Summary
両生類におけるBatrachochytriumのdendrobatidis感染が低減濃度（0.0025％）、および一般的に使用されるよりもイトラコナゾールの短い持続時間（6日間5分浴）を用いて除去することができる。以下で死亡率およびより少ない負の副作用は、この修飾治療プロトコルを用いて観察した。
Abstract
両生類は、任意の脊椎動物クラスの最大の下落を経験しているし、これらの減少の主な原因は、疾患ツボカビを引き起こす真菌の病原体、Batrachochytriumのdendrobatidis（BD）、である。キャプティブ保証コロニーが絶滅両生類で世界的に重要であり、絶滅の重大な脅威のそれらのための唯一の生命線である。無病コロニーを維持することは、キャプティブ経営者の優先事項である、まだすべての種のため、ライフステージ全体で安全かつ効果的な治療が同定されていない。一般的に使用される投与量は、いくつかの個人や種に害を及ぼす可能性があるが、最も広く使用されている化学療法は、イトラコナゾールである。我々は、イトラコナゾールの低い、より安全で効果的な投与量は、Bdの感染症を治すために見つけることができるかどうかを評価するための臨床治療の治験を行った。我々は発見した0.01から0.0025パーセント処理濃度を低下させ、11から処理時間を減少させることによって5分浴の-6日間、カエルは副作用が少ないと少ない治療に関連した死亡の BD感染の硬化させることができた。
Introduction
両生類は現在、すべての脊椎動物の分類群1の生物多様性の最大の下落を経験している。ツボカビ、ツボカビ真菌病原体Batrachochytriumのdendrobatidis（BD）によって引き起こされる皮膚病、これらの劇的な下落2の主要な原因の1つであるBdは生物多様性の損失を生じさせるための記録最悪病原体である：それは両生類の600以上の種に感染し、持ってできるだけ多く200種が絶滅危惧または2,3絶滅したそのうちの300種以上の減少を引き起こした。両生類ツボカビ菌は、特定のホストされていない、それは 、BD 感染が深刻な病気を引き起こす進行するためにホストの資質が許すかは不明である。ツボカビは、電解質の損失および心不全4で得られた、皮膚におけるイオンチャネルを破壊することによって死を引き起こす。また、（何のBdの遊走子を含まない） のBd上清オタマジャクシ5最先端レベルの免疫応答を引き起こすGの研究者は 、BD は 、副生成物6毒性を生産信じています。
多くの種が急速に減少しているため、キャプティブ保証コロニー繁殖プログラムは、重要な保全対策であり、いくつかの種のための唯一の生命線である。確立し、無病コロニーを維持することは両生類管理施設のための挑戦である。 Bdの感染症を治療するための現在の化学療法の方法は、有効であるが、治療される動物に有害であることができ、単一の治療法は、種および両生類7歳クラスの両端に成功しなかった。
Bdの感染の治療のいくつかの臨床試験では、07行われている。治療の三最も一般的に使用される方法は、温熱療法、クロラムフェニコールおよびイトラコナゾールである。温熱療法は、ほとんど副作用を有すると思われるnonchemotherapeutic治療選択肢である複数のライフステージで使用することができ、GENERである同盟国効果的。治療試験では、チャットフィールドとリチャーズ- Zawacki 8は、処置した動物の96％が10日間30°Cに収容された後、感染をクリアしていたことが分かった。この試験は100パーセント成功しませんでしたが、それは他の人が自分の種のための温熱療法を評価するためのベースラインを提供しています。温熱療法は、多くの種に有効であるが、長時間にわたって高温に留まることができない多くの高山種について非実用的である。クロラムフェニコール、抗菌性は、多くの種でのBdを治療するために成功裏に使用され、 インビトロでの真菌の成長を阻害されている。抗菌ように、クロラムフェニコールは、具体的には真菌を攻撃しないが、真核細胞9においてアポトーシスを引き起こすことが知られている。これは、作用の正確なメカニズムは不明であるが、クロラムフェニコール療法は、細胞内の胞子を死滅させる、皮膚におけるアポトーシスを引き起こすことが推測されている。臨床試験は行われないので、したが用量および治療 時間が評価されておらず、現在の治療プロトコルは、典型的には、地上両生類のためのこの治療は実用的でない、2〜4週間10,11のための浸水を必要とする。ヒトへの暴露は、再生不良性貧血12のまれな形態と関連していたので、クロラムフェニコールはまた、獣医学的使用のためのいくつかの国で制限されています。
イトラコナゾール、アゾール系抗真菌は、最も広く飼育されている両生類のBd感染の治療のために使用される。最も広く使用されるプロトコルは、5分11日間連続日の0.01％イトラコナゾール溶液中に入浴動物である。このプロトコルは、両生類のために有効であるが、それは両生類11,13での臨床試験に基づくものではない、哺乳動物への投与に使用される基準に由来した。このプロトコルは、特に属ラナにし、オタマジャクシ、最近metamorphs 11で、特定の種の負の副作用を引き起こす可能性があります。オタマジャクシ処理は、イトラコナゾールのはるかに低い濃度（0.0005％）を用いて成功しているが、脱色14と関連していた。これと同じ濃度は、最近のmetamorphsでトライアルが行われ、感染15の治療に失敗したことが判明した。イトラコナゾール治療によるマイナスの副作用の危険性がありますので、いくつかの専門家は、11日間連続して1の半分の通常の濃度（0.005％）を使用し、これが BD 感染の16を硬化させることに成功したことが判明しました。
本研究では 、BD 感染 15を治療するためのイトラコナゾールを使用して臨床治療試験の要約である。プロトコルは、イトラコナゾールの BD感染動物の治療のための安全かつ効果的である最低用量や治療時間を見つけるための試みを説明しています。本研究で使用した動物は、湾岸のヒキガエルの最近のmetamorphs、Incilius nebuliferた。
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Protocol
倫理承認：本研究は、そのメソッドは、チューレーン大学の動物への使用、およびケア委員会（。プロトコルなし0407）によって承認された。
1。 Bdの感染症の検査
- BD用拭き取り
- 無菌綿棒で綿棒動物ventrumに5回、各太もも、それぞれの側、および45ストロークの合計各肢に5回。拭き取りは両生類の皮膚にBD用のサンプリングの非侵襲的な方法である。
- 静かに、DNAの最大量を綿棒で収集されていることを確認するために、ストロークの際との間で綿棒を回転させます。
- -20℃で1.5ミリリットルマイクロチューブに保管して綿棒
- DNA抽出および定量PCRアッセイ
- 動物の組織のための取扱説明書に従って、市販のDNA単離キットを使用してスワブからのゲノムDNAを抽出する。
- ボイル以下の定量的リアルタイムPCR（定量PCR）を用いて抽出したDNAを分析する
- DNA抽出サンプルを二重脱イオン水で1:10に希釈する。
- PCR阻害を防止するために、ウシ血清アルブミン（BSA）0.7μlを添加する。
- PCR阻害が結果に影響を与えていなかったことを確認するために、各サンプル中の内部陽性対照を含める。
- 正と負の制御と遊走子（感染症）の負荷を推定するための希釈一連の標準を使用して実行サンプル。
2。接種
- 文化のBd
- （40分間121°C）オートクレーブ処理し、冷却させ、1 Lの逆浸透水または脱イオン水に、10gのトリプトンを添加することによってトリプトンブロスを調製する。一度23℃に冷却し、1ミリリットルのペニシリン - ストレプトマイシンを追加します。
- Bdの株 （J. LongcoreからJEL411、PhyllomedusaキツネザルからGuabal、パナマから単離された）、23℃で7日間、リプトンブロスで成長
- Bを転送リプトンと寒天平板にロス文化。
- プレートを作るために、1Lの逆浸透または脱イオン水、オートクレーブ（40分間121℃）に10グラムのトリプトンと10グラム寒天を加える。
- オートクレーブ処理した混合物を、層流フードでは、タッチするのに十分なクールですが、それは凝固する前に、ペトリ皿に入れ、フル1/4-1/3たら。
- 寒天が完全に凝固し、冷却したときに、各プレートに0.5ミリリットルのBdブロスを追加し、プレートの周りに均等に分散。乾燥することができます。
- プレートは 、BD の遊走子、パラフィルムでシールプレートを接種したら。
- プレートは5〜7日、23℃でインキュベートすることができます。接種前に実行可能性を確保するために運動を遊走子確認してください。
- 遊走子接種ソリューションの洪水プレート
- Bdのインキュベーションおよび成長の5〜7日後に、エージング水道水5mlで各プレートをあふれさせると遊走子を10分間メディアを入力することができます。
- 遊走子suspeを注ぐポータブル容器にnsion。
- 血球計数器で遊走子濃度を推定。
- 高齢者水道水で3ミリリットル当たり1×10 6の濃度に混合物を希釈。
- 動物に接種
- 個々の50ミリリットルの容器では、そのventrum上で3ミリリットルの接種液を注ぐことにより、各動物に接種。余分な接種物接種用容器の底に滴下することができます。
- 各動物には感染を確実にするために24時間接種容器内に残ります。
- 接種の24時間後に、個々の消毒をterrariaに動物を戻す。
- 感染は2週間用にビルドすることができます。綿棒と定量PCRの結果の感染を確認し、治療を開始。
- BD-ネガティブコントロールの場合、5ミリリットルと洪水BD-フリーの寒天プレートは、上記と同じ方法を使用して、水道水、かつモック接種動物歳。
3。治療計画
- PREPA処理槽の再
- 1Lの両生類リンゲル液（ - 最小有効治療濃度0.0025％のイトラコナゾール）に2.50ミリリットルの水イトラコナゾール（1％イトラコナゾール内用液）を追加します。
- 両生類リンゲル溶液レシピ：1 Lの逆浸透水または脱イオン水、6.6グラムの塩化ナトリウム、0.15グラムの塩化カリウム、0.15グラムの塩化カルシウム、および0.2グラムの重炭酸ナトリウム。オートクレーブ溶液（40分間121°C）し、室温まで冷却する。
- 0.01％イトラコナゾール処理濃度については、1Lの両生類リンゲル液に10.00ミリリットル水イトラコナゾール（1％イトラコナゾール内用液）を追加
- 0.005％イトラコナゾール処理濃度については、1Lの両生類リンゲル液に5.00ミリリットルの水イトラコナゾール（1％イトラコナゾール内用液）を追加します。
- BD-陽性およびBD-ネガティブコントロールの場合、無イトラコナゾールと両生類のリンゲル液中の動物を入浴。
- 1Lの両生類リンゲル液（ - 最小有効治療濃度0.0025％のイトラコナゾール）に2.50ミリリットルの水イトラコナゾール（1％イトラコナゾール内用液）を追加します。
- 治療<OL>
- 処理液の35ミリリットルで消毒50ミリリットルの容器内の個々の両生類を配置します。
- 動物が完全に静かにコンテナを回転させることによって5分間カバーされていることを確認してください。
- 消毒しterrariaに動物を返します。 6日間繰り返します。
- 日間の治療上のBd感染の試験動物が始まる。
- テスト1週間の治療が終了した後のBd感染の動物、および感染がクリアされたことを確認するために4週間、週に一度。
バイオハザードとして4、BD
- 個々のterrariaを毎週消毒。
- 10％の漂白剤溶液浴中terrariaと治療コンテナを浴びる。
- 流水で二回、各漂白コンテナを洗浄します。
- 容器は再使用する前に24時間乾燥させます。
- クリーンニトリル手袋を着用し、交差汚染を防ぐために、動物を取り扱う際Bdは病原体の。各動物の取り扱いの間に手袋を変更します。
- 10％の漂白剤の解決策をもたらすことにより、廃棄前に、すべての液体廃棄物を消毒する。
- 可能性のある廃棄前にBdのにさらされているすべての固形廃棄物をオートクレーブ。
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Representative Results
すべての動物は、治療が終わった4週間後にBD-陰性であった場合は、イトラコナゾール治療が成功したと考えられた。治療が開始される前に、2週間接種後、全てのBD-接種した動物は、治療後4週が終了している間、BD-陽性対照動物は（16,765.12の平均遊走子負荷を持っていた、（17.34±）1,121.7の平均遊走子負荷で、感染していた）14643.08±。
Incilius nebuliferの治療（N = 15）が6日間、5分の日の0.0025％イトラコナゾール濃度のバスを使用して成功した。 （ 図1B）、多くの：BD-ポジティブコントロール（χ2,1 = 2.17、EXP（B）= 20,500、P = 0.339 Cox回帰）と比較した場合、イトラコナゾール治療のこの低濃度投与量は、死亡率に有意差は認められなかった誰は 、BDに感染した臨床試験の終了まで生存した。
0.0025％iの浴場11日間traconazole、および0.005％の両方と6日間0.0025％のイトラコナゾールは、全て（ 図1Aおよび1B）が有意に増加した11日間の治療期間のための推奨処理濃度とその半分の濃度を効果的かつ安全な治療の選択肢であることが見出されたBD-ポジティブコントロール（Cox回帰に比べて死亡率：2,1 = 35.68χ0.01％イトラコナゾール、EXP（B）= 307.54、P <0.01、0.005％のイトラコナゾール2,1 = 16.17χ、EXP（B）= 9.40はp <0.01）（ 図1A）。 11日間の0.01％イトラコナゾール治療はIに100％の死亡率を引き起こしたnebuliferは 、と半分濃度（11日間0.005％イトラコナゾール）を60％の死亡率（ 図1A）を引き起こした。治療中に死亡した動物の小さなサブセットのための剖検及び病理組織学的検査を行った。この研究には動物がツボカビで死亡していません。
図1。イトラコナゾール治療15全体の生存率の差（A）Incilius nebulifer：11 D処理（N =各イトラコナゾール0.01、0.005の濃度、および0.0025％のための15、N = 17、BD-陽性対照群のためであり、n = 9 Bdは陰性対照群）。 （B）Ⅰ。 nebulifer：（Bdは陰性対照群ではn = 15 0.01、0.005と0.0025％の各イトラコナゾール濃度についてはn = Bdは陽性対照群では17であり、n = 9）6dを治療。黒い矢印は、治療の最終日を示している。実線は対照群（黒= BD-陽性の、灰色= BD-ネガティブ）の生存を示す。破線はイトラコナゾール処置群の生存率を示している（薄い灰色の点= 0.01％、ミディアムグレードット= 0.005％、黒い点= 0.0025％のイトラコナゾール）。 （この図はBrannelly ら 15、図1Bおよび1Cから変更されている）。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
このプロトコルを用いて、我々は、安全かつ効果的に両生類でBdのためのイトラコナゾール処置の治療投与量と時間を削減することができた。最低治療用量および時間（6日間0.0025％）は無症状感染Iについて治療の成功だったnebulifer。低用量と治療時間の両方の有効性は、両生類のすべての種と年齢のクラスに使用すべき安全かつ効果的な治療法はまだありませんように 、BD 感染治療のための臨床治療試験の必要性を示しています。
イトラコナゾール処理から生じる死因は、この点11で不明である。剖検および組織病 理学は、中または直後Brannelly らで治療期間後に死亡した個体の小さなサブセットを行った。15研究。それは動物が死亡していないことは明らかであるが、これらの分析の結果は、死因に関して決定的だったツボカビの。適度な自己分解は、治療群間の微妙な違いを検出するために我々の能力に影響を与えた可能性があり、死亡と試料の保存の間に発生しました。
このプロトコルは1安全で効果的な治療計画の存在をサポートしていますが、今回のようなより多くの臨床試験が進行中である必要があります。第アゾール処理、ボリコナゾールは、少なくとも一種18に有効であることが実証されている。ボリコナゾールは、イトラコナゾールよりも水溶液中でより安定であり、オタマジャクシの使用18のために安全であることが実証されている。イトラコナゾールおよびボリコナゾールの単一の治療用量は価格設定に似ていますが、ボリコナゾールは、より定期的にイトラコナゾールを選択することが研究者やキャプティブマネジャーをリードし、イトラコナゾールよりも購入のためにはるかに高価である。このとき、一つだけ発表された研究は、効果的にボリコナゾール18の実証されています。有効性を実証するために、より多くの種がトライアルが行われる必要がある。
<Pクラス= "jove_content">アゾール抗真菌剤は、真菌の増殖を抑制する13抗真菌化学療法の1種類を表しています。 、BDが表皮でのBdを殺すことを目的と28℃、温熱療法を超える温度で、in vitroで殺されている真菌病原体を殺すだけでなく、成長を削減することを目指し、他の治療法があります。塩酸テルビナフィン、いくつかの種で19 Bdの感染症の治療に成功している代替的な抗真菌剤は、真菌細胞の溶解を引き起こすことによって機能する。直接病原体を攻撃する抗真菌剤は、より成功治療法とすることができ、より多くの仕事は 、BD 感染のための有望な治療の選択肢をテストするために行われる必要があります。イトラコナゾール処置は、無症状感染した動物において有効であることが示されているが、臨床ツボカビの処置は、ほとんど成功していた。日付20への唯一の1の研究では、成功し、末端治療している私 llの両生類、および治療は、電解療法と化学療法の組み合わせを積極的に関与する。末期症状の動物のための成功の治療の選択肢は、特にすべての個々の保護は種の保全に不可欠であるキャプティブ植民地で絶滅寸前の動物のために、必要とされている。
用量および治療 時間を減少させることI.成功であったがnebulifer、治療は臨床感染症、他の種や動物に試験的にされていません。いくつかの種やライフステージは、イトラコナゾール治療の不寛容であるため、大規模な治療計画を適用する前に、キャプティブ管理者は、安全性と有効性を、個人の小さなサブセット上の試用処理を判断する必要があります。治療終了後少なくとも4週間処置した動物を試験することは、低レベルの感染7の根絶を確保する必要がある、あらゆる治療計画の後に実施されるべきである。
両生類保全への取り組みのためにキャプティブ保証コロニー面積優先の BD感染症のための安全で効果的な治療の選択肢の確立テント">、BD自由コロニーを維持することは、絶滅の危機に種のための唯一の生命線である保全活動および捕獲コロニーの成功に不可欠である。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は、競合する経済的利益を宣言していません。
Acknowledgments
私は中の助けを実験計画を概念と素材を支援、治療レジメンと剖検を確立する助けA. Pessier分析し、MWHチャットフィールド、MJ Robak、K.タスカーとDレンゲルヘルプCLリチャーズ-Zawackiに感謝したいと思います研究室や撮影中にそのスペースを使用するためのサポートとタロンガ動物園でのM·マクファデンとP.ハーロウ。プロジェクトは、部分的に、LA Brannellyに授与ルイジアナ州環境教育委員会の許可を経てライフ·テクノロジーズによって野生生物水産ルイジアナ州省によって資金を供給された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Aqueous Itraconazole, Sporonox | Janssen Pharmaceutica Inc. | ||
| NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510-100 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sterile cotton swabs | Medical and Wire Equipment | MW113 | |
| 1.5 ml Microtubes | Sarstedt | 73.703.217 | |
| Qiagen DNEasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69581 | |
| 7500 Real-time PCR | Applied Biosystems | 4351104 | |
| VIC IPC | Applied Biosystems | 4308323 | |
| BSA | Applied Biosystems | AM2618 | |
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| Tryptone | Invitrogen | Q10029 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petri Dish | Sigma Aldrich | CLS430589 |
References
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