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Biology

분해 미세 소관 엔드에 힘 입어 모션을 연구하기 위해 분단 미세 소관의 준비

Published: March 15, 2014 doi: 10.3791/51150
Automatic Translation
1,2, 3, 3
1Center for Theoretical Problems of Physicochemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences, 2Federal Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Moscow, Russia, 3Physiology Department, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

Summary

미세 소관은 본질적으로 불안정 폴리머, 그리고 성장과 단축 사이에 자신의 전환 확률 통제하기가 어렵습니다. 여기에서 우리는 photoablatable 안정 캡으로 분할 미세 소관을 사용하여 프로토콜을 설명합니다. 분할 된 미세 소관 해중합함으로써 분해 미세 소관의 끝 동작의 분석을 지원, 높은 공간적 해상도로 트리거 될 수 있습니다.

Abstract

미세 소관 해중합은 체외에서 다른 단백질 복합체 단백질 코팅 비즈를 수송하는 힘을 제공 할 수 있습니다. 기본 메커니즘은 세포 분열 중에 미세 소관 의존 염색체 운동에 중요한 역할을하는 것으로 생각되지만, 관련 단백질과 자신의 정확한 역할은 불분명합니다. 따라서, 정제 된 구성 요소와 정의 생화학 적 환경을 사용하여 체외에서 이러한 운동을 연구하는있는 분석법을 개발하는 요구가 증가하고 있습니다. 미세 소관은, 그러나, 본질적으로 불안정 중합체이다, 성장과 단축 사이에 자신의 전환 확률 통제하기가 어렵습니다. 우리가 여기에서 설명하는 프로토콜은 photoablatable는 캡을 안정으로 만든 분할 된 미세 소관을 활용. 이러한 분할 된 미세 소관 해중합함으로써 분해 미세 소관의 끝에서 운동의 연구를 지원, 높은 공간적 해상도로 트리거 될 수 있습니다. 이 기술은 CA에 사용될 수있다동적 미세 소관은 끝 processively 이동 형광 표지 된 단백질 복합체, 분자의 수의 정량적 인 분석을 RRY. 이것으로 신호 대 잡음 비율 및 기타 정량적 형광 분석법을 최적화하려면, 커버 슬립은 수용성 형광 표지 된 단백질의 비특이적 흡착을 감소하도록 처리한다. 상세한 프로토콜은 고려 형광 조명의 불균일을 취해, 등거리 가우시안 적합하여 하나의 형광의 강도를 결정하기 위해 제공된다. 마지막으로, 우리는 processive화물 운동에 몇 미세 소관 해중합에 다른 모터와 nonmotor 단백질의 기능에 대한 통찰력을 제공하는 단백질 코팅 마이크로 비즈의 미세 소관에 의존하는 동작을 연구하는 분할 된 미세 소관의 사용을 설명합니다.

Introduction

미세 소관은 높은 세포 구조, 세포 운동성, 세포 분열, 세포 내 수송 1에 중요한 골격 구조를 보존하고 있습니다. 이러한 동적 중합체는 GTP의 존재 튜 불린에서 조립 이들은 자발적 성장이 단축 전환. 미세 소관은 (직경 25 nm의) 콘트라스트가 광학 현미경으로 미세 소관을 관찰하는 데 사용되어야합니다 강화하기 때문에 특별한 광학 기술 매우 얇은입니다. 이러한 폴리머와 이전 작업은 미분 간섭 대비 (DIC)을 3 사용하여 동적 동작을 살펴 보았다. 체외에서 이것과 유사한 연구는 일반적인 실험 조건에서 미세 소관은, 드물게 해중합에 재앙과 스위치를 거쳐야 밝혀마다 5 ~ 15 분 (이 주파수는 28 ~ 32 ° C에서 검사 7-15 밀리미터 용해 튜 불린의 농도입니다 ) 4. 다른 기술은 따라서 인덕턴스에 제안되었다제어 방식으로 전자 미세 소관 해중합. 미세 소관 쇼트닝 여기서 설명한 바와 같이, 거리 수용성 튜 불린 5,6 세척 레이저 광 (7)로 미세 소관을 절단 또는 분할 된 미세 소관 8을 사용하여 발생 될 수있다. 분할 된 미세 소관뿐만 아니라, 확률 론적으로 전환 폴리머를 사용하여 이전 작업은 이러한 염색체, 소포, 단백질 코팅 비즈 작은 세포 내화물은, 단축 미세 소관 9-13의 끝에서 이동할 수 있다는 것을 발견했다. 이러한 현상은 유사 분열 세포의 염색체 운동에 대한 직접적인 의미를 생각하고, 기본 메커니즘이 활성화 연구 14-16에서 현재됩니다.

최근, 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 등의 형광 기반 기술, 동적 인 미세 소관과 운동성을 연구하기 위해 사용되었다가 17-24로 끝났습니다. 이 방법의 장점은 허용한다는 것이다 상호 작용의 검토다른 형광 물질로 표지 단백질을 사용하여 실시간으로 미세 소관과 미세 소관 결합 단백질 사이의. 몇몇 단백질 복합체는 미세 소관 단부를 연신 및 / 또는 단축으로 processively 이동 발견되었다. 그들은 미세 소관 관련 단백질 Dam1 10,12,18, Ska1 19 일 및 XMAP215 (20)뿐만 아니라, 키네신 모터 Kif18A 21, 22, MCAK 23 CENP-E (24)이 (가) 있습니다. 이 단백질은 EB1 (25)와 같은 고전적인 팁 추적 단백질의 그것과 근본적으로 다른 processive 팁 추적을 나타낸다. EB1 분자 및 관련 파트너는 안정적으로 동적 미세 소관은 개별 분자가 빠르게 용해 수영장 (26)와 교환 만 ~ 0.8 초 미세 소관 팁에 바인딩 유지, 종료와 관련된 남아있는 것처럼 보이지만. 미세 소관이 많은 마이크론에 끝 반면, processive 팁 추적기, Dam1처럼, 여행, 및 미세 소관 조언과의 관계는 M 지속될 수모든 초. 팁 연관 시간뿐만 아니라, 추적 결과 속도는, 팁 추적 복합체를 형성하는 분자 (27)의 수에 크게 의존한다. 큰 단백질 앙상블은 일반적으로 훨씬 더 팁 추적기입니다. 예를 들어, 분리 된 효모 kinetochores와 같은 복잡한 어셈블리는 미세 소관에 결합 된 상태를 유지할 수는 시간 28 일 끝납니다. 일부 미세 소관 결합 단백질은, 예를 들어 Ndc80 동원체의 단백질 복합체, 단일 분자 수준에서 종료 미세 소관으로 추적 할 수없는 것으로, 아직 Ndc80은 구슬화물 19,29-31의 움직임을 결합에 매우 효율적입니다되었습니다. 따라서, 다른 단백질 복합체뿐만 아니라 생물학적 역할에 의한 팁 추적 메커니즘을 이해하기 위해, 그 팁 추적 복잡한 분자의 개수의 함수로서 팁 추적을 검사 할뿐만 아니라, 결정하는 것이 중요하다 구슬화물의 표면에 집단 운동을 전시하는이 단지의 기능을 제공합니다.

(그림 1A)와 함께 실험을 준비하고 수행 할 수있는 세부적인 프로토콜을 제공하는 아래. 첫째, 상업적으로 이용 가능한 유리 슬라이드 짧은 폴리에틸렌 관 (프로토콜 1)를 첨부하도록 수정됩니다. 재사용 할 수있는 현미경 흐름 챔버는 다음과 같은 슬라이드에서 조립 및 화학적 또는 플라즈마 세정 및 실란 커버 슬립 (프로토콜 2) 32 ~ 34됩니다. 얻어진 챔버 체적은 유입 배관의 용적 등 만 20-25 μL (또는 15 μL 한 작게, 프로토콜 1 주 3 참조)이다. 시판 유동 챔버도 사용될 수 있지만, 그 양이 단백질의 불필요한 낭비로 이어지는, 보통 크다. 큰 챔버가 사용되는 경우, 아래의 프로토콜의 모든 솔루션의 볼륨이 비례 적으로 조정해야한다. 미세 소관의 씨앗이 서서히 가수 분해 GTP 아날로그, GMPCPP (구아노 신-5'-[(α, β) methyleno] 트리 포스페이트) (프로토콜 3 등을 사용하여, 준비, 하이 먼 <도 참조EM> 등. 35). 씨앗 청소 커버 슬립에 고정하고 표면은 이후에 다른 단백질의 비특이적 흡착을 방지하기 위해 차단 32 (프로토콜 4 제닌 사용 씨의 고정화를 설명합니다). 분단 미세 소관은 5 프로토콜을 사용하여 제조 될 수있다. 이 방법의 주된 이론적 근거는 GTP의 존재하에 동적 미세 소관 형성 중합체, GMPCPP 포함될 안정 튜 불린 세그먼트의 짧은 "캡"을 추가하여 일시적으로 안정화 될 수 있다는 것이다. 이 모자는 로다 민 표지 튜 불린을 포함, 그래서 그들은 530-550 nm의 레이저 또는 수은 아크 램프 (프로토콜 6) (36)의 시야를 비추는 것만으로 간단하게 제거 할 수 있습니다. 팁 트래킹 신호의 형광 강도는 고려 현미경 야 조사 (프로토콜 12)의 요철을 가지고, 분해 미세 소관 단부로 여행 분자의 수를 추정하기 위해 사용될 수있다. 유사한 접근법이 사용될 수있다27 (프로토콜 8)에 기술 된 바와 같이 제조 된 해중합의 미세 소관 단백질 코팅 구슬 사이의 상호 작용을 연구합니다. 일부 단백질은 쉽게 분할 된 미세 소관의 벽에 결합하지만, 레이저 핀셋도하여 그 바인딩 홍보, 미세 소관 벽 근처 비드를 보유 할 수 있습니다.

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Protocol

필수 장비 : 아래에서 설명하는 실험이 DIC와 형광 이미징 (표 1)에 장착 된 광학 현미경을 필요로합니다. 시야 LED 조명은 크게 일반 할로겐 램프로 관찰하기 어려운 커버 슬립 연결된 미세 소관 씨 (37)의 검출을 향상시키기 위해 사용될 수있다. 현미경 실에서 액체의 흐름을 제어하기 위해, 솔루션은 10 ~ 100 μL / 분에서 흐름의 속도를 낼 수있는 연동 펌프로 교환해야합니다. 주사기 펌프도 이용 될 수 있지만, 치료는 유동 속도가 갑자기 변경 될 때 형성 할 수 있고 기포를 피하기 위해주의해야한다. 단백질 - 코팅 된 비드를 처리하기위한, 예를 들어 분할 된 미세 소관 벽 부근들을 가지고, 1064 nm의 연속파 레이저 광 현미경의 광축에 도입하고 생성하기 위해 높은 개구 수 대물 (1.3 이상)로 집중 될 수있다 함정. 형광의 정량 분석여기 광이 광원의 강도 이후 레이저 계 소스에 의해 제공되어야 단일 분자의 강도는 수은 램프에 의해 생성 된 것보다 더 안정적이다. 기계적 진동을 최소화하기 위해, 현미경 광학 테이블에 배치되어야한다. 더 정교한 장비가 해중합 미세 소관이 일정한 힘에서 끝 구슬의 움직임을 연구하고, 싱글 샷 힘 신호 11,38,39를 측정하고, 이러한 방법은 다른 곳에서 설명한다.

1. 제조 재사용 유량 용기

재사용 할 수있는 유량 용기 용 유리 슬라이드 (우리의 공급자에 대한 자세한 내용은 표 2 참조) 그림 1B의 회로도를 사용하여 로컬 유리 제조 시설에서 주문할 수 있습니다. 초음파 밀링 일반 현미경 2 개의 홈 15 ± 1 밀리 긴 만드는 슬라이드 (75mm X 25mm, 두께 1.0 mm), 1.0 ± 0.1 mm 폭과 깊이 0.8 ± 0.05 mm를 수정합니다.가장 가까운 끝 사이의 거리가 14 ± 1 mm 이상이어야한다이 거리가 X 22mm의 coverslip에 22mm 조립 실에 최적입니다. 다른 물질의 목록은 표 2를 참조하십시오.

  1. 홈의 내부 끝 ~ 5mm의 오버행을 떠나, 슬라이드의 각 홈에 100 mm 길이의 폴리에틸렌 관 (OD 0.61 mm, 표 2)를 배치합니다. 홈 내부에 완전히 튜브를 삽입, 시아 노 아크릴 레이트 접착제로 홈 내부의 튜브를 고정합니다.
  2. 튜브 안쪽에 접착제를 흘리고 피하면서, 에폭시 접착제로 홈을 입력합니다. 접착제 ~ 1 일 동안 건조시킵니다.
  3. 날카로운 면도날 슬라이드의 중심으로 기단 부분을 제거하는, 각 부착 위치의 말단부에서 고화 접착제 질량 3-4밀리미터 자른다. 튜브는 홈 내부에 남아 있어야합니다. 근위 부분을 제거하면 잘라 두 개의 튜브 구멍으로 평평한 표면을 생성, 내부 돌출부를 제거합니다.
  4. 물과 테스트 주사기를 채우튜브가 제대로 작동하는지. 자유롭게 액체 흐름, 일일 (그림 1D)를위한 건조한 숲의 바깥 쪽 끝,에 에폭시 접착제의 드롭 (~ 직경 5 ㎜)를 넣어합니다. 이 챔버는 더 튼튼한 것, 그래서 그들은 몇 달 동안 반복 사용할 수 있습니다.
    주 1 : 거꾸로 현미경 실을하려면, 슬라이드 홈 (그림 1C)의 양단에 두 개의 작은 구멍을 만들기 위해 추가로 수정해야합니다. 슬라이드에있는 구멍을 통해 튜브를 삽입 튜브를 구부려 홈 (그림 1E) 내부에 단단히 그들을 맞습니다. 단계 1.2-1.4를 따르지만 유동 챔버를 만들기 위해 사용되는 전체면에서 에폭시 접착제를 제거한다.
    주 2 : 챔버 체적을 감소 개의 톱니 0.050 깊은 ± 0.005 mm를 만들기 위해 맷돌을 사용, 5.0 ± 0.5 mm 폭이 약간 상승 된 슬라이드의 중앙 부분을 떠나 (그림 1B 및 1C에 "에칭 영역"참조). 때 t(아래 설명 참조) 그 흐름 챔버가 조립되어, 이러한 들여 내부에 양면 테이프를 배치합니다.
    주 3 :이 수정 된 슬라이드를 다시 사용하기 위해, 실험 면도날을 사용하여 커버 슬립 및 양면 테이프를 제거 마친 후. 을 박리하여 70 % 에탄올로 슬라이드를 닦아 실란트를 제거합니다. 연동 펌프에 튜브를 연결하고 50 ~ 70 ㎖에 perfuse, 먼지가없는 구획 같은 탈 이온수의 양, 건조 및 저장에 따라, 실험실 세제의 1 ~ 2 %로 용기에 슬라이드를 놓습니다.

2. Coverslips는 준비

이 프로토콜은 6 ~ 8 시간을 소요하고 12 커버 슬립을 준비하는 데 도움이 될 것입니다. 당신은 뚜껑으로 한 세라믹 커버 슬립 홀더와 3 coverslip에 염색 항아리가 필요합니다, 단지 규모는 15 ㎖를해야한다, 각각의 스택 함께 4 커버 슬립을 개최한다. 뚜껑 (250 ㎖)와 유리 항아리 실란과 커버 슬립을 배양하는 데 사용되어야한다. 정규 1 번 유리 커버 슬립을 사용 (22mm X 22mm 또는 2X 30mm 2mm가) 재료의 목록은 표 2와 3을 참조하십시오. 장갑을 착용하고있는 동안의 모든 단계, 흄 후드에서 수행되어야한다.

  1. 유리 coverslip에 염색 항아리에 커버 슬립을 넣고 아세톤으로 항아리를 채우십시오. 1 시간 동안 품어, 탈 이온수로 10 배 씻는다.
  2. 에탄올의 coverslips 10 분을 품어 탈 이온수로 다시 배를 세척한다.
  3. "피라니아"솔루션을 준비합니다. 내열 유리 용기에 과산화수소 용액 (물에서 30 %) 60 ㎖를 넣고 천천히 황산 100 ㎖를 추가 (과산화수소 용액에 산의 최종 비율은 5시 3분이다). 솔루션은 가열됩니다 이것은 정상입니다 만,주의하십시오. 피라니아 솔루션은 매우 부식성입니다! 두꺼운 실험실 코트, 장갑과 고글을 사용!
  4. 뚜껑을 닫고 1 시간 동안 90 °의 C로 예열 물을 욕조에 항아리를 놓고 "피라니아"솔루션으로 커버 슬립 염색 항아리를 채우십시오.
  5. "피라니아"soluti입니다을 부어직장에서 안전 규정의 지시에 따라와에 버린다. 세척은 탈 이온수로 10 배를 커버 슬립.
  6. , 0.1 M KOH로 coverslip에 염색 항아리를 채우 10 분을 배양하고, 탈 이온수로 10 배 씻는다. 이것은 "피라니아"치료 후 커버 슬립에 남아있는 산성 잔류 물을 중화합니다.
  7. 드라이 coverslips를 테플론 코팅 된 편평한 진 핀셋 (유리 표면의 손상을 최소화하기 위해)과 각 커버 슬립을 지주에 의해 한번에 하나씩 압축 건조 질소 불고있다. 실란 용액을 물과 반응성이 매우 높은 때문에, 커버 슬립이 완전히 건조되어 있는지 확인합니다.
  8. 충분히 질소 사전 건조해야한다 세라믹 홀더 (홀더 당 12의 coverslips)에 건조 된 커버 슬립를 스택. 커버 슬립 표면에 달라 붙는 먼지를 방지하기 위해 적용되는 세라믹 홀더를 유지합니다.
  9. 분자 체, 학년 564, 수분 흡수를위한 250 ㎖의 유리 항아리 (지름 6cm)의 바닥을 커버.
  10. 200 ㎖의 항아리 채우기PlusOne 격퇴 실란 솔루션 천천히 뚜껑을 닫고 실온에서 5 분 동안 품어, 항아리에 커버 슬립과 함께 세라믹 홀더를 체험. 이 커버 슬립 표면에 소수성 코팅을 만듭니다.
  11. 천천히 항아리에서 커버 슬립으로 홀더를 제거하고 전송 메탄올로 가득 coverslip에 염색 항아리에 한 번에 하나의 coverslips.
  12. 커버 슬립 염색 항아리는 높이의 2 / 3 침지되도록 소닉 욕조의 물이 저수지에 금속 또는 유리 받침대를 놓습니다. 20 분 70 W의 초음파 처리, 메탄올 용액마다 5 분을 변경 한 후 탈 이온수로 10 배를 씻어. 실란 화가 제대로 작동하면 물에서 제거 할 때, 커버 슬립 건조 나타납니다.
  13. 철저하게 위와 같이, 질소를 사용하여 잔류 물을 제거합니다.
  14. 커버 슬립 사이의면 대면 접촉을 피하기 위해 킴 와이프와 커버 슬립을 층간. 커버 슬립을 실온에서 몇 주 동안 밀봉 된 용기에 저장 될 수있다.
    NOTE 1 : 2.1-2.6 크게 총 제조 시간의 단축, 30 W에서 15 분 동안 플라즈마 세정기로 커버 슬립을 세정에 의해 대체 될 수있는 단계. 청소 챔버 내부의 압력은 100 ~ 200 mTorr로 설정되어 있습니다. 모두 대기와 압축 산소를 사용할 수있다. 세라믹 홀더에 플라즈마 세정의 coverslips 스택 및 2.7 단계로 진행합니다.

3. GMPCPP 안정화 미세 소관의 씨앗 준비

이 절차는 ~ 1 시간이 걸릴 것이며, 그 결과 미세 소관 씨는 실온에서 1-2일 안정이다. 시약의 목록은 표 4를 참조하십시오.

  1. 얼음에 혼합 :
    • 10 μL는 BRB-80 버퍼에 튜 블린 (100 μM, 표 4) 레이블이 지정되지 않은 (80 mM의 파이프, 1 ㎜ EGTA, 4 mM의 MgCl2를, KOH으로 pH 6.9, 보충 1-2 mM의 DTT와 각 실험에 대한 신선한 나누어지는 사용).
    • 2.6 μL의 제닌 표지 튜 블린 (표 4). 준비에 따라 볼륨을 조정,비 표지로 표지 된 튜 불린의 최종 비율은 1:10 ~되도록. 피펫으로 잘 섞는다.
    • 1.4 ㎕의 10 mM의 GMPCPP (최종 농도 1 ㎜)
  2. 35 ° C에서 15 분 알을 품다, 종자는 긴 2 ~ 3 μm의 성장할 것입니다. 다른 미세 소관의 길이가 필요한 경우 시간을 조정합니다.
  3. 실온에서 씨앗을 펠렛 25,000 XG에서 15 분 동안 35 ㎕의 BRB-80 (35 ° C에 데워진가), 피펫으로 혼합하고, 원심 분리기를 추가합니다.
  4. , 상층 액을 버린다 부드럽게 따뜻한 BRB-80의 50 μl를 추가하고 제거하여 펠렛을 씻으십시오.
  5. 를 Resuspend 25 μL의 BRB-80에서 잘 펠렛.

4. 커버 슬립에 미세 소관 씨의 첨부

프로토콜 4와 5는 2 ~ 3 시간이 필요합니다, 그래서 두 흐름 챔버는 하루에 사용됩니다.

  1. 실란의 coverslips를 사용하여 제조 업체의 지침에 따라 유량 용기를 조립하고 4.2 단계로 진행합니다. 주문품의 coverslips를 사용하는 경우 (프로토콜 1) 단계의 벨을 따라아야.
    1. 중앙 ~ 5mm 광역 함께 양면 테이프 두 조각 (5mm × 30 mm)를 부착 단단히 테이프를 눌러 꼭대기에 실란의 coverslip을 넣어.
    2. 튜브 중 하나를 통해 BRB-80와 챔버를 입력하고 둥근 이쑤시개와 두 튜브를 연결합니다.
    3. 작은 플라스틱 페트리 접시 위에 두 색 KWIK 캐스트 실란트의 작은 방울을 짜내, 이쑤시개를 사용하여 신속하게 그러나 철저하게 섞는다. 실란트가 녹색으로 바뀝니다 곧바로 적용 신중하게 커버 슬립의 모든 가장자리를 밀봉. 실란트 커버 슬립 하에서 너무 깊게 침투하는 경우, 이쑤시개 플러그를 제거하여 튜브 중 하나를 열고 튜브 내부 누설을 방지하는 밀봉 완만 한 압력을 적용 할 수있다.
    4. 10 분 동안 챔버 건조시켜 흐름이 더 진행하기 전에 제한되지 않았 음을 확인합니다.
  2. 32 ° C에 데워진 현미경 무대에 챔버를 놓고 액체를 펌프 할, 펌프 튜브 중 하나를 첨부합니다. 주입 관의 길이추천 길이 5 ~ 7 cm입니다 : 시약의 불필요한 손실을 방지하기 위해 최소화되어야한다. 0.5이 끝을 담가 ML BRB-80 버퍼 유리 병. 이 아래 모든 솔루션은 32 ~ 35 ℃로 데워진해야
  3. 펌프 온화한 압력을 적용하거나 단순히 도입 관 마개가 제거 될 때 때때로 형성 될 기포를 밖으로 짜내 배출 튜브의 단부를 엘리베이터.
  4. 100 μL / 분에서 펌프의 속도를 설정합니다. , BRB-80에 1:30으로 희석 방지 제닌 항체의 2 챔버 볼륨과 세척 항체 흡착을 할 수 있도록 15 분 알을 품다.
  5. 따뜻한 BRB-80의 5-10 챔버 볼륨과 세척 실란 커버 슬립의 소수성 표면을 차단하는 BRB-80을 1 % 플루로 닉 F-127으로 10 분을 품어.
  6. 운동 버퍼 5-10 챔버 볼륨 (BRB-80 카제인 0.4 ㎎ / ㎖로 보충)로 세척.
  7. 10 μL / 분에 펌프 속도를 줄이고 30 ~ 40 ㎕의 운동성 버퍼에 1:200-1:600​​ 희석 미세 소관의 씨앗을 perfuse. 15 마일을 품어coverslip에 흡착 항체 씨의 결합을 촉진하기 위해 N.
  8. 어떤 결합되지 않은 물질을 제거하는 운동 버퍼 400 μL에 100 μL / 분에서 실을 씻으십시오.
    주 1 : 씨앗의 결과 밀도는 10-30 당 현미경 필드 (그림 2A)해야한다. 문제를 해결하려면, coverslip에 부착 된 종자를 쉽게 검출을위한 중합 (3.1 단계) 동안 찬란 튜 불린을 사용합니다.
    주 2 : 클라 미도 모나스 (40) 또는 다른 생물학적 소스뿐만 아니라, 용해 및 deciliated Tetrahymena 셀 (41)의 펠리클로부터 제조 Axonemes 또한 nucleators 미세 소관으로 사용될 수있다. 이들은 nucleators 작은 미세 소관 배열을 만들 때 유용하며, protofilaments의 특정 번호와 미세 소관이 (GMPCPP 씨 nucleates ≥ 14 protofilaments (42)를 포함하는 하나의 미세 소관)를 원하는 경우가 바람직하다. 이러한 구조는 ATTA보기 비특이적 흡착에 의한 세정 커버 슬립에 부착 될 수 있지만chment는 실란의 coverslips를 사용하여 특히 항체 기반의 첨부 파일에 비해 일반적으로 덜 안정적이다.

5. 분단 된 미세 소관의 준비

아래의 모든 용액 부피는 챔버 체적 15-20 μL 용; 큰 챔버가 사용되는 경우에 비례하여 증가한다.

  1. Prewarm 레이블이없는 튜 불린 혼합 후 35 ℃에서 30 초 (45 μL 운동성 버퍼는 1 ㎜의 Mg-GTP와 함께 10 ~ 15 μm의 레이블이없는 튜 불린 보충) 30 μL / 분에서 Perfuse.
  2. DIC 광학 (그림 2B, 비디오 1)와 미세 소관의 성장을 모니터링합니다. 5-7 분 동안 배양 한 미세 소관은 보통 ~ 10 μm의 길이 성장.
  3. 로다 민 - 튜 불린 믹스 (0.5 mM의 GMPCPP 및 튜 불린에 로다 민의 0.5 몰비 로다 민 표지 튜 불린의 2-5 μM로 보충 된 65 ㎕의 운동성 버퍼)를 준비하고 30 초 동안 35 ° C에서 솔루션을 따뜻하게.
  4. 30 μ 즉시 PerfuseL / 분. 미세 소관의 끝을 안정 형광 캡의 형성을 촉진하기 위해 8 ~ 10 분 동안 품어. 안정 미세 소관 세그먼트는 자발적으로 핵하고 DIC 광학과 볼 수 있습니다.
  5. tubulins 및 뉴클레오티드뿐만 아니라 수용성 미세 소관의 파편을 제거하기 위해 20 μL / 분에서 운동 버퍼 100 μL 잘 챔버를 씻으십시오.
  6. DIC으로, 미세 소관 (그림 2D)에서 볼 수 있도록 확인, 많은 미세 소관이 모자를 씌우는 동안 분해하기 때문에 자신의 번호는, 그러나, (비디오 2 분할 된 미세 소관으로 일반적인 필드를 보여줍니다) 감소한다.
    주 1 : 분단 미세 소관은 매우 안정적이며, 적어도 2 시간 동안 사용할 수있다. 그러나, 이들 미세 소관의 수명은 과도한 용액 과거 감소, 또는 2 - 머 캅토 에탄올이 촬상 버퍼에의 사용.

6. 해중합 미세 소관 엔드와 단백질의 추적 실험 관측

  1. IntrodUCE 30 ~ 50 10 μL / 분 챔버에 형광 단백질 (0.1 ~ 20 NM)의 μL. 커버 슬립에 붙어 단백질은 분명한 경우 4-8​​ ㎎ / ㎖ BSA와 운동성 버퍼를 보충. Alexa488 - Dam1 팁 추적은 추가로 10 mM의 DTT 또는 0.5 % βME 10이 필요합니다.
  2. 미세 소관의 불필요한 표백 및 분해를 방지하기 위해 현미경 필드 다이어프램을 이용한 조명 필드를 제한한다.
  3. GFP 필터 큐브를 사용하여 비디오 수집을 시작, 다음 이미지 레코딩을 중단하지 않고 로다 민 필터 큐브로 전환합니다. 미세 소관의 끝에서 붉은 부분은 명확하게 볼 수 있어야합니다, 그들은 (비디오 3) 퇴색하고 신속하게 분해하기 시작합니다.
  4. 모자는 거의 (일반적으로 10 ~ 20 초 동안하지만 이번에는 더 낮은 로다 민 라벨의 비율로 성장 캡 예정) 사라질 때까지 조명하고, 미세 소관 분해와 추적 단백질을 기록 GFP 채널로 전환하기 위해 계속합니다.
  5. 분석kymographs를 구성하여 결과 시퀀스, Metamorph의, 개방 ImageJ에 또는 다른 이미지 처리 소프트웨어 (도 2E)을 사용하여) 관측 동안 여러 번 미세 소관 축을 따라 형광 강도를 보여 즉 이차원 이미지.
    주 1 : 수집 속도는 관찰 이벤트의 타이밍에 따라 조정되어야한다. 권장 속도가 느린 이동 초 (FPS) 2 ~ 3 프레임이다, 반지 크기 Dam1 (27)의 콤플렉스하지만 단일 분자에 대한 수집 시간> 20 FPS 19해야한다.
    주 2 : 매우 민감한 EMCCD, 예를 들면 ANDOR iXon3가 해중합 미세 소관과 팁 추적 이벤트의 빠른 기록이 필요합니다. 도르 iXon3 카메라에 권장되는 설정은 다음과 같습니다 이득의 5 배, EM 게인 (200), 1 MHz의 판독 속도, 16 비트 센서 모드, 80 밀리 초 노출 시간.
    주 3 : TIRF 현미경을 사용하여 신호 대 잡음비를 향상시킬 수 있지만, 짧은 미세 소관 사용해야 같은 그쪽T 형광 안정화 캡은 사라져가는 필드의 범위 내에서 유지됩니다.

7. 미세 소관 정보 추적 단지의 분자 크기의 정량 분석

이 접근법에 대한 이론적 근거는 단일의 형광 강도에 팁 추적 착체 전체의 형광 강도의 비를 찾아 팁 추적 복잡한 분자의 수를 결정하는 것이다. 이 접근법은 GFP 단백질 융합체 및 형광 염료로 표지 단백질에 적용 할 수 있지만, 수동식 일부 단백질 분자는 형광하지 않은 경우에는 팁 추적 복합체 분자의 수를 과소있다.

  1. 형광 표지 단백질 분자에 대한 기록 광표백 속도론.
    1. 전체 프로토콜 2를 사용하여 제조 할 수있는 nonmodified 유리 슬라이드, 양면 테이프의 두 스트립, 깨끗한 커버 슬립을 사용하여 일반 현미경 챔버를 조립하거나이의 2.1-2.6 단계를프로토콜입니다.
    2. , 운동성 버퍼에 약 50 nm의 단백질을 추가 운동성 버퍼로 간단히 씻어 VALAP (표 4)과 챔버를 밀봉. (솔루션에서 자발적으로 형성 할 수 또는 여러 개의 단일 분자가 서로 가까이과를 해결할 수없는 경우에 나타날 수 있습니다 삼량 체 및 사량) 단일 분자를 나타내는 균일하게 분산 된 지점 (그림 3A), 그들의 작은 집계에 필드를 얻기 위해 단백질 농도를 최적화 . 이 단계는 photobleaching에 단계와 단계 사이즈의 정확한 결정 (아래 참조)의 다중 피크 분포를 얻기 위해 매우 중요합니다.
    3. 개개의 형광 반점 여전히 볼 수있는에서 조명 레이저 강도를 최소화; 낮은 조명 광표백 시간이 연장되고, 그래서 더 이상 photobleaching에 흔적을 얻을 수있다. 또한 한 프레임 동안 하나 이상의 형광 표백의 가능성을 줄이기 위해, 노광 시간을 최소화한다. 권장 설정도르 iXon3의 카메라 : 게인 5.0 배, EM은 얻기 999, 10 MHz의 판독 속도, 50 ~ 100 밀리 초 노출 시간.
    4. , 조명 셔터를 닫고 신선한 필드로 이동 조명 셔터를 열고 모든 컴플렉스 (이후 IMG (x, y라고 함))을 표백 할 때까지 이미지를 수집, 커버 슬립의 표면에 초점.
  2. 조명의 불균형 (그림 3B)의 획득 된 영상을 수정합니다.
    1. 어떤 형광 용액을 준비, BRB-80의 예를 들어 1 μM 플루오 레세 인 이소 티오 시아 네이트 (FITC). 이러한 솔루션은 사전에 준비 분주하고 -20 ° C.에 저장할 수 있습니다
    2. 7.1.1 절에서와 같이 챔버를 조립하지만, 일반 커버 슬립을 사용합니다. 형광 솔루션을 추가하고 VALAP를 사용하여 챔버를 밀봉.
    3. > 전체 현미경 필드 50 이미지를 수집 : 조명 셔터가 닫혀있는 동안 새로운 표백 영역으로 스테이지를 이동하고, 즉시 셔터를 개방 한 후 영상을 획득.
      4. (그림 3C)를 사용하여 5 픽셀 반경 가우스 블러와 필터. 결과 이미지는 필드 (x, y는 화소의 좌표에 대응 ILLUM (x, y))의 조도의 분포를 나타낸다.
    4. 이 이미지 (최대 (ILLUM))의 최대 픽셀의 밝기를 결정합니다.
    5. 폐쇄 조명 셔터와 7.2.3 획득에게 절에서와 같이 하나의 이미지를 같은 카메라 설정을 사용하여,이 이미지의 평균 픽셀 강도를 결정,이 값은 CN, 카메라의 노이즈에 해당합니다.
    6. 다음 식을 사용하여 실험 이미지 (IMG (X, Y))를 정상화 위의 가치와 이미지 (ILLUM (X, Y))를 사용하여

      BRI의 정량 분석의 결과 이미지 IMG 규범 (X, Y)를 사용하여팁 압정으로 고정 단지 (그림 3D)와 이미지를 정상화도 고정 형광 복합체, 그리고 ghtness.
  3. 하나의 형광의 강도를 결정합니다.
    1. 규범 (x, y)를 IMG 정규화 이미지를 사용하고, 화상 처리 소프트웨어는 원형 영역 (직경 5-6 화소)로 형광 스폿을 선택하고 모든 프레임에 대해 그 적분 강도를 결정 광표백 트레이스를 생성. 매우 밝은 점 (> 디머들보다 밝은 5 배)하지 마십시오.
    2. 같은 원형 영역 도구를 사용하여, 최소 3 자리가없는 지역을 선택 평균 해당 photobleaching에 흔적을 생성 지수 감쇠 기능에 맞게.
    3. 실험 시점과 일치하고 광표백 곡선에서 빼기이 배경 강도 곡선을 집계.
    4. 광표백 곡선 (3-5 점의 슬라이딩 윈도우와 평균을) 부드럽게. 시각적으로 생성 된 곡선과 검사형광 또는 명백한 표백 (그림 3E)의 부족의 급격한 증가를 보여줍니다 어떤 곡선을 버린다.
    5. (곡선의 총수의 통상 50-70%) 나머지 곡선들 각각에 대해, 외형 형광 반점 표백 내용 최종 고원을 선택한다. 만 ~ 100 점을두고 이러한 강도의 평균이 세그먼트를 줄이십시오. 작은 변화를 최소화하기 위해 단축 광표백 곡선 배경 수준이다 현재 값을 빼고 배경 피크 (아래)의 크기를 줄이기 위해.
    6. 20 명 이상 광표백 곡선 (> 1,000 시간 지점)의 모든 시간 지점에 대한 강도의 히스토그램을 그린다. 히스토그램은 최소 4 별개의 봉우리 (주 2 참조)를 전시한다.
    7. MATLAB, 매스 매 티카 또는 유사한 소프트웨어 (그림 3 층)을 사용하여 같은 거리에 가우시안 분포 10,43와 히스토그램에 맞게 :

      wi와 σ I, D와 N 여기 피팅 매개 변수입니다. 내가 진폭에 대응하고 폭 i 번째 피크의 i와 σ를 매개 변수, D가 봉우리 사이의 거리이며, N은 분포의 피크의 총 수에 해당하는 정수 부분입니다. 처음 3 개 이상의 피크의 중심이 적합 선을 시각적으로 좋은 경기를 보여 주면,이 피크 (매개 변수 D) 사이의 거리가 하나의 형광 물질의 형광 강도에 해당합니다.
      주 1 : 현미경 시스템은 상당한 진동을 전시 또는 잡음 (예 : 불안정한 레이저 빔)의 다른 소스가있는 경우 검사 점 (7.3.6)의 수는 증가한다.
      주 2 : 그것은> 등거리 가우스 적합와 정확한 분석을 위해 968을 얻기 위해 필수적이다. 닫기 피크가 획득되는 경우, 거짓 (예를 들어 더블) 스텝 사이즈가 얻어 질 수 있었다조명 조건이 최적이 아닌 경우, 도트가 너무 빠르고 하나의 단계를 표백 등이 잘 해결되지 않습니다.
  4. 팁 추적 복합체의 분자 크기를 결정합니다.
    1. 프로토콜 6 수집 한 이미지를 사용하여 바로 셔터를 연 후 취득한 제 2-4 프레임을 선택합니다. 팁 추적 관찰되기 전에 필드가 몇 시간 동안 조명 된 경우, 동일한 실험 조건에서 photobleaching에의 반응 속도에서 원래의 강도를 추정한다.
    2. 선택한 프레임을 평균 및 섹션 7.2.5-7.2.7에서와 같은 결과 이​​미지를 정상화.
    3. 7.3.1 절에서와 동일한 영역의 크기를 이용하여 형광 팁 추적 복합체의 적분 강도를 측정한다.
    4. , 팁 추적 복잡한 근처에 있으며 지역 관​​광을 사용하여 3 배경 영역의 적분 강도를 측정 이러한 값을 평균과 7.4.3 절에서 끝 추적 복합체의 강도에서 뺍니다. 7.3.5 절에서 수득 한 형광 강도에 의해 7.4.4 절에서 얻어진 형광 강도로 나누어 컴플렉스 형광 분자의 수를 계산한다.
      주 1 :이 프로토콜 7.4 조명 및 수집 설정 프로토콜 7.1에서와 동일합니다 것이 바람직하다. 노출 시간 또는 레이저 강도 중 하나가이 단계에서 조정 된 경우, 결과 형광 값은 그에 따라 조정되어야한다. 그러나, 이러한 크기 조절의 정확성이 상이한 조건 하에서 동일한 샘플 (예를 들어 형광 시간)을 촬상하고, 생성 된 세기의 비율을 계산하여 검증되어야한다.

8. 단백질 코팅 비즈 미세 소관의 정보 추적

  1. 프로토콜 6과 MT 분해를 트리거하여 팁 추적 구슬 실험을 수행한다. DIC 광원의 강도와 동시에 로다 민 형광을 볼 수 있도록하기 위하여 감소되어야DIC 영상.
  2. 10 μL / 분에서 실에 구슬 현탁액의 30 ~ 50 μl를 소개에 Grishchuk 등. 10 애즈 베리 등. 11로 구슬을 준비합니다. 제안 비드 농도는 10 -16 -10 -17 M.입니다
  3. 직립 현미경을 사용하는 경우, 현미경 단계에서 실을 제거하고 구슬 커버 슬립에 침전 할 수 있도록 5 ~ 10 분 정도를 반전. 이 coverslip에 닿는 미세 소관에 비드의 더 나은 바인딩을 촉진하지만,이 절차는 짧은 시간 동안 약간의 중력 기반의 침전을 보여 0.5 μm의 폴리스티렌 비즈와 성공하지 못합니다.
  4. 커버 슬립 - 닿는 미세 소관에 부착 된 구슬을 선택, 비드는 분명 아크 44 (그림 4A)에 이동해야합니다. 닿는 구슬은 1-3 μm의 거리 m 남아 가끔 coverslip에 연결된 구슬 때문에 명확하게 볼 수 있습니다 커버 슬립면에서 위치해야otionless.
  5. 로다 민 필터 큐브로 전환하고 DIC 조명을 사용하는 동안 이미지를 수집하기 시작합니다.
  6. 수은 램프 또는 530-550 nm의 레이저 (필드 조임으로 제한된) 촬상 필드를 조명하기 위해 오픈 셔터. 비드가 분리 또는 분해의 미세 소관의 끝으로 이동 (그림 4D, 4 층, 그리고 4G)까지 녹음을 계속합니다.
    주 1 : 광학 트랩이 미세 소관 벽과 단백질 코팅 구슬 사이의 상호 작용을 촉진하는 데 사용할 수 있습니다. 키네신 모터 (그림 4E-G)로 코팅 구슬로 작업 할 때 특히 유용합니다. 상기와 같은 프로토콜을 수행하지만, 2 밀리미터 밀리그램 - ATP와 운동성 버퍼를 보충합니다. 단계 8.3, 1,064 nm의 레이저 빔을 무료로 떠있는 구슬을 캡처 가까이 분할 된 미세 소관의 벽에 갇혀있는 구슬을 가지고 무대를 이동합니다. 낮은 조명과 DIC와 로다 민 필터 큐브를 통해 영상을 시작하고 출장 미세 소관의 끝으로 걸어 시작 비드를 기다립니다. 선미어 감독 구슬의 움직임이 관찰되고, 빔을 트래핑 셔터를 닫고 형광등 조명에 셔터를 엽니 다. 비드가 분리 또는 분해 미세 소관 끝 트랙까지 녹음을 계속합니다.

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Representative Results

미세 소관을 해중합과 추적 단백질이 끝납니다. 효모 동원체 구성 요소 Dam1는 지금까지 해중합 미세 소관의 최고의 팁 트래커 (14)를 종료한다. GFP로 ​​표지이 10-서브 유닛의 복잡한 쉽게 표현 박테리아 세포 18,38에서 정제, 그래서 우리는 끝 추적 분석에 대한 긍정적 인 제어로 사용하는 것을 권장 할 수 있습니다. 미세 소관의 해중합 끝으로 추적 형광 단백질은 꾸준히 coverslip에 부착 씨 (비디오 3)쪽으로 이동 밝은 형광 자리로 볼 수있다. 또한 해당 kymograph (그림 2E)에 사선으로 표시됩니다. 단백질이 트랙을 팁에 실패 할 경우 반면에, 미세 소관은 인간 Ndc80-GFP 복잡한 19 (그림 2 층)에 볼과 같은 미세 소관의 끝에서 형광 신호의 농축을 표시하지 않고 짧아집니다. processive 추적 관찰 될 때, 미세 소관 짧은 속도번개와는 이동 점 추적하거나 대응 kymograph에 사선의 기울기를 측정함으로써 결정될 수있다. 이것은 45 결합 단백질 - 미세 소관 끝의 강도에 대한 정보를 제공 할 수 있습니다. 미세 소관에 강하게 결합 단백질, Dam1 링 착체 같은 미세 소관 해중합 속도를 느리게. 이 효과는, 그러나, 팁 추적 착체의 크기에 강하게 의존하고 작은 착물 미세 소관 (27)의 분해 속도에 거의 또는 전혀 효과를 발휘할 수있다. 따라서, 미세 소관 단축의 비율에 변화는 팁 추적 착체의 크기의 맥락에서 해석되어야한다. 해중합 끝이 미세 소관 격자에 결합 된 단백질을 "수집"일부 조건에서, 추적, 팁 추적 복잡한 밝기의 증가를 동반 할 수있다. 이 경우 해중합의 비율은 종종 팁-TRA의 크기 증가와 병용 속도가 느려집니다요리하는 복잡한. 다른 경우, 관계는 더 복잡하다. 예를 들어, GFP가 Dam1 소단위의 N-말단에 결합시켰다되는 Dam1 단백질 복합체의 다양한 서브 유닛이 단축 미세 소관 (도 2G)의 단부에서 수집 될 수있다. 미세 소관의 해체는 결국 포장 마차, 미세 소관 해중합의 힘이 너무 큰 단지를 이동할 수있을만큼 강하지 않은 것으로 추정하기 때문이다. 분리가 종종 팁 관련 Dam1 서브 유닛 (10)의 일부의 해리를 나타냅니다 팁 밝기의 감소, 후에 다시 시작합니다. processively 추적하지 않는 미세 소관 결합 단백질은 또한 미세 소관 분해 19,31,46의 속도를 느리게 할 수 있기 때문에 이러한 관계의주의 깊은 검사가 중요합니다.

구슬이 미세 소관의 끝을 해중합으로 추적. 많은 미세 소관 결합 단백질은 이미 동적 MI와 마이크로 비드의 움직임에 대한 커플러로 확인되었다crotubule는 5,11,27,39,47를 종료한다. 놀랍게도, 심지어 Ndc80 단백질 복합체는 구슬 (29, 30)에 의해 미세 소관 선단 추적을 유지시킬 수 있습니다. 일반적으로 단백질 코팅 비즈와 미세 소관 사이의 결합은 강하고, 그래서 구슬이 현미경 실에 추가 할 때 그들은 분단, coverslip에 부착 된 미세 소관 (그림 4A)에 쉽게 결합한다. 그것은 구슬이 된 하나의 미세 소관에 부착 여부를 결정적으로 DIC으로 볼 수없는 경우도. 우리는 여러 가지 미세 소관에 첨부 파일을 형성 구슬을 기록 피하기 위해 몇 가지 기준을 개발했다. 미세 소관 커버 미끄럼 방지 부착 씨 (그림 4B)에서 성장의 사이트 주위에 약간 선회 첫째, 하나의 미세 소관에 부착 된 구슬, 호와 같은 움직임을 보여 주어야한다. 안정화 캡이 조명 될 때 둘째, 하나의 빨간색 부분은 씨와 비드 (그림 4C)에서 원심을 볼 수 있어야합니다. 캡은 종종 followi 볼 수 있습니다캡 표백제까지 비드의 아크와 같은 운동을 겨 (비디오 4). 셋째, 비드 모션 (또는 박리) 캡 표백하고 비드의 운동 방향이 상기 관찰에 기초하여 도출 된 미세 소관 방향과 일치해야 직후 관찰되어야한다. 넷째, 미세 소관 단축하고 시드 향해 비드 이동함에 따라, 아크 형상의 진동의 진폭 (도 4D)을 감소한다.

도 4d에 도시 된 바와 같이 비드에 의한 추적은 매우 processive 때, 이러한 기준들은 만족된다. 비드 추적 processive없는 경우에는, 몇 가지 초기 지시 운동 후 비드 분리하고 무작위로 확산 시작합니다. 큰 구슬, 예를 들어, 1 ㎛의 유리 구슬이 열 운동은 단축 미세 소관 끝 아크 함유 움직임으로 해석 될 수 있음을 충분히 느리다. 의 크기에 기초 포멀 기준선형 트랙에서 구슬의 편차는 이벤트 29 구별 할 수 있습니다. 우리의 이전 연구에서 우리는 미세 소관의 축에 걸쳐 평균 비드 여행을 계산하고이 값이 미세 소관 병렬 비드 모션 0.4 μm의 / 1 μm의를 초과하는 경우, 비드는 95 % 신뢰와 무작위로 확산 할 가능성이있는 것으로 추정. 이 측정 값을 사용하여 우리는 심지어 "제어"비드 준비에, 특이 항체 또는 바이오틴 미세 소관과 함께 사용 스트렙 타비 딘 - 코팅 구슬로 코팅 예를 들면 구슬이 구슬의 5 %가 processively 이동 판정 것으로 나타났다. 높은 정확도가 낮은 processivity과 구슬의 움직임을 모니터링하기 위해 필요한 경우, 우리는 감독 비드 움직임을 쉽게 식별 할 수 있습니다 레이저 트랩을 사용하는 것이 좋습니다.

구슬이 안정 미세 소관에 지속적인 첨부 파일을 형성하지 않을 경우 레이저 트랩도 사용할 수 있어야합니다. 우리는 PLU의 다른 단백질로 코팅 된 비드 구조를 캡처하는 레이저 빔을 사용키네신 CENP-E의 엔드 감독과 분할 된 미세 소관 벽 (그림 4E)의 "시작"과 같은 구슬 24. ATP의 존재에이 구슬은 출장 미세 소관 플러스 끝을 향해 (20 ~ 25 μm의 / 분) 빠르게 이동; kymograph에, 사선에서 모션 결과는 캡 (그림 4 층과 4G) 향한다. 캡이 파괴 된 후, 절단 CENP-E 단백질로 코팅 된 비드는 미세 소관 (그림 4 층에 녹색 화살표)에서 분리. 그러나, 전체 길이 CENP-E 단백질 즉 마이너스 미세 소관 단부를 향해 역방향으로 비드 모션 서스테인 수 (비디오 5). 그 결과, 같은 구슬의 kymograph 전체 길이로 코팅 된 비즈 운동을 지시하고, CENP-E 잘리지 플러스 엔드 및 마이너스 엔드 모두의 존재를 나타내는, 지그재그 패턴을 보여줍니다. 우리는 다른 미세 소관에 의존하는 모터는 유사한 운동성 5,13가 발생할 수 있습니다 것으로 기대

그림 1
그림 1. 분할 또는 동적 미세 소관.와 체외 연구를위한 유량 용기. 분할 된 미세 소관 (MT)의 다이어그램. 안정 MT 씨는, 제닌 (DIG) 표지 튜 불린과 GMPCPP 준비 항 DIG 항체를 통해 coverslip에 부착되어있다. 튜 불린과 다른 단백질의 결합 비특이적 플루 F127으로 차단된다. 미세 소관은 레이블이없는 튜 불린과 GTP를 사용하여 씨앗에서 확장되고, 이러한 확장은 (빨간색) 로다 민 표지 튜 불린과 GMPCPP를 포함하는 짧은 세그먼트로 덮인됩니다. (+로 표시) MT 플러스 말은 일반적으로 표시 할 수있다(-). B 및 C 훨씬 짧은 마이너스 단부로부터 tinguished. 수정 된 유량 용기의 자세한 방식은 수직과 거꾸로 현미경으로 사용하는 슬라이드. 소닉 슬롯은 노란색으로 표시됩니다. 숫자는 D. 밀리미터 및 E. 연결 튜브 수정 된 슬라이드 (확장하지 말 것)의 측면보기;. 굵은 화살표는 챔버가 완전히 (도시하지 않음)를 조립 한 후 튜브를 통해 액체 흐름을 나타냅니다는 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 분할 된 미세 소관 전형적인 단백질 팁 추적 결과의 준비.. coverslip에 부착 된 미세 소관의 씨앗 기기, 비즈니스DIC 광학 (단계 프로토콜 4.8)에 alized, 화살표는 씨앗의 일부를 가리 킵니다. 이미지는 10 프레임의 평균 취득 순차적으로 (100 밀리 초 노출 각). B입니다. 튜 불린과 GTP는 32 ° C에서 13 분 동안 배양 한 동일 현미경 필드 후, 미세 소관은 씨 (단계 프로토콜 5.2). C에서 집중적으로 볼 수 있습니다. 표면 형광 (적색). D로 볼 DIC (녹색)에서 볼 분할 된 미세 소관을 보여주는 의사 컬러 이미지와 로다 민 표지 안정화 캡 (화살표). 패널 C에 있지만보기의 큰 필드와 같은 이미지. 프로토콜의 단계 5.2 동안 솔루션에 자발적으로 핵 일부 로다 민 함유 미세 소관의 조각은,도 (화살촉). E를 볼 수 있습니다. Dam1-GFP 단백질의 Kymograph는 분해 미세 소관의 끝을 추적. 왼쪽 쇼 kymograph의 해당 부분의 인수에 사용되는 형광 채널의 색으로 구분 바. 개종자미세 소관의 끝. F로 올 때까지 iCal의 형광 라인은 미세 소관 벽에 결합 작은 움직임을 보여 Dam1-GFP 복합체에 의해 만들어집니다. E에 있지만, GFP와 같은 Kymograph는 Ndc80 복잡한 19 레이블. 증가 GFP의 형광 로다 민 여기 후 덮인 끝에서 관찰되어 있지만 처음에는 미세 소관은, 균일하게 장식되어 있습니다. 이 증가는 Ndc80-GFP 단백질의 용해 풀에 따라 다르지만 기본 메커니즘은 알려져 있지 않다. 뚜껑을 분해 한 후, 미세 소관 단축은 분명해진다하지만 미세 소관의 끝에서 형광의 작은 농축 팁 추적의 부족. G를 나타내는있다. 이 실험 10에서 미세 소관의 핵에 사용 된 axoneme,,에 팁 추적 Dam1 지점에서 거리가 Metamorph의 트랙 드롭 인 (drop-in)을 포인트를 사용하여 측정 하였다. 단일 Dam1 고리를 형성 할 정도로 : 이동 착체의 초기 휘도는 약 15 서브 유닛에 대응한다. 일의 밝기전자 이동 복잡한은 표백 해결하기 위해 coverslip에 부착, 움직 형광 반점의 강도에 정상화되었다. 수평 스케일 바 : 패널 A, B, D (10 ㎛), 패널 C, F, E (3 μm의). 수직 스케일 바 :. 10 초 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. 형광 신호의 정량 분석.. Dam1-Alexa488 단지와 현미경 분야의 예제 이미지는 커버 슬립 표면에 비특이적으로 결합. 점의 밝기와 조명의 불균형에 이성을합니다. 스케일 바는 2 μm의. B입니다. 패널과 동일한 이미지의 정량적 표현입니다. C D입니다. 패널에서 표준화 된 이미지는 매스 매 티카 9 (볼프람 연구)를 사용하여 강도면으로 꾸몄다. 이 표면은 B보다 더 평평하고 피크 높이 이하 이기종입니다. E 있습니다. CENP-E-GFP 단백질로 수득 광표백 곡선의 예. 각 점의 적분 강도를 수집, 조명의 계정 불균형을 고려하는 표준화 및 곡선 (5 점의 슬라이딩 윈도우와 평균을) 부드럽게했다되었다. 상위 행의 신호는 7.3.4 절에 설명 된 이유에 대한 분석에서 제외 하였다. 섹션 7.3.4-7.3.5. F에서 설명한 바와 같이 하부 행에 도시 된 것과 같은 곡선을 더욱 가공 및 패널 F의 히스토그램을 구축하는 데 사용되었다 NG>. 22 표백 CENP-E-GFP 점 (총 1,900 데이터 포인트)에서 수집 된 필수 강도의 히스토그램. 빨간색 선은 같은 거리에 가우스 함수와 피트, 5 뚜렷한 피크를 볼 수 있습니다. 이 히스토그램에서 결정되는 하나의 GFP의 형광의 적분 강도는 10 4 노소 G하기 x (64.7 ± 1.1)이었다. 프로토콜 7.3.5에 설명 된대로 처리 Dam1-Alexa488에 대한 일반적인 광표백 곡선. H. 48 photobleaching에 Dam1-Alexa488 점 (총 1,548 데이터 포인트)에서 수집 된 필수 강도의 히스토그램, 4 별개의 봉우리를 볼 수 있습니다. 이러한 조건에서 하나의 Alexa488 분자의 적분 강도는 10 3 AU × (17.4 ± 0.8)이었다 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하세요.

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그림 4. 미세 소관 관련 구슬의 움직임의 그림.. 미세 소관 결합 단백질로 코팅 구슬과 실험의 개략도. 두꺼운 화살표는 미세 소관 분해. B의 방향을 나타냅니다. 안정적으로 (26 이미지 기준) 분할 된 미세 소관에 붙어 있던 한 GFP-Dam1 코팅 구슬의 DIC 이미지의 최대 강도 투사. 구슬이 파선. C로 표시된 방향을 미세 소관에 붙어 있던 것을 제안, 아크 등 운동 (화살표)를 보여 주었다. 단일 패널 B에서와 같은 비드의 화상 만 형광 셔터가 개방 된 직후 프로토콜의 단계 21.9 동안 촬영. 비드 근처에있는 형광 모자에 포인트를 화살표 있지만, 미세 소관 첨부 파일 사이트. D에서 반대편에. 최대 강도 투사 disassemblin과 구슬의 움직임의 궤적을 보여줍니다g의 미세 소관. 이미지 영상의 시작 (아크와 같은 돌기를 참고)에서 비드의 분리 (비디오 4). E까지 순차적으로 획득 한 115 프레임으로 만들어졌다. 플러스 엔드 감독 키네신 CENP-E 코팅 구슬과 실험의 개략도. 비드 레이저 트랩을 사용하여 미세 소관과 접촉하게된다. 트랩은 꺼져 비드 시작은 미세 소관 플러스 끝으로 이동. 미세 소관 안정화 캡을 제거하고 미세 소관 분해 한 후, 비드는 모션. F의 방향을 반전. Kymograph가 잘립니다 X.로 코팅 된 0.5 μm의 구슬을 보여줍니다 laevis의 CENP-E의 키네신은 미세 소관 플러스 단부 (24)를 향해 이동. 비드는 약 1 μm의를 여행 한 후, 형광 셔터 (빨간색 막대)를 오픈하고, 안정 캡 (빨간색 화살촉) 표시되었다. 모터가 단축 미세 소관의 끝을 발생 아마 (녹색 화살표 모양) 갑자기 분리 구슬,. G 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 1. 분할 된 미세 소관의 제조. 비디오 세그먼트 미세 소관의 준비를하는 동안 현미경 분야의 DIC 이미지를 보여줍니다. 미세 소관의 씨앗이 이미 커버 슬립에 부착 한 후에 영상이 시작됩니다. 작은 둥근 점 방지 제닌 항체의 우리의 준비에있는 입자에서이다. 튜 불린과 GTP가 추가 된 후, 미세 소관은 씨 (단계 5.2)에서 연장 시작합니다. 그들이 원하는 길이 (8-15 μM)에 도달 한 후, 용액을 Rhodaminated 튜 불린 및 GMPCPP을 소개하고 빠르게 교환된다. D의 교환, 미세 소관 폴리머 벤드시펌프가 정지 한 후 흐름 irection는 있지만 변형되지 않은 방향을 가정합니다. 다음 "상한"단계에서, 어떤 튜 불린은 자발적으로 작은 미세 소관의 조각이 챔버에 떠있는 볼 중합하기 시작합니다. 그들은 또한 모든 가용 튜 불린과 세포핵을 제거 다음 세척 (단계 5.5), 동안 제거됩니다. 이 단계에서 일부 미세 소관은 강력한 캡을 조립하는 데 실패하고, 수용성 튜 불린이 씻겨 때 신속하게 분해. 그들이 조명되지 않는 캡핑 미세 소관은, 그러나, 몇 시간 동안 안정하다; 로다 민 흥분 때, 캡은 단편화되어, 캡핑 미세 소관 세그먼트들은 노출된다. 이미지는 매초마다 획득 30 fps로 재생되었다.

비디오 2. 분할 된 미세 소관의 Uncapping은. 비디오는 로다 민 필터 큐브를 통해 같은 미세 소관의 형광 이미지 뒤에 DIC를 통해 완전히 조립 된 세그먼트 미세 소관을 보여줍니다. B미세 소관의 끝에서 오른쪽 빨간 세그먼트 (화살표) 호에서 이동 인해 사진 표백에 신속하게 페이드. 이미지는 10 fps로 인수, 10 fps로했다.

비디오 3. 미세 소관의 끝을 해중합과 추적 단백질. 분할 된 미세 소관 (MT)은 별개의 점 (녹색 이미지)를 형성 GFP - 라벨 Dam1에 의해 장식 볼 수 감사합니다. 로다 민 형광은 흥분과 빨간 모자는 미세 소관 (빨간색 이미지)의 끝 부분에 부드러운 아크에서 이동 표시되고, 표시된 튜 불린은 고분자의 말에 통합 되었기 때문에 미세 소관의 나머지 부분은 표시되지 않습니다. 빠른 캡 표백제, 무너지기 시작하고 형광 큐브 Rhodaminated의 튜 불린과 GMPCPP이없는 미세 소관 세그먼트의 단축의 시작을 볼 시간에 단지 다시 GFP로 전환됩니다. 단부를 해중합하는 Dam1 점에 도달 할 때, 미세 소관 단부는 밝은 녹색이된다. 그 후, 녹색 형광을 발한다NT 자리는 processive 팁 추적을 설명, 분해 미세 소관으로 이동 볼 수 있습니다. Dam1의 농도는 3 nm의 이미지가 0.4 fps로 취득하고 연주했다이었다. 스케일 바 5 μm의.

비디오 4. 미세 소관은이 미세 소관으로 커버 슬립에 닿는 것을 나타냅니다. Dam1로 코팅 된 유리 구슬이 아크에서 움직이는 볼 끝 해중합으로 추적 구슬. 로다 민 형광이 흥분 할 때, 빨간 모자는 비드에서 원심 볼과 구슬의 움직임 (빨간색 이미지)과 동기 성에서 움직이고있다. 그 호와 같은 움직임의 진폭 (그림 4D)에서 감소하지만 곧, 구슬, 방향성 이동을 시작합니다. DIC 이미지는 로다 민 필터 큐브를 통해 모든 300 밀리 초를 인수하고 6 FPS를 연주했다, 구슬, 스케일 바 5 μm의 1 μm의 수 있습니다.

비디오 5. 키네신 코팅 비드가 분할 된 미세 소관에 양방향으로 이동. 이미징 비드 COA 후 시작전체 길이 CENP-E의 키네신과 테드는 미세 소관 (MT) 벽에 배치했다. 초기 비드 위치로 포인트를 화살표. 모터가 플러스 미세 소관의 끝을 향해 걸어으로 비드, 멀리 화살표에서 이동을 볼 수 있습니다. 플러스 엔드 캡 (화살촉, 붉은 이미지)에 불이 곧 후, 비드는 반대 방향으로 움직이기 시작한다. 만 전체 길이 CENP-E의 키네신 할 수있는 단축 미세 소관 끝에 구슬 몇 운동. 절단 CENP-E 코팅 비즈 플러스-MT의 끝으로 이동할 수 있지만, 미세 소관 해중합을 (를도 4 층과 4G 비교)가 발생 된 후 그들은 곧 분리합니다. DIC 이미지는 1 초를 취득하고 16 fps로 재생 된, 구슬 0.5 μm의 수 있습니다.

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Discussion

대부분의 단일 분자 분석은 오늘날 일상적으로 크게 특이 단백질의 고집을 줄이기 위해 특수 처리 커버 슬립을 사용합니다. 우리가 여기에서 설명하는 절차는 하워드 랩 32에서 개발 된 원래의 프로토콜의 변형이며, 우리는 커버 슬립을 silanizing은도 형광을 사용하지 않는 DIC 기반 비드 분석과 노력의 가치는 사실을 알게 될 것입니다. 이러한 커버 슬립 조립 챔버 훨씬 청소기 표면을 보여주고, 수용성 미세 소관 결합 단백질의 존재 하에서 얻어진 결과는 매우 낮은 단백질 농도가 사용되는 경우에는 특히 더 재현성.

분할 된 이동 단말의 성공적인 준비를위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 :

  1. 튜 불린의 농도와 배양 시간의 최적화 (5.1-5.2 단계). 시간과 프로토콜에 주어진 농도는 대략 등으로 인해 튜 불린 준비, 챔버 볼륨의 차이에 따라 다를 수 있습니다.
  2. 특정 꽉nucleators 커버 슬립에 미세 소관의 첨부 파일 및
  3. 정확하게 흐름 속도를 제어하는​​ 기능. 실험 밀폐 흐름 챔버에서 실시 될 때 우리의 손에서 최상의 결과를 얻을 수 있습니다.

이 프로토콜의 주요 장점은 미세 소관 해중합함으로써 분해 미세 소관 단부의 모션 분석​​을 돕고, 높은 공간적 해상도로 트리거 될 수 있다는 것이다. 이 기술로, 버퍼는 급속히 변경 될 수 있고 미세 소관 결합 단백질과 비즈는 미세 소관 형성 한 후 다양한 버퍼에 추가 될 수있다. 이를 미세 소관 어셈블리에서의 가능한 역할 별도로 미세 소관 해중합에 단백질의 효과를 연구한다. 단백질은 또한 미세 소관과의 상호 작용을 마스크 수있는, 수용성 튜 불린과 상호 작용할 수있는 경우에 유용합니다. 무료, 미 중합 튜 불린이 세포에 존재하기 때문에,주의 w를 사용해야합니다이러한 결과의 생리 학적 의미를 해석 암탉.

분단 미세 소관 접근법의 주요 한계는 미세 소관 조립시 동작을 연구하기 위해 적합하지 않은 것을, 또는 미세 소관 재난 및 구조에 단백질의 추적의 효과. 이 질문은 수용성 튜 불린의 존재에서 재배 동적 미세 소관과 분석이 더 적합합니다. 이 방법의 또 다른 제약 조건은 운동 버퍼가 산소 소거 효소 없어야한다는 것입니다. 이러한 효소 혼합물은, 카탈라아제와 글루코오스 산화 효소 (48)에 기초하여 예를 들면, 크게 형광 분자의 수명을 향상시킬 수있다. 이 시약은 분할 된 미세 소관 분석에 사용되는 경우 미세 소관을 분해하지 않고 표백제 모자 있기 때문에, 분해의 사진 유도가 빈번하다. 참고로, 예를 들어 위 또는 바와 같이 정량적 형광 분석법에서 표백 속도가 항상 고려되어야한다23 일 반 표백 에이전트를 사용하지 않는 경우 특히.

분할 된 미세 소관 분석에서 테스트를 여러 미세 소관 결합 단백질은 레이블이없는 미세 소관 세그먼트 대 로다 민 표지 안정 모자에 우선 바인딩을 보여 주었다. 캡 관련 구슬은 종종 모자를 분해 미세 소관에서 분리하기 때문에 캡에 바인딩, processive 구슬의 비율을 감소시킬 수있다. 마지막으로, 우리는 모터 코팅 비즈가 매우 빠르게 끝 플러스 미세 소관을 향해 걸 으면 미세 소관 해중합는 그들은 또한 미세 소관에서 해리하고 이러한 실험이 생산되지 않습니다이 경우, 트리거되기 전에, 그들은 자주 빨간 모자에 도달주의 .

요약하면, 소관 단축의 말을 따르지없는 고유 모터 활동과 소관 결합 단백질 기능은 흥미로운, 그러나 제대로 이해 현상이다. 여기에 설명 된 프로토콜은 홍보의 연구를 지원해야체외에서 oteins하고 속성. 미세 소관 해중합에 의존하는 수송은 유사 분열시 염색체의 분리에 중요한 역할을합니다. 따라서, 우리는 여기에 설명 된 기술은 궁극적으로 세포 분열의 메커니즘에 대한 더 많은 통찰력을 얻을하는 데 도움이되기를 바랍니다.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

저자는 프로토콜을 개발하고 시약을 제공하는 인물, N. Gudimchuk 및 P. Zakharov에 대한 이미지를 제공하기 위해, N. Dashkevich, N. Gudimchuk 및 A. Korbalev을 재사용 할 수있는 유량 용기를 디자인하고 제조하는 데 도움을 위해 FI Ataullakhanov에게 감사의 말씀을 전합니다 텍스트 편집 및 팁 및 토론을위한 Grishchuk 연구소의 다른 회원들과 도움을 제닌 표지 미세 소관 씨, A. Potapenko를 준비합니다. 이 작품은에 의해 부분적으로 지원되었다 NIH 부여 GM R01-098389과 킴멜 학자 ELG 펜실베니아 근육 연구소에서 파일럿 부여, RFBR 12 채로 04-00111-13-04-40190-H를 부여하고 (13) - 04-40188-H, 과학 상임위원회 보조금 러시아 아카데미 FI Ataullakhanov에 (분자 시스템 통합 및 분자 및 분자 세포 생물학 프로그램의 메커니즘), NIH는 JR 매킨토시에 GM R01 GM033787을 부여하고, 드미트리 Zimin 왕조 재단 박사의 교제 VAV

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Table 1. Microscopy and other equipment.
Microscope Zeiss
Nikon		 Axio Imager 2
Eclipse Ti		 other microscope models capable of DIC and epifluorescence-imaging can be used
Objective Zeiss
Nikon		 420490-9900-000
CFI Apo 100x Oil 1.49		 100X, DIC, 1.3-1.49 NA
Objective heater Bioptechs 150803, 150819-19
Fluorescent filter cube Chroma 49004 or 49008
41017 or 49020		 optimized for Rhodamine fluorescence 
optimized for GFP fluorescence
Acquisition software freeware MicroManager
Molecular Devices		 not applicable
MetaMorph 7.5		 http://valelab.ucsf.edu/~MM/MMwiki/
other software can be used to acquire images and for a particle tracking
EMCCD camera Andor iXon3, DU-897E-cs0-#BV Highly sensitive EMCCD camera
Trapping laser IPG Photonics YLR-10-1064-LP 1,064 nm laser, 10 W
Fluorescence excitation lasers Coherent, Inc.
Coherent, Inc.		 Sapphire 488 LP
Sapphire 552 LP		 excitation of green fluorophores
excitation of red fluorophores
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-001
Commercial flow chambers Warner Instruments RC-20 or RC-30
Perfusion pump Cole Palmer
Harvard Apparatus		 Masterflex 77120-52
Pico Plus		 Both pumps provide the required rate of liquid flow but a peristaltic pump may pulse at very slow speed. The flow with a syringe pump is more consistent for a wide range of rates but this pump has inertia. 
Table 2. Microscopy chamber preparation.
Modified microscope slides for reusable chambers Precision Glassblowing of Colorado Custom order www.precisionglassblowing.com Sonic slots in slides using schematics in Figure 1
Polyethylene tubing Intramedic 427410 I.D. 0.58 mm, O.D. 0.965 mm; use these tubes to connect assembled chamber to the pump and waste container
Polyethylene tubing Intramedic 427400 I.D. 0.28 mm, O.D. 0.61 mm; use these tubes to make the reusable chamber
Regular microscope slides VWR 48312-003 Other similar slides can be used
Coverslips VWR 48393-150, 48366-067 Other similar coverslips can be used
Silicon sealant World Precision Instruments KIT, SILICON SEALANT 5 MIN CURE
Epoxy glue Loctite 83082
Cyanoacrylate adhesive Scotch 3M AD114 Or cyanoacrylate adhesive from other manufacturers
Table 3. Coverslips cleaning and coating.
Molecular Sieves, Grade 564 Macron 4490-04
Coverglass Staining Jar Ted Pella, Inc. 21036
Coverslip Ceramic Holder Thomas Scientific 8542e40
PlusOne Repel Silane GE Healthcare Biosciences 17-1332-01
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
Anti-digoxigenin AB Roche Applied Science 11093274910
Table 4. Preparation of seeds and segmented microtubules.
Tubulin purified from cow brains
Cytoskeleton, Inc
T238P		 For purification protocols see 49–51
Unlabeled porcine tubulin
Labeled tubulin Cytoskeleton, Inc
Invitrogen
Invitrogen		 TL590M
C1171 (Rhodamine)
A-2952 (Digoxigenin)		 Rhodamine-labeled porcine tubulin
Tubulin can be labeled with any amine-reactive dye as in reference52.
GMPCPP Jena Biosciences NU-405 Aliquot and store at -70 °C
VALAP Vaseline, lanolin, and paraffin at 1:1:2 by mass see reference9

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References

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Volkov, V. A., Zaytsev, A. V., Grishchuk, E. L. Preparation of Segmented Microtubules to Study Motions Driven by the Disassembling Microtubule Ends. J. Vis. Exp. (85), e51150, doi:10.3791/51150 (2014).

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