Summary
Batrachochytrium壶菌感染两栖动物可以使用缩小浓度（0.0025％）和伊曲康唑的持续时间较短（5分钟浴六天），比一般用被淘汰。采用这种改性的治疗方案更少的死亡率和较少副作用进行观察。
Abstract
两栖动物遇到任何脊椎动物类的最大跌幅和这些下降的主要原因是真菌病原体，Batrachochytrium壶菌（BD），从而导致疾病的壶菌病。圈养保证菌落受威胁的两栖动物物种的重要全球范围内，可为那些面临灭绝的关键威胁的唯一生命线。维持无病殖民地，是圈养管理者优先级，为所有物种和整个生命阶段还没有安全有效的治疗方法尚未确定。最广泛使用的化学治疗是伊曲康唑，尽管通常使用的剂量可能是有害的一些个体和物种。我们进行了临床治疗试验，以评估伊曲康唑的低，但更安全有效剂量是否能找到治愈波特感染。我们发现，从0.01-0.0025％，减少了治疗浓度，减少治疗时间从115分钟浴-6日，青蛙可以用较少的副作用，减少治疗相关死亡率治愈波特感染。
Introduction
两栖类动物正在经历的所有脊椎动物类群1的生物多样性的最大跌幅。壶菌病，引起壶真菌病原体Batrachochytrium壶菌（BD）一种皮肤疾病，是这些戏剧性的下滑2的主要原因之一波特是最糟糕的病原体上记录造成生物多样性丧失。它感染了600种两栖动物和有造成下跌超过300种，其中有多达200种已成为极度濒危或灭绝2,3。两栖动物壶菌是不特定于主机的，目前尚不清楚什么样的素质的主机允许波特感染进步导致严重的疾病。壶菌病引起的死亡通过破坏离子通道的皮肤，造成电解质损失和心脏衰竭4。此外， 屋宇署上清液（不含波特游动孢子），导致蝌蚪的免疫反应5 leadin克研究者认为波特产生的副产品6有毒。
由于许多物种正在迅速下降，俘虏保证殖民地和育种计划是重要的保护措施，并可能对某些物种的唯一生命线。建立和维持无病殖民地，是两栖动物管理设施是一个挑战。目前的化疗方法治疗波特感染，虽然有效，可能会损害正在接受治疗的动物，并没有单一的治疗方法一直是跨物种和两栖类7龄级成功。
对波特感染治疗几个临床试验已经完成7。治疗的三种最常用的方法有热疗法，氯霉素和伊曲康唑。热疗是，似乎有一些副作用，可以在多个生命阶段中使用的nonchemotherapeutic治疗选择，并是根儿盟友有效。在治疗试验中，查特菲尔德和Richards-Zawacki 8发现，治疗动物的96％被安置在30℃下10天之后清除了感染。虽然这次审判是不是100％成功的，它提供给别人评价热疗法为他们自己种的基准。热疗法，虽然有效的许多物种，是不切实际的，可以不保持在高温环境中长时间许多高山物种。氯霉素，抗菌，已经成功地用于治疗波特在许多物种中，并在体外抑制真菌的生长。作为抗菌，氯霉素不攻击真菌特别，但已经知道导致细胞凋亡在真核细胞9。据推测，氯霉素治疗引起细胞凋亡的皮肤，造成细胞内的孢子囊，但确切的作用机制尚不清楚。虽然没有临床试验已经进行，因此，剂量和治疗时间没有被评估，当前的治疗方案通常需要浸没为两至四个星期10,11，使得这种治疗不切实际的地面两栖动物。氯霉素也被限制在一些国家的兽医使用，因为人体暴露已经与再生障碍性贫血12一种罕见形式的关联。
伊曲康唑，唑类抗真菌，是目前最广泛地用于在圈养两栖动物治疗波特感染。最广泛使用的协议是入浴动物每天连续11天五分钟0.01％伊曲康唑溶液。这个协议是来自用于哺乳动物施用的标准，并且，同时有效两栖类，它不基于在两栖动物11,13的临床试验。这个协议可以导致某些物种的负面影响，特别是在属蛙和蝌蚪和最近metamorphs 11。蝌蚪治疗已经成功使用伊曲康唑的浓度低得多（0.0005％），但用色素脱失14相关联。这同样浓度造模上最近metamorphs，结果为不成功在治疗感染15。因为有一个负面影响与伊曲康唑治疗的风险，一些从业者已经使用一半的通常浓度（0.005％），连续11天，发现这是成功的固化波特感染16。
本研究是使用伊曲康唑治疗波特感染15临床治疗试验的总结。该协议描述，试图找到最低剂量和治疗时间，既安全，有效的治疗波特感染动物与伊曲康唑。在这项研究中使用的动物是最近的墨西哥湾沿岸蟾蜍metamorphs，Incilius nebulifer。
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Protocol
伦理批准：本研究及其方法已获美国杜兰大学动物使用及护理委员会（协议没有0407）。
1。测试用于 BD感染
- 擦拭用于 BD
- 拭动物用无菌棉签5倍的ventrum，每个大腿上，每一侧，并且每个肢为总共45笔画五倍。擦拭取样是对波特的两栖类皮肤无创性方法。
- 在与招之间轻轻转动棉签，保证DNA的最大量收集棉签。
- 于1.5ml微量管在-20℃储存拭子
- DNA提取和qPCR分析
- 提取基因组DNA使用市售的DNA提取试剂盒拭子，根据用于动物组织的指示。
- 使用定量实时PCR（定量PCR）以下博伊尔分析提取的DNA
- 稀释提取DNA样品1:10双去离子水。
- 添加0.7微升的牛血清白蛋白（BSA），以防止PCR抑制。
- 包括内部阳性对照各样品中，以确保PCR抑制没有影响的结果。
- 运行样品与阳性和阴性对照等一系列稀释的标准来估算游动孢子（感染）的负载。
2。接种
- 文波特
- 通过将10g胰蛋白胨1升反渗透或去离子水，高压灭菌（121℃，40分钟），并使其冷却制备胰蛋白胨肉汤。一旦冷却至23℃，加入1 ml青霉素，链霉素。
- 在胰蛋白胨肉汤中生长波特株（JEL411从J. Longcore，隔绝Guabal，巴拿马从Phyllomedusa狐猴 ）七天在23°C。
- 转移的B罗斯文化胰蛋白胨和琼脂平板。
- 使板，加10g胰蛋白胨和10g琼脂到1升反渗透或去离子水和高压釜（121℃，40分钟）。
- 一旦蒸压混合物不够冷静去触摸，但它凝结之前，倒入培养皿中，1/4-1/3满，在层流罩。
- 当琼脂凝固和冷却之后，加入0.5毫升波特肉汤时，每盘均匀涂抹在板周围。晾干。
- 一旦板接种波特游动孢子，密封板用封口膜。
- 让板孵化在23℃下5至7天。检查游动孢子的运动，以确保生存接种前。
- 洪水板的游动孢子接种溶液
- 波特孵化和成长的五到七天 后，洪水每盘用5毫升老化的自来水，并允许游动孢子进入媒体10分钟。
- 倒入游动孢子suspension到便携式容器。
- 估计游动孢子浓度用血球计。
- 稀释混合物，以1×10 6每3毫升与老年自来水的浓度。
- 接种动物
- 在个别50毫升容器，通过在其ventrum浇筑3毫升接种混合接种每个动物。允许额外的接种物滴入接种容器的底部。
- 每个动物将保持在接种容器放置24小时，以确保感染。
- 接种后24小时，回到动物个体消毒terraria。
- 使感染建立了两个星期。确认感染拭子和qPCR结果，并开始治疗。
- 对于BD-阴性对照，年龄洪水BD-自由琼脂平板用5ml自来水，和模拟接种的动物使用与上述相同的方法。
3。治疗方案
- 准备相重新处理浴
- 添加2.50毫升伊曲康唑水溶液（1％斯皮仁诺口服溶液），以1升两栖类林格氏液（0.0025％伊曲康唑 - 最低有效治疗浓度）。
- 两栖类林格氏液配方：1升反渗透或去离子水，氯化6.6克钠加入0.15g氯化钾，0.15克氯化钙和0.2g碳酸氢钠。高压釜中的溶液（121℃，40分钟），并允许冷却到室温。
- 对于0.01％伊曲康唑治疗浓度，添加10.00毫升伊曲康唑水溶液（1％斯皮仁诺口服溶液），以1升两栖类林格氏液
- 为0.005％，伊曲康唑治疗浓度，添加5.00毫升伊曲康唑水溶液（1％斯皮仁诺口服溶液），以1升两栖类林格氏液。
- 对于BD-阳性和BD-阴性对照，洗澡动物两栖类林格氏液，没有伊曲康唑。
- 添加2.50毫升伊曲康唑水溶液（1％斯皮仁诺口服溶液），以1升两栖类林格氏液（0.0025％伊曲康唑 - 最低有效治疗浓度）。
- 治疗<醇>
- 将个人两栖动物在消毒50毫升容器用35ml的处理液。
- 确保动物被轻轻摇动容器完全覆盖五分钟。
- 返回动物消毒terraria。重复6天。
- 实验动物用于 BD感染当天开始治疗。
- 试验动物为波特感染1周治疗结束后，和每周一次四个星期，以确保感染已被清除。
4， 波特作为一个生化危机
- 消毒个别terraria每周一次。
- 沐浴terraria和治疗的容器中，10％的漂白剂溶液浴。
- 用流动水冲洗每漂白容器的两倍。
- 让容器在重新使用前晾干24小时。
- 处理动物时要防止交叉污染戴上干净的手套，丁腈屋宇署病原体。改变处理每个动物之间的手套。
- 通过将解决10％的漂白粉消毒所有液体废物处置前。
- 所有高压灭菌的固体废物，是可能接触到波特之前处置。
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Representative Results
伊曲康唑治疗被认为是成功的，如果所有的动物都是BD-阴性治疗结束后四个星期。治疗前开始，接种后两周内，所有的BD-接种动物受到感染，以1,121.7平均游动孢子负荷（±17.34），而治疗结束四周后，屋宇署阳性对照组动物有16,765.12平均游动孢子负荷（ ±14643.08）。
Incilius nebulifer的治疗组（n = 15），成功利用浴场0.0025％，伊曲康唑浓度为五分钟，每天6天。 （ 图1B），许多人：伊曲康唑治疗这种低浓度的剂量并没有显著的死亡率相比，BD-阳性对照组（χ2,1 = 2.17，Exp（B）= 20,500，P = 0.339 Cox回归）不同谁活了下来，直到与屋宇署感染试验结束。
0.0025％我浴场traconazole 11天，两者0.005％和0.0025％，伊曲康唑六天都被发现是有效和安全的治疗方案（ 图1A和1B），推荐的治疗浓度，一半浓度为11天一个疗程长显著增加的死亡率相比，BD-阳性对照（Cox回归：0.01％伊曲康唑χ2,1 = 35.68，Exp（B）= 307.54，P <0.01; 0.005％，伊曲康唑χ2,1 = 16.17，Exp（B）= 9.40 ，P <0.01）（ 图1A）。 0.01％伊曲康唑治疗11天造成一 100％的死亡率nebulifer，并且一半浓度（0.005％伊曲康唑11天）导致60％的死亡率（ 图1A）。尸体剖检和组织病理学动物治疗期间死亡的一个小的子集进行的。在这项研究中无动物死亡壶菌病的。
图1。差别在生存跨越伊曲康唑治疗15（A）Incilius nebulifer：11 D治疗组（n = 15为每股面值0.01伊曲康唑浓度，0.005和0.0025％，N = 17的BD-阳性对照组和n = 9的BD-阴性对照组）。 （二） 一， nebulifer：6天治疗组（n = 15为0.01，0.005和0.0025％每伊曲康唑浓度，每组17对BD-阳性对照组和n = 9的BD-阴性对照组）。黑色箭头表示处理的最后一天。实线表示对照组的生存期（黑= BD阳性，灰= BD-阴性）。虚线表示伊曲康唑治疗组的生存期（浅灰色圆点= 0.01％，中灰点= 0.005％，黑点= 0.0025％，伊曲康唑）。 （这个数字已经被修改Brannelly 等人 15，图1B和1C）。 点击这里查看大图 。
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Discussion
使用此协议，我们能够安全，有效地降低两栖动物伊曲康唑治疗波特的治疗剂量和时间。最低治疗剂量和时间（六天0.0025％）是一次成功的治疗亚临床感染一nebulifer。这两个较低的剂量和治疗时间的效果表明，有必要为临床治疗试验的波特感染的治疗，因为目前用于两栖类的所有物种和年龄阶层没有安全有效的治疗方法。
死亡由伊曲康唑治疗造成的原因是未知的在这一点11。剖检和组织病理学上的个人期间或之后不久在Brannelly 等 15研究治疗期间的死亡的一小部分进行。这些分析的结果是不确定的，以死亡的原因，但很显然，没有动物死亡的壶菌病。死亡和标本保存，可能影响我们的检测治疗组之间的细微差别的能力之间发生自溶适中。
虽然这个协议支持的一个安全和有效的治疗方案的存在，更多的像这样的试验需要进行。第二唑治疗，伏立康唑，已被证明是有效的，至少1种18。伏立康唑是在水溶液中比伊曲康唑更加稳定，并已被证明是安全的蝌蚪用途18。虽然伊曲康唑和伏立康唑的单次治疗剂量的定价类似，伏立康唑是昂贵得多的报价比伊曲康唑，主要研究人员和圈养管理者更经常选择伊曲康唑。在这个时候，只有一个发表的研究报告已经18伏立康唑的有效证明。为了演示的功效，更物种需要进行造模。
<P类=“jove_content”>唑类抗真菌药代表一种类型的抗真菌化疗抑制真菌生长13。还有其他的治疗方法，其目的是杀灭真菌病原体，而不是仅仅降低增长。 波特是在温度高于28℃，热疗法杀死体外的目的是杀死波特在表皮。特比萘芬盐酸盐，其已经成功地治疗波特感染在一些物种19的替代抗真菌，工作原理是使所述的真菌细胞的裂解。抗真菌药物的直接攻击病原体可能是更成功的治疗方法，以及更多的工作需要做，以测试波特感染有前途的治疗方案。伊曲康唑治疗已被证明是有效的在亚临床感染的动物，但治疗临床壶菌病的在很大程度上是不成功的。只有一个研究迄今20已成功治愈晚期我 LL两栖动物和治疗涉及电解质治疗和化疗的积极组合。需要为身患绝症的动物成功的治疗方案，特别是对在圈养殖民地的地方保护每一个人的是保护该物种的必要的极度濒危动物。
虽然降低剂量和治疗时间是成功的一nebulifer，治疗并未造模上的其他物种或动物的临床感染。有些物种和生命阶段不能耐受伊曲康唑治疗，因此应用了大规模的治疗方案之前，俘虏管理者应该对个人的一小部分试验性治疗，以确定安全性和有效性。治疗完成后测试治疗的动物的至少四个星期是必要的，以确保消除低水平感染7，并应在每次治疗方案后方可实施。
帐篷“>建立用于 BD感染俘虏保证殖民地区域优先两栖动物保护工作安全，有效的治疗方案。维护波特免费殖民地，是必不可少的保护工作，并俘虏殖民地的成功可能是物种濒临灭绝的唯一生命线。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者宣称没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
我要感谢CL理查兹-Zawacki帮助概念化的实验设计和协助材料，A. Pessier帮助制定治疗方案和尸检分析，MWH查特菲尔德，MJ Robak，K.塔斯克和D Lenger在帮助实验室和支持和M.麦克法登和P.哈洛在Taronga动物园的拍摄过程中使用其空间。该项目是通过授予洛杉矶Brannelly路易斯安那州环境教育委员会授予和生命技术部分资金由野生动物和渔业的路易斯安那部门。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Aqueous Itraconazole, Sporonox | Janssen Pharmaceutica Inc. | ||
| NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510-100 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sterile cotton swabs | Medical and Wire Equipment | MW113 | |
| 1.5 ml Microtubes | Sarstedt | 73.703.217 | |
| Qiagen DNEasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69581 | |
| 7500 Real-time PCR | Applied Biosystems | 4351104 | |
| VIC IPC | Applied Biosystems | 4308323 | |
| BSA | Applied Biosystems | AM2618 | |
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| Tryptone | Invitrogen | Q10029 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petri Dish | Sigma Aldrich | CLS430589 |
References
- Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
- Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
- Wake, D. B., Vredenburg, V. T. Colloquium paper: are we in the midst of the sixth mass extinction? A view from the world of amphibians. PNAS. 105, 11466-11473 (2008).
- Voyles, J., et al. Electrolyte depletion and osmotic imbalance in amphibians with chytridiomycosis. Dis. Aquat. Org. 77 (2), 113-118 (2007).
- Ramsey, J. P. Amphibian immune defenses against Batrachochytrium dendrobatidis: A war between host and pathogen. , (2011).
- McMahon, T. A., et al. Chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis has nonamphibian hosts and releases chemicals that cause pathology in the absence of infection. PNAS. 110 (1), 210-215 (2013).
- Berger, L., Speare, R., Pessier, A., Voyles, J., Skerratt, L. F. Treatment of chytridiomycosis requires urgent clinical trials. Dis. Aquat. Org. 92, 165-174 (2010).
- Chatfield, M. W. H., Richards-Zawacki, C. L. Elevated temperature as a treatment for Batrachochytrium dendrobatidis infection in captive frogs. Dis. Aquat. Org. 94 (3), 235-238 (2011).
- Karbowski, M., et al. Free radical-induced megamitochondria formation and apoptosis. Free Rad. Biol. Med. 26 (98), 396-409 (1999).
- Bishop, P. J., et al. Elimination of the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis by Archey's frog Leiopelma archeyi. Dis. Aquat. Org. 84 (1), 9-15 (2009).
- Pessier, A. P., Mendelson, J. A Manual For Control of Infectious Diseases in Amphibian Survival Assurance Colonies and Reintroduction Programs. , IUCN/SSC Conservation Breeding Specialist Group. Apple Valley, MN. (2009).
- Page, S. W. Chloramphenicol 1. Hazards of use and the current regulatory environment. Aus. Vet. J. 68 (1), 1-2 (1991).
- Yoon, H. -J., Seo, M. H., Kim, J. -K. Pharmaceutical formulations for itraconazole. , (2005).
- Garner, T. W. J., Garcia, G., Carroll, B., Fisher, M. C. Using itraconazole to clean Batrachochytrium dendrobatidis infection, and subsequent depigmentation of Alytes muletensis tadpoles. Dis. Aquat. Org. 83, 257-260 (2009).
- Brannelly, L. A., Richards-Zawacki, C. L., Pessier, A. P. Clinical trials with itraconazole as a treatment for chytrid fungal infections in amphibians. Dis. Aquat. Org. 101 (2), 95-104 (2012).
- Jones, M. E. B., Paddock, D., Bender, L., Allen, J. L., Schrenzel, M. S., Pessier, A. P. Treatment of chytridiomycosis with reduced-dose itraconazole. Dis. Aquat. Org. 99 (3), 243-249 (2012).
- Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Dis. Aquat. Org. 60 (2), 141-148 (2004).
- Martel, A., et al. Developing a safe antifungal treatment protocol to eliminate Batrachochytrium dendrobatidis from amphibians. Med. Mycol. 49 (2), 143-149 (2011).
- Bowerman, J., Rombough, C., Weinstock, S. R., Padgett-Flohr, G. E. Terbinafine hydrochloride in ethanol effectively clears Batrachochytrium dendrobatidis in amphibians. J. Herpetol. Med. Surg. 20 (1), 24-29 (2010).
- Young, S., Speare, R., Berger, L., Skerratt, L. F. Chloramphenicol with fluid and electrolyte therapy cures terminally ill green tree frogs (Litoria caerulea) with chytridiomycosis. J. Zoo Wildlife Med. 43 (2), 330-337 (2012).
