Summary

Verminderde Itraconazol Concentratie en duur succesvol zijn in het behandelen van<em> Batrachochytrium dendrobatidis</em> Infectie in Amfibieën

Published: March 14, 2014
doi:

Summary

Batrachochytrium dendrobatidis infectie bij amfibieën kan worden geëlimineerd met behulp van een verminderde concentratie (0.0025%) en de kortere duur (vijf minuten baden voor zes dagen) van itraconazol dan algemeen wordt gebruikt. Minder sterfte en minder negatieve bijwerkingen werden waargenomen met behulp van deze aangepaste behandeling protocol.

Abstract

Amfibieën ervaren de grootste daling van alle gewervelde klasse en een belangrijke oorzaak van deze daling is een pathogene schimmel, Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), die de ziekte chytridiomycose veroorzaakt. Captive verzekering kolonies zijn belangrijk wereldwijd bedreigde soorten amfibieën en kan de enige levensader voor die in kritieke uitsterven bedreigd zijn. Handhaving van ziektevrije kolonies is een prioriteit van captive-managers, nog veilige en effectieve behandelingen voor alle soorten en heel levensstadia niet geïdentificeerd. De meest gebruikte chemotherapeutische behandeling itraconazol, hoewel de dosering gebruikelijke schadelijk sommige individuen en soorten kunnen worden. We voerden een klinische behandeling proef om te beoordelen of een lager en veiliger, maar effectieve dosis itraconazol kan worden gevonden om Bd infecties te genezen. We vonden dat door het verminderen van de behandeling concentratie ,01-,0025% en beperking van de behandelingsduur van 11-6 Dagen van 5 min baden, kon kikkers worden genezen van Bd infectie met minder bijwerkingen en minder-behandeling gerelateerde mortaliteit.

Introduction

Amfibieën zijn momenteel de grootste afname van de biodiversiteit van alle gewervelde taxa 1. Chytridiomycose, een huidziekte veroorzaakt door de chytrid schimmelpathogeen Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), is een van de belangrijkste oorzaken van deze dramatische dalingen 2 Bd is de slechtste pathogeen op verslag voor het veroorzaken van het verlies aan biodiversiteit. Infecteert meer dan 600 soorten amfibieën en heeft veroorzaakte daling in meer dan 300 soorten, waarvan maar liefst 200 soorten bedreigde of uitgestorven 2,3 zijn geworden. De amfibie chytrid schimmel is niet gastheerspecifiek en het is onduidelijk welke kwaliteiten van de host kan voor Bd infectie tot vooruitgang leidt tot een ernstige ziekte. Chytridiomycose veroorzaakt dood door verstoren ionenkanalen in de huid, waardoor verlies aan elektrolyten en hartfalen 4. Ook, Bd supernatant (die geen Bd zoosporen) veroorzaakt een immuunreactie kikkerlarven 5 leading onderzoekers geloven Bd produceert een giftig bijproduct 6.

Omdat veel soorten zijn snel dalende, captive assurance koloniën en fokprogramma's zijn belangrijk instandhoudingsmaatregelen, en kan de enige levensader voor sommige soorten. Opzetten en onderhouden van ziektevrije kolonies is een uitdaging voor amfibie beheer faciliteiten. De huidige chemotherapeutische werkwijzen voor het behandelen Bd infecties, hoewel effectief, schadelijk voor de dieren die behandeld kunnen worden, en geen enkele behandeling methode is succesvol tussen soorten en leeftijdsgroepen amfibieën 7 geweest.

Enkele klinische proeven van behandelingen voor Bd infectie zijn uitgevoerd 7. De drie meest gebruikte behandelmethoden zijn warmte therapie, chlooramfenicol en itraconazol. Warmte therapie is een nonchemotherapeutic behandeling die lijkt weinig bijwerkingen, kan op verschillende levensstadia en is algebondgenoot effectief. In een behandelingsproef, Chatfield en Richards-Zawacki 8 vonden dat 96% van de behandelde dieren infecties na gehuisvest bij 30 ° C gedurende 10 dagen had gewist. Hoewel deze proef was niet 100% succes, het dient als referentie voor anderen om warmtetherapie hun eigen soort beoordelen. Warmte therapie, hoewel effectief voor veel soorten onpraktisch voor vele alpine soorten die niet bij hoge temperaturen gedurende lange tijd. Chlooramfenicol, antibacterieel, is met succes gebruikt om Bd in vele soorten behandeling, en remt schimmelgroei in vitro. Als antibacteriële, de chlooramfenicol niet de schimmel specifiek aanvallen, maar is bekend apoptose te veroorzaken in eukaryote cellen 9. Er wordt gespeculeerd dat chlooramfenicol therapie apoptose veroorzaakt in de huid, het doden van intracellulaire sporangia, hoewel het exacte werkingsmechanisme is niet bekend. Hoewel er geen klinisch onderzoek is uitgevoerd, en daaromdosis en duur van de behandeling zijn niet onderzocht, huidige behandelprotocollen vergen doorgaans onderdompeling gedurende 2-4 weken 10,11, waardoor deze behandeling onpraktisch voor terrestrische amfibieën. Chlooramfenicol is ook beperkt in sommige landen diergeneeskundig gebruik omdat de blootstelling is geassocieerd met een zeldzame vorm van aplastische anemie 12.

Itraconazol, een azole antifungale, is de meest gebruikte voor de behandeling van Bd-infectie bij amfibieën in gevangenschap. Het meest gebruikte protocol baden dieren in een 0,01% itraconazol oplossing gedurende vijf minuten per dag gedurende 11 opeenvolgende dagen. Dit protocol werd afgeleid van standaarden voor zoogdierlijke toediening en, terwijl effectief voor amfibieën, is niet gebaseerd op klinische studies amfibieën 11,13. Dit protocol kan negatieve bijwerkingen in bepaalde soorten veroorzaken, vooral in het genus Rana en kikkervisjes en de recente Metamorphs 11.Tadpole behandeling succesvol is geweest met een veel lagere concentratie (0,0005%) van itraconazol, maar werd geassocieerd met depigmentatie 14. Deze zelfde concentratie werd uitgetest op recente Metamorphs en vond succesvol bij de behandeling van infectie 15 te zijn. Omdat er risico van negatieve bijwerkingen van itraconazol behandeling, hebben sommige beoefenaars ene helft van de gebruikelijke concentratie (0,005%) gedurende 11 opeenvolgende dagen gebruikt en vond dit succesvol te zijn in het genezen van Bd infecties 16 te zijn.

De huidige studie is een samenvatting van een klinisch onderzoek naar de behandeling met behulp van itraconazol aan Bd infectie 15 te behandelen. Het protocol beschrijft een poging om de laagste dosis en behandelingstijd die zowel veilig als effectief voor de behandeling Bd besmette dieren met itraconazol vinden. Dieren die in deze studie waren recente Metamorphs van golf kust padden, Incilius nebulifer.

Protocol

Ethiek Goedkeuring: Dit onderzoek en de methoden zijn goedgekeurd door Animal Gebruik en onderhoud Comite Tulane University (protocol nr. 0407.). 1. Testen op Bd Infectie Zwabberen voor Bd Wattenstaafje dieren met een steriel wattenstaafje vijf maal op de ventrum, vijf keer op elke dij, elke kant, en elke ledemaat voor een totaal van 45 slagen. Zwabberen is een niet-invasieve methode voor de monsterneming voor Bd op amfibie huid…

Representative Results

Itraconazol behandeling werd als succesvol beschouwd indien alle dieren waren Bd-negatieve vier weken na de behandeling beëindigd. Voorafgaand aan de behandeling begonnen, twee weken na de inenting, alle BD-geënte dieren werden besmet, met een gemiddelde zoospore belasting van 1,121.7 (± 17.34), terwijl vier weken na de behandeling beëindigd, de Bd-positieve controle dieren een gemiddelde zoospore belasting van 16,765.12 gehad ( ± 14.643,08). Behandeling van <…

Discussion

Met behulp van dit protocol konden we de behandeling dosering en het tijdstip van itraconazol behandeling voor Bd bij amfibieën veilig en effectief te verminderen. De laagste behandelingsdosering en tijd (0,0025% voor zes dagen) was een succesvolle behandeling voor subklinisch geïnfecteerde I. nebulifer. De effectiviteit van zowel een lagere dosering en duur van de behandeling tonen de noodzaak van klinische behandeling proeven voor Bd infectie behandelingen, want er zijn geen veilige en eff…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ik wil graag CL Richards-Zawacki bedanken voor hun hulp het conceptualiseren van de experimentele opzet en assisteren met materialen, A. Pessier om hulp oprichting van een behandelschema en necropsie analyses, MWH Chatfield, MJ Robak, K. Tasker en D. Lenger voor hulp in de laboratorium en ondersteuning en M. McFadden en P. Harlow in de Taronga Zoo voor het gebruik van hun ruimte tijdens het filmen. Het project werd gedeeltelijk door Louisiana Department of Wildlife and Fisheries gefinancierd door de Louisiana Environmental Education Commission subsidie ​​voor LA Brannelly en van Life Technologies.

Materials

0.1% Aqueous Itraconazole, Sporonox Janssen Pharmaceutica Inc.
NaCl Fisher Scientific S640-500
KCl Fisher Scientific BP366-1
CaCl2 Fisher Scientific BP510-100
NaHCO3 Fisher Scientific BP328-500
Sterile cotton swabs Medical and Wire Equipment MW113
1.5 ml micro tubes Sarstedt 73.703.217
Qiagen DNEasy Blood and Tissue Kit Qiagen 69581
7500 Real-time PCR Applied Biosystems 4351104
VIC IPC Applied Biosystems 4308323
BSA Applied Biosystems AM2618
Agar Invitrogen 30391023
Tryptone Invitrogen Q10029
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15070-063
Petri Dish Sigma Aldrich CLS430589

References

  1. Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
  2. Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
  3. Wake, D. B., Vredenburg, V. T. Colloquium paper: are we in the midst of the sixth mass extinction? A view from the world of amphibians. PNAS. 105, 11466-11473 (2008).
  4. Voyles, J., et al. Electrolyte depletion and osmotic imbalance in amphibians with chytridiomycosis. Dis. Aquat. Org. 77 (2), 113-118 (2007).
  5. Ramsey, J. P. Amphibian immune defenses against Batrachochytrium dendrobatidis: A war between host and pathogen. , (2011).
  6. McMahon, T. A., et al. Chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis has nonamphibian hosts and releases chemicals that cause pathology in the absence of infection. PNAS. 110 (1), 210-215 (2013).
  7. Berger, L., Speare, R., Pessier, A., Voyles, J., Skerratt, L. F. Treatment of chytridiomycosis requires urgent clinical trials. Dis. Aquat. Org. 92, 165-174 (2010).
  8. Chatfield, M. W. H., Richards-Zawacki, C. L. Elevated temperature as a treatment for Batrachochytrium dendrobatidis infection in captive frogs. Dis. Aquat. Org. 94 (3), 235-238 (2011).
  9. Karbowski, M., et al. Free radical-induced megamitochondria formation and apoptosis. Free Rad. Biol. Med. 26 (98), 396-409 (1999).
  10. Bishop, P. J., et al. Elimination of the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis by Archey’s frog Leiopelma archeyi. Dis. Aquat. Org. 84 (1), 9-15 (2009).
  11. Pessier, A. P., Mendelson, J. . A Manual For Control of Infectious Diseases in Amphibian Survival Assurance Colonies and Reintroduction Programs. , (2009).
  12. Page, S. W. Chloramphenicol 1. Hazards of use and the current regulatory environment. Aus. Vet. J. 68 (1), 1-2 (1991).
  13. Yoon, H. -. J., Seo, M. H., Kim, J. -. K. . Pharmaceutical formulations for itraconazole. , (2005).
  14. Garner, T. W. J., Garcia, G., Carroll, B., Fisher, M. C. Using itraconazole to clean Batrachochytrium dendrobatidis infection, and subsequent depigmentation of Alytes muletensis tadpoles. Dis. Aquat. Org. 83, 257-260 (2009).
  15. Brannelly, L. A., Richards-Zawacki, C. L., Pessier, A. P. Clinical trials with itraconazole as a treatment for chytrid fungal infections in amphibians. Dis. Aquat. Org. 101 (2), 95-104 (2012).
  16. Jones, M. E. B., Paddock, D., Bender, L., Allen, J. L., Schrenzel, M. S., Pessier, A. P. Treatment of chytridiomycosis with reduced-dose itraconazole. Dis. Aquat. Org. 99 (3), 243-249 (2012).
  17. Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Dis. Aquat. Org. 60 (2), 141-148 (2004).
  18. Martel, A., et al. Developing a safe antifungal treatment protocol to eliminate Batrachochytrium dendrobatidis from amphibians. Med. Mycol. 49 (2), 143-149 (2011).
  19. Bowerman, J., Rombough, C., Weinstock, S. R., Padgett-Flohr, G. E. Terbinafine hydrochloride in ethanol effectively clears Batrachochytrium dendrobatidis in amphibians. J. Herpetol. Med. Surg. 20 (1), 24-29 (2010).
  20. Young, S., Speare, R., Berger, L., Skerratt, L. F. Chloramphenicol with fluid and electrolyte therapy cures terminally ill green tree frogs (Litoria caerulea) with chytridiomycosis. J. Zoo Wildlife Med. 43 (2), 330-337 (2012).

Play Video

Cite This Article
Brannelly, L. A. Reduced Itraconazole Concentration and Durations Are Successful in Treating Batrachochytrium dendrobatidis Infection in Amphibians. J. Vis. Exp. (85), e51166, doi:10.3791/51166 (2014).

View Video