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Neuroscience

Isolamento e quantificazione della neurotossina botulinica da matrici complesse usando il BoTest Matrix saggi

Published: March 3, 2014 doi: 10.3791/51170
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1BioSentinel Inc., Madison, WI

Summary

La neurotossina botulinica BoTest Matrix (BoNT) test di rilevazione rapida purificano e quantificare BoNT da una gamma di matrici. Qui vi presentiamo un protocollo per l'individuazione e la quantificazione delle BoNT da matrici sia solide e liquide e dimostriamo il test con BOTOX, i pomodori e il latte.

Abstract

È richiesto il rilevamento preciso e la quantificazione di neurotossina botulinica (BoNT) in matrici complesse per il settore farmaceutico, ambientale e test campione alimentare. È necessario un rapido BoNT sperimentazione di prodotti alimentari durante forense epidemia, la diagnosi del paziente, e la prova di sicurezza alimentare, mentre è richiesto il test di potenza accurate per la fabbricazione di prodotti a base di droga-BoNT e la sicurezza del paziente. Il biotest sui topi ampiamente usato per il test BoNT è altamente sensibile, ma manca la precisione e la velocità necessarie per un rapido e di routine test BoNT. Inoltre, l'uso del saggio biologico degli animali ha portato a inviti da parte delle autorità di regolamentazione dei prodotti di droga e sostenitori dei diritti degli animali negli Stati Uniti e all'estero per sostituire il biotest sui topi per il test BoNT. Diversi pezzi in vitro sono stati sviluppati che funzionano bene con purificata BoNT nel buffer semplici, ma la maggior parte non hanno dimostrato di essere applicabile a test in matrici molto complesse. Qui, un protocollo per la rilevazione diBoNT in matrici complesse utilizzando le BoTest Matrix test è presentato. Il saggio consiste di tre parti: la prima parte prevede la preparazione dei campioni per le prove, la seconda parte è un passo immunoprecipitazione con anticorpi anti-BoNT paramagnetici branelli rivestiti con anticorpo per purificare BoNT dalla matrice, e la terza parte quantifica proteolitica isolato di BoNT all'attività utilizzando un giornalista fluorogenica. Il protocollo è scritto per prove ad alta velocità in piastre a 96 pozzetti utilizzando matrici sia liquidi che solidi e richiede circa 2 ore di preparazione manuale con tempi totali dosaggio di 4-26 ore a seconda del tipo di campione, carico tossina, e la sensibilità desiderata. I dati sono presentati per BoNT / A test con soluzione salina tamponata con fosfato, un farmaco, supernatante di coltura, 2% latte e pomodori freschi e comprende discussione dei parametri critici di successo dosaggio.

Introduction

Neurotossine botuliniche (BoNT) sono le sostanze più letali noti, con via endovenosa dosi letali umane stimate a 1-3 ng / kg 1,2. Sette sierotipi strutturalmente simili di BoNT, etichettati A a G, esistere, ciascuno costituito da un dominio catena pesante responsabile cella vincolante, assorbimento e traslocazione nel citosol e una catena leggera che codifica una endopeptidasi zinco 3-5. La tossicità squisita BoNT deriva da, in parte, la sua voce specifica di legame e in motoneuroni a livello della giunzione neuromuscolare 6. Una volta all'interno del neurone, la endopeptidasi catena leggera specificamente fende uno o più dei solubile N-etilmaleimmide sensibile proteina recettore fattore di attacco (SNARE) proteine ​​necessarie per la fusione delle vescicole, inibendo il rilascio dei neurotrasmettitori e portando alla paralisi flaccida 7-14. Comunemente conosciuta come la malattia "botulismo", paralisi del diaframma e muscoli intercostali di BoNT in ultima analisi,insufficienza respiratoria e morte a meno che la diagnosi precoce e il trattamento vengono ricevuti.

Origine alimentare umana botulismo è più comunemente associato con BoNT sierotipi A, B, E e F (BoNT / A, BoNT / B, ecc) e solitamente deriva dalla ingestione di alimenti contaminati 15,16, anche se, diversi casi di botulismo della ferita sono stati segnalati tra gli utenti tossicodipendenti per via endovenosa 17,18. Negli Stati Uniti, botulismo infantile derivante dall'ingestione di spore di Clostridium dai bambini sotto l'anno di età è la forma più comune di botulismo 19-21. Tuttavia, focolai di origine alimentare BoNT derivanti da conserviera casa improprio e trasformazione dei prodotti alimentari sono stati riportati sia negli Stati Uniti e all'estero. Tra il 2000-2009, di almeno 338 casi di botulismo alimentare sono stati segnalati in tutto il mondo tra cui sei decessi 22. La capacità di rilevare rapidamente e sensibilmente focolai di botulismo di origine alimentare è un'indicazione importante che potrebbe aiutare la diagnosi precoce 23,24. Inoltre, i metodi di rilevamento che consentono di costo-efficacia e analisi degli alimenti di routine porteranno a migliorare la sicurezza alimentare.

Specificità neuronale di BoNT e lunga emivita biologica rende anche un potente terapeutico. Negli Stati Uniti, i farmaci a base di BoNT sono approvati dalla Food and Drug Administration per il trattamento di condizioni cosmetiche e disturbi neuromuscolari legati comprese le linee glabellari, distonia cervicale, emicranie, vescica iperattiva, e strabismo. Numerose applicazioni "off-label" sono documentati, compresi i trattamenti ad alte dosi per gravi disfunzioni muscolo 25-28. Accurate tossina quantificazione è fondamentale per il corretto dosaggio, come sottodosaggio può portare a un trattamento inefficace mentre sovradosaggio mette i pazienti a rischio di effetti collaterali potenzialmente dannosi. Purtroppo, nessun protocollo di dosaggio potenza standard è condiviso tra i produttori, con conseguente disparità di definizione dell'unità tra produttori farmaco a base di BoNTcts 29-31.

Il test standard per BoNT è il biotest sui topi in cui BoNT contenenti campioni vengono iniettati per via intraperitoneale in topi e il numero di morti registrati oltre 1-7 giorni 16,32,33. Il biotest sui topi è molto sensibile, con limiti di rilevabilità (LOD) di 5-10 pg BoNT / A 34, tuttavia, le preoccupazioni etiche sull'uso degli animali, l'alto costo della formazione del personale e manutenzione degli impianti di polizia, i tempi di analisi lunghi, e la mancanza di protocolli standardizzati portato nelle chiamate a sviluppare standard, privo di animali BoNT prove e metodi di quantificazione 35-39. Recentemente, diversi alternativi metodi di quantificazione BoNT sono stati sviluppati che offrono mouse o quasi il mouse sensibilità bioassay 40-49. Questi metodi usano comunemente fluorescenza, spettrometria di massa, o metodi immunologici e offrono tempi di analisi molto più breve dei biotest sui topi senza l'uso degli animali. Spettrometria di massa approcci combinati con Techniq immunologicaUES hanno mostrato di rilevare e quantificare BoNT contenuta negli alimenti e altri campioni complessi, tuttavia, le esigenze di formazione del personale e limite di attrezzature specializzate questi saggi 50-55. La maggior parte degli altri test alternativi non sono facilmente applicabili a una prova a campione complessa o non hanno la velocità necessaria per l'analisi di routine BoNT. La natura altamente variabile della viscosità del campione alimentare, pH, contenuto di sale, e costituenti della matrice rappresenta una sfida particolarmente difficile quando si cerca di sviluppare metodi in vitro test con la sensibilità per abbinare l'estrema potenza di BoNT. Inoltre, anche i sistemi tampone semplici e relativamente benigni, come quelli derivanti dalla risospensione dei prodotti farmaceutici a base di BoNT, contengono sale, albumina, zucchero e stabilizzanti (cioè eccipienti) che hanno un impatto significativo in vitro BoNT potenza 56. È necessaria purificazione tossina per il test dell'attività accurata di tutti, ma il più semplice dei campioni 56-59.

IlBoTest saggi Matrix sono stati progettati per una rapida, high-throughput, e la quantificazione coerente del BoNT da campioni altamente complessi che utilizzano attrezzature che si trovano comunemente nei laboratori di ricerca 56,60. Questi saggi usano perline paramagnetiche covalentemente legati ad anticorpi sierotipo-specifici anti-BoNT di legare e sequestrare BoNT su un campione e poi rimuovere composti interferenti matrice mediante lavaggio. Dopo il lavaggio, legato attività proteolitica BoNT viene quindi quantificata in un tampone di reazione ottimizzato utilizzando un giornalista compatibile con il sierotipo BoNT in fase di test. Questi giornalisti sono proteine ​​fluorogeniche costituiti da una proteina fluorescente ciano N-terminale (PCP) frazione e un C-terminale giallo fluorescente derivato proteico (Venere) frazione collegate da un substrato BoNT, residui SNAP25 141-206 o residui sinaptobrevina 33-94 costituisce il BoTest A / E o B / D / giornalisti F / G, rispettivamente, 45. Reporter scissione da BoNT è controllata mediante Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET). Quando tegli giornalista è intatto, eccitazione del CFP si traduce in FRET a Venere, tempra emissione CFP ed emozionante emissione di Venere. Clivaggio del reporter da BoNT impedisce FRET, portando ad un aumento delle emissioni CFP e diminuzione delle emissioni Venus. Attività BoNT può essere misurato quantitativamente utilizzando il rapporto tra le emissioni PCP e Venus. LOD di sotto del 3 pg sono possibili da una vasta gamma di alimenti utilizzando un formato piastra a 96 pozzetti high-throughput 56. Maggiore sensibilità può essere ottenuta usando campioni di volume poiché il test permette concentrazione della tossina sulla superficie delle sfere.

I saggi Matrix BoTest per BoNT A, B, E e F sono stati sviluppati e testati con il cibo, farmaceutica e campioni ambientali 56,60. Qui, descriviamo le procedure per l'esecuzione di questi test per la rilevazione di BoNT a bassa complessità (ad es farmaceutica, BoNT in tampone) e elevata complessità (ad esempio alimenti, ambientale) campioni. Metodi di lavorazione specificiper diversi tipi di campioni sono affrontati in questo protocollo e tipi di campioni qui non descritti possono solitamente essere adattati utilizzando una combinazione dei metodi presentati. Il protocollo è stato sviluppato e testato con BoNT / A, ma è adattabile ad altri sierotipi BoNT utilizzando i rispettivi saggi come dimostrato altrove 56,60.

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Protocol

1. Preparazione dei reagenti del dosaggio

  1. Thaw ditiotreitolo 200x (DTT), 10x Matrix Binding Buffer (10x Binding seguito buffer), 10x tampone di neutralizzazione (solo per prodotti alimentari e pH campioni squilibrate) e 10x BoTest tampone di reazione (10X Reaction Buffer di seguito) a temperatura ambiente (RT) per 15 min o fino a completo scioglimento. Vedi Tabella 1 per un elenco dei tamponi e reagenti utilizzati in questo protocollo. Vedere la Tabella 2 per un elenco dei materiali e delle attrezzature necessarie per questo protocollo.
  2. Agitare i buffer scongelati per 5 secondi per mescolare. 10x neutralizzazione del buffer, 200xDTT, e 10x tampone di reazione dovrebbe apparire chiaro, mentre il buffer Binding 10x avrà un aspetto torbido. Riscaldare il tampone di reazione 10x per 5 min a 37 ° C e ripetere vortex se appare torbido dopo lo scongelamento.
  3. Generare 3,8 ml di tampone di reazione 1x.
    1. Etichettare una provetta "buffer di reazione 1x" 15 ml e aggiungere 3,42 ml di grado wat biologia molecolareer, 380 microlitri di buffer di reazione 10x, 200x e 19 microlitri DTT. Mescolare tampone bene per inversione.
    2. Gli inibitori Tagliare una singola compressa inibitore della proteasi libero-EDTA in quartieri con una lama di rasoio pulito e aggiungere un quarto della tavoletta al buffer di reazione 1x (la parte tablet rimanente può essere conservato a 4 ° C per un uso successivo). NB proteasi non possono essere necessario se si utilizza tossina purificata e tamponi semplici (ad esempio campioni farmaceutici).
    3. Vortex il buffer di reazione 1x fino a quando il tablet proteasi sia completamente dissolto.
  4. Riscaldare le perle Matrix A (perline IP-A di seguito) per 20 min a RT.
  5. Scongelare il giornalista BoTest A / E (A / E giornalista di seguito) a temperatura ambiente al riparo dalla luce.
  6. Etichettare un tubo da 15 ml "0,5 micron A / E giornalista" e aggiungere 45 ml di 20 mM A / E giornalista stock da 1,8 ml di 1x tampone di reazione. Mescolare accuratamente pipettando e memorizzare sul ghiaccio al riparo dalla luce.

2. Stare in piediard Generation Curva Campione

La curva standard qui descritta si estende 10-30,000 MLD 50 / g di alimento o per ml di tampone in diluizioni metà-log (Tabella 3). L'utente finale è libero di utilizzare concentrazioni alternativi come applicabile.

  1. Chiodare e incubando le matrici con materiale di riferimento. Generare la curva standard utilizzando un diluente della stessa matrice come l'ignoto, se possibile, per ridurre gli effetti della matrice. Utilizzare gelatina tampone fosfato (GPB) o soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) come diluente, se aggiuntivi, matrice BoNT-negativo non è disponibile (pieno campo o BoNT test campione focolaio). Generare la curva standard da chiodare BoNT / A nella matrice di scelta seguendo il protocollo appropriato.
    1. Campioni a bassa complessità (p.es. PBS, GPB, o farmaceutico)
      1. Aggiungere 10 ml di tampone appropriato per un tubo da 15 ml e mettere da parte. In questo esempio verrà utilizzato come diluente per la standard curva e diluizioni sconosciuti (sezione 4).
      2. Aggiungere 1,2 ml di tampone in una provetta.
      3. ATTENZIONE: Questo passo utilizza BoNT e estrema cautela deve essere usata durante la manipolazione e lo smaltimento di tutti i reagenti e materiali che vengono a contatto con la tossina. L'uso di dispositivi di protezione individuale e il corretto smaltimento di tutti i materiali deve essere effettuata secondo il Dipartimento del Lavoro linee guida OSHA per BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) degli Stati Uniti. Aggiungi BoNT / A al campione di 1,2 ml tale che la concentrazione finale è di 30.000 mld 50 / ml (36,000 MLD 50 totali).
    2. Campioni di alimenti liquidi (o altri campioni liquidi complessi) Nota: I test iniziali si raccomanda di determinare il volume del surnatante recuperato da campioni chiarito come il particolato (. Es. pasta) in matrici liquide varierà. Questo protocollo assume almeno 1,2 ml del surnatante chiarificato saranno recuperati da una samp 1,4 mlLe. Aumenta la dimensione del campione, se necessario.
      1. Aggiungere 10 ml di cibo liquido da un tubo da 15 ml e metterlo da parte. In questo esempio verrà utilizzato come diluente per la curva standard e diluizioni sconosciuti (sezione 4).
      2. Pesare una provetta da 1,5 ml vuota e registrare la sua massa.
      3. Aggiungere 1,4 ml di prodotto alimentare liquido alla provetta pesato.
      4. Pesare la provetta e calcolare la massa del campione alimentare aggiunto sottraendo la massa del tubo vuoto.
      5. ATTENZIONE: Questo passo utilizza BoNT e estrema cautela deve essere usata durante la manipolazione e lo smaltimento di tutti i reagenti e materiali che vengono a contatto con la tossina. L'uso di dispositivi di protezione individuale e il corretto smaltimento di tutti i materiali deve essere effettuata secondo il Dipartimento del Lavoro linee guida OSHA per BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) degli Stati Uniti. Aggiungere BoNT / A al campione 1,4 ml ad una concentrazione finale di 30.000 MLD 50 / g cibo.
      6. IncubazioneTE diluente e spillo campioni a temperatura ambiente oa 4 ° C per 2 h per dare il tempo BoNT per interagire con la matrice alimentare, simulando una contaminazione naturale.
    3. Campioni solidi alimentari (o altri campioni solidi) Nota: I test iniziali si raccomanda di determinare il volume del surnatante recuperato dai campioni omogeneizzati e chiarite dopo l'aggiunta di 1 ml GPB / g di cibo. Questo protocollo presuppone che almeno 1,2 ml chiariti surnatante verrà recuperata da un campione di 2 g. Aumenta la dimensione del campione, se necessario.
      1. Pesare 10 g di campione solido in una provetta da 50 ml e mettere da parte. Questo verrà utilizzato come diluente.
      2. Pesare 2 g di campione di cibo solido in una seconda provetta da 50 ml.
      3. ATTENZIONE: Questo passo utilizza BoNT e estrema cautela deve essere usata durante la manipolazione e lo smaltimento di tutti i reagenti e materiali che vengono a contatto con la tossina. L'uso di dispositivi di protezione individuale e il corretto smaltimento di tutto il materiales deve essere eseguita secondo il Dipartimento del Lavoro linee guida OSHA per BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) degli Stati Uniti. Aggiungere BoNT / A alla superficie del campione 2 g ad una concentrazione finale di 30.000 MLD 50 / g alimentare (60.000 mld totale 50).
      4. Incubare il diluente e campioni addizionati a temperatura ambiente oa 4 ° C per 2 h per dare il tempo BoNT per interagire con la matrice alimentare, simulando una contaminazione naturale.
  2. Regolazione omogeneizzazione del campione e tampone. Elaborare il campione curva standard a spillo e diluente generato come sopra in base al tipo di campione.
    1. Campioni a bassa complessità
      1. Nessun ulteriore campione di trasformazione è necessaria.
    2. Campioni di alimenti liquidi (o altri campioni liquidi complessi)
      1. Nessun campione omogeneizzazione è necessario.
      2. Aggiungere 140 microlitri di buffer 10x neutralizzazione di 1,4 ml a spillo campione e 1 ml 10x Neutralization tampone al campione del diluente 10 ml. Miscelare bene i campioni per inversione.
      3. Parzialmente chiarire entrambi i campioni mediante centrifugazione per 10 min a 6000 xg e 4 ° C. Rimuovere immediatamente il surnatante e trasferire ai nuovi tubi.
    3. Campioni di alimenti solidi (o altri campioni solidi)
      1. Aggiungere 2 ml di GPB (1 ml GPB / g cibo) al 2 g BoNT / A-spillo solido campione di cibo e 10 ml GPB al campione del diluente 10 g.
      2. Omogeneizzare i campioni con un pestello fino a ben amalgamato. A seconda della natura del campione, ci possono essere piccoli pezzi di materiale che non può essere omogeneizzato, che è accettabile. In alternativa, possono essere utilizzati metodi di omogeneizzazione meccanici. Un miscelatore non è raccomandato in quanto può inattivare nonché vaporizzerai la tossina.
      3. Aggiunta del volume 1/10th di 10x tampone di neutralizzazione al campione diluente sulla base del volume totale approssimativa (ad esempio 2 ml se il volume è di 20 ml). Estrapolareil volume totale del / campione BoNT A-spillo e aggiungere volume 1/10th di 10x tampone di neutralizzazione. Miscelare bene i campioni per inversione.
      4. Parzialmente chiarire entrambi i campioni mediante centrifugazione per 10 min a 6000 xg e 4 ° C. Rimuovere immediatamente il surnatante e trasferire ai nuovi tubi.
  3. Preparare diluizioni seriali curva standard per i test
    1. Utilizzando il / A-spillo campione curva standard BoNT come D1 e il campione nonspiked come diluente, generare i campioni rimanenti curva standard in provette da 1,5 ml microcentrifuga secondo la Tabella 3.

3. Preparare campioni sconosciuti

Questa sezione può essere completata in parallelo alla sezione 2.

  1. Determinare il numero e diluizioni di incognite. Prova incognite in triplice copia, se possibile.
    1. Per i test qualitativi, eseguire le incognite senza ulteriore diluizione di quanto necessario per elaborare il campione come descriletto sotto.
    2. Per le analisi quantitative, preparare almeno due campioni 1:10 diluizione, come descritto di seguito, per garantire che uno o più campioni rientrano nell'intervallo lineare della risposta dosaggio. Generare diluizioni usando un diluente della stessa matrice come l'ignoto, se possibile, per ridurre gli effetti della matrice come descritto nella Sezione 3. In caso contrario, utilizzare PBS o GPB come diluente.
  2. Generazione e diluire i campioni sconosciuti in base al tipo di campione.
    1. Incognite bassa complessità (ad esempio PBS, GPB, o farmaceutico)
      1. Aggiungere almeno 750 microlitri sconosciuti in una provetta per generare sconosciuto diluizione 1.
      2. Aggiungere 675 ml di diluente a due tubi microcentrifuga etichettati sconosciuto diluizione 2 e 3. Il diluente sarà lo stesso materiale utilizzato per la generazione curva standard.
      3. Serialmente diluire diluizione 1 trasferendo 75 ml di diluizione 1 nella provetta di diluizione 2 e miscelazione.
      4. Serie dilute diluizione 2 trasferendo 75 ml di diluizione 2 nella provetta 3 diluizione e miscelazione.
    2. Incognite alimentari liquidi (o altri campioni liquidi complessi) Nota: I test iniziali si raccomanda di determinare il volume del surnatante recuperato da campioni chiarire come discusso nella sezione 3. Aumenta la dimensione del campione, se necessario.
      1. Aggiungi ≥ 875 ml di liquido sconosciuto in una provetta.
      2. Aggiungere il volume 1/10th di 10x tampone di neutralizzazione al campione (ad esempio, 87,5 ml per un campione di 875 ml).
      3. Parzialmente chiarire il campione mediante centrifugazione per 10 min a 6000 xg e 4 ° C. Trasferire immediatamente il surnatante in una nuova provetta. Questo è sconosciuto diluizione 1.
      4. Aggiungere 675 microlitri diluente per due provette etichettate Unknown diluizione 2 e 3. Il diluente sarà lo stesso materiale trattato utilizzato per la generazione curva standard.
      5. Serie diluire diluizione 1 mediante bonificoAnello 75 ml della diluizione 1 nella provetta di diluizione e miscelazione 2.
      6. Serialmente diluire diluizione 2 trasferendo 75 ml di diluizione 2 nella provetta 3 diluizione e miscelazione.
    3. Incognite cibo solido (o altri campioni solidi) Nota: I test iniziali si raccomanda di determinare il volume del surnatante recuperato da campioni chiarire come discusso nella sezione 3. Aumenta la dimensione del campione, se necessario.
      1. Pesare 2 g di campione sconosciuto solido in una provetta da 50 ml.
      2. Aggiungere 2 ml di GPB (1 ml GPB / g di cibo) al campione solido 2 g.
      3. Omogeneizzare i campioni come descritto nella Sezione 3.2.3.2.
      4. Aggiunta del volume 1/10th di 10x tampone di neutralizzazione al campione sulla base del volume totale approssimativa (ad esempio 0,4 ml se il volume è 4 ml). Miscelare bene i campioni per inversione.
      5. Parzialmente chiarire il campione mediante centrifugazione per 10 min a 6000 xg e 4 ° C. IMMEDIATAMENTEtrasferimento y ≥ 750 microlitri surnatante in una provetta. Questo è sconosciuto diluizione 1.
      6. Aggiungere 675 ml di diluente a due tubi etichettati sconosciuto diluizione 2 e 3. Il diluente sarà lo stesso materiale trattato utilizzato per la generazione curva standard.
      7. Serialmente diluire diluizione 1 trasferendo 75 ml di diluizione 1 nella provetta di diluizione 2 e miscelazione.
      8. Serialmente diluire diluizione 2 trasferendo 75 ml di diluizione 2 nella provetta 3 diluizione e miscelazione.

4. Finale Chiarimento Esempio

Se il liquido di prova o campioni alimentari solidi, centrifugare tutti i campioni per 5 min a ≥ 14.000 xg in una microcentrifuga a chiarire completamente i campioni. Rimuovere immediatamente il surnatante e trasferire ai nuovi tubi.

5. Setup Plate e BoNT / A tirare verso il basso

  1. Il layout specifico piatto dipende dall'applicazione, tuttavia, non utilizzare i pozzetti esterni in modo daal fine di evitare effetti di bordo. Ogni campione sconosciuto e campione curva standard D1-D8 necessita di 3 pozzi mentre campione D9 richiede 6 pozzetti. Un layout piatto proposto è mostrato in Figura 1.
  2. Aggiungere 20 microlitri 10x tampone di legame a ciascun pozzetto per essere utilizzato.
  3. Aggiungere 200 ml di ogni diluizione chiarito e sconosciuta a ciascuno dei tre pozzi (sei pozzi per D9) per i test triplice copia. Mescolare la piastra per 10 secondi con un miscelatore micropiastra.
  4. Aggiungere le perle IP-A.
    1. Vortex le perline IP-A per 10 secondi alla massima velocità. Continua vortex se perle non sono completamente risospese e omogeneo.
    2. Pipette 20 microlitri IP-A perline per ogni campione bene.
    3. Mescolare la piastra per 30 secondi con un miscelatore micropiastra.
  5. Incubare la piastra con una piastra rotante incubatore per 2 ore a 750 rpm, 25 ° C o RT. Prestazioni dell'analisi dipende altamente generare e mantenere il PI-A sospensione di sferette durante tutte le fasi di incubazione. Perline sempre riattivare con Microfonitardi mixer dopo pellet e mantenere la sospensione con un orbitale per micropiastre shaker durante tutte le fasi di incubazione.

6. Lavaggio Plate e Bead Resuspension

  1. Lavare i piatti a mano o tramite una rondella magnetica piatto automatizzata compatibile tallone. Un lavatore automatico configurato per biglie magnetiche aumenta notevolmente la velocità di analisi.
    1. Lavaggio manuale
      1. Etichettare un tubo da 50 ml "tampone 1x Wash" e aggiungere 45 ml di acqua per biologia molecolare e 5 ml 10x Matrix tampone di lavaggio. Mescolare tampone bene per inversione.
      2. Rimuovere la piastra dal piatto rotante incubatrice.
      3. Porre immediatamente la piastra su una piastra di separazione 96 pozzetti perla magnetica per 5 min.
      4. Pur mantenendo la piastra sulla piastra a 96 pozzetti separazione magnetica tallone, rimuovere delicatamente e scartare il surnatante dai pozzetti dei campioni con una pipetta-canale multi-singolo o. Non aspirareperline visivamente controllano il buffer aspirato nel puntale per la rimozione cordone accidentale. Se la rimozione è testimoniata, aggiungere delicatamente il contenuto punta di nuovo al pozzo, riselezionare, e ripetere la rimozione.
      5. Aggiungere 300 microlitri 1x tampone di lavaggio a ciascun pozzetto.
      6. Risospendere completamente le perle mescolando la piastra per 30 secondi su un mixer micropiastra.
      7. Incubare la piastra sulla piastra di separazione 96 pozzetti branello magnetico per 2 min.
      8. Rimuovere ed eliminare il surnatante dai pozzetti del campione come prima.
      9. Ripetere i passaggi 6.1.1.5-6.1.1.8 altre tre volte per un totale di 4 lavaggi.
      10. Con la piastra sulla piastra di separazione 96 pozzetti branello magnetico, ispezionare visivamente i pozzetti per confermare addirittura la rimozione surnatante; utilizzare una pipetta per rimuovere l'eccesso di tampone residuo, se necessario. Alcuni tampone rimarrà nei pozzetti e la cura deve essere presa per evitare la rimozione tallone o tallone essiccazione.
      11. Aggiungere 50 microlitri 1x tampone di reazione in ciascun pozzetto campione e mescolare la piastra per 30 seC su un agitatore per micropiastre per risospendere completamente le microsfere. Se necessario, utilizzare una pipetta per risospendere completamente le sfere.
    2. Lavaggio automatico Piatto
      1. Installazione e programma la lavatrice secondo la Tabella 4. Pulire e lavare la rondella di alta qualità (ad esempio Nanopure) di acqua.
      2. Prime la rondella eseguendo il programma "Prime".
      3. Rimuovere la piastra dal piatto rotante incubatrice.
      4. Porre immediatamente la piastra sulla piastra di separazione 96 pozzetti perlina magnetica sulla rondella piastra.
      5. Eseguire il programma di collegamento "Master Wash". Il primo passo è un programma di incubazione 5 min passaggio in cui la rondella sarà stazionaria.
      6. A seguito del completamento del programma, rimuovere la piastra dalla lavatrice, aggiungere 50 microlitri di buffer di reazione 1x a ciascun campione, e mescolare la piastra per 30 secondi su un mixer micropiastra per risospendere completamente le sfere. Se necessario, utilizzare una pipetta per risospendere completamente le sfere.

    7. Assay Iniziazione e incubazione

    1. Aggiungere 50 microlitri 0,5 micron A / E reporter (cfr. sezione 1) in ciascun pozzetto campione e mescolare per 30 secondi su un mixer micropiastra per risospendere completamente le sfere.
    2. Aggiungere 100 microlitri di acqua a ciascun bene inutilizzato sul piatto per evitare effetti di bordo.
    3. Sigillare la piastra con piastra nastro sigillante e incubare la piastra con una piastra rotante termostato a 750 rpm, 25 ° C o RT. Proteggere la piastra dalla luce durante l'incubazione.

    8. Raccolta dati e analisi

    Nota: Questo test è un test in tempo reale che può essere misurato più volte fino ad ottenere la sensibilità desiderata, non ci sono terminatori richiesti. Tempi consigliati di lettura iniziali sono 2, 4, e 24 ore di tempo di incubazione con la sensibilità del test aumenta con il tempo di incubazione.

    1. La raccolta dei dati
      1. Ad ogni volta leggere, rimuovere la piastra dal piatto rotante incubatore, rimuovere il sigilloing nastro e collocare immediatamente la piastra sulla piastra di separazione 96 pozzetti branello magnetico. Lasciare le perline si separino per 2 min.
      2. Posizionare la piastra nel lettore per micropiastre e misurare le emissioni a ~ 470 e ~ 526 nm in eccitazione a ~ 434 nm.
      3. Se si desiderano ulteriori tempi di lettura, risospendere le sfere per 30 sec sul mixer micropiastra, sigillare la piastra, e restituire la piastra alla piastra rotante incubatore.
    2. Analisi dei dati
      1. Calcolare il rapporto di emissione per ogni campione dividendo la relativa unità di fluorescenza (RFU) valore a 526 nm dal valore RFU a 470 nm.
      2. Tracciare il rapporto delle emissioni rispetto al log [BoNT / A] per i punti dati della curva standard. A seconda della diluizione BoNT / A collaudato, una curva dose-risposta sigmoidale sarà ottenuta (vedi Rappresentante dei risultati).
      3. Inserire i dati della curva standard con la pendenza della curva dose-risposta variabile Y = Basso + (Alto-Basso) / (1 ​​+10 ^ ((logEC 50-X) * versante)) dove X è l'logaritmo della concentrazione, Y è la risposta, e Y inizia in basso e va verso l'alto con una forma sigmoidale.
      4. Determinare i limiti di rilevabilità (LOD), limite di quantificazione (LOQ), e la concentrazione effettiva metà-massimale (CE 50). Limiti di rilevamento sono definite come un campione avente un rapporto di emissione meno di 3 deviazioni standard (DS) sotto i controlli in bianco (n = 6). Limiti di quantificazione sono definiti come un campione avente un rapporto di emissione inferiore a 10 DS al di sotto dei controlli in bianco (n = 6). CE 50 è determinata dalla sigmoidale dose-risposta fitting.
      5. Interpolare la potenza di tutti i campioni sconosciuti contro la relazione dose-risposta curva standard sigmoidale.
        1. Per risultati quantitativi, il campione sconosciuto dovrebbe idealmente rientrare nella porzione lineare della curva standard. Approssimare la porzione lineare della curva standard calcolando la finestra risposta dosaggio 20-80% totale (ad esempio se il rapporto di emissione della curva standard ranges 0,5-2,5, nell'intervallo lineare sarebbe la porzione della curva standard che varia 0,9-2,1).
        2. Per i risultati qualitativi, confrontare il campione sconosciuto con il LOD e LOQ della curva standard.
        3. Non estrapolare campioni sconosciuti oltre i limiti della curva standard.

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Representative Results

Un diagramma che riassume i passaggi del protocollo descritto è illustrato nella Figura 2. Il test richiede tra 4-26 ore per completare a seconda del tipo di campione e dalla sensibilità del test desiderato, ma solo ~ 2 ore di hands-on tempo. Il test viene eseguito in piastre da 96 pozzetti e, a seconda del tipo di test in corso, permette test triplicato di fino a 20 campioni anche standard per piastra.

La figura 3 mostra i risultati del test rappresentativi utilizzando BoNT / A holotoxin spillo in PBS e testato con il protocollo descritto di seguito 2, 4, e 24 ore di incubazione con il giornalista A / E. Purificato BoNT / A holotoxin stato scelto per questo esperimento perché il suo peso molecolare definito di ~ 150 kDa, rispetto al più ampio definito 700-900 kDa per il complesso tossina, e la purezza consentire spiking molto preciso a concentrazioni precise. Il rapporto di emissione, il rapporto di emissione a 526 nm a 470 nm che a seguito di eccitazione a 434nm, in ogni punto il tempo è tracciata contro BoNT / A concentrazione (il valore MLD 50 si basa su test di potenza della BoNT / A del produttore). Clivaggio del reporter da BoNT viene misurata come riduzione del rapporto di emissione, che con il nostro lettore di piastre varia tra circa 2.7 per il reporter intatto a circa 0,7 per il reporter completamente scissa. È importante notare che, poiché ogni misure lettore di piastre a fluorescenza in RFU, il valore effettivo del coefficiente di emissione dipenderà il lettore di piastra utilizzata. Prolungamento del tempo di incubazione con i risultati Reporter in aumento clivaggio giornalista viste da un spostamento verso sinistra della curva. I punti dati, testati in triplice copia, display a bassa deviazione standard della media e seguono l'andamento previsto del rapporto aumentato di emissione con diminuzione del carico di tossine. Fallimento del test di seguire questa tendenza attesa potrebbe indicare un errore durante la generazione diluizione o plotting di dati. I rapporti di emissione dei controlli che non contengono BoNT / A rimangono costanti During incubazione (Figura 3, riquadro), che indica l'assenza di attività della proteasi aspecifica.

Un esempio di utilizzo di questo protocollo di quantificare campioni farmaceutici BoNT / A è mostrato in Figura 4. Una curva standard è stata generata in PBS con purificata BoNT / A holotoxin ed elaborati in parallelo con diluizioni del farmaco generati da un singolo 100 U fiala di BOTOX liofilizzato reidratato in soluzione fisiologica 0,9%. (Idealmente, la curva standard sarebbe composto da lotti di riferimento di BOTOX ma tale materiale non è prontamente disponibile.) I campioni sono stati analizzati utilizzando il protocollo descritto con l'eccezione che 50 campioni microlitri sono stati testati in duplicato senza l'uso di 10x tampone di legame. La curva standard è stata tracciata in funzione della concentrazione BoNT A / seguente 24 ore di incubazione con il reporter A / E. Il rapporto di emissione di ciascun campione sconosciuto è stato quindi visualizzato riportando la sua intersezione sulla curva standard. In questo saggio, la lineaar porzione della curva standard (finestra risposta dosaggio 20-80%) risulta compresa tra un rapporto di emissione di 2,11-1,05 ed è indicato dal riquadro tratteggiato in figura. Le concentrazioni dei tre incognite che rientrano in questo intervallo lineare stati poi interpolati dalla curva standard (Figura 4, riquadro). Questo esempio dimostra la metodologia generale che potrebbe essere utilizzato per rilevare o quantificare un campione sconosciuto con una curva standard.

Pomodori freschi e latte 2% sono stati scelti per dimostrare le prestazioni del protocollo e la sensibilità utilizzando sia un solido (pomodoro) e liquidi alimentari (latte 2%) della matrice. BoNT complessa / composto dal nucleo holotoxin e proteine ​​neurotossina-associato (PAN) è stato selezionato per questi esperimenti perché questa preparazione assomiglia alla tossina prodotta durante una contaminazione Clostridium naturale. Come mostrato in Figura 5A, recupero di BoNT / A, misurata come clivaggio del reporter A / E, si osserva con bmatrici OTH. Aumento del tempo di incubazione con il giornalista aumenta la sensibilità del test, ma non si traduce in rapporti di emissione diminuiti per i controlli senza tossina (Figura 5A, inserti), indicando i risultati scissione osservati da BoNT / A e proteasi non aspecifica riporto dal cibo nel saggio. Come con la figura 3, il display dati a bassa variabilità e segue l'andamento atteso del diminuita giornalista scissione con la riduzione della concentrazione di tossine.

La BoNT / A LOD, LOQ, e EC 50 per entrambi gli alimenti in ogni tempo indicato sono riassunti nella Tabella 5. Il LOD e LOQ sono definiti come il campione più bassa concentrazione con un rapporto di emissione inferiore a tre e dieci DS al di sotto di fondo (campioni che non contengono BoNT / A), rispettivamente. Questi limiti sono limitati ai punti dati testati, sebbene l'interpolazione della curva dose-risposta sigmoidale può essere utilizzato per calcolare i limiti teorici inferiori. Alcuni matrice-to-variabilità matrice in LOD e LOQ è previsto, come effetti matrice possono influenzare il legame della tossina ai talloni e al recupero delle perle durante il lavaggio. Mentre sembrerebbe che non vi era più ripresa tossina dal 2% di latte di pomodori dai dati in figura 5A, gran parte di questa differenza risulta dalla diluizione aggiuntivo necessario per omogeneizzare campioni di pomodoro in GPB.

Oltre ad essere un solido matrice alimentare, pomodori sono un tipo di esempio notevole dove pH e forza ionica regolazione, ottenuto con l'aggiunta di 10x tampone di neutralizzazione, è fondamentale per il successo dosaggio. Figura 5B illustra risposte dosaggio durante il test pomodori con o senza inclusione di buffer Neutralizzazione 10x. La mancata aggiungere i 10x risultati tampone di neutralizzazione in cattive recupero di BoNT / A da campioni ed è dimostrato da un rapporto costante emissione attraverso tutte le concentrazioni BoNT / A testati. Aggiunta del tampone Neutralizzazione 10x, però, risultati di rivelazione sensibile della tossina.

Proteasi non specifici contenuti in matrici complesse può portare a falsi positivi se non affrontati dal proteasi diversi da BoNT possono scindere il giornalista A / E. Proteasi aspecifici possono essere endogeni al campione di alimento o introdotti durante l'uso preparativi BoNT nonpurified come Clostridium surnatanti di coltura. Un'accurata tallone lavaggio rimuoverà proteasi più aspecifici, tuttavia, l'aggiunta di inibitori della proteasi per il tampone di reazione è fondamentale figura 6 mostra l'attività della proteasi non specifica trovato Clostridium BoNT / A surnatanti di coltura utilizzando un giornalista A / E modificato, BoTest KO (KO giornalista. ). Il reporter KO è la stessa come il reporter A / E con l'eccezione che la BoNT / A sito di clivaggio è stato mutato in modo tale che non è più tagliata da BoNT / A. Pertanto, qualsiasi giornalista scissione osservato il risultato di attività della proteasi specifica. Gli alti livelli di KO giornalista CLEAvage indica il supernatante di coltura contiene un alto livello di attività della proteasi, ma che l'attività è effettivamente negata con l'aggiunta di inibitori della proteasi.

I dati di esempio dimostrano l'utilità del protocollo per alto rendimento BoNT / A rilevamento nei buffer semplici e matrici alimentari. Alcuni alimenti possono richiedere piccoli aggiustamenti del dosaggio, ma il protocollo descritto dovrebbero dare buoni risultati con la maggior parte dei tipi di alimenti.

Figura 1
Figura 1. Consigliato layout della piastra. Campioni sono limitati ai interiori 60 pozzetti della piastra per evitare possibili effetti di bordo. Campioni curva sconosciuti o standard possono essere aggiunti, se lo desideri. Tutti i pozzetti non utilizzati devono essere riempiti con 100 microlitri di acqua durante il giornalista incubazione. Click qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 2
Figura 2. Schema del protocollo descritto. Ogni passo importante nel protocollo è indicato da una casella con l'etichetta e allineato accanto a una timeline dosaggio approssimativo (non in scala). Campioni non alimentari non richiedono l'elaborazione del campione e così entrano nel protocollo valle di campioni alimentari. La casella tratteggiata intorno generazione diluizione seriale per le incognite indica che questo è un optional, ma consigliato, passo. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 3
Figura 3. Rilevamento di BoNT / A holotoxin in PBS usando il protocollo descritto.Purificata BoNT / A holotoxin è stata aggiunta in PBS e testato utilizzando il protocollo descritto con una BoNT / A concentrazione superiore di 1 nm. Tutti i campioni sono stati testati in triplicato e le barre di errore rappresentano la deviazione standard della media. Segnalato potenza si basa sul mouse bioassay test della tossina del produttore. Il rapporto di emissione (il rapporto di emissione a 526 nm a 470 nm su di eccitazione a 434 nm) della curva standard è stata misurata dopo 2, 4, e 24 ore di incubazione con A / E giornalista e grafico in funzione di BoNT / A concentrazione . Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 4
Figura 4. Quantificazione del BOTOX prodotto di droga utilizzando il protocollo descritto. Un'unica 100 U fiala di liofilizzato farmaco BOTOX era resuspe NDED in 220 ml di soluzione salina allo 0,9%, diluito in serie, e testati sconosciuti contro una curva standard made in PBS usando purificata BoNT / A holotoxin. I campioni sono stati testati secondo il protocollo descritto eccetto che 50 campioni microlitri sono stati testati senza 10x tampone di legame in duplicato. La curva standard è stato calcolato il rapporto sagomata emissione dei campioni curva standard agli impianti sigmoidale equazione dose-risposta variabile ed è tracciata in funzione della concentrazione BoNT A /. Ogni campione sconosciuto viene mostrato dove si interseca con la curva standard a seguito di un hr incubazione 24 con il reporter A / E. Le concentrazioni dei campioni sconosciuti rientrano nel range lineare (casella ombreggiata tratteggiata) sono stati interpolati dalla curva standard. L'etichetta per ogni Sconosciuto BOTOX è il numero di unità presenti nel campione sulla base di potenza marcato. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard della media.t = "_blank"> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 5
Figura 5. Recupero di BoNT / A-spillo 2% di latte e il collaudo di pomodori freschi utilizzando il protocollo descritto. Campioni di latte 2% e pomodori freschi sono stati aggiunti purificato BoNT / A complessa e testato utilizzando il protocollo descritto. Tutti i campioni sono stati testati in triplicato e le barre di errore rappresentano la deviazione standard della media. (A) Il rapporto di emissione del latte 2% e pomodori freschi curve standard sono stati misurati dopo 2, 4, e 24 ore di incubazione con A / E giornalista e tracciate in funzione di BoNT / A potenza. (B) Il mancato di includere il buffer 10x neutralizzazione durante risultati dei test di pomodoro in un fallimento del test. Campioni di pomodoro fresco sono stati testati secondo il protocollo descritto con o senza aggiunta di 10x Neutralzione del buffer. I dati indicati sono per il punto di tempo di 4 ore. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 6
Inibitori Figura 6. Proteasi sono necessari quando il test matrici complesse. Clostridium BoNT / A (ceppo Sala A) coltura supernatante è stato diluito serialmente in PBS e testato utilizzando il protocollo descritto con o senza inibitori della proteasi aggiunto al tampone di reazione e con entrambi i terminali A / E e KO giornalisti. Il rapporto di emissione è stata misurata dopo 24 ore di incubazione con entrambi i terminali A / E o reporter KO e un grafico in funzione di BoNT / A potenza. Scissione significativa del giornalista KO è stato visto senza aggiunta di inibitori della proteasi, ma è stata negata dalla loro inclusione. Tutti i campioni sono stati testati in triplicato e l'errore bars rappresentano la deviazione standard della media. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Buffer Composizione Temperatura di stoccaggio Stabilità Note
10x Matrix Binding Buffer 500 mM HEPES-NaOH, pH 7,1, 250 mM NaCl, 1% Tween-20, 5% caseina, 0,05% NaN 3 -20 O -80 ° C Stabile per un minimo di cinque giorni a 4 ° C dopo lo scongelamento Fornito con Kit BoTest Matrix A botulinica di rilevamento
10x Matrix Wash Buffer 119 Fosfati mM, pH 7,4, 1,370 mM NaCl, 27 mM KCl, 1% Tween-20 -20 O -80 ° C Stabile per un minimo di cinque giorni a 4 ° C dopo lo scongelamento Fornito con Kit BoTest Matrix A botulinica di rilevamento
10x neutralizzazione Buffer 1 M HEPES-NaOH, pH 8,0, 1 M NaCl 4 ° C Stabile fino a sei mesi a 4 ° C
10X Reaction Buffer BoTest 500 mM HEPES-NaOH, pH 7,1, 50 mM NaCl, 1% Tween-20, 100 mM ZnCl 2 -20 O -80 ° C Stabile per un minimo di cinque giorni a 4 ° C dopo lo scongelamento Fornito con Kit BoTest Matrix A botulinica di rilevamento
BoTest A / E Reporter 20 mM a 50 mM HEPES-NaOH, NaCl 10 mM, 15% glicerolo -80 ° C Conservare in piccole aliquote. Stabile per un minimo di cinque giorni a 4 ° C dopo lo scongelamento. Fornito con Kit BoTest Matrix A botulinica di rilevamento
Gelatina tampone fosfato (GPB) 33,3 mM NaH 2 PO 4, pH 6.2, 2 g / L gelatina 4 ° C Stabile fino a 1 mese a 4 ° C
200x ditiotreitolo (DTT) 1 M DTT -20 ° C Stabile fino a 6 mesi a -20 ° C Marca e memorizzare piccoli (100 microlitri) aliquote
1x PBS-t 11.9 Fosfati mM, pH 7,4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,1% Tween-20 4 ° C Stabile fino a 1 mese a 4 ° C Può essere fatto utilizzando 10x PBS da Fisher (BP399-1)
Matrix A Beads (IP-A Beads) Biglie magnetiche coniugate covalentemente al pollo anti-BoNT / A anticorpo in PBS. 0.1% Tween-20, 0,05% di sodio azide, 0.25% caseina e 50% glicerolo -20 ° C Stabile per un minimo di cinque giorni a 4 ° C dopo l'estrazione dalla -20 ° C. NON congelare a -80 ° C

Tabella 1. Buffer richiesti per il protocollo descritto. Neutralizzazione 10xBuffer è solo per elevata complessità (ad esempio alimenti) campioni e non può essere richiesta a seconda della natura dei campioni viene saggiato.

Nome del materiale / attrezzature Azienda Numero di catalogo Commenti / Descrizione
BoTest Matrix Una neurotossina botulinica Detection Kit BioSentinel A1015 Kit di rilevazione per BoNT / B e F sono inoltre disponibili.
Varioskan Flash lettore di fluorescenza di micropiastre Thermo-Fisher Scientific 5250040 La maggior parte monocromatore o unità base di filtro-con 434 nm di eccitazione e 470 nm e 526 nm capacità di emissione possono essere utilizzati.
96-ben Bead Magnetic Separation Piatto V & P Scientific VP771H Altri piastre magnetiche possono essere utilizzati, ma la piastra devono essere progettati per separare il beads al lato del bene.
Magnetic Bead-compatibile Piastra Rondella BioTek ELx405 VSRM Opzionale, necessario solo per il lavaggio piatto automatizzato. Altre rondelle magnetiche piastra compatibile tallone possono anche essere utilizzati, ma devono essere testati prima dell'uso.
Microcentrifuga Vario N / A Opzionale, necessario solo per i campioni che necessitano di centrifugazione.
Mixer piatto MixMate Eppendorf 22674200
Orbital Shaker Vario N / A Utilizzati a RT o a 25 ° C Se il controllo della temperatura è disponibile
Libero-EDTA Protease Inhibitor Tablets Roche 4693132001 Richiesto solo per il cibo o test ambientali. Gli inibitori della proteasi devono essere privi-EDTA.
BoNT / A Metabiologics N / A Opzionale, richiesto solo per fini di normalizzazione e di quantificazione
Nero, piastre con 96 pozzetti a fondo piatto NUNC 237.105 Le piastre non devono essere trattati
96 pozzetti piastra di tenuta del nastro Thermo Scientific 15036

Tabella 2. Materiali e attrezzature necessarie per il protocollo descritto. Alcuni materiali e le attrezzature sono opzionali o possono essere sostituiti a seconda delle apparecchiature disponibili. Ulteriori test di idoneità e di ottimizzazione possono essere richiesti se utilizzando attrezzature alternativo.

</ Tr>
Nome del campione Volume Tossina Volume diluente [BoNT / A] (MLD 50 / ml) o (MLD 50 / g cibo) log [BoNT / A] (MLD 50 / ml) o (MLD 50 / g cibo) D1 Pl 1.200 Archivio N / A 30.000 4.48
D2 300 microlitri D1 600 microlitri 10.000 4
D3 90 microlitri D1 810 microlitri 3.000 3.48
D4 90 microlitri D2 810 microlitri 1000 3
D5 90 microlitri D3 810 microlitri 300 2.48
D6 90 microlitri D4 810 microlitri 100 2
D7 90 microlitri D5 810 microlitri 30 1.48
D8 90 microlitri D6 810 microlitri 10 1
D9 N / A 1.400 pl N / A N / A

Tabella 3:. Tabella di diluizione per i campioni della curva standard Questa tabella genera una curva standard in diluizioni semilogaritmici oltre 3,5 ordini di grandezza. Abbastanza campione bianco No BoNT (D9) è generato per eseguire un n = 6. Diluizioni possono essere aggiunti, se lo desideri.

<td> 0
Nome Programma Variabile Valore Commenti
Primo Reagente bottiglia La
Primo Volume 400
Prime Portata 7
Immergere Dopo Prime? N
Matrix Wash Reagente bottiglia La Il numero di lavaggi può essere aumentato se l'attività della proteasi residui di questi.
Metodo
4
Soak / Agitare Y
Soak Durata 180
Agitare prima Soak? N
Prime Dopo Soak? N
Disp
Dispensare Volume 300
Dispensare Portata 5
Dispensare Altezza 130
Hor. Dispensare Pos. 0
Disattivare Aspirare? Y
In basso Wash First? N
Prime Prima di Start? N
Aspir
Aspirazione Altezza 40
Hor. Aspirare Pos. 0
Aspirazione Tasso 5
Aspirazione Delay
Trasversale Aspirare? N
Finale di aspirazione? Y
Finale Delay aspirazione 0
Matrix Soak Soak Durata 300 Aumento della durata di ammollo può aumentare il recupero tallone dagli alimenti più viscosi.
Agitare prima Soak? N
Maestro Wash Matrix Soak Si tratta di un programma di 'Link' per eseguire il Matrix ammollo e programmi Matrix Lavare insieme.
Matrix Wash

Tabella 4. Magnetic automatizzati impostazioni del programma lavatore compatibile tallone. I seguenti programmi assumono che la rondella piastra è dotata di un magnete che tira perline alla parete del pozzetto e che il buffer modulo di commutazione è impostato in modo tale che 1x Wash Buffer ( PBS-t) è collegato alla valvola A. Questi programmi sono specifici per il BioTek ELx405. Consultare il manuale dello strumento per le istruzioni di programmazione. Altro rondelle piastre automatico o collettori sottovuoto può essere utilizzato compatibile con perlina magnetico, tuttavia, il test sarà richiesto di definire le impostazioni che massimizzano l'efficienza lavaggio e minimizzare la perdita tallone durante il lavaggio. I test iniziali della ripresa cordone a seguito di lavaggio è consigliato a prescindere dal lavatore specifico utilizzato.

<td> LOD
Matrix alimentare Metrico 2 hr 4 ore 24 ore
50 MLD / g alimentare MLD 50 / bene 50 MLD / g alimentare MLD 50 / bene 50 MLD / g alimentare MLD 50 / bene
Latte 300 58 100 19 30 6
LOQ 1000 193 300 58 100 19
EC 50 2.404 464 590 114 92 18
Pomodori Freschi LOD 1000 91 300 27 30 3
LOQ 1000 91 1000 91 100 9
EC 50 7561 687 1.932 176 229 21

Tabella 5. Limiti di rilevabilità (LOD), limite di quantificazione (LOQ) e half-maximal concentrazione efficace (EC 50) per il latte 2% e il collaudo pomodoro fresco mostrato nella Figura 2A. Il CE 50 è derivato dal sigmoidale della curva dose-risposta in forma durante il LOD e LOQ sono definiti come il punto dati concentrazione minima che cade o 3 o 10 deviazioni standard sotto i controlli senza BoNT (n = 6), rispettivamente. I dati sono presentati sia MLD 50 / g cibo e totali MLD 50 s testati per pozzetto nel volume del campione 200 microlitri.

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Discussion

Questo protocollo descrive le procedure per la quantificazione BoNT / A complesso, holotoxin, o Clostridium cultura surnatante in matrici complesse. Il protocollo è lo stesso, però, quando prova diversi sierotipi di BoNT (ad es BoNT / B, E e F) con i rispettivi saggi Matrix 56,60, anche se la sensibilità del test varia di tutti i sierotipi e saggi. Questo protocollo non tiene conto di ogni tipo di campione possibile e alcune modifiche può essere richiesto a seconda della composizione del campione specifico e applicazione desiderata. Le matrici possono includere campioni di prodotti alimentari (ad esempio alimenti test di provocazione) o buffer eccipiente farmaceutico (prove farmaco a base di BoNT ad esempio). Non alimentari complesse (es. tessuto animale o ambientale) liquidi e campioni solidi devono essere trattati come campioni di prodotti alimentari. Questo protocollo utilizza volumi 200 pl / pozzetto di esempio ma non più di 50 pl / pozzetto può essere testata con un corrispondente adeguamento al volume di 10x bindinag buffer. I campioni di dimensioni inferiori a 50 ml devono essere diluiti con GPB o PBS per ≥ 50 ml prima del test.

La natura altamente variabile dei prodotti alimentari rappresenta una sfida particolare per il rilevamento e la quantificazione BoNT nel cibo. PH del campione, viscosità, forza ionica, e la presenza di particolato possono tutti potenzialmente influenzare l'attività della tossina all'interno della matrice alimentare e richiedere che la tossina essere isolato dal cibo per un accurato, quantificazione in vitro. Molti alimenti o preparati di tossina contengono anche proteasi endogene che devono essere rimossi o inattivati ​​quando si utilizzano i giornalisti a base di proteine ​​per garantire che solo l'attività della proteasi BoNT-specifico viene misurata. Anche semplici matrici tampone ben definiti, come tamponi eccipiente farmaceutico, possono contenere composti che interferiscono con l'attività BoNT che deve essere rimosso prima quantificazione 35,56-59,61. Immunoprecipitation offre un veloce, altamente specifico-sierotipo BoNT puriMetodo zione ma necessita di anticorpi ad alta affinità per isolare le basse concentrazioni di tossine presenti negli alimenti "mondo reale", ambientale e campioni farmaceutici.

Il protocollo descritto purifica la tossina con perline paramagnetiche rivestite con anticorpi anti-BoNT / A diretti verso la catena pesante dominio del recettore della tossina della BoNT / A holotoxin nucleo 56. Specie Clostridium, tuttavia, producono naturalmente tossina complessi costituiti dalla holotoxin nucleo in associazione con PAN 62-64. I PAN proteggono la tossina dall'attacco proteasi nel tratto gastro-intestinale e si ritiene per facilitare il trasporto della tossina attraverso l'epitelio intestinale 63,65. I PAN inibire il legame degli anticorpi IP-A tallone anti-BoNT / A al holotoxin nucleo (dati non riportati). Questa inibizione è alleviato aumentando il pH del campione sopra ~ 6.25, causando la BoNT / A complesso di dissociare in holotoxin e PAN e consentendo tossina efficacelegame alla IP-A Perle 66. Per questo motivo, regolando il pH del campione sopra 6,5 è fondamentale per il successo del test (Figura 5B). Il 10x binding buffer utilizzato nel protocollo contiene un agente tampone per contribuire ad aumentare il pH a condizioni di analisi standard. Tuttavia, molti alimenti acidi possono sopraffare la capacità tampone del buffer Binding. L'addizionale 10x tampone di neutralizzazione aumenta notevolmente la capacità tampone campione e dovrebbe neutralizzare la maggior parte delle matrici alimentari.

Un altro parametro importante per il dosaggio è forza ionica del campione. È richiesto un chiarimento dei campioni mediante centrifugazione per un efficace lavaggio di perline e recupero dopo immunoprecipitazione. Test con pomodori freschi rivelato che non BoNT / A ripresa si è visto quando i campioni sono stati semplicemente trattati e centrifugati. Abbiamo ipotizzato che BoNT / A può associare con la polpa di pomodoro inducendolo a pellet durante la centrifugazione e diventare assente dalsopranatante testato. Abbiamo trovato che aumentando la forza ionica o, più significativamente, neutralizzando le interazioni limitate pH tra BoNT e la matrice con conseguente miglioramento recupero tossina (Figura 5B). Sebbene non richiesto per il recupero BoNT, si prevede, anche se non dimostrato, che le concentrazioni saline elevate anche aumentare la severità della immunoprecipitazione e provocare recupero proteina meno aspecifici, soprattutto in alimenti basso contenuto di sale.

PH del campione e regolazione della forza ionica nel protocollo viene eseguita con l'aggiunta di 10x tampone di neutralizzazione e dovrebbe essere compatibile con un'ampia gamma di alimenti. Mentre il buffer 10x neutralizzazione ha una elevata capacità di tamponamento, alcuni cibi altamente acidi possono richiedere la regolazione del pH supplementare. Prove di pH del campione a seguito di buffer Inoltre è consigliato se scarso rendimento saggio è osservato e volume del campione permette. Regolazione del pH aggiuntivo può essere raggiunto attraverso l'aggiunta di svolumi centro commerciale di 1 M HEPES pH 8, se necessario. Il NaCl supplementare introdotto dal buffer Neutralizzazione 10x dovrebbe essere accettabile per tutti, ma i cibi più salati, tuttavia, 10x tampone di neutralizzazione può essere sostituito con 1 M HEPES pH 8 se scarsi risultati sono visti con un determinato prodotto alimentare. Nessuna differenza significativa è stata osservata durante il test del protocollo descritto a concentrazioni di NaCl fino a 1,2 M in PBS.

Mentre questo protocollo è applicabile alla maggior parte dei campioni, alimenti agli estremi di pH, forza ionica, e / o contenuti proteasi non possono produca buoni risultati con il saggio. Alcuni alimenti possono anche rimanere troppo viscoso dopo l'aggiunta di GPB, con conseguente scarso recupero tallone. Diluire campioni con un semplice tampone come PBS può migliorare i risultati. Aumentando il numero di lavaggi o lavare stringenza (aumentando la concentrazione di NaCl) e aumentando la concentrazione di inibitori della proteasi senza EDTA può anche migliorare i risultati se non specifico proteasi contaminateione è osservata. Pulizia dello strumento è molto importante anche quando si utilizza il lavaggio automatico delle lastre. Contaminazione degli ugelli idraulici e di iniezione con proteasi (ad esempio tripsina) da altri test di laboratorio può portare all'introduzione involontaria della proteasi durante il dosaggio. Pulizia accurata della rondella piastra secondo il manuale d'uso del produttore è raccomandato prima di eseguire il test.

I saggi Matrix BoTest sono i primi commercializzati, saggi di attività-based per il rilevamento BoNT e la quantificazione in matrici complesse. Rispetto al biotest mouse standard, il saggio è veloce, meno costoso e permette di testare high-throughput senza la necessità di impianti specializzati o preoccupazioni etiche riguardo all'uso degli animali 56. Altri vitro BoNT metodi di individuazione sono stati descritti, ma non hanno dimostrato di essere compatibile con matrici complesse, richiedono attrezzature specializzate, o non sono commercialmente disponibille 35,42-44,46-55. I saggi sono anche saggi di attività-based che misurano l'attività endoproteasi tossina, considerando che le tecniche tradizionali test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) riportano solo la massa tossina. Test ELISA basati su attività erano state precedentemente descritte, ma questi test non sono state dimostrate per lavorare con matrici alimentari e non comprendere la purificazione della tossina dalla matrice del campione 41. Sottostima significativa della tossicità di campioni complessi si può verificare se la tossina non viene purificato dal campione da composti matrice spesso interferiscono con l'attività BoNT 35,56-59.

Una volta che il protocollo è padroneggiata, le modifiche possono essere fatte per aumentare il volume di campione e aumentare la sensibilità campione. Ad esempio, il legame della tossina ai talloni può essere eseguita in grandi, campioni massivi (ad esempio 10 ml o superiore) prima della raccolta per centrifugazione. Queste perle possono essere aggiunti ad una piastra a 96 pozzetti e dosati seguendo il descrivered protocollo. Incrementi di sensibilità maggiore di un log sono stati osservati con una maggiore dimensione del campione 56. Pertanto, il protocollo descritto può essere utilizzato con campioni di quantitativi maggiori di rilevare anche tracce di BoNT contenute in campioni che possono andare inosservati dal biotest sui topi.

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Disclosures

FM Dunning, TM Piazza, F. Zeytin e WC Tucker sono dipendenti o proprietari di BioSentinel Inc. BioSentinel attualmente produce e ha commercializzato alcuni dei reagenti presentati in questo rapporto.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare H. Olivares e D. Ruge per le discussioni importanti e consigli. Questa ricerca è stata sostenuta in parte da un premio NSF SBIR (IIP-1.127.245 a BioSentinel Inc.) e del Dipartimento della Difesa contratto (W81XWH-07-2-0045 a BioSentinel Inc.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit BioSentinel A1015 Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate reader Thermo Fisher Scientific 5250040 Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 nm and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation Plate V&P Scientific VP771H Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer BioTek ELx405 VSRM Optional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
Microcentrifuge Optional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixer Eppendorf 22674200
Orbital Shaker Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor Tablets Roche 4693132001 Only required for food or environmental testing. Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/A Metabiologics Optional, only required for standardization and quantification purposes
Black, Flat-bottomed 96-well Plates NUNC 237105 Plates should not be treated
96-well Plate Sealing Tape Thermo Fisher Scientific 15036

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Dunning, F. M., Piazza, T. M., Zeytin, F. N., Tucker, W. C. Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays. J. Vis. Exp. (85), e51170, doi:10.3791/51170 (2014).

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