Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

العزلة والكمي لالبوتولينوم السموم العصبية من مصفوفات مجمع باستخدام مصفوفة BoTest فحوصات

Published: March 3, 2014 doi: 10.3791/51170
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1BioSentinel Inc., Madison, WI

Summary

البوتولينوم عصبي BoTest ماتريكس (بونت) فحوصات الكشف تنقية بسرعة وتحديد بونت من مجموعة من المصفوفات العينة. هنا، نقدم بروتوكول للكشف والقياس الكمي للبونت من المصفوفات سواء الصلبة والسائلة وإظهار مقايسة مع البوتوكس، والطماطم، والحليب.

Abstract

مطلوب كشف دقيق وتقدير حجم عصبي البوتولينوم (بونت) في مصفوفات معقدة للأدوية، والبيئية، واختبار عينة الغذاء. مطلوب السريع بونت اختبار المواد الغذائية خلال الطب الشرعي الفاشية، تشخيص المريض، واختبار سلامة الأغذية في حين أن المطلوب دقيقة اختبار فاعلية لتصنيع المنتجات القائمة على المخدرات بونت وسلامة المرضى. الأحيائي الماوس تستخدم على نطاق واسع لاختبار بونت هي حساسة للغاية لكنه يفتقر الى الدقة والإنتاجية اللازمة لاختبار بونت السريع والروتينية. وعلاوة على ذلك، أدى استخدام الأحيائي في الحيوانات في المكالمات من قبل السلطات التنظيمية المنتج المخدرات وأنصار حقوق الحيوان في الولايات المتحدة والخارج ليحل محل الماوس الأحيائي لاختبار بونت. وقد وضعت عدة فحوصات في المختبر الغيار التي تعمل بشكل جيد مع تنقيته بونت في مخازن بسيطة، ولكن لم يظهر معظم لتكون قابلة للتطبيق لاختبار المصفوفات في معقدة للغاية. هنا، وبروتوكول للكشف عنويرد في مصفوفات معقدة بونت باستخدام مصفوفة BoTest المقايسات. يتكون الاختبار من ثلاثة أجزاء: الجزء الأول يشمل إعداد العينات للاختبار، والجزء الثاني هو خطوة مناعي استخدام الألغام المضادة للبونت المغلفة الأضداد الخرز ممغطس لتنقية بونت من المصفوفة، والجزء الثالث الكمي بروتين المعزول بونت ل النشاط باستخدام مراسل الفلورة. يتم كتابة بروتوكول للاختبار إنتاجية عالية في لوحات 96 جيدا باستخدام المصفوفات سواء السائلة والصلبة ويتطلب حوالي 2 ساعة إعداد دليل بإجمالي مرات الفحص من 4-26 ساعة اعتمادا على نوع العينة، تحميل السم، وحساسية المطلوب. يتم عرض البيانات لبونت / A الاختبار مع الفوسفات مخزنة المالحة، وهو منتج المخدرات، والثقافة طاف والحليب 2٪، والطماطم الطازجة ويتضمن مناقشة المعايير الضرورية للنجاح الفحص.

Introduction

أعصاب البوتولينوم (BoNTs) هي المواد المعروفة فتكا، بجرعات قاتلة الإنسان في الوريد تقدر ب 1-3 نانوغرام / كغ 1،2. سبعة الأنماط المصلية مماثلة هيكليا من بونت، وصفت من A إلى G، موجودة، يتألف كل منها من سلسلة مجال الثقيلة مسؤولة عن خلية ملزمة، امتصاص، وإزفاء في العصارة الخلوية وسلسلة الضوء الذي يشفر ببتيداز داخلية الزنك 3-5. سمية رائعة من بونت النتائج من، في جزء منه، دخولها ملزمة ومحددة في الخلايا العصبية الحركية عند تقاطع العصبية والعضلية 6. مرة واحدة داخل الخلايا العصبية، وعلى وجه التحديد ببتيداز داخلية سلسلة ضوء يشق واحد أو أكثر من ذوبان N-تراعي ethylmaleimide البروتين عامل مرفق مستقبلات (فخ) البروتينات اللازمة لحويصلة الانصهار، مما يعوق الافراج عن العصبي ويؤدي إلى الشلل الرخو 7-14. والمعروف باسم مرض "التسمم الغذائي"، شلل الحجاب الحاجز والعضلات الوربية التي كتبها بونت يؤدي في النهاية إلىوردت فشل الجهاز التنفسي والموت ما لم التشخيص المبكر والعلاج.

ويرتبط المنقولة بالغذاء الإنسان التسمم الغذائي الأكثر شيوعا مع بونت الأنماط المصلية A، B، E، F و(بونت / A، بونت / B، الخ) وعادة ما ينتج عن تناول الأغذية الملوثة 15،16، على الرغم من، العديد من حالات التسمم الغذائي الجرح ولم يبلغ عن وبين متعاطي المخدرات عن طريق الحقن الوريدي 17،18. في الولايات المتحدة، والتسمم الرضع الناتجة عن ابتلاع الجراثيم كلوستريديوم من قبل الأطفال الذين تقل أعمارهم عن واحد هو الشكل الأكثر شيوعا من التسمم الغذائي 19-21. ومع ذلك، تم الإبلاغ عن تفشي المنقولة بالغذاء بونت الناتجة عن غير لائق تعليب المنزل وتجهيز الأغذية في كل من الولايات المتحدة والخارج. بين 2000-2009، تم الإبلاغ عن 338 حالة على الأقل من التسمم المنقولة بالأغذية في جميع أنحاء العالم بما في ذلك ستة قتلى 22. القدرة بسرعة وحساسية للكشف عن تفشي التسمم الغذائي المنقولة عن طريق الأغذية هو مؤشر الحرجة التي يمكن أن تساعد التشخيص المبكر 23،24. وعلاوة على ذلك، فإن طرق الكشف التي تسمح فعالة من حيث التكلفة واختبار الأغذية الروتينية تؤدي إلى تحسين الأمن الغذائي.

خصوصية بونت في الخلايا العصبية وطويلة العمر النصفي البيولوجي أيضا يجعلها العلاجية القوية. في الولايات المتحدة، يتم الموافقة على المخدرات استنادا بونت من قبل إدارة الغذاء والدواء لعلاج الحالات مستحضرات التجميل والاضطرابات العصبية والعضلية ذات الصلة بما في ذلك خطوط المقطب، خلل التوتر عنق الرحم، والصداع النصفي، وفرط نشاط المثانة، والحول. يتم توثيق العديد من التطبيقات "غير الرسمي"، بما في ذلك العلاجات جرعة عالية لضعف شديد في العضلات 25-28. دقيقة السم الكمي هو أمر حاسم لالجرعات الصحيحة، كما underdosing قد يؤدي إلى العلاج غير فعال بينما الجرعة الزائدة يضع المرضى المعرضين لخطر الآثار الجانبية الضارة المحتملة. للأسف، يتم تقاسم أي بروتوكول رجولية فحص موحدة عبر الشركات المصنعة، مما أدى إلى عدم المساواة بين الم Ù حدة تعريف المخدرات استنادا بونت-سنت 29-31.

معيار اختبار لبونت هو الأحيائي الماوس التي يتم حقن عينات بونت التي تحتوي على الغشاء البريتونى في الفئران وأعداد الوفيات المسجلة خلال 1-7 أيام 16،32،33. الأحيائي الماوس حساس جدا مع حدود الكشف (اللد) من 5-10 خريج بونت / A 34، ولكن المخاوف الأخلاقية على استخدام الحيوانات، والتكلفة العالية لتدريب الموظفين والحفاظ على مرافق الحيوان، مرات الفحص طويلة، وعدم وجود أدت بروتوكولات موحدة في المكالمات لتطوير موحدة، خالية من الحيوان بونت الاختبار وطرق القياس الكمي 35-39. مؤخرا، تم تطوير عدة أساليب القياس الكمي بونت البديلة التي توفر الماوس أو شبه الماوس الأحيائي حساسية 40-49. هذه الأساليب عادة ما تستخدم مضان، مطياف الكتلة، أو أساليب المناعية وتقديم مرات الفحص أقصر بكثير من الماوس الأحيائي بدون استخدام الحيوانات. مطياف الكتلة جنبا إلى جنب مع النهج techniq المناعيةعرضت شركة نظام الطاقة الموحد لكشف وتحديد بونت الواردة في المواد الغذائية وعينات أخرى معقدة، ولكن، ومتطلبات تدريب الموظفين والحد من المعدات المتخصصة هذه المقايسات 50-55. معظم فحوصات أخرى بديلة غير قابلة للتطبيق بسهولة لاختبار عينة معقدة أو تفتقر إلى الإنتاجية المطلوبة للاختبار الروتيني بونت. طبيعة متغير بدرجة كبيرة من اللزوجة عينة الغذاء، ودرجة الحموضة ومحتوى الملح، ومكونات المصفوفة يمثل تحديا صعبا خصوصا عندما تحاول تطوير أساليب الفحص في المختبر مع حساسية لتتناسب مع قوة متطرفة من بونت. وعلاوة على ذلك، حتى الأنظمة الوقائية بسيطة وحميدة نسبيا، مثل تلك الناجمة عن إعادة تعليق من المنتجات القائمة على المخدرات بونت، تحتوي على الملح، والزلال، والسكر مثبتات (أي السواغات) التي تؤثر بشكل كبير في المختبر بونت رجولية 56. مطلوب تنقية السم لاختبار دقة النشاط من جميع ولكن أبسط من عينات 56-59.

الوقد صممت BoTest المقايسات مصفوفة لالسريع، والإنتاجية العالية، وتقدير ثابت من بونت من عينات معقدة للغاية باستخدام المعدات التي توجد عادة في مختبرات البحوث 56،60. هذه المقايسات استخدام حبات ممغطس مرتبطة تساهميا لالمصلي محددة الأجسام المضادة للبونت لربط وعزل بونت من عينة ثم قم بإزالة التدخل مركبات المصفوفة عن طريق الغسيل. بعد الغسيل، ثم يتم كميا المقيدة النشاط بروتين بونت في رد فعل العازلة الأمثل باستخدام مراسل متوافقة مع النمط المصلي بونت التي يجري اختبارها. هذه هي بروتينات صحفيين الفلورة تتكون من السماوي N-محطة البروتين الفلوري (CFP) شاردة وبروتين فلوري الصفراء المشتقة-C محطة (فينوس) شاردة ويربطها به الركيزة بونت، وبقايا SNAP25 141-206 أو بقايا synaptobrevin 33-94 تشكل BoTest A / E أو B / D / F للصحفيين / G، على التوالي 45. ويتم رصد مراسل الانقسام من قبل بونت باستخدام فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق). عندما رانه مراسل سليمة، إثارة CFP النتائج في الحنق الى كوكب الزهرة، التبريد والانبعاثات CFP الانبعاثات فينوس مثيرة. الانقسام لمراسل بواسطة بونت يمنع الحنق، مما يؤدي إلى زيادة في الانبعاثات CFP وانخفاض في الانبعاثات فينوس. ويمكن بعد ذلك أن يقاس النشاط بونت كميا باستخدام نسبة من انبعاثات CFP والزهرة. اللد أقل من 3 خريج ممكنة من مجموعة واسعة من الأطعمة باستخدام 96 جيدا شكل عالية الإنتاجية لوحة 56. ويمكن الحصول على زيادة الحساسية باستخدام حجم العينة أكبر منذ مقايسة يسمح تركيز السامة على سطح حبة.

تم تطوير المقايسات مصفوفة BoTest لBoNTs A، B، E، F واختبارها ومع المواد الغذائية والأدوية، والعينات البيئية 56،60. هنا، نحن تصف إجراءات لتنفيذ هذه المقايسات للكشف عن بونت في التعقيد منخفضة (مثل الأدوية، وبونت في المخزن) وعالية التعقيد (مثل المواد الغذائية والبيئية) العينات. طرق المعالجة محددةلتتم معالجتها عدة أنواع العينة في هذا البروتوكول، وأنواع العينات وليس وصفها هنا عادة ما يمكن تكييفها باستخدام مزيج من الأساليب المقدمة. وقد تم تطوير بروتوكول واختبارها مع بونت / A ولكن قابلة للتكيف مع الأنماط المصلية بونت أخرى باستخدام المقايسات الخاصة بها كما هو موضح في أماكن أخرى 56،60.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الفحص الكواشف

  1. ذوبان الجليد dithiothreitol 200X (DTT)، 10X ماتريكس تجليد العازلة (10X العازلة ملزم الآخرة)، 10X تحييد العازلة (عينات غير متوازن الطعام أو درجة الحموضة فقط)، و 10x BoTest رد فعل العازلة (10X العازلة رد فعل الآخرة) في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 15 دقيقة أو حتى تحسنت تماما. انظر الجدول رقم 1 للحصول على قائمة من مخازن والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول. انظر الجدول رقم 2 للحصول على قائمة من المواد والمعدات اللازمة لهذا البروتوكول.
  2. دوامة المخازن المؤقتة لإذابة 5 ثانية إلى المزيج. 10X تحييد العازلة، 200xDTT، و 10x العازلة رد فعل يجب أن تظهر واضحة في حين أن العازلة ملزمة 10X سوف يكون له مظهر غائم. تدفئة العازلة رد فعل 10X لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية وكرر vortexing لحالة ظهوره غائم التالية الذوبان.
  3. توليد 3.8 مل من العازلة رد فعل 1X.
    1. تسمية 15 مل المخروطية أنبوب "1X العازلة رد فعل" وإضافة 3.42 مل البيولوجيا الجزيئية الصف واتإيه، 380 ميكرولتر 10X العازلة رد فعل، و 19 ميكرولتر 200X DTT. تخلط جيدا العازلة انعكاس.
    2. لا يجوز مثبطات قطع احدة خالية من EDTA قرص مثبط البروتياز في أرباع باستخدام شفرة حلاقة نظيفة وإضافة ربع قرص إلى المخزن المؤقت رد الفعل 1X (يمكن تخزين الجزء المتبقي لوحي في 4 درجات مئوية لاستخدامها في وقت لاحق). NB البروتياز يكون من الضروري في حالة استخدام السم المنقى ومخازن بسيطة (مثل عينات الأدوية).
    3. دوامة المخزن المؤقت رد الفعل 1X حتى يذوب تماما قرص البروتيني.
  4. تدفئة حبات مصفوفة A (IP-A حبات الآخرة) لمدة 20 دقيقة في RT.
  5. ذوبان الجليد مراسل BoTest A / E (A / E مراسل الآخرة) في RT محمية من الضوء.
  6. تسمية أنبوب 15 مل المخروطية "0.5 ميكرومتر مراسل A / E" وإضافة 45 ميكرولتر من 20 ميكرومتر الأسهم مراسل A / E إلى 1.8 مل 1X رد فعل العازلة. مزيج دقيق من قبل pipetting وتخزينها على الجليد محمية من الضوء.

2. موقفارض الجيل المنحنى عينة

منحنى القياسية الموضحة هنا يمتد 10-30،000 MLD 50 / ز الطعام أو في المخزن المؤقت مل التخفيفات في سجل نصف (الجدول 3). المستخدم النهائي هو حر في استخدام تركيزات بديلة حسب مقتضى الحال.

  1. ارتفاعه واحتضان المصفوفات مع المواد المرجعية. توليد منحنى القياسية باستخدام مخفف من نفس المصفوفة كما المجهول، إذا كان ذلك ممكنا، للحد من الآثار مصفوفة. استخدام الجيلاتين العازلة الفوسفات (الباوند) أو الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) باعتبارها مخفف إذا إضافية، مصفوفة بونت سلبية ليست متاحة (مثل حقل أو بونت اندلاع اختبار العينة). توليد منحنى القياسية من خلال ارتفاعه بونت / A في مصفوفة الاختيار التالية البروتوكول المناسب أدناه.
    1. عينات منخفضة التعقيد (مثل برنامج تلفزيوني، الباوند، أو الأدوية)
      1. إضافة 10 مل من العازلة المناسبة للأنبوب 15 مل المخروطية وتوضع جانبا. وسوف تستخدم هذه العينة كما مخفف للالقياسيهد منحنى والتخفيفات غير معروف (القسم 4).
      2. إضافة 1.2 مل العازلة لأنبوب microcentrifuge.
      3. تنبيه: يستخدم هذا خطوة بونت ويجب توخي الحذر الشديد عند التعامل مع والتخلص من أي الكواشف والمواد التي تأتي في اتصال مع السم. يجب أن يتم تنفيذ استخدام معدات الوقاية الشخصية والتخلص السليم من جميع المواد وفقا لوزارة الخارجية الأمريكية من المبادئ التوجيهية OSHA العمل لبونت (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html). إضافة بونت / ألف لعينة 1.2 مل من هذا القبيل أن تركيز النهائي هو 30،000 MLD 50 / مل (36،000 MLD 50 المجموع).
    2. عينات المواد الغذائية السائلة (أو عينات السائل المعقدة الأخرى) ملاحظة: سوف ينصح الاختبار الأولي لتحديد حجم طاف تعافى من عينات أوضح باسم الجسيمات (. مثل اللب) في مصفوفات السائل تختلف. هذا البروتوكول يفترض على الأقل 1.2 مل من طاف أوضح سيتم استردادها من 1.4 مل عصيدةجنيه. زيادة حجم العينة إذا لزم الأمر.
      1. إضافة 10 مل الغذائية السائلة إلى أنبوب مخروطي 15 مل وضعه جانبا. وسوف تستخدم هذه العينة كما مخفف لمنحنى القياسية والتخفيفات غير معروف (القسم 4).
      2. تزن فارغة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge وتسجيل كتلته.
      3. إضافة 1.4 مل من المواد الغذائية السائلة إلى أنبوب microcentrifuge وزنه.
      4. Reweigh في أنبوب microcentrifuge وحساب كتلة العينة الغذائية المضافة من خلال طرح كتلة أنبوب فارغ.
      5. تنبيه: يستخدم هذا خطوة بونت ويجب توخي الحذر الشديد عند التعامل مع والتخلص من أي الكواشف والمواد التي تأتي في اتصال مع السم. يجب أن يتم تنفيذ استخدام معدات الوقاية الشخصية والتخلص السليم من جميع المواد وفقا لوزارة الخارجية الأمريكية من المبادئ التوجيهية OSHA العمل لبونت (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html). إضافة بونت / ألف لعينة 1.4 مل في تركيز النهائي من 30،000 MLD 50 / ز الغذائية.
      6. Incubaالشركة المصرية للاتصالات ومخفف وارتفعت عينات في RT أو 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة لإعطاء الوقت بونت للتفاعل مع مصفوفة المواد الغذائية، ومحاكاة لتلوث الطبيعية.
    3. عينات المواد الغذائية الصلبة (أو عينات صلبة أخرى) ملاحظة: من المستحسن اختبار الأولية لتحديد حجم طاف تعافى من عينات متجانسة وأوضح بعد إضافة 1 مل الباوند / ز الغذائية. يفترض هذا البروتوكول الذي لا يقل عن 1.2 مل أوضح سيتم استردادها طاف من عينة 2 غرام. زيادة حجم العينة إذا لزم الأمر.
      1. تزن من 10 جم العينة الصلبة في أنبوب مخروطي 50 مل وتوضع جانبا. وسوف تستخدم هذه كما مخفف.
      2. تزن 2 غرام من عينة الطعام الصلب في الثانية 50 مل أنبوب مخروطي.
      3. تنبيه: يستخدم هذا خطوة بونت ويجب توخي الحذر الشديد عند التعامل مع والتخلص من أي الكواشف والمواد التي تأتي في اتصال مع السم. استخدام معدات الوقاية الشخصية والتخلص السليم من جميع الموادو يجب أن يتم طبقا لوزارة الخارجية الأمريكية من المبادئ التوجيهية OSHA العمل لبونت (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html). إضافة بونت / ألف لسطح 2 غرام عينة لتركيز النهائي من 30،000 MLD 50 / ز الغذائية (60،000 مجموع MLD 50).
      4. احتضان مخفف وعينات ارتفعت في RT أو 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة لإعطاء الوقت بونت للتفاعل مع مصفوفة المواد الغذائية، ومحاكاة لتلوث الطبيعية.
  2. تجانس العينة وعازلة التعديل. معالجة العينة منحنى القياسية ارتفعت ومخفف إنشاؤها أعلاه وفقا لنوع العينة.
    1. عينات قليلة التعقيد
      1. لا مزيد من المعالجة عينة أمر ضروري.
    2. عينات المواد الغذائية السائلة (أو عينات السائل المعقدة الأخرى)
      1. لا تجانس العينة هو ضروري.
      2. إضافة 140 ميكرولتر العازلة 10X تحييد إلى 1.4 مل ارتفعت العينة و1 مل 10X Neutralizatأيون العازلة للعينة مخفف 10 مل. مزيج جيد من قبل عينات انقلاب.
      3. توضيح جزئيا على حد سواء عينات بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 6،000 x ج و 4 درجة مئوية. على الفور إزالة supernatants ونقل إلى أنابيب جديدة.
    3. عينات المواد الغذائية الصلبة (أو عينات الصلبة الأخرى)
      1. إضافة 2 مل الباوند (1 مل الباوند / ز الغذاء) إلى 2 غرام بونت /-ارتفعت عينة الطعام الصلب و 10 مل الباوند إلى 10 غرام عينة مخفف.
      2. التجانس العينات باستخدام مدقة حتى المخلوطة جيدا. اعتمادا على طبيعة العينة، قد يكون هناك قطع صغيرة من المواد التي لا يمكن المتجانس، الذي هو مقبول. بالتناوب، يمكن استخدام أساليب تجانس الميكانيكية. لا ينصح استخدام الخلاط لأنه قد يعطل وكذلك aerosolize السم.
      3. إضافة حجم 1/10th من 10X تحييد العازلة للعينة مخفف على أساس إجمالي حجم تقريبي (مثلا 2 مل وإذا كان حجم هو 20 مل). قدر إستقرائياالحجم الكلي لل/ عينة بونت-A ارتفعت وإضافة حجم 1/10th من 10X العازلة تحييد. مزيج جيد من قبل عينات انقلاب.
      4. توضيح جزئيا على حد سواء عينات بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 6،000 x ج و 4 درجة مئوية. على الفور إزالة supernatants ونقل إلى أنابيب جديدة.
  3. إعداد منحنى التخفيفات التسلسلي القياسية للاختبار
    1. باستخدام بونت /-ارتفعت عينة منحنى القياسية كما D1 والعينة nonspiked كما مخفف، وتوليد ما تبقى من العينات المنحنى القياسي في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge وفقا للجدول 3.

3. تحضير العينات غير معروف

هذا القسم يمكن أن تكتمل بالتوازي مع القسم 2.

  1. تحديد عدد والتخفيفات من المجاهيل. اختبار مجهولين في ثلاث نسخ إن أمكن.
    1. لفحوصات النوعية، تشغيل المجهولة دون أي تخفيف مزيد من المطلوب لمعالجة العينة كما descriسرير أدناه.
    2. لفحوصات الكمي، وإعداد ما لا يقل عن اثنين من 1:10 عينات التخفيف، كما هو موضح أدناه، لضمان أن العينات واحد أو أكثر تقع ضمن مجموعة خطية من استجابة الفحص. توليد التخفيفات باستخدام مخفف من نفس المصفوفة كما المجهول، إذا كان ذلك ممكنا، للحد من الآثار مصفوفة كما هو موضح في القسم 3. خلاف ذلك، استخدم برنامج تلفزيوني أو الباوند كما مخفف.
  2. توليد وتمييع عينات غير معروفة وفقا لنوع العينة.
    1. المجهولة قليلة التعقيد (مثل برنامج تلفزيوني، الباوند، أو الأدوية)
      1. إضافة 750 ميكرولتر على الأقل غير معروفة لأنبوب microcentrifuge لتوليد غير معروف التخفيف 1.
      2. إضافة 675 ميكرولتر مخفف لاثنين من أنابيب microcentrifuge المسمى غير معروف التخفيف 2 و 3. سوف يكون مخفف نفس المواد المستخدمة لتوليد منحنى القياسية.
      3. متسلسل تمييع التخفيف 1 عن طريق نقل 75 ميكرولتر من التخفيف 1 في أنبوب التخفيف 2 والاختلاط.
      4. مخفف متسلسله التخفيف 2 عن طريق نقل 75 ميكرولتر من التخفيف 2 في أنبوب التخفيف 3 والاختلاط.
    2. المجاهيل الغذائية السائلة (أو عينات السائل المعقدة الأخرى) ملاحظة: من المستحسن اختبار الأولية لتحديد حجم طاف تعافى من عينات أوضح كما نوقش في القسم 3. زيادة حجم العينة إذا لزم الأمر.
      1. إضافة ≥ 875 ميكرولتر من المجهول السائل إلى أنبوب microcentrifuge.
      2. إضافة حجم 1/10th من 10X تحييد العازلة للعينة (على سبيل المثال 87.5 ميكرولتر لعينة ميكرولتر 875).
      3. توضيح جزئيا العينة بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 6،000 x ج و 4 درجة مئوية. ونقل على الفور طاف لأنبوب جديد. هذا هو غير معروف التخفيف 1.
      4. إضافة 675 ميكرولتر مخفف لاثنين من الأنابيب المسمى غير معروف التخفيف 2 و 3. سوف يكون مخفف المواد المصنعة نفسها المستخدمة لتوليد منحنى القياسية.
      5. متسلسل تمييع التخفيف 1 عن طريق التحويلحلقة 75 ميكرولتر من التخفيف 1 في أنبوب التخفيف 2 والاختلاط.
      6. متسلسل تمييع التخفيف 2 عن طريق نقل 75 ميكرولتر من التخفيف 2 في أنبوب التخفيف 3 والاختلاط.
    3. المجاهيل الصلبة الطعام (أو عينات صلبة أخرى) ملاحظة: من المستحسن اختبار الأولية لتحديد حجم طاف تعافى من عينات أوضح كما نوقش في القسم 3. زيادة حجم العينة إذا لزم الأمر.
      1. تزن 2 غرام من عينة مجهولة الصلبة في أنبوب مخروطي 50 مل.
      2. إضافة 2 مل الباوند (1 مل الباوند / ز الغذاء) إلى 2 غرام العينة الصلبة.
      3. التجانس العينات كما هو موضح في القسم 3.2.3.2.
      4. إضافة حجم 1/10th من 10X العازلة تحييد لعينة بناء على الحجم الإجمالي التقريبي (على سبيل المثال 0.4 مل وإذا كان حجم هو 4 مل). مزيج جيد من قبل عينات انقلاب.
      5. توضيح جزئيا العينة بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 6،000 x ج و 4 درجة مئوية. فورانقل ذ ≥ 750 ميكرولتر طاف لأنبوب microcentrifuge. هذا هو غير معروف التخفيف 1.
      6. إضافة 675 مل مخفف لاثنين من الأنابيب المسمى غير معروف التخفيف 2 و 3. سوف يكون مخفف المواد المصنعة نفسها المستخدمة لتوليد منحنى القياسية.
      7. متسلسل تمييع التخفيف 1 عن طريق نقل 75 ميكرولتر من التخفيف 1 في أنبوب التخفيف 2 والاختلاط.
      8. متسلسل تمييع التخفيف 2 عن طريق نقل 75 ميكرولتر من التخفيف 2 في أنبوب التخفيف 3 والاختلاط.

4. النهائي توضيح عينة

إذا اختبار السائل أو عينات المواد الغذائية الصلبة، الطرد المركزي جميع العينات لمدة 5 دقائق في ≥ 14،000 XG في microcentrifuge لتوضيح بشكل كامل العينات. على الفور إزالة supernatants ونقل إلى أنابيب جديدة.

5. إعداد لوحة وبونت / A هدم

  1. تخطيط لوحة محددة هي تطبيق يعتمد، ومع ذلك، لا تستخدم الآبار خارج ذلكلتجنب آثار الحافة. يتطلب كل عينة مجهولة والعينة القياسية منحنى D1-D8 3 آبار في حين يتطلب عينة D9 6 آبار. ويرد تخطيط لوحة اقترح في الشكل 1.
  2. إضافة 20 ميكرولتر 10X العازلة ملزمة إلى كل بئر لاستخدامها.
  3. إضافة 200 ميكرولتر من كل تخفيف توضيح وغير معروفة إلى كل من ثلاثة آبار (ستة آبار لD9) لاختبار ثلاث نسخ. مزيج لوحة لمدة 10 ثانية على خلاط صفيحة ميكروسكوبية.
  4. إضافة IP-A الخرز.
    1. دوامة حبات IP-A لمدة 10 ثانية على أعلى سرعة. تواصل vortexing لإذا لم يتم معلق الخرز كاملة ومتجانسة.
    2. ماصة 20 ميكرولتر IP-A حبات لكل عينة جيدا.
    3. مزيج لوحة لمدة 30 ثانية على خلاط صفيحة ميكروسكوبية.
  5. احتضان لوحة باستخدام لوحة حاضنة الدورية لمدة 2 ساعة عند 750 دورة في الدقيقة، 25 ° C أو RT. أداء الاختبار هو تعتمد اعتمادا كبيرا على توليد والحفاظ على-A IP التعليق حبة خلال جميع الخطوات الحضانة. Resuspend الخرز دائما مع micropأواخر خلاط بعد التكوير والحفاظ على وقف استخدام وحة microtiter المداري شاكر خلال جميع الخطوات الحضانة.

6. غسل لوحة والخرزة إعادة تعليق

  1. تغسل الصحون إما باليد أو باستخدام حبة متوافق المغناطيسي لوحة الآلي غسالة. لوحة غسالة آلية تكوين لحبات المغناطيسي يزيد كثيرا مقايسة الإنتاجية.
    1. دليل الغسل
      1. تسمية أنبوب 50 مل المخروطية "غسل 1X العازلة" وإضافة 45 مل البيولوجيا الجزيئية المياه الصف و 5 مل 10X ماتريكس غسل العازلة. تخلط جيدا العازلة انعكاس.
      2. إزالة لوحة من لوحة الدورية الحاضنة.
      3. وضع لوحة على الفور على 96 حبة جيدا المغناطيسي لوحة الفصل لمدة 5 دقائق.
      4. مع الحفاظ على لوحة على 96 لوحة جيدا الانفصال حبة المغناطيسي، وإزالة بلطف وتجاهل supernatants من الآبار العينة باستخدام ماصة واحد أو متعدد القنوات. لا نضحالخرز بصريا رصد العازلة يستنشق في الطرف ماصة لإزالة حبة عرضي. إذا شهدت إزالة، إضافة بلطف محتويات طرف إلى البئر، reseparate، وتكرار الإزالة.
      5. إضافة 300 ميكرولتر 1X العازلة غسل لكل عينة جيدا.
      6. في resuspend تماما الخرز عن طريق خلط لوحة لمدة 30 ثانية على خلاط صفيحة ميكروسكوبية.
      7. احتضان لوحة في 96 جيدا حبة المغناطيسي لوحة الفصل لمدة 2 دقيقة.
      8. إزالة وتجاهل supernatants من العينة الآبار كما كان من قبل.
      9. كرر الخطوات من 6.1.1.5-6.1.1.8 ثلاث مرات أكثر ليصبح المجموع 4 يغسل.
      10. مع لوحة على 96 حبة جيدا المغناطيسي لوحة الانفصال، تفقد البصر الآبار لتأكيد حتى إزالة طاف، واستخدام ماصة لإزالة العازلة المتبقية الزائدة عند الضرورة. ستبقى بعض عازلة في الآبار ويجب توخي الحذر لتجنب إزالة حبة حبة أو التجفيف.
      11. إضافة 50 ميكرولتر 1X العازلة رد فعل على كل عينة جيدا وتخلط لوحة لمدة 30 حد ذاتهج على خلاط صفيحة ميكروسكوبية ل resuspend تماما الخرز. إذا لزم الأمر، واستخدام ماصة ل resuspend تماما الخرز.
    2. غسل لوحة الآلي
      1. الإعداد وبرنامج الغسالة وفقا للجدول 4. نظيفة وتدفق غسالة ذات جودة عالية (على سبيل المثال nanopure) المياه.
      2. رئيس الغسالة عن طريق تشغيل برنامج "رئيس".
      3. إزالة لوحة من لوحة الدورية الحاضنة.
      4. وضع لوحة على الفور على 96 حبة جيدا المغناطيسي لوحة الفصل على لوحة غسالة.
      5. تشغيل البرنامج رابط "غسل ماستر". الخطوة الأولى هي برنامج خطوة الحضانة 5 دقائق حيث غسالة ستكون ثابتة.
      6. بعد إتمام البرنامج، وإزالة لوحة من الغسالة، إضافة 50 ميكرولتر 1X العازلة رد فعل على كل عينة جيدا، وتخلط لوحة لمدة 30 ثانية على خلاط صفيحة ميكروسكوبية ل resuspend تماما الخرز. إذا لزم الأمر، واستخدام ماصة ل resuspend تماما الخرز.

    7. بدء فحص والحضانة

    1. إضافة 50 ميكرولتر 0.5 ميكرومتر مراسل A / E (انظر القسم 1) لكل عينة وتخلط جيدا لمدة 30 ثانية على خلاط صفيحة ميكروسكوبية ل resuspend تماما الخرز.
    2. إضافة 100 ميكرولتر المياه إلى كل بئر غير المستخدمة على لوحة لمنع الآثار الحافة.
    3. ختم اللوحة مع لوحة ختم الشريط واحتضان لوحة باستخدام لوحة الدورية حاضنة في 750 دورة في الدقيقة، 25 ° C أو RT. حماية لوحة من الضوء أثناء الحضانة.

    8. جمع البيانات وتحليلها

    ملاحظة: هذا الاختبار هو الاختبار في الوقت الحقيقي التي يمكن قياسها عدة مرات حتى يتم الحصول على حساسية المطلوب، لا توجد الكواشف توقف المطلوبة. أوصت مرات القراءة الأولية هي 2، 4، و 24 ساعة وقت الحضانة مع حساسية مقايسة مع زيادة فترة حضانة.

    1. جمع البيانات
      1. في كل مرة يقرأ، وإزالة لوحة من لوحة الدورية حاضنة، وإزالة الختمالشريط جي، ووضع على الفور لوحة على ال 96 جيدا حبة المغناطيسي لوحة الفصل. السماح حبات لفصل لمدة 2 دقيقة.
      2. وضع لوحة في قارئ صفيحة ميكروسكوبية وقياس الانبعاثات في ~ 470 ~ 526 نانومتر وتحت الإثارة في ~ 434 نانومتر.
      3. إذا كنت تريد قراءة مرات إضافية، resuspend والخرز لمدة 30 ثانية على خلاط صفيحة ميكروسكوبية، ختم لوحة، والعودة لوحة لوحة الدورية الحاضنة.
    2. تحليل البيانات
      1. حساب نسبة الانبعاثات لكل عينة بقسمة حدة مضان النسبي (RFU) القيمة عند 526 نانومتر من قيمة RFU في 470 نانومتر.
      2. مؤامرة نسبة الانبعاثات مقابل سجل [بونت / A] لنقاط البيانات منحنى القياسية. اعتمادا على بونت / A رجولية مجموعة اختبار، وسيتم الحصول على منحنى الاستجابة للجرعة السيني (انظر نتائج الممثل).
      3. احتواء البيانات منحنى القياسية مع المنحدر متغير منحنى الاستجابة للجرعة Y = أسفل + (أعلى أسفل) / (1 ​​+10 ^ ((logEC 50-X) * Hillslope)) حيث X هووغاريتم تركيز، Y هو استجابة لذلك، ويبدأ Y في أسفل ويذهب إلى أعلى مع شكل السيني.
      4. تحديد حدود الكشف (اللد)، حدود الكمي (LOQ)، والتركيز الفعال نصف القصوى (EC 50). يتم تعريف حدود الكشف على عينة وجود نسبة الانبعاثات أقل من 3 انحرافات معيارية (الانحرافات المعيارية) دون ضوابط فارغة (ن = 6). يتم تعريف حدود الكمي كعينة وجود نسبة الانبعاثات أقل من 10 الانحرافات المعيارية دون ضوابط فارغة (ن = 6). EC 50 يتم تحديد من السيني الاستجابة للجرعة منحنى مناسبا.
      5. أقحم قوة من أي عينات غير معروفة ضد الاستجابة للجرعة منحنى القياسية السيني.
        1. للحصول على نتائج الكمي، ينبغي أن تندرج في عينة مجهولة من الناحية المثالية داخل الجزء خطية من المنحنى القياسي. تقريب جزء خطية من منحنى القياسية عن طريق حساب مجموع نافذة استجابة فحص 20-80٪ (على سبيل المثال إذا كانت نسبة الانبعاثات من منحنى ص القياسيةفي نفس الفئة 0،5-2،5، ومجموعة الخطي سيكون جزء من منحنى القياسية التي تتراوح 0،9-2،1).
        2. للحصول على نتائج النوعية، مقارنة عينة مجهولة ضد اللد وLOQ من منحنى القياسية.
        3. لا استقراء عينات غير معروفة خارج حدود منحنى القياسية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويظهر رسم تخطيطي يلخص الخطوات في البروتوكول هو موضح في الشكل 2. مقايسة بين 4-26 ساعة يتطلب لاستكمال اعتمادا على نوع العينة وحساسية الفحص المطلوب، ولكن فقط ~ 2 ساعة من التدريب العملي في الوقت المحدد. يتم إجراء الفحص في لوحات 96 جيدا، واعتمادا على نوع من التجارب التي يتم تنفيذها، ويسمح الاختبار ثلاث نسخ تصل إلى 20 عينة بما في ذلك المعايير لكل لوحة.

ويبين الشكل 3 نتائج الفحص باستخدام ممثل بونت / ارتفعت A holotoxin في برنامج تلفزيوني واختبارها مع بروتوكول صفها التالية 2، 4، و 24 ساعة الحضانة مع مراسل A / E. وقد تم اختيار تنقية بونت / A holotoxin لهذه التجربة لأنه يعرف وزنه الجزيئي لل~ 150 كيلو دالتون، مقارنة مع نطاق أوسع تعريف 700-900 كيلو دالتون للمجمع السم، والنقاء تسمح ارتفاعه دقيقة جدا بتركيزات دقيقة. نسبة الانبعاثات، ونسبة الانبعاثات في 526 نانومتر إلى 470 نانومتر أنه في أعقاب الإثارة في 434نانومتر، في كل نقطة زمنية يتم رسم مقابل بونت / A تركيز (ويستند قيمة MLD 50 على اختبار قوة في بونت / A الشركة المصنعة). يتم قياس الانقسام لمراسل بواسطة بونت كتخفيض في نسبة الانبعاثات، والتي مع قارئ لوحة لدينا يتراوح بين حوالي 2.7 لمراسل سليمة إلى حوالي 0.7 لمراسل المشقوق بالكامل. من المهم أن نلاحظ أنه منذ مضان كل التدابير قارئ لوحة في RFUs، القيمة الفعلية لنسبة الانبعاثات سوف تعتمد على قارئ لوحة المستخدمة. فترة حضانة لفترات طويلة مع نتائج مراسل في زيادة الانقسام مراسل كما يراها التحول نحو اليسار في منحنى. نقاط البيانات، واختبارها في ثلاث نسخ، وعرض منخفض SD للمتوسط ​​واتبع الاتجاه المتوقع زيادة نسبة الانبعاثات مع انخفاض الحمل السم. قد فشل الفحص لمتابعة هذا الاتجاه المتوقع تشير إلى وجود خطأ أثناء إنشاء التخفيف أو التآمر البيانات. تبقى نسب الانبعاثات من الضوابط التي لا تحتوي على بونت / A أيضا ثابت الزيتوز الحضانة (الشكل 3، أقحم)، مما يدل على عدم وجود نشاط الأنزيم البروتيني غير محددة.

ويرد مثال باستخدام هذا البروتوكول لتحديد الأدوية بونت / A العينات في الشكل 4. تم إنشاء منحنى القياسية في برنامج تلفزيوني مع تنقيته بونت / A holotoxin ومعالجتها بالتوازي مع التخفيفات من الناتج المخدرات ولدت من نفس واحدة 100 U قارورة من البوتوكس مجفف بالتجميد ممهى في المياه المالحة 0.9٪. (ومن الناحية المثالية، وستتألف منحنى مستوى الكثير من مرجعية البوتوكس ولكن هذه المواد لا تتوفر بسهولة.) تم اختبار العينات باستخدام بروتوكول صفها باستثناء التي تم اختبارها في 50 ميكرولتر عينات مكررة من دون استخدام 10X العازلة ملزمة. وقد رسم منحنى القياسية بوصفها وظيفة من بونت / A تركيز التالية 24 ساعة الحضانة مع مراسل A / E. نسبة الانبعاثات من كل عينة مجهولة ثم تصور من قبل بالتآمر تقاطعه عبر منحنى القياسية. في هذا الاختبار، والخطع جزء من المنحنى القياسي (20-80٪ النافذة استجابة مقايسة) يقع بين نسبة انبعاث 2،11-1،05 ويشار بواسطة مربع متقطع في الشكل. تركيزات من المجاهيل الثلاثة التي تقع ضمن هذا النطاق الخطي ثم تم محرف من المنحنى القياسي (الشكل 4، أقحم). يوضح هذا المثال المنهجية العامة التي يمكن استخدامها للكشف أو قياس أي عينة مجهولة ضد منحنى القياسية.

وقد تم اختيار الطماطم الطازجة والحليب 2٪ لإثبات أداء البروتوكول والحساسية باستخدام كل من الصلبة (الطماطم) والأغذية السائلة (حليب 2٪) المصفوفة. وقد تم اختيار بونت / مجمع يتألف من holotoxin الأساسية والبروتينات المرتبطة عصبي (برامج العمل الوطنية) لهذه التجارب لأن هذا الإعداد يشبه السم أنتجت خلال التلوث المطثية الطبيعية. كما هو مبين في الشكل 5A، والانتعاش من بونت / A، التي تقاس على أنها تشطر لمراسل A / E، لوحظ مع بالمصفوفات الغير. زيادة فترة حضانة مع مراسل يزيد من حساسية الفحص، لكنه لا يؤدي إلى نسب الانبعاثات انخفضت لعدم وجود ضوابط السم (الشكل 5A، إدراجات)، مما يدل على انشقاق النتائج لوحظ من بونت / ألف والبروتيني غير محددة لا تحمل أكثر من الطعام في الفحص. كما هو الحال مع الشكل (3)، يعرض البيانات تقلب منخفضة ويلي انخفض الاتجاه المتوقع لمراسل الانقسام مع انخفاض تركيز السم.

ولخص بونت / A اللد، LOQ، وEC 50 لكل من الأطعمة في كل نقطة زمنية هو مبين في الجدول رقم 5. يتم تعريف اللد وLOQ كما أدنى تركيز العينة مع نسبة الانبعاثات أقل من ثلاثة وعشرة الانحرافات المعيارية أدناه الخلفية (عينات لا تحتوي على بونت / A)، على التوالي. وتقتصر هذه الحدود إلى نقاط البيانات اختبارها، على الرغم من الاستيفاء إلى منحنى الاستجابة للجرعة السيني يمكن استخدامها لحساب حدود النظرية أقل. بعض المصفوفة إلىومن المتوقع تقلب مصفوفة في اللد وLOQ، وآثار قد تؤثر على مصفوفة ملزمة من السم إلى الخرز والانتعاش من الخرز أثناء الغسل. في حين يبدو أن هناك المزيد من الانتعاش السم من الحليب 2٪ من الطماطم (البندورة) من البيانات في الشكل 5A، والكثير من هذا الاختلاف ناتج عن تخفيف الإضافية المطلوبة لالتجانس عينات الطماطم في الباوند.

بالإضافة إلى كونها مصفوفة الطعام الصلب، والطماطم هي نوع العينة يذكر حيث درجة الحموضة والقوة الأيونية التكيف، من خلال إضافة 10X العازلة تحييد تحقيق، أمر بالغ الأهمية لنجاح الفحص. يوضح الشكل 5B الاستجابات عند اختبار فحص الطماطم مع أو بدون إدراج في تحييد العازلة 10X. فشل لإضافة 10X تحييد نتائج عازلة في الانتعاش الضعيف للبونت / A من العينات ويتضح من نسبة الانبعاثات ثابتة عبر جميع التركيزات بونت / A اختبارها. بالإضافة إلى ذلك المخزن المؤقت تحييد 10X، رغم ذلك، صesults في كشف حساسة من السم.

البروتياز غير محدد الواردة في مصفوفات معقدة يمكن أن يؤدي إلى نتائج إيجابية خاطئة إذا لم تعالج منذ البروتياز الأخرى من بونت قد يلتصق مراسل A / E. قد تكون غير محددة البروتياز الذاتية للعينة الغذائية أو أدخلت عند استخدام مستحضرات nonpurified بونت مثل supernatants الثقافة كلوستريديوم. سوف غسل حبة شامل إزالة معظم البروتياز غير محددة، إلا أن إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني إلى المخزن المؤقت رد فعل حاسم الشكل 6 يوضح نشاط الأنزيم البروتيني غير محددة وجدت في كلوستريديوم بونت / ثقافة supernatants باستخدام مراسل A / E تعديل، BoTest KO (KO مراسل. ). مراسل KO هو نفس المراسل A / E باستثناء أن بونت / تم تحور موقع الانقسام بحيث لم يعد المشقوق من قبل بونت / A. وبالتالي، فإن أي انشقاق مراسل المرصودة النتائج من نشاط الأنزيم البروتيني غير محددة. مستويات عالية من KO مراسل كليavage يشير يحتوي طاف الثقافة على مستوى عال من نشاط الأنزيم البروتيني، ولكن انتفى هذا النشاط على نحو فعال من خلال إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني.

إظهار بيانات عينة فائدة البروتوكول لإنتاجية عالية بونت / A الكشف في مخازن بسيطة والمصفوفات الغذائية. قد تتطلب بعض الأطعمة التعديلات مقايسة صغيرة، ولكن البروتوكول وصف ينبغي أن تسفر عن نتائج جيدة مع غالبية أنواع المواد الغذائية.

الشكل 1
الشكل 1. المقترحة لوحة التخطيط. تقتصر عينات إلى الداخلية 60 بئرا من لوحة لتجنب الآثار حافة ممكن. يمكن إضافة عينات منحنى غير معروف أو القياسية كما تريد. ينبغي أن تملأ جميع الآبار غير المستخدمة مع 100 ميكرولتر المياه أثناء مراسل الحضانة. المبادرة القطريةCK هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 2
الشكل 2. نظرة عامة تخطيطي للبروتوكول وصفها. يشار إلى كل خطوة رئيسية في البروتوكول من قبل مربع وصفت والانحياز إلى جانب جدول زمني فحص المقدرة (لا لتوسيع نطاق). عينات غير غذائية لا تتطلب تجهيز العينات وذلك بإدخال بروتوكول المصب من العينات الغذائية. مربع متقطع حول الجيل التخفيف المتسلسل للالمجهولة يشير هذا هو اختياري، ولكن الموصى بها، خطوة. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 3
الرقم 3. الكشف عن بونت / A holotoxin في برنامج تلفزيوني باستخدام بروتوكول صفها.وقد ارتفعت المنقى بونت / A holotoxin في برنامج تلفزيوني واختبارها باستخدام بروتوكول صفها مع تركيز بونت / A العلوي من 1 نانومتر. تم اختبار جميع العينات في ثلاث نسخ وأشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري للمتوسط. ويستند رجولية تقريرا عن الفأر الاختبار الأحيائي الشركة المصنعة للسموم. وقد تم قياس نسبة الانبعاثات (نسبة الانبعاثات في 526 نانومتر إلى 470 نانومتر عند الإثارة في 434 نانومتر) من منحنى القياسية التالية 2، 4، و 24 ساعة الحضانة مع مراسل A / E وتآمر بوصفها وظيفة من بونت / A تركيز . اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 4
وكان وحيد 100 U قنينة من منتج مجفف بالتجميد المخدرات البوتوكس الرقم 4. الكمي لمنتج البوتوكس المخدرات باستخدام بروتوكول صفها. resuspe nded في 220 ميكرولتر 0.9٪ المالحة، المخفف متسلسل، واختبارها كما المجهولة ضد منحنى القياسية المحرز في برنامج تلفزيوني باستخدام المنقى بونت / A holotoxin. تم اختبار العينات وفقا لبروتوكول صفها إلا أنه تم اختبار 50 عينة ميكرولتر دون 10X العازلة ملزمة في مكررة. تم احتساب منحنى القياسية من المناسب نسبة الانبعاثات من العينات المنحنى القياسي إلى المنحدر السيني المعادلة بين الجرعة والاستجابة متغير ويتم رسم بوصفها وظيفة من بونت / A التركيز. ويرد كل عينة مجهولة حيث يتقاطع مع منحنى القياسية بعد الحضانة 24 ساعة مع مراسل A / E. تم محرف تركيزات من العينات غير معروف تقع ضمن نطاق الخطية (المربع المظلل متقطع) من منحنى القياسية. التسمية لكل مجهولة البوتوكس هو عدد الوحدات في العينة يعتمد على قوة المسمى. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري للمتوسط.ر = "_blank"> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 5
وقد ارتفعت الرقم 5. استرداد بونت / A-ارتفعت الحليب 2٪ والاختبار الطماطم الطازجة باستخدام بروتوكول صفها. عينات من الحليب 2٪ والطماطم الطازجة مع تنقيته بونت / مجمع واختبارها باستخدام بروتوكول صفها. تم اختبار جميع العينات في ثلاث نسخ وأشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري للمتوسط ​​(أ) تم قياس نسبة الانبعاثات من الحليب 2٪ والطماطم الطازجة المنحنيات القياسية التالية 2، 4، و 24 حضانة ساعة مع مراسل A / E وتآمر بوصفها وظيفة من بونت / A رجولية. (B) فشل لتشمل المنطقة العازلة 10X تحييد خلال نتائج الاختبارات الطماطم في فشل الفحص. تم اختبار عينات من الطماطم الطازجة وفقا للبروتوكول وصفها إما مع أو بدون إضافة 10X محايدسعودة العازلة. البيانات المعروضة لنقطة زمنية 4 ساعة. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 6
ويطلب الرقم 6. مثبطات البروتياز عند اختبار المصفوفات المعقدة. كلوستريديوم بونت / A (سلالة قاعة A) تم تخفيفه بشكل متسلسل الثقافة طاف في برنامج تلفزيوني واختبارها باستخدام بروتوكول صفها إما مع أو بدون مثبطات الأنزيم البروتيني تضاف إلى رد فعل العازلة ومع كل من و / E KO وصحفيين. وقد تم قياس نسبة الانبعاثات التالية 24 ساعة الحضانة مع كل من A / E أو KO صحفيين وتآمر بوصفها وظيفة من بونت / A رجولية. واعتبر الانقسام هامة لمراسل KO دون إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني لكنه نفى من قبل إدراجها. تم اختبار جميع العينات في ثلاث نسخ والخطأ بARS تمثل الانحراف المعياري للمتوسط. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

العازلة تركيب درجة حرارة التخزين استقرار الملاحظات
10X ماتريكس الاحتياطي ملزم 500 ملي HEPES-هيدروكسيد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.1، 250 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1٪ توين 20، 5٪ بروتين الجبن، 0.05٪ نان 3 -20 أو -80 ° C مستقرة لمدة لا تقل عن خمسة أيام في 4 درجات مئوية على الذوبان المتوفرة مع BoTest مصفوفة A الكشف عن توكسين كيت
10X ماتريكس الاحتياطي اغسل 119 ملي الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.4، 1،370 مم كلوريد الصوديوم، و 27 ملي بوكل، 1٪ توين 20 -20 أو -80 ° C مستقرة لمدة لا تقل عن خمسة أيام في 4 درجات مئوية على الذوبان المتوفرة مع BoTest مصفوفة A الكشف عن توكسين كيت
10X تحييد العازلة 1 M-HEPES هيدروكسيد الصوديوم، ودرجة الحموضة 8.0، 1 M كلوريد الصوديوم 4 ° C مستقرة لمدة تصل إلى ستة أشهر في 4 درجات مئوية
10X العازلة رد فعل BoTest 500 ملي HEPES-هيدروكسيد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.1 و 50 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1٪ توين 20، و 100 ميكرومتر ZNCL 2 -20 أو -80 ° C مستقرة لمدة لا تقل عن خمسة أيام في 4 درجات مئوية على الذوبان المتوفرة مع BoTest مصفوفة A الكشف عن توكسين كيت
BoTest A / E مراسل 20 ميكرومتر في 50 ملي HEPES-هيدروكسيد الصوديوم، و 10 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 15٪ الجلسرين -80 ° C تخزين في مأخوذة الصغيرة. مستقرة لمدة لا تقل عن خمسة أيام في 4 درجات مئوية على الذوبان. المتوفرة مع BoTest مصفوفة A الكشف عن توكسين كيت
الجيلاتين الفوسفات العازلة (الباوند) 33.3 ملم ناه 2 ص 4، ودرجة الحموضة 6.2، 2 ز / L الجيلاتين 4 ° C مستقرة لمدة تصل إلى 1 في الشهر في 4 درجات مئوية
200X dithiothreitol (DTT) 1 M DTT -20 ° C مستقرة لمدة تصل إلى 6 أشهر في -20 ° C جعل وتخزين صغيرة (100 ميكرولتر) مأخوذة
برنامج تلفزيوني 1X-T 11.9 ملي الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.4، 137 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل، 0.1٪ توين 20 4 ° C مستقرة لمدة تصل إلى 1 في الشهر في 4 درجات مئوية يمكن إجراؤها باستخدام 10X PBS من فيشر (BP399-1)
مصفوفة A الخرز (IP-A الخرز) حبات مغناطيسية مترافق تساهميا إلى الدجاج المضادة للبونت / A الأجسام المضادة في برنامج تلفزيوني. 0.1٪ توين 20، 0.05٪ صوديوم أزيد، 0.25٪ بروتين الجبن، و 50٪ الجلسرين -20 ° C مستقرة لمدة لا تقل عن خمسة أيام في 4 درجات مئوية على إزالة من -20 درجة مئوية. لا تجمد AT -80 ° C

الجدول 1. المخازن المؤقتة المطلوبة للبروتوكول وصفها. وتحييد 10Xالعازلة هو فقط من أجل معقدة للغاية (مثل المواد الغذائية) وعينات قد لا يكون مطلوبا تبعا لطبيعة العينات التي يعاير.

اسم المادة / معدات شركة عدد التسويقي التعليقات / الوصف
BoTest مصفوفة A البوتولينوم السموم العصبية كشف كيت BioSentinel A1015 مجموعات الكشف عن بونت / B و F وتتوفر أيضا.
Varioskan فلاش قارئ مضان صفيحة ميكروسكوبية الحرارية فيشر العلمية 5250040 معظم أو مستوحد اللون وحدات على أساس التصفية مع 434 نانومتر الإثارة و 470 نانومتر و 526 نانومتر القدرة الانبعاثات يمكن استخدامها.
96 جيدا المغناطيسي الخرزة فصل اللوحة V & P العلمية VP771H ويمكن استخدام لوحات الممغنطة الأخرى، ولكن ينبغي أن تصمم لوحة لفصل بEADS إلى جانب البئر.
حبة متوافق المغناطيسي لوحة الغسالة BIOTEK ELx405 VSRM اختياري، المطلوب فقط الآلي لوحة الغسيل. ويمكن أيضا أن تستخدم غيرها المغناطيسي حبة متوافق غسالات لوحة، ولكن ينبغي اختبارها قبل الاستخدام.
ميكروسنتريفوج مختلف N / A اختياري، المطلوب فقط للعينات التي تحتاج إلى الطرد المركزي.
MixMate وحة خلاط إيبندورف 22674200
شاكر المداري مختلف N / A تستخدم في RT أو عند 25 درجة مئوية إذا التحكم في درجة الحرارة هو متاح
EDTA خالية من البروتياز المانع أقراص روش 4693132001 مطلوب فقط من أجل الغذاء أو اختبار البيئية. يجب أن تكون مثبطات الأنزيم البروتيني خالية من EDTA.
بونت / A Metabiologics N / A اختياري، المطلوب فقط لأغراض توحيد وتقدير
الأسود، لوحات 96 جيدا مسطحة القاع نونك 237105 يجب ألا تعامل وحات
96 لوحة جيدا ختم الشريط الحرارية العلمية 15036

الجدول 2. المواد والمعدات اللازمة للبروتوكول وصفها بعض المواد والمعدات اختيارية أو يمكن أن تكون بديلا اعتمادا على المعدات المتاحة. اختبار ملاءمة إضافية والأمثل قد يكون مطلوبا إذا باستخدام معدات بديلة.

</ آر>
اسم العينة حجم السمية حجم مخفف [بونت / A] (MLD 50 / مل) أو (MLD 50 / ز الغذاء) تسجيل [بونت / A] (MLD 50 / مل) أو (MLD 50 / ز الغذاء) D1 1،200 ميكرولتر الأسهم N / A 30،000 4.48
D2 300 ميكرولتر D1 600 ميكرولتر 10،000 4
D3 90 ميكرولتر D1 810 ميكرولتر 3،000 3.48
D4 90 ميكرولتر D2 810 ميكرولتر 1،000 3
D5 90 ميكرولتر D3 810 ميكرولتر 300 2.48
D6 90 ميكرولتر D4 810 ميكرولتر 100 2
D7 90 ميكرولتر D5 810 ميكرولتر 30 1.48
D8 90 ميكرولتر D6 810 ميكرولتر 10 1
D9 N / A 1،400 ميكرولتر N / A N / A

. يولد هذا الجدول الجدول تخفيف للعينات منحنى القياسية منحنى القياسية في التخفيفات سجل نصف أكثر من 3.5 أوامر من حجم: الجدول 3. يتم إنشاء كافية لا بونت عينة فارغة (D9) لتشغيل ن = 6. ويمكن أن يضاف التخفيفات إضافية إذا لزم الأمر.

<الدفتيريا> 0
اسم البرنامج متغير قيمة تعليقات
رئيسي كاشف زجاجة A
رئيس وحدة التخزين 400
رئيس معدل التدفق 7
بعد نقع رئيس؟ N
مصفوفة غسل كاشف زجاجة A ويمكن زيادة عدد يغسل إذا لوحظ نشاط الأنزيم البروتيني المتبقية.
طريقة
4
نقع / اهتز Y
نقع المدة 180
يهز قبل نقع؟ N
رئيس بعد نقع؟ N
DISP
الاستغناء حجم التداول 300
الاستغناء معدل التدفق 5
الاستغناء الارتفاع 130
هور. الاستغناء نقاط البيع. 0
تعطيل نضح؟ Y
أسفل غسل الأولى؟ N
رئيس قبل البداية؟ N
Aspir
تطلع الارتفاع 40
هور. نضح نقاط البيع. 0
قيم الطموح 5
تطلع تأخير
نضح بالعرض؟ N
النهائي الطموح؟ Y
النهائي شفط تأخير 0
مصفوفة نقع نقع المدة 300 زيادة مدة نقع قد يزيد الانتعاش حبة من الأطعمة أكثر لزوجة.
يهز قبل نقع؟ N
غسل الماجستير مصفوفة نقع هذا هو برنامج 'لينك' لتشغيل ماتريكس نقع وغسل برامج ماتريكس معا.
مصفوفة غسل

الآلي إعدادات البرنامج الجدول 4. المغناطيسي حبة متوافق وحة غسالة. تفترض البرامج التالية التي تم تجهيز لوحة غسالة مع المغناطيس التي تشد الخرز إلى جانب الآبار والتي تم تعيينها المخزن المؤقت تبديل وحدة بحيث تصل 1X الاحتياطي اغسل ( Pويرد BS-T) لصمام A. هذه البرامج محددة إلى BIOTEK ELx405. الرجوع إلى دليل أداة لتعليمات البرمجة. الأخرى المغناطيسي حبة متوافق غسالات وحة التلقائي أو الفتحات فراغ يمكن استخدامها، ولكن سوف تكون هناك حاجة إلى اختبار تحديد الإعدادات التي تعظيم كفاءة الغسيل وتقليل الخسائر حبة أثناء الغسل. ينصح الاختبارات الأولية على الانتعاش حبة التالية غسل بغض النظر عن غسالة لوحة المحددة المستخدمة.

<الدفتيريا> اللد
ماتريكس الغذاء متري 2 ساعة 4 ساعة 24 ساعة
MLD 50 / ز الغذاء MLD 50 / جيد MLD 50 / ز الغذاء MLD 50 / جيد MLD 50 / ز الغذاء MLD 50 / جيد
حليب 300 58 100 19 30 6
LOQ 1،000 193 300 58 100 19
EC 50 2،404 464 590 114 92 18
الطماطم الطازجة اللد 1،000 91 300 27 30 3
LOQ 1،000 91 1،000 91 100 9
EC 50 7،561 687 1،932 176 229 21

الجدول 5. حدود الكشف (اللد)، حدود الكمي (LOQ)، ونصف مترaximal التركيز الفعال (EC 50) للحليب 2٪ والاختبار الطماطم الطازجة هو مبين في الشكل 2A. وEC 50 مشتق من السيني الاستجابة للجرعة منحنى مناسبا في حين يتم تعريف اللد وLOQ باعتبارها نقطة بيانات أقل تركيز الذي يقع إما 3 أو 10 الانحرافات المعيارية دون أي ضوابط بونت (ن = 6)، على التوالي. يتم عرض البيانات في كل MLD 50 / ز المواد الغذائية ومجموع MLD 50 ق اختبار لكل بئر في حجم العينة 200 ميكرولتر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف هذا البروتوكول إجراءات لقياس بونت / مجمع، holotoxin، أو كلوستريديوم الثقافة طاف في مصفوفات معقدة. البروتوكول هو نفسه، ومع ذلك، عند اختبار الأنماط المصلية الأخرى بونت (بونت مثل / B، E، F و) مع المقايسات الخاصة ماتريكس منها 56،60، على الرغم من حساسية الفحص سوف تختلف باختلاف الأنماط المصلية والمقايسات. لا يأخذ في الحسبان هذا البروتوكول لكل نوع من عينة ممكن ان يكون قد يتطلب بعض التعديلات تبعا لتكوين عينة محددة والتطبيق المطلوب. ويمكن أن تشمل مصفوفات العينات الغذائية (مثل الغذاء اختبار التحدي) أو مخازن الأدوية سواغ (اختبار المنتجات القائمة على المخدرات بونت-سبيل المثال). ينبغي أن يعامل غير غذائية معقدة (مثل الأنسجة الحيوانية أو البيئية) السائلة والصلبة عينات كعينات الغذاء. يستخدم هذا البروتوكول أحجام 200 ميكرولتر / عينة بشكل جيد ولكن اقل من 50 ميكرولتر / جيد يمكن اختبار مع تعديل مماثل لحجم 10X المربوطةز العازلة. يجب تخفيفه عينات أصغر من 50 ميكرولتر مع الباوند أو برنامج تلفزيوني ل≥ 50 ميكرولتر قبل الاختبار.

الطبيعة المتغيرة للغاية من المواد الغذائية يمثل تحديا خاصا للكشف بونت والكمي في الغذاء. درجة الحموضة العينة، اللزوجة، القوة الأيونية، ووجود الجسيمات يمكن أن تؤثر على كل يحتمل نشاط السم داخل المصفوفة الغذاء وتستلزم أن السم تكون معزولة عن الطعام للدقيقة، في المختبر الكمي. العديد من الأطعمة أو مستحضرات تحتوي أيضا على السم البروتياز الذاتية التي يجب إزالتها أو المعطل للصحفيين عند استخدام البروتين على أساس لضمان أن نشاط الأنزيم البروتيني فقط بونت محددة يتم قياسها. حتى بسيطة، مصفوفات العازلة واضحة المعالم، مثل مخازن سواغ الصيدلانية، يمكن أن تحتوي على المركبات التي تتداخل مع النشاط بونت التي يجب إزالتها قبل 35،56-59،61 الكمي. مناعي تقدم سريع، عالية المصلي محددة بونت بوريطريقة fication ولكن يتطلب الأجسام المضادة تقارب عالية لعزل تركيزات منخفضة السمية الموجودة في الغذاء "في العالم الحقيقي"، والبيئية، وعينات المستحضرات الصيدلانية.

بروتوكول وصف ينقي السم باستخدام الخرز ممغطس المغلفة مع المضادة للبونت / A الأجسام المضادة الموجهة نحو السم السلسلة الثقيلة المجال مستقبلات من بونت / A holotoxin الأساسية 56. الأنواع المطثية، ومع ذلك، وبطبيعة الحال تنتج المجمعات السم تتألف من holotoxin الأساسية في تكوين الجمعيات مع برامج العمل الوطنية 62-64. برامج العمل الوطنية حماية السم من الهجوم البروتيني في القناة الهضمية، ويعتقد لتسهيل النقل السم عبر ظهارة الأمعاء 63،65. برامج العمل الوطنية تحول دون ملزم للIP-A حبة لمكافحة بونت / A الأجسام المضادة للholotoxin الأساسية (لا تظهر البيانات). يخلص هذا تثبيط عن طريق زيادة درجة الحموضة إلى عينة أعلاه ~ 6.25، مما تسبب في بونت / A السم الفعال معقدة لفصل في holotoxin وخطط العمل الوطنية والسماح للالربط إلى IP-A الخرز 66. لهذا السبب، وتعديل عينة الرقم الهيدروجيني إلى 6.5 أعلاه أمر بالغ الأهمية لنجاح الفحص (الشكل 5B). المخزن المؤقت تجليد 10X المستخدمة في بروتوكول يحتوي على وكيل التخزين المؤقت للمساعدة في رفع درجة الحموضة لظروف الفحص القياسية. ومع ذلك، يمكن أن العديد من الأطعمة الحمضية تطغى على قدرة التخزين المؤقت من العازلة ملزمة. الإضافي 10X العازلة تحييد يزيد كثيرا من قدرة التخزين المؤقت عينة ويجب تحييد معظم مصفوفات الغذاء.

آخر معلمة مهمة لفحص هو قوة الأيونية العينة. مطلوب توضيح من العينات بواسطة الطرد المركزي لغسل حبة فعالة والانتعاش في أعقاب مناعي. وكشف الاختبار مع الطماطم الطازجة التي لا بونت / A الانتعاش كان ينظر عندما تم معالجتها ببساطة العينات وطرد. افترضنا أن بونت / A قد ربط مع اللحم الطماطم الامر الذي ادى الى بيليه خلال الطرد المركزي وأصبحت غائبة عنطاف اختبارها. وجدنا أن زيادة القوة الأيونية، أو أكثر بكثير، وتحييد التفاعلات محدودة درجة الحموضة بين بونت والمصفوفة مما أدى إلى تحسين الانتعاش السم (الشكل 5B). في حين ليس مطلوبا لتحقيق الانتعاش بونت، فمن المتوقع، على الرغم من لم يثبت، أن تركيزات أعلى الملح أيضا زيادة التشدد من مناعي يؤدي إلى الانتعاش والبروتين أقل غير محددة، خاصة في الأطعمة الملح منخفضة.

يتم تنفيذ عينة الرقم الهيدروجيني وتعديل قوة الأيونية في البروتوكول بإضافة 10X العازلة تحييد ويجب أن تكون متوافقة مع مجموعة واسعة من الأطعمة. في حين أن تحييد العازلة 10X لديه قدرة عالية التخزين المؤقت، قد تتطلب بعض الأطعمة الحمضية للغاية ضبط الأس الهيدروجيني إضافية. ينصح اختبار عينة الرقم الهيدروجيني التالية بالإضافة عازلة إذا لوحظ ضعف الأداء الفحص ويسمح حجم العينة. ويمكن تحقيق ضبط الأس الهيدروجيني إضافية من خلال إضافة ثانيةأحجام مول من 1 M HEPES الرقم الهيدروجيني 8، إذا لزم الأمر. وكلوريد الصوديوم الإضافية التي أدخلتها العازلة تحييد 10X يجب أن يكون مقبولا للجميع ولكن ملوحة الأطعمة، ولكن يمكن استبدال 10X العازلة تحييد مع 1 M HEPES الرقم الهيدروجيني 8 إذا رأيت النتائج السيئة مع المواد الغذائية معين. وقد لوحظ عدم وجود فروق كبيرة عند اختبار بروتوكول الموصوفة في تركيزات كلوريد الصوديوم يصل إلى 1.2 M في برنامج تلفزيوني.

في حين أن هذا البروتوكول ينطبق على الغالبية العظمى من العينات، والأطعمة في اقصى درجة الحموضة، والقوة الأيونية، و / أو المحتوى البروتيني قد لا تسفر عن نتائج جيدة مع الفحص. قد تبقى بعض الأطعمة أيضا لزجة جدا بعد إضافة الباوند، مما أدى إلى ضعف الانتعاش حبة. Predilution العينات مع العازلة بسيطة مثل برنامج تلفزيوني قد يحسن النتائج. زيادة عدد يغسل أو يغسل صرامة (عن طريق زيادة تركيز كلوريد الصوديوم) وزيادة تركيز مثبطات الأنزيم البروتيني خالية من EDTA يمكن أيضا تحسين النتائج إذا غير محددة البروتياز contaminatويلاحظ أيون. النظافة الصك هو أيضا مهم جدا عند استخدام لوحة الغسيل الآلي. تلوث السباكة وحقن الفتحات مع البروتياز (مثل التربسين) من فحوصات مختبرية أخرى يمكن أن تؤدي إلى إدخال غير مقصود من البروتياز أثناء الفحص. ينصح تنظيف شامل للغسالة لوحة وفقا لدليل المستخدم الخاص بالشركة المصنعة قبل تشغيل الفحص.

المقايسات مصفوفة BoTest هي الأولى تجاريا، فحوصات على أساس النشاط لكشف بونت والكمي في مصفوفات معقدة. مقارنة الأحيائي الماوس القياسية، فحص سريع، وأقل تكلفة، ويسمح الاختبار عالية الإنتاجية دون الحاجة إلى مرافق متخصصة أو مخاوف أخلاقية بشأن استخدام الحيوانات 56. وقد وصفت أخرى في المختبر بونت طرق الكشف ولكن لم يثبت لتكون متوافقة مع المصفوفات عينة معقدة، تتطلب معدات متخصصة، أو ليست availab تجاريالو 35،42-44،46-55. المقايسات أيضا فحوصات على أساس النشاط التي تقيس النشاط endoprotease السم، بينما التقليدية انزيم مرتبط الفحص immunosorbant (ELISA) تقنيات تقريرا فقط السم الشامل. تم فحوصات ELISA على أساس النشاط هو موضح سابقا ولكن لم يظهر هذه المقايسات للعمل مع المصفوفات والغذاء لا تشمل تنقية السموم من العينة مصفوفة 41. قد يحدث سوء تقدير كبير من سمية عينات معقدة إذا لم يتم تنقيته من السموم من العينة منذ مركبات مصفوفة غالبا ما تتداخل مع النشاط بونت 35،56-59.

بمجرد يتقن البروتوكول، ويمكن إجراء تعديلات على زيادة حجم العينة وزيادة حساسية العينة. على سبيل المثال، ملزم من السم لحبات يمكن أن يؤديها في أكبر، والعينات الأكبر (على سبيل المثال 10 مل أو أكثر) قبل جمع بواسطة الطرد المركزي. ويمكن بعد هذه الخرز يمكن ان تضاف الى لوحة 96 جيدا ويعاير بعد وصفد البروتوكول. وقد لوحظت زيادة في حساسية أكبر من سجل واحد مع زيادة حجم العينة 56. وبالتالي، فإن بروتوكول وصف يمكن استخدامه مع عينات للكشف عن حجم أكبر حتى كميات ضئيلة من بونت الواردة في العينات التي قد تكتشف من قبل الأحيائي الماوس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

FM دانينغ، TM ساحة، F. Zeytin، ومرحاض تاكر هم موظفون أو أصحاب BioSentinel شركة BioSentinel حاليا بتصنيع وتسويق بعض الكواشف الواردة في هذا التقرير.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر H. اوليفاريس وD. روج لإجراء مناقشات قيمة والمشورة. وأيد هذا البحث في جزء من جائزة SBIR NSF (IIP-1127245 لBioSentinel شركة) وعقد وزارة الدفاع (W81XWH-07-2-0045 لBioSentinel شركة).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit BioSentinel A1015 Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate reader Thermo Fisher Scientific 5250040 Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 nm and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation Plate V&P Scientific VP771H Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer BioTek ELx405 VSRM Optional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
Microcentrifuge Optional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixer Eppendorf 22674200
Orbital Shaker Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor Tablets Roche 4693132001 Only required for food or environmental testing. Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/A Metabiologics Optional, only required for standardization and quantification purposes
Black, Flat-bottomed 96-well Plates NUNC 237105 Plates should not be treated
96-well Plate Sealing Tape Thermo Fisher Scientific 15036

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arnon, S. S., et al. Botulinum toxin as a biological weapon: medical and public health management. J. Am. Med. Assoc. 285, 1059-1070 (2001).
  2. Gill, D. M. Bacterial toxins: a table of lethal amounts. Microbiol. Rev. 46, 86-94 (1982).
  3. Montal, M. Botulinum neurotoxin: a marvel of protein design. Annu. Rev. Biochem. 79, 591-617 (2010).
  4. Lacy, D. B., Stevens, R. C. Sequence homology and structural analysis of the clostridial neurotoxins. J. Mol. Biol. 291, 1091-1104 (1999).
  5. Montecucco, C., Schiavo, G. Structure and function of tetanus and botulinum neurotoxins. Q. Rev. Biophys. 28, 423-472 (1995).
  6. Ahnert-Hilger, G., Munster-Wandowski, A., Holtje, M. Synaptic vesicle proteins: targets and routes for botulinum neurotoxins. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 364, 159-177 (2013).
  7. Yamasaki, S., et al. Cleavage of members of the synaptobrevin/VAMP family by types D and F botulinal neurotoxins and tetanus toxin. J. Biol. Chem. 269, 12764-12772 (1994).
  8. Schiavo, G., et al. Identification of the nerve terminal targets of botulinum neurotoxin serotypes A, D, and E. J. Biol. Chem. 268, 23784-23787 (1993).
  9. Schiavo, G., et al. Tetanus and botulinum-B neurotoxins block neurotransmitter release by proteolytic cleavage of synaptobrevin. Nature. 359, 832-835 (1992).
  10. Schiavo, G., et al. Botulinum G neurotoxin cleaves VAMP/synaptobrevin at a single Ala-Ala peptide bond. J. Biol. Chem. 269, 20213-20216 (1994).
  11. Rossetto, O., et al. SNARE motif and neurotoxins. Nature. 372, 415-416 (1994).
  12. Montecucco, C., Schiavo, G. Mechanism of action of tetanus and botulinum neurotoxins. Mol. Microbiol. 13, 1-8 (1994).
  13. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365, 160-163 (1993).
  14. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin C1 blocks neurotransmitter release by means of cleaving HPC-1/syntaxin. EMBO J. 12, 4821-4828 (1993).
  15. Cherington, M. Clinical spectrum of botulism. Muscle Nerve. 21, 701-710 (1998).
  16. Lindstrom, M., Korkeala, H. Laboratory diagnostics of botulism. Clin. Microbiol. Rev. 19, 298-314 (2006).
  17. Werner, S. B., Passaro, D., McGee, J., Schechter, R., Vugia, D. J. Wound botulism in California, 1951-1998: recent epidemic in heroin injectors. Clin. Infect. Dis. 31, 1018-1024 (2000).
  18. Passaro, D. J., Werner, S. B., McGee, J., MacKenzie, W. R., Vugia, D. J. Wound botulism associated with black tar heroin among injecting drug users. J. Am. Med. Assoc. 279, 859-863 (1998).
  19. Brook, I. Infant botulism. J. Perinatol. 27, 175-180 (2007).
  20. Arnon, S. S. Honey, infant botulism and the sudden infant death syndrome. West J. Med. 132, 58-59 (1980).
  21. Arnon, S. S. Infant botulism. Annu. Rev. Med. 31, 541-560 (1980).
  22. Peck, M. W., Stringer, S. C., Carter, A. T. Clostridium botulinum in the post-genomic era. Food Microbiol. 28, 183-191 (2011).
  23. Sharma, S. K., Whiting, R. C. Methods for detection of Clostridium botulinum toxin in foods. J. Food Prot. 68, 1256-1263 (2005).
  24. Sobel, J. Botulism. Clin. Infect. Dis. 41, 1167-1173 (2005).
  25. Chen, S. Clinical uses of botulinum neurotoxins: current indications, limitations and future developments. Toxins. 4, 913-939 (2012).
  26. Sinha, D., Karri, K., Arunkalaivanan, A. S. Applications of Botulinum toxin in urogynaecology. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 133, 4-11 (2007).
  27. Dmochowski, R., Sand, P. K. Botulinum toxin A in the overactive bladder: current status and future directions. BJU Int. 99, 247-262 (2007).
  28. Benecke, R., Dressler, D. Botulinum toxin treatment of axial and cervical dystonia. Disabil. Rehabil. 29, 1769-1777 (2007).
  29. Hunt, T., Clarke, K. Potency evaluation of a formulated drug product containing 150-kd botulinum neurotoxin type A. Clin. Neuropharmacol. 32, 28-31 (2009).
  30. Marchetti, A., et al. Retrospective evaluation of the dose of Dysport and BOTOX in the management of cervical dystonia and blepharospasm the REAL DOSE study. Mov. Disord. 20, 937-944 (2005).
  31. Wohlfarth, K., Sycha, T., Ranoux, D., Naver, H., Caird, D. Dose equivalence of two commercial preparations of botulinum neurotoxin type A: time for a reassessment. 25, 1573-1584 (2009).
  32. AOAC International, Clostridium botulinum and its toxins in foods (method 977.26 section 17.7.01). , (2001).
  33. Schantz, E. J., Kautter, D. A. Microbiological methods: standardized assay for Clostridium botulinum toxins. J. AOAC. 61, 96-99 (1978).
  34. Ferreira, J. L. Comparison of amplified ELISA and mouse bioassay procedures for determination of botulinal toxins A, B, E, and F. J. AOAC. Int. 84, 85-88 (2001).
  35. Directive 2003/15/EC of the European Parliament and of the Council. Official Journal of the European Union. , (2003).
  36. Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM Scientific Workshop on Alternative Methods to Refine, Reduce or Replace the Mouse LD50 Assay for Botulinum Toxin Testing. Report No. 08-6416, NIH. , (2008).
  37. Bitz, S. The botulinum neurotoxin LD50 test - problems and solutions. ALTEX. 27, 114-116 (2010).
  38. Balls, M. Replacing the animal testing of botulinum toxin: time to smooth out the wrinkles. Altern. Lab. Anim. 38, 1-2 (2010).
  39. Balls, M. Botulinum toxin testing in animals: the questions remain unanswered. Altern. Lab. Anim. 31, 611-615 (2003).
  40. Singh, A. K., Stanker, L. H., Sharma, S. K. Botulinum neurotoxin: where are we with detection technologies. Crit. Rev. Microbiol. 39, 43-56 (2013).
  41. Liu, Y. Y., Rigsby, P., Sesardic, D., Marks, J. D., Jones, R. G. A functional dual-coated (FDC) microtiter plate method to replace the botulinum toxin LD50 test. Anal. Biochem. 425, 28-35 (2012).
  42. Ouimet, T., Duquesnoy, S., Poras, H., Fournie-Zaluski, M. C., Roques, B. P. Comparison of Fluorigenic Peptide Substrates PL50, SNAPtide, and BoTest A/E for BoNT/A Detection and Quantification: Exosite Binding Confers High-Assay Sensitivity. J. Biomol. Screen. , (2013).
  43. Scotcher, M. C., Cheng, L. W., Stanker, L. H. Detection of botulinum neurotoxin serotype B at sub mouse LD(50) levels by a sandwich immunoassay and its application to toxin detection in milk. PLoS One. 5, (2010).
  44. Mason, J. T., Xu, L., Sheng, Z. M., O'Leary, T. J. A liposome-PCR assay for the ultrasensitive detection of biological toxins. Nat. Biotechnol. 24, 555-557 (2006).
  45. Ruge, D. R., et al. Detection of six serotypes of botulinum neurotoxin using fluorogenic reporters. Anal. Biochem. 411, 200-209 (2011).
  46. Hines, H. B., et al. Use of a recombinant fluorescent substrate with cleavage sites for all botulinum neurotoxins in high-throughput screening of natural product extracts for inhibitors of serotypes A, B, and E. Appl. Environ. Microbiol. 74, 653-659 (2008).
  47. Gilmore, M. A., et al. Depolarization after resonance energy transfer (DARET): a sensitive fluorescence-based assay for botulinum neurotoxin protease activity. Anal. Biochem. 413, 36-42 (2011).
  48. Capek, P., Dickerson, T. J. Sensing the deadliest toxin: technologies for botulinum neurotoxin detection. Toxins. 2, 24-53 (2010).
  49. Bagramyan, K., Barash, J. R., Arnon, S. S., Kalkum, M. Attomolar detection of botulinum toxin type A in complex biological matrices. PLoS One. 3, (2008).
  50. Wang, D., Baudys, J., Kalb, S. R., Barr, J. R. Improved detection of botulinum neurotoxin type A in stool by mass spectrometry. Anal. Biochem. 412, 67-73 (2011).
  51. Parks, B. A., et al. Quantification of botulinum neurotoxin serotypes A and B from serum using mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 9047-9053 (2011).
  52. Kalb, S. R., Goodnough, M. C., Malizio, C. J., Pirkle, J. L., Barr, J. R. Detection of botulinum neurotoxin A in a spiked milk sample with subtype identification through toxin proteomics. Anal. Chem. 77, 6140-6146 (2005).
  53. Kalb, S. R., et al. The use of Endopep-MS for the detection of botulinum toxins A, B, E, and F in serum and stool samples. Anal. Biochem. 351, 84-92 (2006).
  54. Boyer, A. E., et al. From the mouse to the mass spectrometer: detection and differentiation of the endoproteinase activities of botulinum neurotoxins A-G by mass spectrometry. Anal. Chem. 77, 3916-3924 (2005).
  55. Barr, J. R., et al. Botulinum neurotoxin detection and differentiation by mass spectrometry. Emerg. Infect. Dis. 11, 1578-1583 (2005).
  56. Dunning, F. M., et al. Detection of botulinum neurotoxin serotype A, B, and F proteolytic activity in complex matrices with picomolar to femtomolar sensitivity. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7687-7697 (2012).
  57. Jones, R. G., Ochiai, M., Liu, Y., Ekong, T., Sesardic, D. Development of improved SNAP25 endopeptidase immuno-assays for botulinum type A and E toxins. J. Immunol. Methods. 329, 92-101 (2008).
  58. Ekong, T. A., Feavers, I. M., Sesardic, D. Recombinant SNAP-25 is an effective substrate for Clostridium botulinum type A toxin endopeptidase activity in vitro. Microbiology. 143 (pt 10), 3337-3347 (1997).
  59. Shone, C. C., Roberts, A. K. Peptide substrate specificity and properties of the zinc-endopeptidase activity of botulinum type B neurotoxin. Eur. J. Biochem. 225, 263-270 (1994).
  60. Piazza, T. M., et al. In vitro detection and quantification of botulinum neurotoxin type e activity in avian blood. Appl. Environ. Microbiol. 77, 7815-7822 (2011).
  61. Mizanur, R. M., Gorbet, J., Swaminathan, S., Ahmed, S. A. Inhibition of catalytic activities of botulinum neurotoxin light chains of serotypes A, B and E by acetate, sulfate and calcium. Int. J. Biochem. Mol. Biol. 3, 313-321 (2012).
  62. Sugii, S., Sakaguchi, G. Molecular construction of Clostridium botulinum type A toxins. Infect. Immun. 12, 1262-1270 (1975).
  63. Sharma, S. K., Ramzan, M. A., Singh, B. R. Separation of the components of type A botulinum neurotoxin complex by electrophoresis. Toxicon. 41, 321-331 (2003).
  64. Bryant, A. M., Davis, J., Cai, S., Singh, B. R. Molecular composition and extinction coefficient of native botulinum neurotoxin complex produced by Clostridium botulinum hall A strain. Protein. J. 32, 106-117 (2013).
  65. Kukreja, R. V., Singh, B. R. Comparative role of neurotoxin-associated proteins in the structural stability and endopeptidase activity of botulinum neurotoxin complex types A and E. 46, 14316-14324 (2007).
  66. Eisele, K. H., Fink, K., Vey, M., Taylor, H. V. Studies on the dissociation of botulinum neurotoxin type A complexes. Toxicon. 57, 555-565 (2011).

Tags

علم الأعصاب، العدد 85، توكسين، اختبار الأغذية والكشف والتحديد الكمي، مصفوفات معقدة، BoTest ماتريكس، كلوستريديوم، واختبار قوة
العزلة والكمي لالبوتولينوم السموم العصبية من مصفوفات مجمع باستخدام مصفوفة BoTest فحوصات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dunning, F. M., Piazza, T. M.,… More

Dunning, F. M., Piazza, T. M., Zeytin, F. N., Tucker, W. C. Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays. J. Vis. Exp. (85), e51170, doi:10.3791/51170 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter