para el transporte de diferentes complejos de proteínas y los granos proteicos recubierto in vitro. Los mecanismos subyacentes se cree que desempeñan un papel vital en los movimientos de los cromosomas microtúbulos dependientes durante la división celular, pero las proteínas correspondientes y sus funciones exactas están mal definidos. Por lo tanto, hay una necesidad creciente de desarrollar ensayos con el que estudiar tales motilidad in vitro utilizando componentes purificados y medio bioquímica definida. Los microtúbulos, sin embargo, son inherentemente inestables polímeros; su conmutación entre el crecimiento y acortamiento es estocástico y difícil de controlar. Los protocolos que describimos aquí se aprovechan de los microtúbulos segmentados que se hacen con el fotoescindible estabilizar tapas. La despolimerización de microtúbulos tales segmentados se puede activar con alta resolución temporal y espacial, ayudando así a los estudios de la motilidad en los extremos de los microtúbulos desmontaje. Esta técnica se puede utilizar para CArry a cabo un análisis cuantitativo del número de moléculas en los complejos de proteínas marcadas con fluorescencia, que se mueven processively con los extremos de los microtúbulos dinámica. Para optimizar una relación señal-ruido en este y otros ensayos fluorescentes cuantitativos, cubreobjetos deben ser tratados para reducir la absorción no específica de proteínas marcadas fluorescentemente-solubles. Protocolos detallados se proporcionan a tener en cuenta la falta de uniformidad de la iluminación fluorescente, y determinar la intensidad de un solo fluoróforo utilizando ajuste gaussiano equidistantes. Por último, se describe el uso de los microtúbulos segmentados para estudiar los movimientos de los microtúbulos dependientes de las microperlas de proteína-revestido, proporcionando conocimientos sobre la capacidad de las diferentes proteínas motoras y no motoras para acoplar la despolimerización de microtúbulos al movimiento de carga processive.

Introduction

Los microtúbulos son altamente conservadas estructuras citoesqueléticas que son importantes para la arquitectura celular, la motilidad celular, la división celular, y el transporte intracelular 1. Estos polímeros dinámicos se ensamblan a partir de tubulina en presencia de GTP, y cambian de forma espontánea entre el crecimiento y acortamiento 2. Los microtúbulos son muy delgado (sólo 25 nm de diámetro), por lo tanto las técnicas ópticas especiales para incrementar el contraste debe ser utilizado para observar los microtúbulos con un microscopio óptico. El trabajo previo con estos polímeros examinó su comportamiento dinámico mediante contraste de interferencia diferencial (DIC) 3. Este y otros estudios in vitro revelaron que en condiciones típicas experimentales, los microtúbulos se someten a la catástrofe y cambie a la despolimerización sólo en raras ocasiones, una vez cada 5-15 minutos (esta frecuencia es de 7-15 concentración de tubulina soluble mM examinada en 28-32 ° C ) 4. Así, se han propuesto diferentes técnicas para la induccióne microtúbulos despolimerización de una manera controlada. Acortamiento de microtúbulos puede ser activado mediante el lavado de distancia tubulina soluble en 5,6, corte microtúbulos con un haz de láser 7, o el uso de los microtúbulos segmentados 8, tal como se describe aquí. El trabajo previo utilizando los microtúbulos segmentados, así como polímeros de conmutación estocásticamente, se ha encontrado que pequeñas cargas intracelulares, tales como cromosomas, vesículas, y perlas de proteína recubiertos, se pueden mover en los extremos de los microtúbulos acortamiento 9-13. Este fenómeno se cree que tiene una implicación directa de los movimientos de los cromosomas en las células mitóticas, y los mecanismos subyacentes están actualmente bajo investigación activa 14-16.

Recientemente, las técnicas a base de fluorescentes, incluyendo la reflexión interna total de fluorescencia (TIRF) microscopía, se han empleado para estudiar la motilidad con microtúbulos dinámicos extremos 17-24. La ventaja de este enfoque es que permite el examen de la interaccións entre los microtúbulos y proteínas de unión a microtúbulos en tiempo real utilizando proteínas marcadas con diferentes fluoróforos. Se encontraron varios complejos de proteínas para mover processively con el alargamiento y / o acortamiento de los extremos de los microtúbulos. Ellos incluyen las proteínas asociadas a los microtúbulos Dam1 10,12,18, Ska1 19, y XMAP215 20, así como motores de quinesina Kif18A 21,22, MCAK 23 y CENP-E 24. Estas proteínas exhiben processive punta-de seguimiento, que es fundamentalmente diferente de la de las proteínas de punta de seguimiento de clásicos como EB1 25. Aunque las moléculas EB1 y los socios parecen permanecer de manera estable asociada a los microtúbulos dinámica termina, las moléculas individuales permanecen atados a la punta de los microtúbulos por sólo ~ 0,8 seg, intercambiar rápidamente con la piscina soluble 26. Por el contrario, procesivas punta-trackers, como Dam1, viajan con los microtúbulos termina para muchos micras, y su asociación con las puntas de los microtúbulos pueden durar mningún segundo. La punta tiempo asociación, así como el que resulte de seguimiento, depende en gran medida del número de moléculas que forman la punta de rastreo complejo 27. Grandes conjuntos de proteínas suelen ser mucho mejores de punta-trackers. Por ejemplo, dichos ensamblajes complejos como los cinetocoros de levadura aisladas pueden permanecer acoplado a microtúbulos termina por hora 28. Algunas proteínas de unión a microtúbulos, por ejemplo Ndc80 complejo de proteínas cinetocoro, se han encontrado para ser incapaces de realizar un seguimiento con microtúbulos termina en un solo nivel de molécula, sin embargo Ndc80 es muy eficiente en el acoplamiento del movimiento del talón de carga 19,29-31. Por lo tanto, para entender el mecanismo de la punta de seguimiento por diferentes complejos de proteínas, así como sus funciones biológicas, es importante examinar la punta de seguimiento como una función del número de moléculas en el complejo punta de seguimiento, así como para determinar la capacidad de estos complejos para exhibir la motilidad colectiva en la superficie de la carga de talón.

(Figura 1A). En primer lugar, los portaobjetos de vidrio disponibles comercialmente son modificados para unir tubos de polietileno corto (Protocolo 1). La cámara de flujo microscopía reutilizable se ensambla a partir de una diapositiva tal y el plasma-limpiado y cubreobjetos silanizada (protocolo 2) 32-34 químicamente o. El volumen de la cámara resultante es sólo 20-25 l (o tan pequeño como 15 l, véase la nota 3 en el Protocolo 1), incluyendo el volumen de la tubería de entrada. Cámaras de flujo disponibles comercialmente también se pueden usar, pero su volumen es generalmente más grande, que conduce a la pérdida innecesaria de proteínas. Si se emplea una cámara más grande, el volumen de todas las soluciones en los protocolos a continuación debe ser escalado proporcionalmente. Semillas de microtúbulos continuación, se preparan, por ejemplo, usando GTP analógico lentamente hidrolizable, GMPCPP (guanosina-5'-[(α, β)-methyleno] trifosfato) (Protocolo 3, ver también Hyman <em> et al. 35). Las semillas se inmovilizan sobre un cubreobjetos de limpiado y la superficie es posteriormente bloqueando los comandos para prevenir la absorción no específica de otras proteínas 32 ​​(protocolo de 4 describe semillas inmovilización utilizando digoxigenina). Los microtúbulos segmentados pueden ser preparados usando el Protocolo 5. La razón principal de este enfoque es que los polímeros de microtúbulos dinámicos, que se forman en presencia de GTP, se pueden estabilizar temporalmente mediante la adición de los cortos "topes" de segmentos de tubulina estables, que contienen GMPCPP. Estas tapas también contienen tubulina marcada con rodamina, para que puedan ser retirados simplemente iluminando el campo de visión con un láser de 530-550 nm o lámpara de arco de mercurio (Protocolo 6) 36. La intensidad de fluorescencia de la señal de la punta de seguimiento se puede usar entonces para estimar el número de moléculas que se desplazan con los extremos de los microtúbulos desmontaje, teniendo en cuenta la falta de uniformidad de la iluminación de campo del microscopio (Protocolo 7). Un enfoque similar se puede utilizarpara estudiar las interacciones entre los microtúbulos depolymerizing y perlas de proteína-revestido, preparado como se describe en el 27 (Protocolo de 8). Algunas proteínas se unen fácilmente a las paredes de los microtúbulos segmentados, pero pinzas láser también pueden utilizarse para sostener el cordón cerca de la pared de microtúbulos, promoviendo así su unión.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Equipo necesario: Los experimentos descritos a continuación requieren de un microscopio óptico equipado para DIC y fluorescencia de imagen (Tabla 1). Campo brillante iluminación LED se puede utilizar para mejorar de manera significativa la detección de las semillas de microtúbulos cubreobjetos-adjunto 37, que son difíciles de observar con una lámpara halógena regular. Para controlar el flujo de líquido en las cámaras de microscopía, las soluciones deben ser intercambiados con una bomba peristáltica capaz de velocidades de flujo de 10 a 100 l / min. Una bomba de jeringa también se puede utilizar pero se debe tener cuidado para evitar las burbujas de aire que se pueden formar cuando la velocidad de flujo se cambia bruscamente. Para la manipulación de perlas de proteína-revestido, por ejemplo, para llevarlos cerca de la pared de microtúbulos segmentado, una nm haz de láser de onda continua 1064 se puede introducir en el eje óptico del microscopio y se concentró con un objetivo de abertura numérica alta (1,3 o superior) para producir una trampa. Para el análisis cuantitativo de la fluorescenciaintensidad de las moléculas individuales de la luz de excitación debe ser proporcionada por una fuente láser-base ya que la intensidad de esta fuente de luz es más estable que la generada por una lámpara de mercurio. Para reducir al mínimo las vibraciones mecánicas, el microscopio se debe colocar en una mesa óptica. Se requiere un equipo más sofisticado para estudiar el movimiento de las perlas con la despolimerización de microtúbulos termina bajo una fuerza constante, y para medir las señales de fuerza de disparo único 11,38,39, estos métodos se describen en otra parte.

1. Fabricación reutilizables cámaras de flujo

Los portaobjetos de vidrio para cámaras de flujo reutilizables se pueden pedir a una planta de fabricación de vidrio local utilizando esquemas de la Figura 1B (ver Tabla 2 para obtener información sobre nuestro proveedor). Con la molienda ultrasónica modificar diapositivas normales de microscopio (75 mm x 25 mm, 1,0 mm de grosor) para hacer dos ranuras 15 ± 1 mm de largo, 1,0 ± 0,1 mm de ancho y 0,8 ± 0,05 mm de profundidad.Distancia entre los extremos más cercanos debe ser 14 ± 1 mm; esta distancia es óptima para una cámara montada con 22 mm x 22 mm cubreobjetos. Consulte la Tabla 2 para obtener una lista de otros materiales.

  1. Coloque un tubo largo de polietileno 100 mm (OD 0.61 mm, Tabla 2) en cada ranura de la diapositiva, dejando ~ 5 mm voladizos en los extremos interiores de las ranuras. Fijar los tubos dentro de las ranuras con adhesivo de cianoacrilato, la incorporación de los tubos completamente dentro de las ranuras.
  2. Llene las ranuras con pegamento epoxi, evitando derramar el pegamento dentro de los tubos. Deje que el pegamento se seque durante aproximadamente 1 día.
  3. Con una hoja de afeitar afilada cortar la masa solidificada pegamento de 3-4 mm desde el extremo distal de cada sitio de unión, la eliminación de las partes proximal al centro de la diapositiva. Los tubos deben permanecer dentro de sus ranuras. Retirada de las piezas proximales también cortar y eliminar los voladizos interiores, creando una superficie plana con dos aberturas del tubo.
  4. Llene una jeringa con agua y pruebasi las trompas están funcionando correctamente. Si el líquido fluye libremente, poner una gota de pegamento epoxi (~ 5 mm de diámetro) en los extremos exteriores de las arboledas y secos por 1 días (Figura 1D). Esto hará que las cámaras más duradera, por lo que puede ser utilizado en varias ocasiones durante muchos meses.
    Nota 1: Para hacer una cámara para un microscopio invertido, los portaobjetos deben modificarse adicionalmente para hacer dos agujeros pequeños en los extremos opuestos de las ranuras (Figura 1C). Inserte los tubos a través de los agujeros en la diapositiva, doblar los tubos y que encajen perfectamente dentro de las ranuras (Figura 1E). Siga los pasos 1.2 a 1.4, pero quitar el pegamento epoxi de toda la superficie, que se utiliza para hacer una cámara de flujo.
    Nota 2: Para reducir el volumen de la cámara, utilice la molienda para hacer dos muescas 0,050 ± 0,005 mm de profundidad, dejando la parte central de la diapositiva 5.0 ± 0.5 mm de ancho y ligeramente elevada (ver "áreas grabadas" en las figuras 1B y 1C). Cuando tcámara de flujo que se monta (como se describe más adelante), coloque la cinta de doble cara en el interior de estas hendiduras.
    Nota 3: Para volver a utilizar estas diapositivas modificados, después de terminar los experimentos quitar el cubreobjetos y la cinta de doble cara con una cuchilla de afeitar. Retire el sellador pelando apagado y limpiando el portaobjetos con etanol al 70%. Colocar el portaobjetos en un recipiente con un 1-2% de un detergente para lavar platos de laboratorio, conecte un tubo a una bomba peristáltica y perfundir 50-70 ml, siga con igual volumen de agua desionizada, se seca y guardar en un compartimento libre de polvo.

2. Preparación de Cubreobjetos

Este protocolo tiene 6-8 horas y ayudará a preparar 12 cubreobjetos. Usted necesitará un titular cubreobjetos cerámica y 3 recipientes de tinción cubreobjetos con tapas; volumen frasco debe ser de 15 ml, por lo que cada uno tendrá 4 cubreobjetos apilados juntos. Un frasco de vidrio con una tapa (250 ml) se debe utilizar para incubar cubreobjetos con silano. Utilice cubreobjetos de vidrio No.1 regulares (22 mm x 22 mm o 22 mm x 30 mm, ver tablas 2 y 3 para una lista de materiales). Todos los pasos deben llevarse a cabo en una campana de extracción, mientras que el uso de guantes.

  1. Ponga los portaobjetos en los recipientes de tinción cubreobjetos de vidrio y llenar los frascos con acetona. Incubar durante 1 hora, lavar 10 veces con agua desionizada.
  2. Incubar los cubreobjetos de 10 min con etanol y lavar de nuevo 10 veces con agua desionizada.
  3. Preparar la solución de "pirañas". Poner 60 ml de solución de peróxido de hidrógeno (30% en agua) en un recipiente de vidrio resistente al calor y añadir lentamente 100 ml de ácido sulfúrico (relación final de ácido a la solución de peróxido de hidrógeno es 05:03). La solucion se calienta, esto es normal, pero tenga cuidado. Solución Piranha es extremadamente corrosivo! Utilice laboratorio grueso abrigo, guantes y gafas de protección!
  4. Llene los recipientes de tinción cubreobjetos con solución "piraña", cerrar los párpados y colocar los frascos en un baño de agua previamente calentada a 90 ° C durante 1 hora.
  5. Se retira la soluti "piraña"en y deseche según las instrucciones de las regulaciones de seguridad en su lugar de trabajo. Lave cubreobjetos 10 veces con agua desionizada.
  6. Llene los recipientes de tinción cubreobjetos con 0,1 M de KOH, incubar 10 minutos, y lavar 10 veces con agua desionizada. Esto neutralizará cualquier residuo ácido que quedan en los cubreobjetos después del tratamiento "pirañas".
  7. Cubreobjetos secos, uno a la vez manteniendo cada cubreobjetos con unas pinzas plana con bordes recubiertos de teflón (para minimizar el daño a una superficie de vidrio) y mientras se sopla nitrógeno seco comprimido. Asegúrese de que los cubreobjetos se secan por completo, ya que la solución de silano es altamente reactivo con el agua.
  8. Pila de los cubreobjetos secos en los titulares de cerámica (12 cubreobjetos por titular), que deben ser previamente secado a fondo con nitrógeno. Mantener los titulares de cerámica cubiertos para evitar el polvo se pegue a la superficie de cubreobjetos.
  9. Cubrir el fondo del tarro de 250 ml de vidrio (6 cm de diámetro) con tamices moleculares, grado 564, para la absorción de agua.
  10. Llene el frasco con 200 ml deSolución PlusOne Repel Silano y sumergirse lentamente un soporte cerámico con cubreobjetos en un frasco, cierra la tapa y se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente. Esto creará recubrimiento hidrófobo sobre la superficie cubreobjetos.
  11. Retire lentamente el soporte con cubreobjetos de la jarra y la transferencia cubreobjetos uno a la vez en los recipientes de tinción cubreobjetos llenos de metanol.
  12. Coloque un metal o pedestal de vidrio en el depósito de agua de un baño de ultrasonidos, de tal manera que la cubeta de tinción cubreobjetos se sumerge durante 2/3 de su altura. Someter a ultrasonidos a 70 W durante 20 min, el cambio de solución de metanol cada 5 min, luego enjuague 10 veces con agua desionizada. Si la silanización funcionaba correctamente, aparecerán en seco los cubreobjetos cuando se retira del agua.
  13. Eliminar completamente el agua residual utilizando nitrógeno, como anteriormente.
  14. Interlay los cubreobjetos con Kimwipes para evitar el contacto de superficie a superficie entre los cubreobjetos. Los cubreobjetos se pueden almacenar en un contenedor sellado durante varias semanas a temperatura ambiente.
    Nota 1: Los pasos 2.1 a 2.6 se puede sustituir por la limpieza de los cubreobjetos con el limpiador de plasma durante 15 minutos a 30 W, lo que reduce considerablemente el tiempo de preparación total. La presión dentro de la cámara de limpieza se fija en 100-200 mTorr. Tanto el oxígeno atmosférico y comprimido se puede utilizar. Apilar los cubreobjetos plasma limpiado en los titulares de cerámica y vaya al paso 2.7.

3. Preparación de microtúbulos estabilizados-GMPCPP Semillas

Este procedimiento se llevará a ~ 1 hr y las semillas de microtúbulos resultantes son estables durante 1-2 días a temperatura ambiente. Consulte la Tabla 4 para una lista de los reactivos.

  1. Mezcle en el hielo:
    • 10 l no marcados tubulina (100 M, Tabla 4) en BRB-80 tampón (Pipes 80 mM, EGTA 1 mM, MgCl2 4 mM, pH 6,9 con KOH; suplemento con TDT 1-2 mM utilizando alícuota para cada experimento).
    • 2,6 l marcada con digoxigenina tubulina (Tabla 4). Ajuste el volumen en función de la preparación,de tal manera que la proporción final de la etiqueta a la tubulina no marcada es ~ 1:10. Mezcle bien con la pipeta.
    • 1,4 l mM GMPCPP 10 (concentración final 1 mM)
  2. Incubar 15 min a 35 ° C, las semillas crecerán 2-3 micras de largo. Ajustar el tiempo si se desea diferente longitud de los microtúbulos.
  3. Añadir 35 l BRB-80 (precalentado a 35 ° C), se mezcla con la pipeta, y se centrifuga durante 15 minutos a 25.000 xg para sedimentar las semillas a temperatura ambiente.
  4. Desechar el sobrenadante, lavar el pellet añadiendo con cuidado y quitando 50 l de BRB-80 caliente.
  5. Resuspender pellet bien en 25 l BRB-80.

4. La unión de los microtúbulos semillas a los Cubreobjetos

Protocolos 4 y 5 requieren 2-3 horas, por lo que dos cámaras de flujo se utilizan por día.

  1. Montar la cámara de flujo según las instrucciones del fabricante utilizando cubreobjetos silanizadas y vaya al paso 4.2. Si utiliza cubreobjetos medida (Protocolo 1), siga el bel pasosow.
    1. Coloque dos trozos de cinta adhesiva de doble cara (5 mm x 30 mm) a lo largo de la zona ancha mm ~ 5 central, poner cubreobjetos silanizada encima de la cinta, presione con firmeza.
    2. Llenar la cámara con BRB-80 a través de uno de los tubos y conecte ambos tubos con palillos de dientes redondos.
    3. Coloque una pequeña gota de bicolor Kwik sellante moldeada en la parte superior de una pequeña placa Petri de plástico, y mezclar rápidamente, pero a fondo con un palillo de dientes. El sellador se pondrá verde, aplicar de inmediato, sellando cuidadosamente todos los bordes del cubreobjetos. Si el sellador penetra muy profundamente bajo el cubreobjetos, abra uno de los tubos quitando el tapón de palillo de dientes y aplique una presión suave para evitar que el sellador se filtre en el interior de los tubos.
    4. Deje secar la cámara durante 10 minutos y confirme que el flujo no está restringida antes de seguir adelante.
  2. Coloque la cámara en una platina del microscopio precalentada a 32 ° C y colocar uno de los tubos a una bomba, que bombear el líquido fuera. La longitud del tubo de entradadebe reducirse al mínimo para evitar la pérdida innecesaria de los reactivos: la longitud recomendada es de 5-7 cm. Sumerja este fin en un vial de 0,5 ml con BRB-80 buffer. Esta y todas las soluciones a continuación debe ser precalentado a 32-35 ° C.
  3. Aplicar una suave presión con una bomba o simplemente levantar el extremo del tubo de salida para exprimir las burbujas de aire, que pueden formar ocasionalmente cuando se retira el tapón de tubo de entrada.
  4. Ajuste la velocidad de la bomba a 100 l / min. Lavar con 2 volúmenes de cámara de anticuerpos anti-digoxigenina diluidas 1:30 en BRB-80, incubar 15 min para permitir la adsorción de anticuerpos.
  5. Lavar con 5-10 volúmenes de cámara de BRB-80 caliente, incubar 10 min con 1% de Pluronic F-127 en BRB-80 para bloquear la superficie hidrofóbica de cubreobjetos silanizada.
  6. Lavar con 5-10 volúmenes de cámara de tampón de la motilidad (BRB-80 suplementado con 0,4 mg / ml de caseína).
  7. Reduzca la velocidad de la bomba de 10 l / min y perfundir semillas microtúbulos diluida 1:200-1:600 ​​en 30-40 búfer motilidad l. Incubar 15 millasn para promover la unión de las semillas a los anticuerpos cubreobjetos-adsorbido.
  8. Lavar la cámara a 100 l / min con 400 l de tampón de la motilidad para eliminar cualquier material no unido.
    Nota 1: La densidad resultante de semillas debe ser 10-30 por campo microscópico (Figura 2A). Para solucionar problemas, utilice la tubulina marcado con fluorescencia durante la polimerización (paso 3.1) para la detección fácil de las semillas cubreobjetos inscritos.
    Nota 2: axonemas preparados a partir de Chlamydomonas 40 o de otras fuentes biológicas, así como las unas películas de células lisadas Tetrahymena y deciliated 41 también se pueden utilizar como nucleadores de microtúbulos. Estos nucleadores son útiles para crear arreglos pequeños microtúbulos, y se prefieren cuando microtúbulos con número específico de protofilamentos se desean (GMPCPP nuclea semilla uno de los microtúbulos que contiene ≥ 14 protofilamentos 42). Estas estructuras se pueden unir a los cubreobjetos limpiado por la absorción no específica, pero la Attachment suele ser menos estables en comparación con el apego a base de anticuerpos, especialmente cuando se utilizan los cubreobjetos silanizadas.

5. Preparación de Segmented microtúbulos

Todos los volúmenes de solución a continuación son para el volumen de la cámara de 15 a 20 l, aumentar proporcionalmente si se utiliza la cámara más grande.

  1. Precaliente mezcla tubulina sin marcar (búfer motilidad 45 l suplementado con 1 mM Mg-GTP y con 10-15 M tubulina sin etiqueta) durante 30 segundos a 35 ° C. Perfusión a 30 l / min.
  2. Controle atentamente el crecimiento de microtúbulos con DIC óptica (Figura 2B, vídeo 1). Durante 5-7 minutos de incubación de los microtúbulos por lo general crecen ~ 10 micras de largo.
  3. Preparar la mezcla Rodamina-tubulina (65 l de tampón suplementado con motilidad mM GMPCPP 0,5 y 2-5 M de tubulina marcada con rodamina con 0,5-1 relación molar de Rodamina a la tubulina) y calentar la solución a 35 ° C durante 30 seg.
  4. Perfusión de inmediato a 30 μl / min. Se incuba durante 8-10 minutos para promover la formación de tapones fluorescentes estables en las puntas de los microtúbulos. Segmentos de microtúbulos estables también se nuclean espontáneamente y serán visibles con la óptica DIC.
  5. Lavar la cámara de bien con 100 l de tampón de la motilidad en 20 l / min para eliminar tubulinas y nucleótidos, así como fragmentos de microtúbulos solubles.
  6. Con la DIC, confirman que los microtúbulos son visibles (Figura 2D), su número, sin embargo, debería disminuir debido a que muchos microtúbulos desarme durante el taponado (Video 2 muestra un campo típico con los microtúbulos segmentados).
    Nota 1: segmentado microtúbulos son muy estables y pueden utilizarse durante al menos 2 horas. Sin embargo, la vida útil de estos microtúbulos disminuye con la solución de intercambio excesiva, o si 2-mercaptoetanol se utiliza en la memoria intermedia de imágenes.

6. Observación experimental de la Proteína de seguimiento con despolimerización de microtúbulos Ends

  1. IntrodUCE 30-50 l de proteína fluorescente (0,1-20 nM) en la cámara a 10 l / min. Si la proteína se pegue a la cubreobjetos es evidente, complemento a la memoria intermedia de la motilidad con 4-8 mg / ml de BSA. Alexa488-Dam1 punta de seguimiento requiere además mM DTT 10 o 0,5-1% βME 10.
  2. Limite el campo de iluminación utilizando un diafragma de campo del microscopio para evitar el blanqueo innecesario y desmontaje de los microtúbulos.
  3. Comience adquisición de vídeo mediante cubo de filtro de las buenas prácticas agrarias, y luego cambiar a Rodamina cubo de filtro sin interrumpir la grabación de imágenes. Los segmentos de color rojo en los extremos de los microtúbulos deben ser claramente visibles, sino que comenzarán a desaparecer y se desintegran rápidamente (Video 3).
  4. Continuar para iluminar hasta las tapas de casi desaparecen (por lo general de 10 a 20 segundos, pero esta vez serán más largos por las tapas que crecen con una relación de etiquetado Rodamina inferior), y volver al canal para grabar GFP proteína de seguimiento con el desmontaje de microtúbulos.
  5. Analizar lasecuencias resultantes mediante la construcción de kymographs, es decir, imágenes de dos dimensiones que muestran la intensidad de fluorescencia a lo largo del eje de microtúbulos durante diversos tiempos durante la observación) usando MetaMorph, libremente disponible ImageJ u otro software de procesamiento de imágenes (Figura 2E).
    Nota 1: Tasa de adquisición debe ser ajustado en función de la periodicidad de los fenómenos observados. La dosis recomendada es de 2-3 fotogramas por segundo (fps) para el movimiento lento, anillo de tamaño Dam1 complejos 27, pero el tiempo de adquisición de moléculas individuales debe ser> 20 fps 19.
    Nota 2: A EMCCD muy sensible, por ejemplo ANDOR iXon3, es necesario para la grabación rápida de eventos punta de seguimiento con los microtúbulos depolymerizing. La configuración recomendada para cámara Andor iXon3 son: 5x ganancia, EM ganar 200, la velocidad de lectura de 1 MHz, el modo de sensor de 16 bits, 80 ms tiempo de exposición.
    Nota 3: El uso de la microscopía TIRF será la relación señal-ruido mejora, sin embargo, se deben usar los microtúbulos más cortos, tales thaT las tapas de estabilización fluorescentes permanecen dentro del alcance de campo evanescente.

7. Análisis cuantitativo del tamaño molecular de los microtúbulos Complejos Tip-tracking

La justificación de este enfoque es determinar el número de moléculas en un complejo de punta de seguimiento mediante la búsqueda de la relación de la intensidad de fluorescencia total del complejo punta de seguimiento a la intensidad de un solo fluoróforo. Este enfoque se puede aplicar a fusiones de proteínas-GFP y proteínas marcadas con colorantes fluorescentes, pero puede subestimar el número de moléculas en los complejos punta-de seguimiento si algunas moléculas de proteína en las preparaciones no son fluorescentes.

  1. Cinética fotoblanqueo récord para las moléculas de proteína marcadas con fluorescencia.
    1. Montar cámara de microscopía regular usando un portaobjetos de vidrio no modificado, dos tiras de cinta adhesiva de doble cara, y un cubreobjetos limpio, que puede ser preparado usando todo el Protocolo 2, o sólo los pasos 2.1 a 2.6 de esteprotocolo.
    2. Añadir aproximadamente 50 nM de proteína en tampón de la motilidad, lavar brevemente con tampón de motilidad y sellar la cámara con valap (Tabla 4). Optimizar la concentración de proteína para obtener el campo con manchas uniformemente dispersas (Figura 3A), que representan las moléculas individuales y sus pequeños agregados (trímeros y tetrámeros, que pueden formar espontáneamente en la solución o pueden aparecer cuando varias moléculas individuales están muy juntas y no se pueden resolver) . Este paso es muy importante para la obtención de una distribución multi-pico de pasos de fotoblanqueo y determinación precisa de un tamaño de paso (ver más abajo).
    3. Minimizar la intensidad del láser de iluminación a la que las manchas fluorescentes individuales siguen siendo visibles; con iluminación inferior se extiende el tiempo de fotoblanqueo, por lo que las trazas de fotoblanqueo ya se pueden obtener. También minimizar el tiempo de exposición para reducir la probabilidad de más de un fluoróforo de blanqueo durante un fotograma. La configuración recomendadapara Andor iXon3 cámara: Ganancia 5.0x, EM ganar 999, la velocidad de lectura de 10 MHz, 50-100 milisegundos el tiempo de exposición.
    4. Centrarse en la superficie del cubreobjetos, cierre el obturador de iluminación, vaya a un campo nuevo, abra el obturador iluminación y adquirir imágenes hasta que todos los complejos han blanqueado (posteriormente denominado img (x, y)).
  2. Corregir las imágenes adquiridas para irregularidades de la iluminación (Figura 3B).
    1. Preparar la solución de cualquier fluoróforo, por ejemplo, 1 M isotiocianato de fluoresceína (FITC) en BRB-80. Tal solución puede ser preparada de antemano, se dividió en alícuotas y se almacenó a -20 ° C.
    2. Montar una cámara como en la Sección 7.1.1, pero utilizar un cubre regular. Añadir la solución de fluoróforo y sellar la cámara utilizando valap.
    3. Recoger> 50 imágenes de todo el campo microscópico: mover el escenario para una nueva área sin blanquear mientras el obturador iluminación está cerrada, y adquirir las imágenes inmediatamente después de abrir el obturador.
      4. (Figura 3C). La imagen resultante representa la distribución de la intensidad de iluminación del campo (Illum (x, y), donde x e y corresponden a las coordenadas del píxel).
    4. Determinar el brillo máximo de píxeles de esta imagen (Max (Illum)).
    5. Con el obturador cerrado y el uso de la iluminación mismos ajustes de la cámara como en la Sección 7.2.3 adquirir una imagen, determinar la intensidad media de píxeles de esta imagen; este valor corresponde a CN, ruido de la cámara.
    6. Utilice los valores anteriores y la imagen (Illum (x, y)) para normalizar la imagen experimental (img (x, y)) con la siguiente expresión:

      Utilice la norma imagen Img resultante (x, y) para el análisis cuantitativo de la BRIllo de los complejos fluorescentes estacionarias, y también para normalizar las imágenes con los complejos punta-viradas (Figura 3D).
  3. Determinar la intensidad de un solo fluoróforo.
    1. El uso de imágenes normalizadas img norma (x, y) y cualquier software de procesamiento de imagen, selecciona una mancha fluorescente con una región circular (5-6 píxeles de diámetro) y determinar su intensidad integral de todas las tramas, la generación de las huellas photobleaching. Evite mismos puntos brillantes (> 5 veces más brillante que los reguladores de intensidad).
    2. Utilizando la misma herramienta región circular, seleccione al menos 3 áreas libres de manchas, generar las trazas fotoblanqueo correspondientes, promedio y en forma con la función de decaimiento exponencial.
    3. Tabule este contexto curva de intensidad para que coincida con los puntos de tiempo de experimentación y restarlo de las curvas photobleaching.
    4. Suavizar las curvas photobleaching (promedio con la ventana deslizante de 3-5 puntos). Inspeccione visualmente las curvas resultantes ydescartar cualquier curva que muestra un aumento brusco en la fluorescencia o la falta de blanqueo evidente (Figura 3E).
    5. Para cada una de las curvas restantes (generalmente 50-70% del número total de curvas), seleccionar visualmente la meseta final, cuando la mancha fluorescente ha blanqueado. Acortar este segmento para dejar sólo ~ 100 puntos y un promedio de estas intensidades. Restar este valor de la curva de fotoblanqueo acortada para minimizar pequeñas variaciones es los niveles de fondo y para reducir el tamaño del pico de fondo (por debajo).
    6. Trazar un histograma de las intensidades de todos los puntos de tiempo de 20 o más curvas photobleaching (> 1000 puntos de tiempo). El histograma debe exhibir al menos 4 picos distintos (ver nota 2).
    7. Montar el histograma con la distribución de Gauss equidistante 10,43 utilizando MATLAB, Mathematica o software similar (Figura 3F):

      waquí A i y σ i, d y N son parámetros de ajuste. Parámetros A i y σ i corresponden a la amplitud y la anchura de el i-ésimo pico; d es la distancia entre los picos, N es número entero, que se corresponde con el número total de picos en la distribución. Si los centros de los primeros 3 o más picos muestran una visualmente buen partido a la línea ajustada, la distancia entre estos picos (parámetro d) corresponde a una intensidad de fluorescencia de un solo fluoróforo.
      Nota 1: El número de puntos examinados (Sección 7.3.6) se debe aumentar si el sistema de microscopía exhibe vibraciones importantes o hay otra fuente de ruido (rayo láser por ejemplo inestable).
      Nota 2: Es esencial para obtener> 3 picos para un análisis preciso con un ajuste gaussiano equidistantes. Si se obtienen menos picos, el falso (por ejemplo, doble) tamaño de paso se podría obtenercuando las condiciones de iluminación no son óptimas, por ejemplo, cuando los puntos se blanquean pasos muy rápidos y simples no se resuelven así.
  4. Determine el tamaño molecular del complejo punta-tracking.
    1. Utilice las imágenes recogidas con el Protocolo 6 y seleccione los primeros 2-4 marcos, que fueron adquiridos inmediatamente después de abrir el obturador. Si el campo se iluminó durante algún tiempo antes de que se observó la punta de seguimiento, estimar la intensidad original de la cinética de photobleaching en las mismas condiciones experimentales.
    2. La media de los fotogramas seleccionados y normalizar la imagen resultante que en las secciones 7.2.5-7.2.7.
    3. Medir la intensidad integral del complejo punta de seguimiento fluorescente utilizando el mismo tamaño de la región como en la Sección 7.3.1.
    4. Medir la intensidad integral de 3 zonas de fondo cerca del complejo de la punta de seguimiento y el uso de la misma región, el promedio de estos valores y restar de la intensidad del complejo punta-tracking de la Sección 7.4.3. Calcular el número de moléculas de fluoróforo en el complejo dividiendo la intensidad de fluorescencia obtenida en la Sección 7.4.4 por la intensidad del fluoróforo sola obtenido en la Sección 7.3.5.
      Nota 1: Es deseable que los ajustes de iluminación y de adquisición de protocolo 7.4 son los mismos que en el protocolo 7.1. Si bien el tiempo de exposición o la intensidad del láser se ajustó durante estos pasos, los valores fluorescentes resultantes debe ampliarse en consecuencia. Sin embargo, la exactitud de tales escala debe ser verificada mediante imágenes de la misma muestra (por ejemplo, tiempo fluorescente) bajo estas diferentes condiciones y el cálculo de la relación de las intensidades resultantes.

8. Microtúbulos Tip-tracking por las cuentas de Proteína Coated

  1. Llevar a cabo experimentos con perlas de punta de seguimiento mediante la activación de desmontaje MT como en el protocolo 6. La intensidad de la fuente de luz DIC debe reducirse para permitir la visualización Rodamina fluorescencia simultáneamente conDe formación de imágenes DIC.
  2. Preparar las cuentas como en Grishchuk et al. 10 y Asbury et al. 11 Introducir 30-50 l de suspensión de cuentas dentro de la cámara a 10 l / min. La concentración de perlas sugerido es de 10 -16 -10 -17 M.
  3. Si usa el microscopio en posición vertical, retire la cámara desde la platina del microscopio y de invertirlo durante 5-10 minutos para permitir que los granos de sedimento en el cubreobjetos. Esto promueve una mejor fijación del talón a los microtúbulos atados al cubreobjetos, pero este procedimiento no tiene éxito con 0,5 micras perlas de poliestireno, que muestran poca sedimentación por gravedad durante un tiempo tan corto.
  4. Seleccionar un cordón que está unido a los microtúbulos cubreobjetos-atado; el talón debe moverse en un arco de clara 44 (Figura 4A). El cordón atado debe estar ubicado 1-3 m de distancia de la superficie cubreobjetos, que es claramente visible debido a las perlas cubreobjetos-adjunta ocasionales que permanecen motionless.
  5. Cambie a Rodamina cubo filtro y comenzar a recoger imágenes durante el uso de la iluminación DIC.
  6. Abrir obturador para iluminar el campo de la imagen (restringido con un diafragma de campo) con una lámpara de mercurio o de 530 a 550 nm láser. Continuar el registro hasta que el talón se separa o se mueve con el fin de microtúbulos desmontaje (Figuras 4D, 4F y 4G).
    Nota 1: trampa óptica puede utilizarse para promover la interacción entre la pared de los microtúbulos y el talón recubierto de proteína. Esto es especialmente útil cuando se trabaja con perlas recubiertas con motores de quinesina (Figuras 4E-G). Siga mismos protocolos que el anterior pero complementar búfer motilidad con 2 mM Mg-ATP. En la etapa 8.3, la captura de una gota de libre flotación con el rayo láser 1064 nm, mover la etapa de llevar el talón atrapado cerca de la pared de microtúbulos segmentado. Comience de imágenes con poca luz DIC ya través del cubo de filtro de rodamina y esperar a que el cordón para comenzar a caminar hacia el final de los microtúbulos tapado. En popaer se observa el movimiento del talón dirigida, cierre el obturador para atrapar la viga y abrir el obturador para la iluminación fluorescente. Continuar el registro hasta que el talón se separa o pistas con el fin de microtúbulos desmontaje.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Proteína seguimiento con depolymerizing microtúbulos termina. Cinetocoro levadura componente Dam1 es, con mucho, el mejor consejo-tracker de los microtúbulos depolymerizing termina 14. Este complejo de 10 subunidad marcada con GFP se puede expresar fácilmente y se purifica a partir de células bacterianas 18,38, por lo que recomendamos su uso como un control positivo para el ensayo de la punta de seguimiento. Una proteína fluorescente que rastrea con el extremo despolimerización de microtúbulos de un es visto como un punto fluorescente brillante en movimiento constante hacia la semilla cubreobjetos-adjunta (vídeo 3). También aparecerá como una línea oblicua sobre una quimógrafo correspondiente (Figura 2E). En contraste, si la proteína no a la punta de la pista, los microtúbulos se acorta sin mostrar el enriquecimiento en la señal fluorescente al final de microtúbulos, tal como se ve para el humano Ndc80-GFP complejo 19 (Figura 2F). Cuando se observa el seguimiento processive, la tasa de microtúbulos cortamiento se puede determinar mediante el seguimiento del punto móvil o por la medición de la pendiente de la línea oblicua en la quimógrafo correspondiente. Esto puede dar información acerca de la fuerza de cierre en proteínas de los microtúbulos vinculante 45. Las proteínas que se unen fuertemente a los microtúbulos, como el complejo anillo Dam1, ralentizan la tasa de despolimerización de los microtúbulos. Este efecto, sin embargo, depende en gran medida del tamaño del complejo punta de seguimiento y los pequeños complejos puede ejercer poco o ningún efecto sobre la tasa de microtúbulos desmontaje 27. Por lo tanto, el cambio en la tasa de acortamiento de microtúbulos debe interpretarse en el contexto de el tamaño del complejo punta de seguimiento. En algunas condiciones, el seguimiento puede ser acompañado por el aumento en el brillo del complejo punta de seguimiento, como el final de despolimerización "recoge" la proteína que se une a la red de microtúbulos. En este caso la tasa de despolimerización a menudo se ralentiza de forma concomitante con el tamaño creciente de la punta-TRAcomplejo cking. En otros casos, la relación es más compleja. Por ejemplo, muchas subunidades de los complejos proteína Dam1, en ​​el que la GFP se conjugó en el extremo N-terminal de la subunidad Dam1, se pueden recoger al final de los microtúbulos acortamiento (Figura 2G). Desagregación de los microtúbulos puestos eventualmente; presumiblemente debido a la fuerza de la despolimerización de microtúbulos no es lo suficientemente fuerte como para mover complejos que son demasiado grandes. El desmontaje a menudo se reanuda después de una disminución en el brillo punta, lo que indica la disociación de algunas de las subunidades Dam1 punta asociada 10. Un examen cuidadoso de estas relaciones es importante porque las proteínas de unión a microtúbulos que no rastrean processively también puede ralentizar el ritmo de 19,31,46 desmontaje de microtúbulos.

Bolas de seguimiento con depolymerizing extremos de los microtúbulos. Muchas proteínas de unión a microtúbulos ya han sido identificados como acopladores para el movimiento microbead con dinámica millascrotubule termina 5,11,27,39,47. Sorprendentemente, incluso el complejo de proteínas Ndc80 puede mantener la punta de seguimiento de finales de los microtúbulos por las perlas 29,30. Por lo general, la unión entre los granos y los microtúbulos de proteína-revestido es fuerte, por lo que cuando se agregan cuentas a la cámara de microscopía que se unen fácilmente a los microtúbulos, cubreobjetos conectado segmentados (Figura 4A). No siempre es posible ver definitivamente con CID si el grano se convirtió unido a sólo un microtúbulo. Hemos desarrollado varios criterios para evitar la grabación de las perlas que se han formado varios archivos adjuntos a los microtúbulos. En primer lugar, un cordón que está conectado a un microtúbulo debe mostrar un movimiento en forma de arco, como el de los microtúbulos pivota ligeramente alrededor del sitio de su crecimiento de la cubierta de deslizamiento de semillas adjunto (Figura 4B). En segundo lugar, cuando se ilumina la tapa de la estabilización, sólo un segmento rojo debe ser visto distal de la semilla y el talón (Figura 4C). La tapa puede verse a menudo following de arco de movimiento del grano hasta que los blanqueadores de cabeza (Video 4). En tercer lugar, el movimiento del talón (o su desprendimiento) se deben observar poco después de la tapa ha blanqueado y la dirección del movimiento del talón debe ser coherente con la orientación de los microtúbulos, que se deduce sobre la base de las observaciones anteriores. En cuarto lugar, como se acorta los microtúbulos y el talón se mueve hacia la semilla, la amplitud de las oscilaciones en forma de arco debe disminuir (Figura 4D).

Cuando el seguimiento por el grano es muy procesiva, como se muestra en la Figura 4D, estos criterios son a menudo satisfechos. Sin embargo, si el seguimiento de talón no es procesiva, después de algún movimiento dirigido inicial del talón se separa y comienza la difusión de azar. Con perlas más grandes, por ejemplo, perlas de vidrio de 1 m, este movimiento térmico es lo suficientemente lento como que podría ser mal interpretada como un movimiento que contiene de arco con el final de los microtúbulos manteca. Un criterio formal basado en la magnitud dedesviación del talón desde la pista lineal se puede utilizar para discriminar tales eventos 29. En nuestros trabajos anteriores, se calculó el promedio de cuentas excursiones a través del eje de microtúbulos, y se estimó que si este valor supera 0,4 m / 1 m de la perla de movimiento de los microtúbulos paralelos, el cordón era probable que difundir al azar con una confianza del 95%. Utilizando esta medida, se encontró que incluso en preparaciones de perlas de "control", por ejemplo, perlas recubiertas con el anticuerpo no específico o perlas recubiertas con estreptavidina utilizadas en conjunción con los microtúbulos biotinilados, 5% de perlas fueron juzgados para mover processively. Si se desea una mayor precisión para controlar los movimientos de cuentas con baja capacidad de procesamiento, se recomienda utilizar una trampa láser, donde los movimientos de cuentas dirigidas son más fáciles de identificar.

Trampa láser también se debe utilizar si las bolas no consiguen crear vínculos duraderos a los microtúbulos estables. Se utilizó un rayo láser para capturar perlas recubiertas con diferentes construcciones de proteína de PLUdirigida s de extremo kinesin CENP-E y "lanzar" tales perlas en las paredes de los microtúbulos segmentados (Figura 4E) 24. En presencia de ATP estas perlas se mueven rápidamente (20-25 m / min) hacia el microtúbulos más extremos tapados; en un quimógrafo, tales resultados de movimiento en la línea oblicua dirigida hacia la tapa (figuras 4F y 4G). Después de que se destruya la gorra, una bola recubierta con la proteína CENP-E truncada se desprende de los microtúbulos (flecha verde en la figura 4F). Sin embargo, la proteína de longitud completa CENP-E puede sostener el movimiento del talón en la dirección inversa, es decir, hacia el final de los microtúbulos menos (Vídeo 5). Como resultado, la quimógrafo para tales perlas muestra un patrón de zigzag, indicando la presencia de tanto más-y menos-final extremo dirigido por los movimientos perlas recubiertas con longitud completa, y no truncada CENP-E. Esperamos que otros motores de microtúbulos dependientes pueden exhibir 5,13 motilidad similares

Figura 1
Figura 1. Flujo cámara para estudios in vitro con los microtúbulos segmentados o dinámicas. A. Diagrama de un microtúbulo segmentado (MT). Semillas MT estables se preparan con digoxigenina tubulina (DIG)-etiquetados y GMPCPP, unidos a cubreobjetos a través de anticuerpos anti-DIG. Unión de la tubulina y de otras proteínas no específica se bloquearon con Pluronic F127. Los microtúbulos se extienden a partir de las semillas utilizando tubulina no marcada y GTP, y estas extensiones se tapan con segmentos cortos que contienen tubulina rodamina y GMPCPP (en rojo). MT Plus final (marcado con +) por lo general puede ser disdistinguía el de un extremo menos mucho más corto (-). B y C. Esquemas detallados de la cámara de flujo modificado diapositivas para su uso con microscopios verticales e invertidos. Ranuras de Sonic se muestran en amarillo. Los números son en milímetros. D y E. Vistas laterales de las diapositivas modificados (no a escala) con tubos fijos. Flechas gruesas indican el flujo de líquido a través de los tubos después de las cámaras están completamente ensamblados (no se muestra) Haz click aquí para ver la imagen más grande.

Figura 2
Figura 2. Preparación de los microtúbulos segmentados y proteína típica resultados punta de seguimiento de A.. Adjunta-Cubreobjetos semillas microtúbulos visumarginadas con DIC óptica (paso 4.8 del protocolo); flechas apuntan a algunas de las semillas. La imagen es de un promedio de 10 cuadros en secuencia adquirida (100 milisegundos de exposición de cada uno). B. Microscopio de campo en la misma después de la tubulina y GTP se incubaron durante 8 min a 32 ° C, los microtúbulos se ven que emana de las semillas (paso 5.2 del protocolo). C. Una imagen de color de pseudo-microtúbulos que muestra una vista segmentada en la DIC (verde) y las tapas de estabilización marcadas con rodamina (flechas), visto con epifluorescencia (rojo). D. La misma imagen que en el panel C, pero con un campo de visión más amplio. Algunos fragmentos de microtúbulos que contiene rodamina, que nuclean espontáneamente en la solución durante el paso 5.2 del protocolo, también se observan (puntas de flecha). E. Quimógrafo de la proteína GFP-Dam1 seguimiento al final de los microtúbulos desmontaje. Barras con código de color de la izquierda muestran un canal fluorescente utilizado para la adquisición de la parte correspondiente de la quimógrafo. Vertlíneas fluorescentes iCal son creados por los complejos Dam1-GFP que se unen a la pared de los microtúbulos y muestran poco movimiento hasta el final de los microtúbulos viene por. F. Quimógrafo como en E, pero con GFP etiquetada Ndc80 complejo 19. Inicialmente, los microtúbulos está decorado de manera uniforme, aunque el aumento de la fluorescencia de GFP se observó en el extremo tapado después de Rodamina excitación. Este aumento depende de la piscina soluble de la proteína Ndc80-GFP, pero el mecanismo subyacente no se conoce. Después de la tapa se desintegra, el acortamiento de los microtúbulos se hace evidente, pero hay poca enriquecimiento de fluorescencia en la punta de los microtúbulos, lo que indica una falta de tip-tracking. T. Distancia del punto Dam1 punta de seguimiento al axonema, que fue utilizado para la nucleación de microtúbulos en este experimento 10, se midió utilizando MetaMorph Track Puntos drop-in. El brillo inicial del complejo en movimiento corresponde a aproximadamente 15 subunidades: suficientes para formar un solo anillo Dam1. El brillo de thcompleja e movimiento fue normalizada a la intensidad de las manchas fluorescentes, inmóviles cubreobjetos-unido a corregir para el blanqueo. Las barras horizontales de escala: los grupos A, B, D (10 micras), los grupos C, F, E (3 m). Barras de escala verticales: 10 seg. Click aqui para ver la imagen más grande.

Figura 3
Figura 3. El análisis cuantitativo de las señales fluorescentes. Una. Ejemplo imagen del campo de microscopio con complejos Dam1-Alexa488 unido de manera no específica a la superficie de cubreobjetos. Nota heterogeneidad en puntos de brillo y falta de uniformidad de la iluminación. La barra de escala es de 2 m. B. La representación cuantitativa de la misma imagen que en el panel A. C D. Imagen normalizada del panel A representa como superficie de intensidad usando Mathematica 9 (Wolfram Research). Tenga en cuenta que esta superficie es más plana que en B y los picos son menos heterogénea en altura. E. Los ejemplos de las curvas fotoblanqueo obtenidos con la proteína CENP-E-GFP. Se recogió la intensidad integral de cada punto, se normalizó para tener en cuenta las irregularidades de la iluminación y las curvas fueron suavizadas (promedio con la ventana deslizante de 5 puntos). Señales en la fila superior se excluyeron del análisis adicional por las razones descritas en la Sección 7.3.4. Curvas como las mostradas en la fila inferior se procesaron y se utilizaron para construir un histograma en el panel F, como se describe en las secciones 7.3.4-7.3.5. F ng>. Histograma de intensidades integrales recogidos de 22 puntos de blanqueo CENP-E-GFP (total 1.900 puntos de datos). La línea roja es apropiado con la función de Gauss equidistantes; 5 picos distintos se ven. La intensidad integral de un solo fluoróforo GFP determinado a partir de este histograma fue (64,7 ± 1,1) x 10 4 Ag o. Curva fotoblanqueo típica para Dam1-Alexa488, procesada como se describe en el protocolo 7.3.5. H. Histograma de intensidades integrales recogidos de 48 fotoblanqueo puntos Dam1-Alexa488 (total 1.548 puntos de datos); 4 picos distintos se ven. La intensidad integral de una molécula Alexa488 en estas condiciones era (17,4 ± 0,8) x 10 3 au Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

es/ftp_upload/51150/51150fig4.jpg "/>
Figura 4. Ilustración de los movimientos de las cuentas asociadas a los microtúbulos. A. Esquema del experimento con perlas recubiertas con proteínas de unión a los microtúbulos. Flechas gruesas indican la dirección de desensamblaje de los microtúbulos. B. Proyección de intensidad máxima de las imágenes DIC de un talón GFP-revestido-Dam1, que fue de forma estable unida a un microtúbulo segmentado (basado en 26 imágenes). Bead mostró el movimiento en forma de arco (flecha), lo que sugiere que se adjuntó a un microtúbulo orientado como se muestra con una línea discontinua. C. Imagen única del mismo grano como en el panel B, pero tomadas durante el paso 8.6 del protocolo inmediatamente después de abrir el obturador fluorescente. La flecha apunta a la tapa fluorescente situado cerca del talón, pero en el lado opuesto del sitio de fijación de microtúbulos. D. Una proyección de intensidad máxima muestra la trayectoria del movimiento de la perla con el disassembling microtúbulos. La imagen fue creada a partir de 115 marcos adquiridos secuencialmente desde el inicio de formación de imágenes (en cuenta la proyección en forma de arco) y hasta de grano de desprendimiento (Video 4). E. Esquema del experimento con perlas recubiertas con kinesina plus de fin dirigida CENP-E. El grano se pone en contacto con los microtúbulos usando trampa láser. La trampa se desconecta y se inicia el talón se mueve hacia los microtúbulos más extremo. Después de la tapa de estabilización de microtúbulos se retire y microtúbulos desmontado, el cordón se invierte la dirección de su movimiento. F. Quimógrafo muestra un cordón de 0,5 micras recubierto con X. truncada laevis CENP-E kinesina avanzar hacia microtúbulos más extremo 24. Después de la perla viajó alrededor de 1 m, de obturación fluorescente se abrió (barra roja), y la tapa de la estabilización se hizo visible (punta de flecha roja). La cuenta individual de repente (punta de flecha verde), presumiblemente cuando el motor se encontró con el final de los microtúbulos manteca. T Haz click aquí para ver la imagen más grande.

Video 1. Preparación de los microtúbulos segmentados. Video muestra DIC imágenes de un microscopio de campo durante la preparación de los microtúbulos segmentados. Imaging se inicia después de las semillas de microtúbulos ya han unido a la cubreobjetos. Los pequeños puntos redondos son de las partículas que se encuentran en nuestra preparación de anticuerpos anti-digoxigenina. Después se añaden tubulina y GTP, microtúbulos comienzan a alargarse de las semillas (paso 5.2). Después de que lleguen a la longitud deseada (8-15 micras), la solución se intercambia rápidamente para introducir rodaminado tubulina y GMPCPP. Durante el intercambio, los polímeros de microtúbulos curva en el dirección de flujo, pero después de que se detuvo la bomba que asuma la orientación unstrained. Durante la siguiente fase "tapado", algunos tubulina comienza a polimerizarse espontáneamente y pequeños fragmentos de microtúbulos se ven flotando en la cámara. Ellos se eliminan durante el siguiente lavado (paso 5.5), que también elimina todos tubulina soluble y nucleótidos. Durante estas etapas algunos microtúbulos no pueden montar las tapas robustas, y cuando la tubulina soluble se elimina por lavado se desmontan rápidamente. Los microtúbulos tope, sin embargo, son estables durante varias horas a menos que se iluminan; Rodamina cuando es excitado, las tapas se fragmentan, y los segmentos de microtúbulos no niveladas quedan expuestas. Las imágenes fueron adquiridas cada segundo, jugado a 30 fps.

Video 2. Destapar los microtúbulos segmentados. Video muestra un microtúbulo segmentado totalmente montado a través de DIC, seguido de imágenes fluorescentes de la misma microtúbulos a través del cubo de filtro de rodamina. A bsegmento rojo al final de los microtúbulos (flecha) se mueve en arco y se desvanece rápidamente debido a la foto-blanqueo. Imágenes adquiridas a 6 fps y reproducir a 10 fps.

Video 3. Proteína seguimiento con depolymerizing final de los microtúbulos. A microtúbulos segmentado (MT) es visible gracias a la decoración de GFP-etiquetados Dam1, que forma puntos distintos (imágenes verdes). De fluorescencia de rodamina es entonces excitado y la tapa de color rojo se hace visible, se mueve en un arco suave en el extremo de los microtúbulos (las imágenes de color rojo), y el resto de los microtúbulos no es visible debido a que la tubulina marcado se incorporó sólo en el extremo del polímero. Los blanqueadores de tapa rápidas, comienza a desmoronarse y el cubo fluorescente se enciende de nuevo a las buenas prácticas agrarias, justo a tiempo para ver el comienzo del acortamiento del segmento de los microtúbulos que no tiene la tubulina rodaminado y GMPCPP. Cuando depolymerizing final alcanza los puntos Dam1, el final de los microtúbulos se vuelve de color verde brillante. Posteriormente, una fluorescencia verdelugar nt se ve que se mueve con los microtúbulos desmontaje, que ilustra la processive punta-tracking. Concentración de Dam1 era 3 nM, las imágenes fueron adquiridas y se reproducen en el 0,4 fps. La barra de escala 5 micras.

Video 4. Bead seguimiento con despolimerización de microtúbulos termina. Cuenta de vidrio recubierto con Dam1 es visto moviéndose en un arco, lo que indica que está atado a la cubreobjetos por un microtúbulo. Cuando se excita la fluorescencia de rodamina, la gorra roja se ve distalmente desde el reborde y se mueve en sincronía con el movimiento de la perla (imágenes en rojo). Pronto, el cordón comienza a moverse direccionalmente, mientras que su movimiento en forma de arco disminuye en amplitud (Figura 4D). DIC imágenes fueron adquiridas a través de Rodamina cubo filtro cada 300 ms y jugaron 6 fps; grano es de 1 m, barra de escala 5 micras.

Video 5. Grano Kinesin recubierto movimiento bidireccional de los microtúbulos segmentado. Imaging se inicia después de la coa granoted con larga duración CENP-E kinesina fue colocado en la microtúbulos (MT) de la pared. La flecha apunta a la posición inicial del grano. El cordón se ve alejándose de la flecha, como el motor camina hacia el extremo más microtúbulos. Poco después de la tapa plus de fin se ilumina (punta de flecha, las imágenes de color rojo), el cordón comienza a moverse en la dirección opuesta. Sólo duración CENP-E quinesina puede acoplar el movimiento del talón hasta el final de los microtúbulos manteca. Perlas recubiertas con truncada CENP-E pueden moverse hacia el extremo más-MT pero separar poco después se desencadenó la despolimerización de microtúbulos (compárense las Figuras 4F y 4G). DIC imágenes fueron adquiridas cada 1 s y jugaron a los 16 fps; grano es de 0,5 micras.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Muchos ensayos de una sola molécula hoy en día utilizan habitualmente cubreobjetos especialmente tratadas para reducir drásticamente la adherencia no específica de proteínas. El procedimiento se describe aquí es una modificación del protocolo original desarrollado en Howard laboratorio 32, y nos encontramos con que silanizar los cubreobjetos es bien vale la pena el esfuerzo, incluso con ensayos de cuentas basados ​​en la DIC, que no utilizan la fluorescencia. Cámaras ensambladas con tales cubreobjetos muestran superficies mucho más limpias, y los resultados obtenidos en la presencia de la proteína soluble de unión a microtúbulos son más reproducibles, especialmente si se utiliza una concentración muy baja de proteína.

Los pasos más importantes para la preparación exitosa de MTs segmentadas son:

  1. optimización de la concentración de tubulina y los tiempos de incubación (los pasos 5.1 a 5.2). Los tiempos y las concentraciones indicadas en el protocolo son aproximados y pueden variar debido a las diferencias en los preparativos de tubulina, volumen de la cámara, etc.
  2. específico y apretadola unión de los microtúbulos nucleadores para el cubreobjetos, y
  3. la capacidad de controlar las velocidades de flujo de precisión. En nuestras manos, se logran cuando los experimentos se llevan a cabo en las cámaras de flujo sellados los mejores resultados.

La principal ventaja de este protocolo es que la despolimerización de microtúbulos puede ser activado con una alta resolución temporal y espacial, ayudando de este modo el análisis de los movimientos en los extremos de los microtúbulos desmontaje. Con esta técnica, los tampones se pueden cambiar rápidamente y proteínas y granos de unión a microtúbulos se pueden añadir en una variedad de tampones después de los microtúbulos se han formado. Esto permite el estudio de los efectos de una proteína sobre la despolimerización de los microtúbulos por separado de sus posibles funciones en ensamblaje de los microtúbulos. Esto es útil si la proteína también puede interactuar con la tubulina soluble, que puede enmascarar sus interacciones con los microtúbulos. Sin embargo, desde gratis, la tubulina polimerizada está presente en la célula, se debe tener precaución wgallina interpretación importancia fisiológica de este tipo de resultados.

La limitación principal del enfoque de microtúbulos segmentado es que no es adecuado para estudiar los movimientos durante el ensamblaje de los microtúbulos, o los efectos de seguimiento de proteínas en la catástrofe de microtúbulos y de rescate. Para estas preguntas, los ensayos con microtúbulos dinámicos cultivadas en la presencia de tubulina solubles son más apropiados. Otra limitación de este método es que los buffers de motilidad deben estar libres de enzimas eliminadora de oxígeno. Tales mezclas de enzimas, por ejemplo, sobre la base de la catalasa y la glucosa-oxidasa 48, pueden mejorar significativamente la vida útil de las moléculas fluorescentes. Sin embargo, si estos reactivos se utilizan en el ensayo de microtúbulos segmentado, el foto-inducción de desmontaje es poco frecuente debido a microtúbulos tapas de lejía sin desintegración. En ensayos cuantitativos de fluorescencia, la tasa de blanqueo siempre debe tenerse en cuenta, como se describe anteriormente o por ejemplo en referencia23, especialmente si no se utilizan agentes anti-blanqueo.

Varias proteínas de unión a microtúbulos ensayados en el ensayo de microtúbulos segmentado mostraron unión preferencial a las tapas de estabilización marcadas con rodamina vs los segmentos de microtúbulos no marcados. La unión a las tapas puede reducir la fracción de perlas de processive, ya que las perlas de tapa asociada a menudo se desprenden de la microtúbulos cuando la tapa se desintegra. Por último, señalamos que si las perlas de motor recubierto caminan hacia los microtúbulos más terminar muy rápido, con frecuencia llegan a las gorras rojas antes de activar la despolimerización de los microtúbulos, en cuyo caso también se disocian de los microtúbulos y un experimento de este tipo no serán productivas .

En resumen, la capacidad de las proteínas de unión a microtúbulos con ninguna actividad inherente del motor para seguir el final de un acortamiento de los microtúbulos es un interesante fenómeno, todavía poco comprendido. Los protocolos descritos aquí deben ayudar a los estudios de este tipo de proteins y sus propiedades in vitro. Transporte despolimerización de microtúbulos dependientes de desempeña un papel importante en la segregación cromosómica durante la mitosis. Por lo tanto, esperamos que las técnicas descritas aquí en última instancia, ayudar a obtener mayor conocimiento en los mecanismos de la división celular.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a FI Ataullakhanov para ayudar a diseñar y fabricar cámaras de flujo reutilizables, N. Dashkevich, N. y A. Gudimchuk Korbalev para proporcionar imágenes de figuras, N. y P. Gudimchuk Zakharov para el desarrollo de un protocolo y proporcionar reactivos para preparar semillas microtúbulos marcadas con digoxigenina, A. Potapenko para obtener ayuda con la edición de texto y otros miembros del laboratorio Grishchuk para consejos y discusiones. Esta obra fue financiada en parte por subvención NIH R01 GM-098389 y una subvención piloto de Pennsylvania Muscle Instituto de ELG, que es un Kimmel Scholar, por RFBR ofrece 12-04-00111-A, 13-04-40190-H y 13 -04-40188-H, Academia Rusa de Ciencias del Presidium de Subvenciones (Mecanismos de Sistemas Molecular Integración y programas de Biología Celular Molecular y Moleculares) a FI Ataullakhanov, NIH subvención GM R01 GM033787 a JR McIntosh, y una beca postdoctoral de la Fundación Dinastía Zimin Dmitry al VAV

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Table 1. Microscopy and other equipment.
Microscope Zeiss
Nikon		 Axio Imager 2
Eclipse Ti		 other microscope models capable of DIC and epifluorescence-imaging can be used
Objective Zeiss
Nikon		 420490-9900-000
CFI Apo 100x Oil 1.49		 100X, DIC, 1.3-1.49 NA
Objective heater Bioptechs 150803, 150819-19
Fluorescent filter cube Chroma 49004 or 49008
41017 or 49020		 optimized for Rhodamine fluorescence 
optimized for GFP fluorescence
Acquisition software freeware MicroManager
Molecular Devices		 not applicable
MetaMorph 7.5		 http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/
other software can be used to acquire images and for a particle tracking
EMCCD camera Andor iXon3, DU-897E-cs0-#BV Highly sensitive EMCCD camera
Trapping laser IPG Photonics YLR-10-1064-LP 1,064 nm laser, 10 W
Fluorescence excitation lasers Coherent, Inc.
Coherent, Inc.		 Sapphire 488 LP
Sapphire 552 LP		 excitation of green fluorophores
excitation of red fluorophores
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-001
Commercial flow chambers Warner Instruments RC-20 or RC-30
Perfusion pump Cole Palmer
Harvard Apparatus		 Masterflex 77120-52
Pico Plus		 Both pumps provide the required rate of liquid flow but a peristaltic pump may pulse at very slow speed. The flow with a syringe pump is more consistent for a wide range of rates but this pump has inertia. 
Table 2. Microscopy chamber preparation.
Modified microscope slides for reusable chambers Precision Glassblowing of Colorado Custom order www.precisionglassblowing.com Sonic slots in slides using schematics in Figure 1
Polyethylene tubing Intramedic 427410 I.D. 0.58 mm, O.D. 0.965 mm; use these tubes to connect assembled chamber to the pump and waste container
Polyethylene tubing Intramedic 427400 I.D. 0.28 mm, O.D. 0.61 mm; use these tubes to make the reusable chamber
Regular microscope slides VWR 48312-003 Other similar slides can be used
Coverslips VWR 48393-150, 48366-067 Other similar coverslips can be used
Silicon sealant World Precision Instruments KIT, SILICON SEALANT 5 MIN CURE
Epoxy glue Loctite 83082
Cyanoacrylate adhesive Scotch 3M AD114 Or cyanoacrylate adhesive from other manufacturers
Table 3. Coverslips cleaning and coating.
Molecular Sieves, Grade 564 Macron 4490-04
Coverglass Staining Jar Ted Pella, Inc. 21036
Coverslip Ceramic Holder Thomas Scientific 8542e40
PlusOne Repel Silane GE Healthcare Biosciences 17-1332-01
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
Anti-digoxigenin AB Roche Applied Science 11093274910
Table 4. Preparation of seeds and segmented microtubules.
Tubulin purified from cow brains
Cytoskeleton, Inc
T238P		 For purification protocols see 49–51
Unlabeled porcine tubulin
Labeled tubulin Cytoskeleton, Inc
Invitrogen
Invitrogen		 TL590M
C1171 (Rhodamine)
A-2952 (Digoxigenin)		 Rhodamine-labeled porcine tubulin
Tubulin can be labeled with any amine-reactive dye as in reference52.
GMPCPP Jena Biosciences NU-405 Aliquot and store at -70 °C
VALAP Vaseline, lanolin, and paraffin at 1:1:2 by mass see reference9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 13, 83-117 (1997).
  2. Mitchison, T. M., Kirschner, M. W. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (15), 237-242 (1984).
  3. Walker, R. A., Brien, O., et al. Dynamic Instability of Individual Microtubules Analyzed by Video Light Microscopy: Rate Constants and Transition Frequencies. J. Cell Biol. 107, 1437-1448 (1988).
  4. Gardner, M. K., Zanic, M., Gell, C., Bormuth, V., Howard, J. Depolymerizing Kinesins Kip3 and MCAK Shape Cellular Microtubule Architecture by Differential Control of Catastrophe. Cell. 147 (5), 1092-1103 (2011).
  5. Lombillo, V. A., Stewart, R. J., McIntosh, J. R. Minus-end-directed motion of kinesin-coated microspheres driven by microtubule depolymerization. Nature. 373, 161-164 (1995).
  6. Franck, A. D., Powers, A. F., Gestaut, D. R., Gonen, T., Davis, T. N., Asbury, C. L. Tension applied through the Dam1 complex promotes microtubule elongation providing a direct mechanism for length control in mitosis. Nat. Cell Biol. 9 (7), 832-837 (2007).
  7. Tran, P. T., Walker, R. A., Salmon, E. D. A metastable intermediate state of microtubule dynamic instability that differs significantly between plus and minus ends. J. Cell Biol. 138 (1), 105-117 (1997).
  8. Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R. Force production by disassembling microtubules. Nature. 438, 384-388 Forthcoming.
  9. Coue, M., Lombillo, A., Richard, J. Microtubule Depolymerization Promotes Particle and Chromosome Movement In Vitro. J. Cell Biol. 112 (6), 1165-1175 (1991).
  10. Grishchuk, E. L., Spiridonov, I. S., et al. Different assemblies of the DAM1 complex follow shortening microtubules by distinct mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (19), 6918-6923 (2008).
  11. Asbury, C. L., Gestaut, D. R., Powers, A. F., Franck, A. D., Davis, T. N. The Dam1 kinetochore complex harnesses microtubule dynamics to produce force and movement. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (26), 9873-9878 (2006).
  12. Westermann, S., Wang, H. -W., Avila-Sakar, A., Drubin, D. G., Nogales, E., Barnes, G. The Dam1 kinetochore ring complex moves processively on depolymerizing microtubule ends. Nature. 440 (7083), 565-569 (2006).
  13. Grissom, P. M., Fiedler, T., Grishchuk, E. L., Nicastro, D., West, R. R., Mcintosh, J. R. Kinesin-8 from Fission Yeast A Heterodimeric , Plus-End – directed Motor that Can Couple Microtubule Depolymerization to Cargo Movement. Mol. Biol. Cell. 20, 963-972 (2009).
  14. McIntosh, J. R., Volkov, V., Ataullakhanov, F. I., Grishchuk, E. L. Tubulin depolymerization may be an ancient biological motor. J. Sci. 123, 3425-3434 (2010).
  15. Grishchuk, E. L., McIntosh, J. R., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I. Force generation by dynamic microtubule polymers. Compr. Biophys. 4, 93-117 (2012).
  16. Asbury, C. L., Tien, J. F., Davis, T. N. Kinetochores' gripping feat: conformational wave or biased diffusion. Trends Cell Biol. (1), 38-46 (2011).
  17. Tien, J. F., Umbreit, N. T., et al. Cooperation of the Dam1 and Ndc80 kinetochore complexes enhances microtubule coupling and is regulated by aurora B. Cell Biol. 189 (4), 713-723 (2010).
  18. Gestaut, D. R., Graczyk, B., et al. Phosphoregulation and depolymerization-driven movement of the Dam1 complex do not require ring formation. Nat. Biol. 10 (4), 407-414 (2008).
  19. Schmidt, J. C., Arthanari, H., et al. The Kinetochore-Bound Ska1 Complex Tracks Depolymerizing Microtubules and Binds to Curved Protofilaments. Dev. Cell. 23 (5), 968-980 (2012).
  20. Brouhard, G. J., Stear, J. H., et al. XMAP215 is a processive microtubule polymerase. Cell. 132 (1), 79-88 (2008).
  21. Stumpff, J., Du, Y., et al. A Tethering Mechanism Controls the Processivity and Kinetochore-Microtubule Plus-End Enrichment of the Kinesin-8 Kif18A. Mol. Cell. 43 (5), 764-775 (2011).
  22. Su, X., Qui, W., Gupta, M., Pereira-Leal, J., Reck-Peterson, S. L., Pellman, D. Mechanisms underlying the dual-mode regulation of microtubule dynamics by Kip3/kinesin-8. Mol. Cell. 43 (5), 751-763 (2011).
  23. Helenius, J., Brouhard, G., Kalaidzidis, Y., Diez, S., Howard, J. The depolymerizing kinesin MCAK uses lattice diffusion to rapidly target microtubule ends. Nature. 441 (7089), 115-119 (2006).
  24. Gudimchuk, N., Vitre, B., et al. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive bi-directional tracker of dynamic microtubule tips. Nat. Cell Biol. 15 (9), 1079-1088 (2013).
  25. Akhmanova, A., Steinmetz, M. Microtubule +TIPs at a glance. J. Sci. 20 (Pt 20), 3415-3419 (2010).
  26. Dixit, R., Barnett, B., Lazarus, J., Tokito, M., Goldman, Y., Holzbaur, E. Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (2), 492-497 (2009).
  27. Grishchuk, E. L., Efremov, A. K., et al. The Dam1 ring binds microtubules strongly enough to be a processive as well as energy-efficient coupler for chromosome motion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (40), 15423-15428 (2008).
  28. Akiyoshi, B., Sarangapani, K. K., et al. Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments. Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).
  29. McIntosh, J. R., Grishchuk, E. L., et al. Fibrils Connect Microtubule Tips with Kinetochores A Mechanism to Couple Tubulin Dynamics to Chromosome Motion. Cell. 135 (2), 322-333 (2008).
  30. Powers, A. F., Franck, A. D., et al. The Ndc80 kinetochore complex forms load-bearing attachments to dynamic microtubule tips via biased diffusion. Cell. 136 (5), 865-875 (2009).
  31. Umbreit, N. T., Gestaut, D. R., et al. The Ndc80 kinetochore complex directly modulates microtubule dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (40), 16113-16118 (2012).
  32. Gell, C., Bormuth, V., et al. Microtubule Dynamics Reconstituted In Vitro and Imaged by Single-Molecule Fluorescence Microscopy. Methods Biol. 95, 221-245 (2010).
  33. Dixit, R., Ross, J. L. Studying Plus-End Tracking at Single Molecule Resolution Using TIRF Microscopy. Methods Cell Biol. 95, 543-554 (2010).
  34. Beausang, F. J., Sun, Y., Quinlan, E. M., Forkey, N. J., Goldman, Y. Construction of Flow Chambers for Polarized Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (polTIRFM). Cold Spring Harbour Protoc. 6, 712-715 (2012).
  35. Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D. N., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP Hydrolysis in Microtubule Dynamics: Information from a Slowly Hydrolyzable Analogue, GMPCPP. Mol. Biol. Cell. 3, 1155-1167 (1992).
  36. Grishchuk, E. L., Ataullakhanov, F. I. In Vitro Assays to Study the Tracking of Shortening Microtubule Ends and to Measure Associated Forces. Methods Cell Biol. 95, 657-676 (2010).
  37. Gutiérrez-Medina, B., Block, S. M. Visualizing individual microtubules by bright field microscopy. Am. J. Phys. 78 (11), 1152-1159 (2010).
  38. Volkov, V. A., Zaytsev, A. V., et al. Long tethers provide high-force coupling of the Dam1 ring to shortening microtubules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (19), 7708-7713 (2013).
  39. Laan, L., Pavin, N., et al. Cortical dynein controls microtubule dynamics to generate pulling forces that position microtubule asters. Cell. 148 (3), 502-514 (2012).
  40. Myster, S. H., Knott, J. A., O'Toole, E., Porter, M. E. The Chlamydomonas Dhc1 gene encodes a dynein heavy chain subunit required for assembly of the I1 inner arm complex. Mol. Biol. Cell. 8, 607-620 (1997).
  41. Lombillo, V. A., Coue, M., McIntosh, J. R. In vitro motility assays using microtubules tethered to Tetrahymena pellicles. Methods Cell Biol. 39, 149-165 (1993).
  42. Hyman, A., Chrétien, D., Arnal, I., Wade, R. Structural changes accompanying GTP hydrolysis in microtubules: information from a slowly hydrolyzable analogue guanylyl-(alpha,beta)-methylene-diphosphonate. J. Cell Biol. 128 (1-2), 117-125 (1995).
  43. Park, M., Kim, H., Kim, D., Song, N. W. Counting the Number of Fluorophores Labeled in Biomolecules by Observing the Fluorescence-Intensity Transient of a Single Molecule. Bull. Chem. Soc. Jap. 78, 1612-1618 (2005).
  44. Welburn, J. P. I., Grishchuk, E. L., Backer, C. B., Wilson-Kubalek, E. M., Yates, J. R., Cheeseman, I. M. The human kinetochore Ska1 complex facilitates microtubule depolymerization-coupled motility. Dev. Cell. 16 (3), 374-385 (2009).
  45. Efremov, A., Grishchuk, E. L., Mcintosh, J. R., Ataullakhanov, F. I. In search of an optimal ring to couple microtubule depolymerization to processive chromosome motions. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (48), 19017-19022 (2007).
  46. Itoh, T., Hisanaga, S., Hosoi, T., Kishimoto, T., Hotani, H. Phosphorylation states of microtubule-associated protein 2 (MAP2) determine the regulatory role of MAP2 in microtubule dynamics. Biochemistry. 36 (41), 12574-12582 (1997).
  47. Oguchi, Y., Uchimura, S., Ohki, T., Mikhailenko, S. V., Ishiwata, S. The bidirectional depolymerizer MCAK generates force by disassembling both microtubule ends. Nat. Biol. (6), 1-8 (2011).
  48. Kishino, A., Yanagida, T. Force measurements by micromanipulation of a single actin filament by glass needles. Nature. 334, 74-76 (1988).
  49. Borisy, G. G., Marcum, J. M., Olmsted, J. B., Murphy, D. B., Johnson, K. A. Purification of tubulin and associated high molecular weight proteins from porcine brain and characterization of microtubule assembly in vitro. Ann. NY Acad. Sci. 253, 107-132 (1975).
  50. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S., Kirschner, M. W. A Protein Factor Essential for Microtubule Assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72 (5), 1858-1862 (1975).
  51. Widlund, P. O., Podolski, M., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Mol. Biol. Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
  52. Hyman, A., Drechsel, D., et al. Preparation of Modified Tubulins. Methods Enzymol. 196, 478-485 (1991).

Tags

Protocolo Básico cámara de flujo de microscopía de una sola molécula de fluorescencia trampa láser proteína de unión a microtúbulos motor microtúbulos dependiente de microtúbulos punta-tracking
Preparación de segmentados microtúbulos para estudiar las mociones impulsadas por las que desmontan microtúbulos Ends
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Volkov, V. A., Zaytsev, A. V.,… More

Volkov, V. A., Zaytsev, A. V., Grishchuk, E. L. Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends. J. Vis. Exp. (85), e51150, doi:10.3791/51150 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter