Summary
Batrachochytrium dendrobatidis infectie bij amfibieën kan worden geëlimineerd met behulp van een verminderde concentratie (0.0025%) en de kortere duur (vijf minuten baden voor zes dagen) van itraconazol dan algemeen wordt gebruikt. Minder sterfte en minder negatieve bijwerkingen werden waargenomen met behulp van deze aangepaste behandeling protocol.
Abstract
Amfibieën ervaren de grootste daling van alle gewervelde klasse en een belangrijke oorzaak van deze daling is een pathogene schimmel, Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), die de ziekte chytridiomycose veroorzaakt. Captive verzekering kolonies zijn belangrijk wereldwijd bedreigde soorten amfibieën en kan de enige levensader voor die in kritieke uitsterven bedreigd zijn. Handhaving van ziektevrije kolonies is een prioriteit van captive-managers, nog veilige en effectieve behandelingen voor alle soorten en heel levensstadia niet geïdentificeerd. De meest gebruikte chemotherapeutische behandeling itraconazol, hoewel de dosering gebruikelijke schadelijk sommige individuen en soorten kunnen worden. We voerden een klinische behandeling proef om te beoordelen of een lager en veiliger, maar effectieve dosis itraconazol kan worden gevonden om Bd infecties te genezen. We vonden dat door het verminderen van de behandeling concentratie ,01-,0025% en beperking van de behandelingsduur van 11-6 Dagen van 5 min baden, kon kikkers worden genezen van Bd infectie met minder bijwerkingen en minder-behandeling gerelateerde mortaliteit.
Introduction
Amfibieën zijn momenteel de grootste afname van de biodiversiteit van alle gewervelde taxa 1. Chytridiomycose, een huidziekte veroorzaakt door de chytrid schimmelpathogeen Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), is een van de belangrijkste oorzaken van deze dramatische dalingen 2 Bd is de slechtste pathogeen op verslag voor het veroorzaken van het verlies aan biodiversiteit. Infecteert meer dan 600 soorten amfibieën en heeft veroorzaakte daling in meer dan 300 soorten, waarvan maar liefst 200 soorten bedreigde of uitgestorven 2,3 zijn geworden. De amfibie chytrid schimmel is niet gastheerspecifiek en het is onduidelijk welke kwaliteiten van de host kan voor Bd infectie tot vooruitgang leidt tot een ernstige ziekte. Chytridiomycose veroorzaakt dood door verstoren ionenkanalen in de huid, waardoor verlies aan elektrolyten en hartfalen 4. Ook, Bd supernatant (die geen Bd zoosporen) veroorzaakt een immuunreactie kikkerlarven 5 leading onderzoekers geloven Bd produceert een giftig bijproduct 6.
Omdat veel soorten zijn snel dalende, captive assurance koloniën en fokprogramma's zijn belangrijk instandhoudingsmaatregelen, en kan de enige levensader voor sommige soorten. Opzetten en onderhouden van ziektevrije kolonies is een uitdaging voor amfibie beheer faciliteiten. De huidige chemotherapeutische werkwijzen voor het behandelen Bd infecties, hoewel effectief, schadelijk voor de dieren die behandeld kunnen worden, en geen enkele behandeling methode is succesvol tussen soorten en leeftijdsgroepen amfibieën 7 geweest.
Enkele klinische proeven van behandelingen voor Bd infectie zijn uitgevoerd 7. De drie meest gebruikte behandelmethoden zijn warmte therapie, chlooramfenicol en itraconazol. Warmte therapie is een nonchemotherapeutic behandeling die lijkt weinig bijwerkingen, kan op verschillende levensstadia en is algebondgenoot effectief. In een behandelingsproef, Chatfield en Richards-Zawacki 8 vonden dat 96% van de behandelde dieren infecties na gehuisvest bij 30 ° C gedurende 10 dagen had gewist. Hoewel deze proef was niet 100% succes, het dient als referentie voor anderen om warmtetherapie hun eigen soort beoordelen. Warmte therapie, hoewel effectief voor veel soorten onpraktisch voor vele alpine soorten die niet bij hoge temperaturen gedurende lange tijd. Chlooramfenicol, antibacterieel, is met succes gebruikt om Bd in vele soorten behandeling, en remt schimmelgroei in vitro. Als antibacteriële, de chlooramfenicol niet de schimmel specifiek aanvallen, maar is bekend apoptose te veroorzaken in eukaryote cellen 9. Er wordt gespeculeerd dat chlooramfenicol therapie apoptose veroorzaakt in de huid, het doden van intracellulaire sporangia, hoewel het exacte werkingsmechanisme is niet bekend. Hoewel er geen klinisch onderzoek is uitgevoerd, en daaromdosis en duur van de behandeling zijn niet onderzocht, huidige behandelprotocollen vergen doorgaans onderdompeling gedurende 2-4 weken 10,11, waardoor deze behandeling onpraktisch voor terrestrische amfibieën. Chlooramfenicol is ook beperkt in sommige landen diergeneeskundig gebruik omdat de blootstelling is geassocieerd met een zeldzame vorm van aplastische anemie 12.
Itraconazol, een azole antifungale, is de meest gebruikte voor de behandeling van Bd-infectie bij amfibieën in gevangenschap. Het meest gebruikte protocol baden dieren in een 0,01% itraconazol oplossing gedurende vijf minuten per dag gedurende 11 opeenvolgende dagen. Dit protocol werd afgeleid van standaarden voor zoogdierlijke toediening en, terwijl effectief voor amfibieën, is niet gebaseerd op klinische studies amfibieën 11,13. Dit protocol kan negatieve bijwerkingen in bepaalde soorten veroorzaken, vooral in het genus Rana en kikkervisjes en de recente Metamorphs 11.Tadpole behandeling succesvol is geweest met een veel lagere concentratie (0,0005%) van itraconazol, maar werd geassocieerd met depigmentatie 14. Deze zelfde concentratie werd uitgetest op recente Metamorphs en vond succesvol bij de behandeling van infectie 15 te zijn. Omdat er risico van negatieve bijwerkingen van itraconazol behandeling, hebben sommige beoefenaars ene helft van de gebruikelijke concentratie (0,005%) gedurende 11 opeenvolgende dagen gebruikt en vond dit succesvol te zijn in het genezen van Bd infecties 16 te zijn.
De huidige studie is een samenvatting van een klinisch onderzoek naar de behandeling met behulp van itraconazol aan Bd infectie 15 te behandelen. Het protocol beschrijft een poging om de laagste dosis en behandelingstijd die zowel veilig als effectief voor de behandeling Bd besmette dieren met itraconazol vinden. Dieren die in deze studie waren recente Metamorphs van golf kust padden, Incilius nebulifer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek Goedkeuring: Dit onderzoek en de methoden zijn goedgekeurd door Animal Gebruik en onderhoud Comite Tulane University (protocol nr. 0407.).
1. Testen op Bd Infectie
- Zwabberen voor Bd
- Wattenstaafje dieren met een steriel wattenstaafje vijf maal op de ventrum, vijf keer op elke dij, elke kant, en elke ledemaat voor een totaal van 45 slagen. Zwabberen is een niet-invasieve methode voor de monsterneming voor Bd op amfibie huid.
- Voorzichtig draai de swab tijdens en tussen slagen te zorgen voor de grootste hoeveelheid DNA wordt verzameld op het wattenstaafje.
- WINKEL swabs in 1,5 ml microbuisjes bij -20 ° C.
- DNA-extractie en qPCR assay
- Uittreksel genomisch DNA van de uitstrijkjes met een commercieel verkrijgbare DNA isolatie kit, volgens de instructies van dierlijk weefsel.
- Analyseer de geëxtraheerde DNA met behulp van kwantitatieve real time PCR (qPCR) volgende Boyle
- Verdunnen DNA-extractie monsters 01:10 met dubbele gedemineraliseerd water.
- Voeg 0,7 ul van runderserumalbumine (BSA) PCR inhibitie voorkomen.
- Zijn een interne positieve controle in elk monster te verzekeren PCR remming werd geen resultaten beïnvloeden.
- Voer monsters met een positieve en negatieve controle en een reeks verdunning normen zoöspore (infectie) laad schatten.
2. Enting
- Cultuur Bd
- Bereid trypton bouillon door toevoeging van 10 g trypton 1 L omgekeerde osmose of gedeïoniseerd water, autoclaaf (121 ° C gedurende 40 min.) en afgekoeld. Eenmaal afgekoeld tot 23 ° C, voeg 1 ml penicilline-streptomycine.
- Grow Bd stam (JEL411 van J. Longcore, geïsoleerd van Guabal, Panama uit een Phyllomedusa maki) in een tryptone bouillon gedurende zeven dagen bij 23 ° C.
- Breng de broth cultuur trypton en agar platen.
- Platen, voeg 10 g trypton en 10 g agar 1 L omgekeerde osmose of gedeïoniseerd water en autoclaaf (121 ° C gedurende 40 min).
- Zodra de geautoclaveerde mengsel is afgekoeld om te raken, maar voordat het stolt, giet in petrischaaltjes, 1/4-1/3 vol, in een laminaire stroming kap.
- Wanneer agar volledig is gestold en afgekoeld, voeg 0,5 ml Bd bouillon aan elke plaat en verdeel gelijkmatig over de plaat. Laten drogen.
- Zodra de platen worden geënt met Bd zoösporen, Seal-platen met Parafilm.
- Laat platen geïncubeerd bij 23 ° C gedurende 5-7 dagen. Controleer zoospore beweging om de levensvatbaarheid te garanderen voor enting.
- Vloed platen voor zoospore enting oplossing
- Na de 5-7 dagen van Bd incubatie en groei, overstromen elk bord met 5 ml leidingwater leeftijd en laat zoösporen tot de media voor 10 min in te voeren.
- Giet de zoospore Suspension in een draagbare container.
- Schatting zoöspore concentratie met een hemocytometer.
- Verdun het mengsel tot een concentratie van 1 x 10 6 per 3 ml met leidingwater leeftijd.
- Inoculeren dieren
- In individuele 50 ml containers, te enten elk dier door het gieten van 3 ml inoculum mengsel over haar ventrum. Laat extra inoculum te druppelen in de basis van de inoculatie container.
- Elk dier zal in inenting container blijven gedurende 24 uur voor infecties zorgen.
- Na 24 uur van inenting, terugkeren dieren aan individuele gedesinfecteerd terraria.
- Laat infectie bouwen voor twee weken. Bevestig infectie met wattenstaafje en qPCR resultaten, en beginnen met de behandeling.
- Voor Bd-negatieve controles, overstroming Bd-vrij agar platen met 5 ml jaar leidingwater, en mock enten de dieren met behulp van dezelfde methoden als hierboven.
3. Behandelschema
- Prepare behandeling bad
- Voeg 2,50 ml waterige itraconazol (1% Trisporal OS) om 1 L Amphibian Ringer-oplossing (0,0025% itraconazol - de laagste effectieve behandeling concentratie).
- Amfibie Ringer's oplossing recept: 1 L omgekeerde osmose of gedeïoniseerd water, 6,6 g natriumchloride, 0,15 g kaliumchloride, 0,15 g calciumchloride en 0,2 g natriumbicarbonaat. Autoclaaf oplossing (121 ° C gedurende 40 min) en laat afkoelen tot kamertemperatuur.
- Voor 0,01% itraconazol behandeling concentratie, voeg 10,00 ml waterige itraconazol (1% Trisporal OS) om 1 L Amphibian Ringer-oplossing
- Voor 0,005% itraconazol behandeling concentratie, voeg 5,00 ml waterige itraconazol (1% Trisporal OS) om 1 L Amphibian Ringer-oplossing.
- Voor Bd-positieve en Bd-negatieve controles, baden dieren in Amphibian Ringer-oplossing zonder itraconazol.
- Voeg 2,50 ml waterige itraconazol (1% Trisporal OS) om 1 L Amphibian Ringer-oplossing (0,0025% itraconazol - de laagste effectieve behandeling concentratie).
- Behandeling <ol>
- Plaats individuele amfibieën in gedesinfecteerd 50 ml containers met 35 ml van de behandeling oplossing.
- Zorgen voor dieren zijn volledig gedekt gedurende vijf minuten onder voorzichtig schudden van de container.
- Terug dieren ontsmet terraria. Herhaal dit voor zes dagen.
- Proefdieren voor Bd infectie op de dag dat de behandeling begint.
- Proefdieren voor Bd infectie een week na de behandeling is voltooid, en een keer per week gedurende vier weken voor infecties zorgen heeft ontruimd.
4. Bd als Biohazard
- Desinfecteren individuele terraria wekelijks.
- Baad de terraria en behandeling containers in een 10% bleekwater oplossing bad.
- Tweemaal Spoel elk gebleekt container met stromend water.
- Verpakking laten drogen voor 24 uur voor hergebruik.
- Draag schone nitril handschoenen bij het hanteren van dieren om kruisbesmetting te voorkomenvan Bd ziekteverwekker. Wijzig handschoenen tussen de behandeling van elk dier.
- Desinfecteer alle vloeibare afvalstoffen voorafgaand aan verwijdering door het brengen van de oplossing tot 10% bleekmiddel.
- Autoclaaf alle vaste afvalstoffen die mogelijk wordt blootgesteld aan Bd alvorens ze te verwijderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Itraconazol behandeling werd als succesvol beschouwd indien alle dieren waren Bd-negatieve vier weken na de behandeling beëindigd. Voorafgaand aan de behandeling begonnen, twee weken na de inenting, alle BD-geënte dieren werden besmet, met een gemiddelde zoospore belasting van 1,121.7 (± 17.34), terwijl vier weken na de behandeling beëindigd, de Bd-positieve controle dieren een gemiddelde zoospore belasting van 16,765.12 gehad ( ± 14.643,08).
Behandeling van Incilius nebulifer (n = 15) was succesvol gebruik van baden in 0.0025% itraconazol concentratie gedurende vijf minuten per dag gedurende zes dagen. Deze lage concentratie dosis itraconazol behandeling niet significant van mortaliteit in vergelijking met de Bd-positieve controles (Cox regressie: χ 2,1 = 2,17, exp (b) = 20,500, p = 0,339) (Figuur 1B), veel wie bleef bestaan tot het einde van de proef met Bd infectie.
Baden van 0.0025% itraconazole voor 11 dagen, en zowel 0,005% en 0,0025% itraconazol zes dagen bleken alle effectieve en veilige behandeling opties (Figuren 1A en 1B). De aanbevolen behandeling concentratie helft concentratie een behandelingsduur van 11 dagen aanzienlijk toegenomen zijn mortaliteit in vergelijking met de Bd-positieve controles (Cox regressie: 0.01% itraconazol χ 2,1 = 35,68, exp (b) = 307,54, p <0.01; 0,005% itraconazool χ 2,1 = 16,17, exp (b) = 9.40 , p <0.01) (Figuur 1A). De 0.01% itraconazol behandeling voor 11 dagen 100% sterfte in I. veroorzaakt nebulifer, en de helft van die concentratie (0,005% itraconazol voor 11 dagen) 60% sterfte (figuur 1A) veroorzaakt. Autopsie en histopathologie voor een klein deel van de dieren die stierven tijdens de behandeling werden uitgevoerd. Geen enkel dier in deze studie overleden chytridiomycose.
Figuur 1. Verschillen in overleving over itraconazol behandelingen 15 (A) Incilius nebulifer:. 11 d behandeling (n = 15 voor elke itraconazol concentratie van 0,01, 0,005 en 0,0025%, n = 17 voor de Bd-positieve controlegroep en n = 9 voor de Bd-negatieve controlegroep). (B) I. nebulifer: 6 d behandeling (n = 15 voor elke itraconazol concentratie van 0,01, 0,005 en 0,0025%, n = 17 voor de Bd-positieve controlegroep en n = 9 voor de Bd-negatieve controlegroep). Zwarte pijlen geven de laatste behandelingsdag. Doorgetrokken lijnen geven de overleving van controlegroepen (zwart = Bd-positief, grijs = Bd-negatief). Gebroken lijnen geven de overleving van itraconazol behandelingsgroepen (licht grijze stippen = 0,01%, Medium grijze punten = 0,005%, zwarte stippen = 0.0025% itraconazol). (Dit cijfer is aangepast Brannelly et al.. 15, figuur 1B en 1C). Klik hier voor grotere afbeelding .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met behulp van dit protocol konden we de behandeling dosering en het tijdstip van itraconazol behandeling voor Bd bij amfibieën veilig en effectief te verminderen. De laagste behandelingsdosering en tijd (0,0025% voor zes dagen) was een succesvolle behandeling voor subklinisch geïnfecteerde I. nebulifer. De effectiviteit van zowel een lagere dosering en duur van de behandeling tonen de noodzaak van klinische behandeling proeven voor Bd infectie behandelingen, want er zijn geen veilige en effectieve behandelingen te worden gebruikt voor alle soorten en leeftijdsklassen van amfibieën.
De oorzaak van overlijden ten gevolge van itraconazol behandeling is onbekend op dit moment 11. Autopsie en histopathologie werden uitgevoerd op een klein deel van de personen die stierven tijdens of kort na de behandeling in de Brannelly et al.. 15 studiepunten. De resultaten van deze analyses waren niet overtuigend als de oorzaak van de dood, maar het is duidelijk dat er geen dier stierfvan chytridiomycose. Matige autolyse plaatsgevonden tussen dood en specimen behoud, die ons vermogen om subtiele verschillen tussen de behandelgroepen te ontdekken kan hebben beïnvloed.
Hoewel dit protocol ondersteunt het bestaan van een veilige en effectieve behandeling regime, meer studies zoals deze gang moet worden. Een tweede azool behandeling, voriconazol, is aangetoond effectief in ten minste een soort 18 is. Voriconazol is in een oplossing van water en stabieler dan itraconazol en is aangetoond veilig voor kikkervisje gebruik 18 te zijn. Hoewel een enkele behandeling dosis itraconazol en voriconazol zijn vergelijkbaar in de prijsvorming, voriconazol is veel duurder voor de aankoop dan itraconazol, toonaangevende onderzoekers en gevangen managers itraconazol meer regelmatig kiezen. Op dit moment heeft slechts een gepubliceerd onderzoek worden de werkelijk voriconazol 18 aangetoond. Om de werkzaamheid aan te tonen, moeten meer soorten worden uitgetest.
<p class = "jove_content"> azoolantimycotica vertegenwoordigen een type antifungale chemotherapie die schimmelgroei 13 remmen. Er zijn andere behandelmethoden die tot doel hebben de schimmelpathogeen doden plaats van alleen de groei beperken. Bd gedood in vitro bij temperaturen boven 28 ° C en warmtetherapie wil Bd de epidermis doden. Terbinafine hydrochloride, een andere antimycotische die succesvol bij het behandelen Bd infectie bij sommige soorten 19 is, werkt door het veroorzaken lysis van de schimmelcellen. Antischimmelmiddelen die direct een aanval op de ziekteverwekker kunnen zijn meer succesvolle behandelingen, en meer werk moet worden gedaan om veelbelovende opties voor de behandeling Bd infectie testen.Itraconazol behandeling is effectief gebleken in het subklinisch geïnfecteerde dieren te zijn, maar de behandeling van klinische chytridiomycose is grotendeels in het ongelijk gesteld. Slechts een studie tot op heden 20 heeft met succes terminaal behandeld i ll amfibieën, en de behandeling in een agressieve combinatie van elektrolyt en chemotherapie. Succesvolle behandeling mogelijk maken van terminaal zieke dieren nodig zijn, met name voor bedreigde dieren in gevangenschap levende kolonies waar de bescherming van elk individu is van essentieel belang voor de instandhouding van de soort.
Hoewel het verminderen van de dosis en duur van de behandeling succesvol voor I. was nebulifer, de behandeling niet is uitgetest op andere diersoorten of dieren met klinische infecties. Sommige soorten en levensstadia itraconazol niet verdragen behandeling, dus voordat een grootschalige behandeling regime, en captive-managers moeten proefbehandeling op een kleine deelverzameling van individuen om de veiligheid en effectiviteit te bepalen. Testen van de behandelde dieren gedurende ten minste vier weken na beëindiging van de behandeling noodzakelijk uitroeiing van laag infectie 7 waarborgen, en moeten na elke behandeling regime worden uitgevoerd.
tent "> Vaststelling van veilige en effectieve behandeling opties voor Bd infecties in gevangenschap assurance kolonies gebied prioriteit voor amfibie pogingen tot instandhouding. Handhaving Bd vrije kolonies is essentieel voor het succes van de pogingen tot instandhouding en gevangen kolonies kan de enige levensader voor soorten op de rand van uitsterven zijn .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur verklaart geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Ik wil graag CL Richards-Zawacki bedanken voor hun hulp het conceptualiseren van de experimentele opzet en assisteren met materialen, A. Pessier om hulp oprichting van een behandelschema en necropsie analyses, MWH Chatfield, MJ Robak, K. Tasker en D. Lenger voor hulp in de laboratorium en ondersteuning en M. McFadden en P. Harlow in de Taronga Zoo voor het gebruik van hun ruimte tijdens het filmen. Het project werd gedeeltelijk door Louisiana Department of Wildlife and Fisheries gefinancierd door de Louisiana Environmental Education Commission subsidie voor LA Brannelly en van Life Technologies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Aqueous Itraconazole, Sporonox | Janssen Pharmaceutica Inc. | ||
| NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510-100 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sterile cotton swabs | Medical and Wire Equipment | MW113 | |
| 1.5 ml Microtubes | Sarstedt | 73.703.217 | |
| Qiagen DNEasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69581 | |
| 7500 Real-time PCR | Applied Biosystems | 4351104 | |
| VIC IPC | Applied Biosystems | 4308323 | |
| BSA | Applied Biosystems | AM2618 | |
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| Tryptone | Invitrogen | Q10029 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petri Dish | Sigma Aldrich | CLS430589 |
References
- Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
- Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
- Wake, D. B., Vredenburg, V. T. Colloquium paper: are we in the midst of the sixth mass extinction? A view from the world of amphibians. PNAS. 105, 11466-11473 (2008).
- Voyles, J., et al. Electrolyte depletion and osmotic imbalance in amphibians with chytridiomycosis. Dis. Aquat. Org. 77 (2), 113-118 (2007).
- Ramsey, J. P. Amphibian immune defenses against Batrachochytrium dendrobatidis: A war between host and pathogen. , (2011).
- McMahon, T. A., et al. Chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis has nonamphibian hosts and releases chemicals that cause pathology in the absence of infection. PNAS. 110 (1), 210-215 (2013).
- Berger, L., Speare, R., Pessier, A., Voyles, J., Skerratt, L. F. Treatment of chytridiomycosis requires urgent clinical trials. Dis. Aquat. Org. 92, 165-174 (2010).
- Chatfield, M. W. H., Richards-Zawacki, C. L. Elevated temperature as a treatment for Batrachochytrium dendrobatidis infection in captive frogs. Dis. Aquat. Org. 94 (3), 235-238 (2011).
- Karbowski, M., et al. Free radical-induced megamitochondria formation and apoptosis. Free Rad. Biol. Med. 26 (98), 396-409 (1999).
- Bishop, P. J., et al. Elimination of the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis by Archey's frog Leiopelma archeyi. Dis. Aquat. Org. 84 (1), 9-15 (2009).
- Pessier, A. P., Mendelson, J. A Manual For Control of Infectious Diseases in Amphibian Survival Assurance Colonies and Reintroduction Programs. , IUCN/SSC Conservation Breeding Specialist Group. Apple Valley, MN. (2009).
- Page, S. W. Chloramphenicol 1. Hazards of use and the current regulatory environment. Aus. Vet. J. 68 (1), 1-2 (1991).
- Yoon, H. -J., Seo, M. H., Kim, J. -K. Pharmaceutical formulations for itraconazole. , (2005).
- Garner, T. W. J., Garcia, G., Carroll, B., Fisher, M. C. Using itraconazole to clean Batrachochytrium dendrobatidis infection, and subsequent depigmentation of Alytes muletensis tadpoles. Dis. Aquat. Org. 83, 257-260 (2009).
- Brannelly, L. A., Richards-Zawacki, C. L., Pessier, A. P. Clinical trials with itraconazole as a treatment for chytrid fungal infections in amphibians. Dis. Aquat. Org. 101 (2), 95-104 (2012).
- Jones, M. E. B., Paddock, D., Bender, L., Allen, J. L., Schrenzel, M. S., Pessier, A. P. Treatment of chytridiomycosis with reduced-dose itraconazole. Dis. Aquat. Org. 99 (3), 243-249 (2012).
- Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Dis. Aquat. Org. 60 (2), 141-148 (2004).
- Martel, A., et al. Developing a safe antifungal treatment protocol to eliminate Batrachochytrium dendrobatidis from amphibians. Med. Mycol. 49 (2), 143-149 (2011).
- Bowerman, J., Rombough, C., Weinstock, S. R., Padgett-Flohr, G. E. Terbinafine hydrochloride in ethanol effectively clears Batrachochytrium dendrobatidis in amphibians. J. Herpetol. Med. Surg. 20 (1), 24-29 (2010).
- Young, S., Speare, R., Berger, L., Skerratt, L. F. Chloramphenicol with fluid and electrolyte therapy cures terminally ill green tree frogs (Litoria caerulea) with chytridiomycosis. J. Zoo Wildlife Med. 43 (2), 330-337 (2012).
