Summary
BoTest 매트릭스 보툴리눔 신경 독소 (본트) 검출 분석은 빠르게 정화 및 샘플 행렬의 범위에서 본트의 양을. 여기, 우리는 고체와 액체 두 행렬에서 본트의 검출과 정량을위한 프로토콜을 제시하고 보톡스, 토마토, 우유와 분석을 보여줍니다.
Abstract
정확한 탐지 및 복잡한 매트릭스에서 보툴리눔 신경 독소 (BONT)의 정량화는 제약, 환경, 식품 샘플 테스트를 위해 필요합니다. 정확한 역가 시험이 BONT 기반의 의약품 제조 및 환자의 안전을 위해 필요합니다 동안 식품의 신속한 본트 테스트는 발생 법의학, 환자 진단 및 식품 안전 테스트에서 필요합니다. 본트 테스트를 위해 널리 사용되는 마우스 생물 검정은 매우 민감하지만, 신속하고 일상 본트 테스트에 필요한 정밀도와 처리량이 부족하다. 또한, 동물의 생물 검정의 사용은 본트 테스트를위한 마우스 생물 검정을 대체 할 수있는 미국 및 해외 의약품 규제 당국과 동물 권리 지지자에 의해 호출 귀착되었다. 여러 생체 대체 시험 법은 간단 버퍼에서 정제 본트와 잘 작동이 개발되어 있지만, 대부분은 매우 복잡한 매트릭스의 시험에 적용 할 수 표시되지 않았습니다. 여기에서의 검출을위한 프로토콜BoTest 매트릭스 분석을 사용하여 복잡한 매트릭스에서 본트가 표시됩니다. 분석은 세 부분으로 구성된다 : 첫 번째 부분은 시험을위한 시료의 준비를 포함, 두 번째 부분 행렬에서 BONT를 정화 안티 BONT 항체 - 코팅 된 상자성 비드를 사용하여 면역 침전 단계이며, 셋째 부분은 절연 BONT의 단백질 분해를 정량화 형광 기자를 사용하여 활동. 프로토콜은 액체와 고체 두 행렬을 사용하여 96 - 웰 플레이트에 높은 처리량 테스트를 위해 작성 4-26 시간의 총 분석 시간은 시료의 종류, 독소로드, 원하는 감도에 따라와 설명서를 준비 약 2 시간을 필요로합니다. 데이터는 인산염 완충 생리 식염수, 의약품, 배양액, 2 % 우유, 신선한 토마토와 본트 / A 테스트를 제시하고 분석의 성공을위한 중요한 매개 변수의 설명이 포함되어 있습니다.
Introduction
보툴리눔 신경 독소 (BoNTs가) 1-3 NG 추정 정맥 인간의 치사량 알려진 치명적인 물질이다 / 1,2 kg. BONT 일곱 구조상 유사한 혈청 형은, 각 셀이 아연 엔도 펩 티다 제 3-5 인코딩 세포질 및 경쇄으로, 흡수 및 전좌 바인딩에 대해 책임 중쇄 도메인으로 구성된 존재 G 통해 레이블. 본트의 절묘한 독성이 부분에서의 결과, 신경 근육 접합부 6에서 운동 뉴런에 자사의 특정 바인딩 및 항목. 일단 뉴런 내부 경쇄 엔도 펩 티다 제는 특별히 클리브 수용성 N-에틸 말레이 미드 구분 인자 부속 단백질 수용체 (SNARE) 소포 융합에 필요한 단백질 중 하나 이상은, 신경 전달 물질 방출을 억제 및 이완성 마비 7-14 선도. 일반적으로 질병 "보툴리누스 중독,"본트에 의해 다이어프램과 늑간 근육의 마비로 알려진 궁극적으로 결과조기 진단과 치료를하지 않는 한 호흡 부전과 죽음이 수신됩니다.
인간의 인성 보툴리누스 중독은 가장 일반적으로 BONT 혈청 형 A, B, E와 관련, 일반적으로 F (BONT / A, BONT / B 등)은 오염 된 음식 (15, 16)의 섭취에서 발생되고 있지만, 상처 보툴리누스 중독의 몇 가지 경우 정맥 주사 마약 사용자 (17, 18) 사이에보고되었다. 미국의 경우, 하나의 세 미만의 어린이가 클로 스트 리듐 포자의 섭취로 인한 유아 보툴리누스 중독 보툴리누스 중독 19-21의 가장 일반적인 형태입니다. 그러나, 부적절한 가정 통조림 및 가공 식품으로 인한 식품 매개 본트의 발생은 미국과 해외 모두에서보고되었다. 2,000에서 2,009 사이 사이에, 인성 보툴리누스 중독의 적어도 3백38가지 경우는 여섯 사망 22 일을 포함하여 전 세계적으로보고되었다. 신속하고 민감하게 인성 보툴리누스 중독의 발생을 감지 할 수있는 능력은 조기 진단에 도움이 할 수있는 중요한 표시이다 (23, 24). 또한, 비용 효과적이고 일상적인 식품 검사 수있는 검출 방법 개선 식량 안보로 이어질 것입니다.
본트의 신경 세포 특이 긴 생물학적 반감기는 또한 강력한 치료합니다. 미국에서는 본트 기반 약물은 화장품 조건 미간 라인, 자궁 경부 디스 토니아, 편두통, 과민성 방광, 사시 등의 신경 근육 관련 질환의 치료를 위해 식품 의약품 안전청에 의해 승인됩니다. 다수의 "오프 라벨"응용 프로그램은 심각한 근육 장애 25-28를위한 고용량 치료를 포함하여 설명되어 있습니다. 과다 복용은 잠재적으로 유해한 부작용의 위험에 환자를두고있는 동안 underdosing이 효과 치료로 이어질 수 있으므로 정확한 독소 정량화, 올바른 투약 중요합니다. 불행하게도, 표준화 된 역가 시험 프로토콜은 본트 기반 약물의 produ 사이의 단위 정의 불평등의 결과로, 제조 업체간에 공유되지 않습니다CTS 29-31.
본트의 표준 시험 BONT 함유 시료를 생쥐에 복강 주사와 죽음의 숫자가 1-7 일 이상 16,32,33 기록되는 마우스 생물 검정입니다. 마우스 생물 검정 5-10 PG BONT / A (34)의 검출 한계 (LOD)에 매우 민감하지만, 동물의 사용에 윤리적 인 문제, 높은 교육 인력의 비용과 동물 시설, 긴 분석 시간 및 부족을 유지 표준화 된 프로토콜은 표준화, 동물성 본트 테스트 및 정량 방법 35-39을 개발하기 위해 호출 결과. 최근, 여러 가지 대체 본트 정량 방법은 마우스 및 인근 마우스 생물 검정 감도 40-49을 제공하는 개발되었다. 이러한 방법은 일반적으로 형광, 질량 분석기, 면역 학적 방법을 사용하고 동물을 사용하지 않고 마우스 생물 검정보다 훨씬 짧은 분석 시간을 제공합니다. 질량 분석은 면역 techniq와 함께 접근 방법단말은 감지하고 BONT 음식과 다른 복잡한 시료에 포함 된 계량 표시했다 있지만, 인사 교육 요구 사항 및 특수 장비의 제한이 분석 50-55. 대부분의 다른 대체 시험 법은 복잡한 샘플 테스트에 쉽게 적용 할 수 없습니다 또는 일상 본트 테스트에 필요한 처리량이 부족합니다. BONT의 극단적 역가 맞게 감도 시험 관내 분석 방법을 개발하고자 할 때 식품 샘플의 점도, 산도, 염 함량, 및 매트릭스 성분의 높은 변수 특성은 특히 어려운 도전을 제시한다. 또한, 이러한 BONT 기반 의약품의 재 부상으로 인한 것과도 간단하고 상대적으로 양성 버퍼 시스템은 크게 체외 BONT 힘 56에 영향을 소금, 알부민, 설탕 안정제 (즉, 부형제)가 포함되어 있습니다. 독소 정화는 샘플 56-59의 간단한 그러나 모두의 정확한 작동 테스트를 위해 필요합니다.
BoTest 매트릭스 분석은 신속하고 높은 처리량을 위해 설계되었으며, 일반적으로 연구소 56, 60에있는 장비를 사용하여 매우 복잡한 시료에서 본트의 일관성을 정량화 하였다. 이러한 분석은 공유 결합하여 샘플로 본트를 격리시키는 한 후 세척하여 매트릭스 화합물을 방해 제거하는 혈청 형 특정 안티 본트 항체에 링크 된 성체의 구슬을 사용합니다. 세탁 후, 바인딩 본트의 단백질 분해 활성은 다음 본트 혈청 형이 시험과 호환 기자를 사용하여 최적화 된 반응 버퍼에 계량입니다. 이 기자는 N-말단 시안 형광 단백질 (CFP) 부분과 구성 본트 기판, SNAP25 잔류 141-206 또는 시냅 잔류 33-94로 연결 C-말단 노란색 형광 단백질 유도체 (비너스) 부분으로 구성된 형광 단백질 BoTest A / E 또는 B / D / F / G 기자, 각각 45. 본트로 기자의 분열은 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)를 사용하여 모니터링됩니다. 때 t그는 기자 CFP의 여기가 CFP 방출 흥미로운 금성 방출을 담금질, 금성 FRET 결과, 그대로입니다. 본트로 기자의 분열은 CFP 방출과 금성 방출 감소의 증가로 이어지는, FRET을 방지 할 수 있습니다. BONT 활동은 정량적 CFP 금성 배출량의 비율을 사용하여 측정 할 수있다. 3 PG 아래 LOD는 높은 처리량 96 웰 플레이트 포맷 (56)을 이용하여 식품의 넓은 범위에서 가능하다. 분석은 비드 표면에 독소의 농도를 수 있기 때문에 감도를 증가가 큰 샘플 볼륨을 사용하여 얻을 수있다.
BoNTs A, B, E, 및 F에 대한 BoTest 매트릭스 분석법이 개발, 식품, 제약, 환경 시료 56, 60과 함께 시험 하였다. 여기, 우리는 (예를 들어, 제약, BONT 버퍼)와 높은 복잡성 (예 : 식품, 환경) 샘플 낮은 복잡성 본트의 검출에 대해 이러한 분석을 실행하기위한 절차를 설명합니다. 구체적인 처리 방법여러 종류의 시료는이 프로토콜에서 해결하고 설명을 생략 종류의 시료는 일반적으로 표시 방법을 조합하여 적용 할 수 위해. 프로토콜은 개발 및 테스트 BONT / A와 함께하지만, 다른 56, 60 설명한대로 각각의 분석을 사용하여 다른 본트의 혈청 형에 적응할 수 있었다.
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Protocol
1. 분석 시약의 제조
- 해동 200X 디티 오 트레이 톨 (DTT), 10 배 매트릭스 바인딩 버퍼 (10X 바인딩 버퍼 이하), 10 배 중화 버퍼 (음식이나 산도 불균형 샘플 만), 15 분 동안 10 배 BoTest 반응 버퍼 실온에서 (10X 반응 버퍼 이하) (RT) 나까지 완전히 해동. 이 프로토콜에 사용 된 버퍼와 시약의 목록은 표 1을 참조하십시오. 이 프로토콜에 필요한 재료 및 장비의 목록은 표 2를 참조하십시오.
- 혼합 5 초 동안 해동 버퍼를 소용돌이. 배 바인딩 버퍼가 흐린 모양을해야합니다 동안 10 배 중화 버퍼, 200xDTT 및 10X 반응 버퍼는 분명히 나타납니다. 37 ° C에서 5 분 동안 10 배 반응 버퍼를 따뜻하게하고 해동 다음 흐린 나타나는 경우 소용돌이로 교반을 반복합니다.
- 1X 반응 버퍼의 3.8 ML를 생성합니다.
- 15 ML 원뿔 튜브 "1X 반응 버퍼를"레이블 및 3.42 ㎖의 분자 생물학 수준의 와트를 추가어, 380 ㎕의 10 배 반응 버퍼 19 μL 200X DTT. 반전에 의해 버퍼 잘 섞는다.
- 깨끗한 면도날을 사용하여 분기 만에 하나 EDTA없는 단백질 분해 효소 억제제의 정제를 잘라 1X 반응 버퍼 (나머지 정제 부분은 나중에 사용하기 위해 4 ° C에 저장할 수 있습니다) 타블렛 4 분의 1을 추가합니다. NB 프로테아제 억제제하지 않을 수 있습니다 정제 된 독소와 간단한 버퍼 (예를 들어, 제약 샘플)를 사용하는 경우 필요하다.
- 소용돌이 단백질 분해 효소의 정제가 완전히 녹을 때까지 1X 반응 버퍼.
- 실온에서 20 분 동안 매트릭스 비즈 (이하 IP-비즈)를 따뜻하게.
- 빛으로부터 보호 실온에서 BoTest A / E 기자 (A / E 기자 이하)를 해동.
- 15 ML 원뿔 튜브 "0.5 μM A / E 기자 '라벨 1.8 ㎖의 1X 반응 버퍼에 20 μM A / E 기자 주식의 45 μl를 추가합니다. 피펫에 의해 철저하게 혼합하고 빛으로부터 보호 얼음에 저장합니다.
2. 대ARD 곡선 샘플 생성
여기에 설명 된 표준 곡선의 절반 로그 희석 (표 3)에서 10-30,000 MLD 50 / g의 음식이나 ML 버퍼 당에 걸쳐있다. 최종 사용자는 적용 가능한 대체 농도를 무료로 사용할 수 있습니다.
- 스파이 킹 및 참고 자료로 매트릭스를 배양. 가능한 매트릭스 효과를 줄이기 위해, 미지 같은 행렬의 희석제를 사용하여 표준 곡선을 생성한다. 추가로 본트 음성 매트릭스 (예 : 필드 또는 본트 발생 샘플 테스트)를 사용할 수없는 경우 희석제로 젤라틴 인산 버퍼 (GPB) 또는 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)를 사용합니다. 아래의 해당 프로토콜 다음과 같은 선택의 행렬로 본트 / 스파이 킹하여 표준 곡선을 생성합니다.
- 복잡도가 낮은 시료 (예를 들어 PBS, GPB, 또는 제약)
- 15 ML 원뿔 튜브에 적절한 버퍼의 10 ML을 추가하고 따로 설정합니다. 이 샘플은 standar을위한 희석제로 사용됩니다D 곡선과 알 수없는 희석 (4 절).
- 마이크로 원심 튜브에 1.2 ㎖의 버퍼를 추가합니다.
- 주의 :이 단계는 본트를 사용하여 처리하고 독소와 접촉하는 시약 및 재료 처리 할 때는 각별한주의가 사용되어야합니다. 개인 보호 장비 및 모든 자료의 적절한 폐기의 사용은 본트 노동 OSHA 지침 (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html)의 미국학과에 따라 수행해야합니다. 최종 농도가 30,000 MLD 50 / ㎖ (36,000 MLD 50 총)이되도록 1.2 ㎖의 시료에 본트 / A를 추가합니다.
- 액체 식품 샘플 (또는 다른 복잡한 액체 샘플) 주 : 초기 테스트가 액체 행렬의 입자상 물질 (. 예를 들어, 펄프)로 명확 샘플에서 발견 한 상층 액의 양을 결정하는 것이 좋습니다 따라 달라질 수 있습니다. 이 프로토콜은 1.4 ㎖의 SAMP에서 복구됩니다 명확히 상층 액의 적어도 1.2 ml의 가정르. 필요한 경우 샘플 크기를 늘립니다.
- 15 ML 원뿔 관에 10 ㎖의 액체 음식을 추가하고 따로 설정합니다. 이 샘플은 표준 곡선과 알 수없는 희석 (제 4 장)에 대한 희석제로 사용됩니다.
- 빈 1.5 ML의 microcentrifuge 관의 무게와 질량을 기록한다.
- 무게 microcentrifuge 관에 액체 식품의 1.4 ML을 추가합니다.
- 마이크로 원심 튜브를 닫고 다시 무게를 측정하고 빈 튜브의 질량을 빼서 첨가 식품 샘플의 질량을 계산한다.
- 주의 :이 단계는 본트를 사용하여 처리하고 독소와 접촉하는 시약 및 재료 처리 할 때는 각별한주의가 사용되어야합니다. 개인 보호 장비 및 모든 자료의 적절한 폐기의 사용은 본트 노동 OSHA 지침 (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html)의 미국학과에 따라 수행해야합니다. 30,000 MLD 50 / G 식품의 최종 농도 1.4 ml의 샘플로 본트 / A를 추가합니다.
- Incuba희석제 테와 자연의 오염을 흉내 낸, 음식 매트릭스와 상호 작용하는 본트 시간을 제공하기 위해 2 시간 동안 RT 또는 4 ° C에서 샘플을 아군.
- 단단한 음식 샘플 (또는 다른 고체 시료) 참고 : 초기 테스트는 1 ㎖ GPB / g 음식의 추가 다음 균질화와 명확 샘플에서 발견 한 상층 액의 양을 결정하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 적어도 1.2 ml의 상층 액은 2g 샘플에서 복구됩니다 명확히 것으로 가정합니다. 필요한 경우 샘플 크기를 늘립니다.
- 50 ML 원뿔 관에 10g 고체 시료를 달아 따로 설정합니다. 이 희석제로 사용됩니다.
- 제 50 ML 원뿔 관에 2g 단단한 음식 샘플을 달다.
- 주의 :이 단계는 본트를 사용하여 처리하고 독소와 접촉하는 시약 및 재료 처리 할 때는 각별한주의가 사용되어야합니다. 개인 보호 장비 및 물질의 적절한 처리의 사용들 (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) BONT 노동 OSHA 지침의 미국학과에 따라 수행해야합니다. 30,000 MLD 50 / G 식품 (60,000 총 MLD 50)의 최종 농도로 2g 샘플의 표면에 본트 / A를 추가합니다.
- 자연의 오염을 흉내 낸, 음식 매트릭스와 상호 작용하는 본트 시간을 제공하기 위해 2 시간 동안 RT 또는 4 ° C에서의 희석제 및 아군 샘플을 품어.
- 복잡도가 낮은 시료 (예를 들어 PBS, GPB, 또는 제약)
- 샘플 균질화 버퍼 조정. 샘플의 종류에 따라 위의 생성 된 아군 표준 곡선의 시료와 희석액을 처리합니다.
- 낮은 복잡도 샘플
- 더 이상의 샘플 처리가 필요하지 않습니다.
- 액체 식품 샘플 (또는 다른 복잡한 액체 샘플)
- 어떤 샘플 균질화 할 필요가 없습니다.
- 1.4 ml로 140 ㎕의 10 배 중화 버퍼를 추가 아군 샘플 1 ㎖의 10 배 Neutralizat이온은 10 ㎖ 희석 샘플 버퍼. 물론 반전에 의해 샘플을 섞는다.
- 부분적으로 6,000 XG, 4 ℃에서 10 분 동안 원심 분리하여 두 샘플을 명확히 즉시 상층 액을 제거하고 새 튜브로 전송할 수 있습니다.
- 단단한 음식 샘플 (또는 다른 고체 시료)
- 10g의 희석 시료에 2g BONT / A 아군 고체 식품 샘플 및 10 ㎖ GPB에 2 ㎖ GPB (1 ㎖ GPB / g 음식)를 추가합니다.
- 철저하게 혼합 될 때까지 유를 사용하여 샘플을 균질화. 시료의 성질에 따라, 수락 균일화 할 수없는 물질의 작은 덩어리가있을 수있다. 선택적으로, 기계적 균질화 방법이 사용될 수있다.가 비활성화뿐만 아니라 독소를 에어로졸 수도로서 브라인을 사용하는 것은 권장되지 않는다.
- (체적이 20 ㎖ 인 경우 예 2 ㎖) 대략 전체 부피를 기준으로 희석 샘플 10X 중화 완충액 1/10th의 양을 추가. 추정총 BONT / A 아군 샘플의 볼륨과 10 배 중화 버퍼 1/10th의 볼륨을 추가합니다. 물론 반전에 의해 샘플을 섞는다.
- 부분적으로 6,000 XG, 4 ℃에서 10 분 동안 원심 분리하여 두 샘플을 명확히 즉시 상층 액을 제거하고 새 튜브로 전송할 수 있습니다.
- 낮은 복잡도 샘플
- 테스트를위한 표준 곡선 시리얼 희석을 준비
- 희석제로 D1로 본트 / A 아군 표준 곡선의 샘플과 nonspiked 샘플을 사용하여, 표 3에 따라 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 남아있는 표준 곡선의 샘플을 생성합니다.
3. 알 수없는 샘플 준비
이 절에서는 2 절에 병렬로 완료 할 수 있습니다.
- 미지의 수와 희석을 확인합니다. 가능하면 중으로 미지수를 테스트합니다.
- 질적 분석을 위해, descri로 샘플을 처리하는 데 필요한 것보다 더 희석하지 않고 신원 미상아래 침대.
- 후술하는 바와 같이 정량적 분석을 위해, 하나 이상의 샘플 분석 반응의 선형 범위 내에 있도록, 적어도 2 배 희석 샘플을 준비한다. 가능하면 제 3 절에서 설명한 매트릭스 효과를 줄이기 위해, 미지 같은 행렬의 희석제를 사용하여 희석 물을 생성한다. 그렇지 않으면, 희석제로 PBS 또는 GPB를 사용합니다.
- 생성하고 샘플 분류에 따른 미지 시료를 희석.
- 낮은 복잡성 미지 (예를 들어, PBS, GPB, 또는 제약)
- 알 수없는 희석 1을 생성하는 microcentrifuge 관에 알 수없는 적어도 750 μl를 추가합니다.
- 알 수없는 희석 2, 3 표시된 두 개의 마이크로 원심 튜브에 675 ㎕의 희석제를 추가합니다. 희석제는 표준 곡선의 생성에 사용되는 동일한 물질 일 것이다.
- 직렬 희석 2 관에 희석 1의 75 μl를 전송하고 혼합하여 희석 한 희석.
- 직렬 dilut희석 3 관에 희석 2의 75 μl를 전송하고 혼합하여 전자 희석 2.
- 액체 식품의 미지 (또는 다른 복잡한 액체 샘플) 주 : 초기 테스트는 3 장에서 논의 된 바와 같이 명확히 샘플에서 발견 한 상층 액의 양을 결정하는 것이 좋습니다. 필요한 경우 샘플 크기를 늘립니다.
- microcentrifuge 관에 액체 알 수없는 ≥ 875 μl를 추가합니다.
- 샘플 (875 ㎕의 샘플에 대한 예를 들어, 87.5 μL)에 10 배 중화 버퍼 1/10th의 볼륨을 추가합니다.
- 부분적으로 6,000 XG, 4 ℃에서 10 분 동안 원심 분리하여 샘플을 명확히 즉시 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. 이 알 수없는 희석 1입니다.
- 알 수없는 희석 2, 3 표시된 두 개의 튜브에 675 ㎕의 희석제를 추가합니다. 희석제는 표준 곡선 생성을 위해 사용 된 동일한 가공 소재 일 것이다.
- 직렬 전송에 의해 희석 한 희석링 75 희석 2 관과 혼합에 희석 1 μL.
- 직렬 희석 3 관에 희석 2의 75 μl를 전송하고 혼합하여 희석 2를 희석.
- 단단한 음식 미지 (또는 다른 고체 시료) 참고 : 초기 테스트는 3 장에서 논의 된 바와 같이 명확히 샘플에서 발견 한 상층 액의 양을 결정하는 것이 좋습니다. 필요한 경우 샘플 크기를 늘립니다.
- 50 ML 원뿔 관에 2g 고체 미지 시료를 달다.
- 2g 고체 시료에 2 ㎖ GPB (1 ㎖ GPB / g 음식)를 추가합니다.
- 3.2.3.2 절에 설명 된 샘플을 균질화한다.
- (부피가 4 ㎖의 경우 예를 들어, 0.4 ml)에 대략적인 총 부피를 기준으로 시료에 10 배 중화 버퍼 1/10th의 볼륨을 추가합니다. 물론 반전에 의해 샘플을 섞는다.
- 부분적으로 6,000 XG, 4 ℃에서 10 분 동안 원심 분리하여 샘플을 명확히 이 immediatelmicrocentrifuge 관에 Y 전송 ≥ 750 ㎕의 상층 액. 이 알 수없는 희석 1입니다.
- 알 수없는 희석 2, 3 표시된 두 개의 튜브에 675 ㎖의 희석제를 추가합니다. 희석제는 표준 곡선 생성을 위해 사용 된 동일한 가공 소재 일 것이다.
- 직렬 희석 2 관에 희석 1의 75 μl를 전송하고 혼합하여 희석 한 희석.
- 직렬 희석 3 관에 희석 2의 75 μl를 전송하고 혼합하여 희석 2를 희석.
- 낮은 복잡성 미지 (예를 들어, PBS, GPB, 또는 제약)
4. 최종 샘플 해설
테스트 액체 또는 고체 식품 샘플, 마이크로 원심에서 ≥ 14,000 XG에 원심 분리기 5 분의 모든 샘플이 완전히 샘플을 명확하게합니다. 즉시 상층 액을 제거하고 새 튜브로 전송할 수 있습니다.
5. 플레이트 설치 및 BONT / A는 풀다운
- 구체적인 플레이트 레이아웃 애플리케이션 의존하지만, 외부 웰을 사용하지 않는 한 이렇게가장자리 효과를 방지 할 수 있습니다. 샘플 D9 6 우물을 필요로하는 동안 각 미지 시료와 표준 곡선 샘플 D1-D8 3 우물이 필요합니다. 제안 플레이트 레이아웃은도 1에 도시된다.
- 각 잘 사용하는 20 ㎕의 10 배 바인딩 버퍼를 추가합니다.
- (200) 각 명확히 희석 μL와 세중 테스트를위한 세 개의 우물 (D9 여섯 우물)의 각각에 알을 추가합니다. 마이크로 믹서에 10 초 동안 판을 섞는다.
- IP-A의 구슬을 추가합니다.
- 최고 속도로 10 초 동안 소용돌이 IP-A 구슬. 구슬이 완전히 재현 탁하고 균일하지 않은 경우 소용돌이로 교반을 계속합니다.
- 피펫 20 μL IP-A의 각 샘플에 구슬을 잘.
- 마이크로 믹서에 30 초 동안 판을 섞는다.
- 750 rpm에서 2 시간, 25 °의 C 또는 RT의 회전판 인큐베이터를 사용하여 번호판을 품어. 분석 성능을 생성하고 모든 배양 단계에서 IP-A 비드 서스펜션을 유지에 매우 의존적이다. microp와 함께 항상 재현 탁 비즈모든 배양 단계에서 궤도 마이크로 플레이트 쉐이커를 사용하여 현탁액을 펠렛 및 유지 후 후반 믹서.
6. 플레이트의 세척 및 구슬 재 부상
- 손으로 또는 자기 비드 호환 자동화 된 와셔를 사용하여 하나 접시를 씻으십시오. 자석 구슬을 위해 구성된 자동화 된 와셔를 크게 분석 처리량을 증가시킨다.
- 수동 세척
- 50 ML 원뿔 튜브 "1X 워시 버퍼"및 45 ㎖의 분자 생물학 등급 물 5 ㎖의 10 배 매트릭스 세척 버퍼를 추가 레이블을 지정합니다. 반전에 의해 버퍼 잘 섞는다.
- 회전판 인큐베이터에서 접시를 제거합니다.
- 바로 5 분 동안 96 - 웰 자기 비드 분리 판의 판을 놓습니다.
- 96 - 웰 자기 비드 분리 판의 판을 유지하면서 부드럽게 제거하여 단일 또는 멀티 채널 피펫을 사용하여 샘플 우물에서 상층 액을 버린다. 대기음하지 마십시오비즈 - 시각적 사고 비드 제거를위한 피펫 팁에 흡입 된 버퍼를 모니터링 할 수 있습니다. 제거가 목격하는 경우, 부드럽게 잘 reseparate로 다시 팁 내용을 추가 및 제거를 반복합니다.
- 물론 각각의 샘플에 300 μL 1X 세척 버퍼를 추가합니다.
- 완전 마이크로 믹서에 30 초 동안 접시를 혼합하여 구슬을 재현 탁.
- 2 분 동안 96 - 웰 자기 비드 분리 판의 판을 품어.
- 제거하고 이전과 샘플 우물에서 상층 액을 버린다.
- 반복 4 세척 총 6.1.1.5-6.1.1.8 세 번 이상 반복합니다.
- 96 - 웰 자기 비드 분리 판의 판으로, 시각적으로도 상층 액 제거를 확인하기 위해 우물을 검사, 필요에 따라 초과 잔류 버퍼를 제거하기 위해 피펫을 사용합니다. 일부 버퍼가 우물에 남아 손질 비드 제거 또는 구슬 건조하지 않도록주의해야합니다.
- 각 샘플 웰에 50 ㎕의 반응 1X 버퍼를 추가, 30 SE를 위해 접시를 혼합C 마이크로 믹서에 완전히 구슬을 재현 탁합니다. 필요한 경우, 완전히 구슬을 재현 탁 피펫을 사용합니다.
- 자동 플레이트 세척
- 표 4에 따라 설치 및 프로그램 세탁기. 고품질 (예 nanopure) 물 청소 및 세척 세탁기.
- 주요 프로그램 "프라임"을 실행하여 세탁기.
- 회전판 인큐베이터에서 접시를 제거합니다.
- 즉시 와셔에 96 - 웰 자기 비드 분리 판의 판을 놓습니다.
- 연결 프로그램 "마스터 워시"를 실행합니다. 첫 번째 프로그램 단계는 세탁기가 정지됩니다 5 분 배양 단계입니다.
- 프로그램 종료 후, 세탁기에서 플레이트를 분리 아니라 각 샘플에 50 μL 1X 반응 버퍼를 추가하고, 완전히 구슬을 재현 탁하는 마이크로 믹서에 30 초 동안 판을 섞는다. 필요한 경우, 완전히 구슬을 재현 탁 피펫을 사용합니다.
7. 분석 개시 및 창업 보육
- 각 샘플 웰에 50 ㎕를 0.5 μM의 A / E 기자 (섹션 1 참조)를 추가하고 완전히 구슬을 재현 탁하는 마이크로 믹서에 30 초 동안 혼합한다.
- 가장자리 효과를 방지하기 위해 접시에 사용되지 않은 각 웰에 100 ㎕의 물을 추가합니다.
- 플레이트 밀봉 테이프로 플레이트를 밀봉하고 25 ° C 또는 RT, 750 rpm으로 회전하는 접시 인큐베이터를 사용하여 번호판을 품어. 배양시 빛에서 접시를 보호합니다.
8. 데이터 수집 및 분석
주 :이 분석은 원하는 감도가 얻어 질 때까지 여러 번 측정 될 수 실시간 분석하고, 요구 된 정지 시약은 없다. 권장 초기 읽기 시간은 2, 4, 그리고 분석 감도와 24 시간의 배양 시간은 배양 시간에 따라 증가.
- 데이터 수집
- 각 읽기 시간에, 회전판 인큐베이터에서 접시를 제거, 봉인을 제거테이프를 보내고, 즉시 96 - 웰 자기 비드 분리 판의 판을 놓습니다. 구슬이 2 분 동안 분리 할 수 있습니다.
- 마이크로 플레이트 리더에 접시를 놓고 ~ 470의 배출량을 측정하고 ~ 434 nm에서 여기에서 ~ 526 nm의.
- 추가 읽기 시간이 필요한 경우, 마이크로 믹서에 30 초 동안 구슬을 재현 탁 접시를 봉인하고, 회전판 배양기에 플레이트를 반환합니다.
- 데이터 분석
- 470 nm에서 RFU 값에 의해 526 nm에서 상대적인 형광 단위 (RFU) 값을 나눔으로써 각 샘플의 발광 비율을 계산한다.
- 표준 곡선 데이터 포인트에 대한 로그 [BONT / A] 대 발광 비율을 플롯. 시험 BONT / A 효능 범위에 따라 S 자형 투여 량 - 반응 곡선 (대표 결과 참조) 수득 될 것이다.
- 변수 기울기 용량 - 반응 곡선 Y는 = 바닥 + (상위 - 하위) /를 사용하여 표준 곡선 데이터에 맞게 (1 +10 (^ (logEC 50-X)를 * Hillslope)) 여기서 X는농도의 대수는, Y는 반응이고, Y는 하단에서 시작하여 S 자형 형상 상위로 진행한다.
- 검출 한계 (LOD)를 확인, 정량 (LOQ), 반 최대 유효 농도 (EC 50)의 제한. 검출 한계 이하로 컨트롤 안함 발광 비율보다 3 표준 편차 (표준 편차)을 갖는 샘플로 정의된다 (N = 6). 정량 한계는 샘플이 10 미만 표준 편차 안함 컨트롤 아래 방출 비율을 갖는 것으로 정의된다 (N = 6). EC (50)은 S 자형 용량 - 반응 곡선 맞춤에서 결정된다.
- S 자형 용량 - 반응 표준 곡선에 대한 알 수없는 샘플의 힘을 보간.
- 정량적 인 결과를 알 수없는 샘플은 이상적 표준 곡선의 직선 부분 내에해야합니다. (20-80 % 합계 분석 응답 윈도우를 계산하여 표준 곡선의 선형 부분을 대략 예 만약 표준 곡선 (R)의 발광 비율제스 0.5-2.5, 선형 범위)는 0.9-2.1 범위 표준 곡선의 부분이 될 것입니다.
- 질적 결과, 표준 곡선의 LOD와 LOQ에 대한 알 수없는 샘플을 비교합니다.
- 표준 곡선의 한계를 넘어 미지 시료를 추정하지 마십시오.
- 수동 세척
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Representative Results
설명 된 프로토콜의 단계를 요약 한 도면이도 2에 도시된다. 분석은 샘플의 종류와 원하는 분석 감도에 따라 완료하는 데 4-26 시간 사이에 필요하지만 만 ~ 2 시간 시간 실습. 어 세이는 96 - 웰 플레이트에서 수행하고, 테스트가 수행되는 분류에 따라서는, 접시 당 표준을 포함하여 최대 20 샘플 중으로 시험한다.
그림 3은 본트를 사용하는 대표적인 분석 결과를 보여줍니다 / A holotoxin는 PBS로 아군 및 A / E 기자 2, 4, 24 시간 배양 한 다음 설명 프로토콜 테스트. 정제 BONT / A holotoxin는 ~ 150 kDa의 그것의 정의 분자량이 독소 복합체에 대한보다 광범위하게 정의 된 700 ~ 900 kDa의 비교 때문에이 실험을 위해 선택하고, 순도는 정확한 농도에서 매우 정확한 스파이크를 허용했다. 발광 비율, 470 ㎚에서의 그것과 526 nm에서의 방출의 비는 (434)에 여진을 다음NM, 각 시점에서 BONT / A 농도 (MLD 50 값 BONT / A 제조사 역가 테스트에 기초) 대 플롯. 본트로 기자의 분열은 우리의 플레이트 리더로 완전히 절단 된 기자에 대해 0.7 그대로 기자 약 2.7 사이의 범위 배출 비율의 감소로 측정된다. 그것은 RFUs 각 플레이트 판독기 대책 형광 때문에, 발광 비율의 실제 값을 사용 플레이트 판독기에 의존 할 것이다 것을주의하는 것이 중요하다. 곡선의 좌측 이동으로 볼 때 증가 기자 분열에서 기자 결과와 배양 시간을 연장. 세중의에서 테스트 데이터 포인트는 평균의 낮은 SD를 표시하고 감소 독소 부하 증가 배출 비율의 예상 추세를 따르십시오. 이 예상 추세를 따르지 분석의 실패는 희석 세대 데이터 음모를 꾸미고 중에 오류가있을 수 있습니다. 더 BONT / A를 포함하지 않는 컨트롤의 배출 비율은 DURIN 안정 유지비특이적 프로테아제 활동의 부족을 나타내는 g 배양 (도 3, 인셋).
약학 BONT / A 샘플을 계량이 프로토콜을 사용하는 예는도 4에 도시된다. 표준 곡선은 정제 본트 / A의 holotoxin와 PBS에서 발생하는 0.9 %의 식염수에 재수 동결 건조 BOTOX의 단일 100 U 유리 병에서 생성 된 약품의 희석과 병렬로 처리되었습니다. (이상적으로, 표준 곡선은 보톡스의 참조를 많이 구성 될 수 있지만, 이러한 물질은 쉽게 사용할 수 없습니다.) 샘플 50 ㎕의 샘플을 10 배 바인딩 버퍼를 사용하지 않고 중복 시험했다는 사실을 제외하고 설명 된 프로토콜을 사용하여 테스트되었습니다. 표준 곡선은 A / E 리포터와 함께 24 시간 배양 한 다음 BONT / A 농도의 함수로서 플롯 팅 하였다. 각각의 미지 시료의 방출 비율은 다음 표준 곡선을 가로 질러 교차를 플롯하여 시각화 하였다. 이 분석에서, 라인표준 곡선 (20 % -80 분석 응답 창) 아칸소 부분은 2.11-1.05의 배출 비율 사이에 폭포와 그림에서 점선 박스로 표시됩니다. 이 선형 범위 내에 세 개의 미지의 농도는 다음 표준 곡선 (그림 4, 삽입)에서 보간 하였다. 이 예에서는 표준 곡선에 대해 알 수없는 샘플을 감지하거나 정량화하는 데 사용됩니다 일반적인 방법을 보여줍니다.
신선한 토마토와 2 % 우유는 프로토콜의 성능과 우수 (토마토) 및 액체 식품 (2 % 우유) 행렬을 모두 사용하여 감도를 설명하기 위해 선택되었다. 이 혼합물은 자연 클로 스트 리듐 속의 세균 오염시 생성되는 독소와 유사하기 때문에 핵심 holotoxin 및 신경 독소 관련 단백질 (낮잠)로 구성 본트 / A 단지는이 실험을 위해 선정되었다. 그림 5A, A / E 기자의 분열로 측정 BONT / A, 복구에 나타낸 바와 같이, B와 관찰OTH 행렬. 기자 증가 배양 시간은 분석 감도를 증가하지만에 음식에서 이월 BONT / A에서 관찰 분열 결과와 특이하지 프로테아제를 나타내는없는 독소 컨트롤 (그림 5A, 인 세트)에 대한 감소 배출 비율로 발생하지 않습니다 분석. 의 예상 추세와 리포터 분열을 감소도 3, 데이터 디스플레이 낮은 가변성과 마찬가지로 다음과 독소 농도를 감소시켰다.
BONT / A LOD, LOQ하고 그림과 각 시점에서 두 식품에 대한 EC (50)는 표 5에 요약되어있다. LOD와 LOQ는 이하 세 십 SD를 각각 배경 (더 BONT / A를 포함하지 않는 샘플), 아래의 배출 비율이 가장 낮은 농도를 샘플로 정의됩니다. S 자형 용량 - 반응 곡선 보간이 낮은 이론적 한계를 계산하기 위해 사용될 수 있지만, 이러한 제한은, 테스트 데이터 포인트로 제한된다. 일부 매트릭스 투매트릭스 효과는 구슬과 세탁시 비드의 회복에 독소의 결합에 영향을 미칠 수 있으므로 LOD 및 LOQ의 행렬 변화가 예상된다. 그것은 이러한 차이의 대부분은 GPB에 토마토 시료를 균질화하는 데 필요한 추가 희석 한 결과 그림 5A,의 데이터에서 토마토 2 % 우유에서 더 많은 독소 복구가 있다는 것을 나타납니다 동안.
단단한 음식 행렬 인 이외에, 토마토 10 배 중화 버퍼의 첨가에 의해 달성 pH와 이온 강도 조절, 분석의 성공에 매우 중요 주목할만한 샘플 유형입니다.의 포함 유무에 관계없이 토마토를 테스트 할 때 그림 (b)는 분석 응답을 보여줍니다 배 중화 버퍼. 샘플에서 BONT / A의 가난한 복구에 10 배 중화 버퍼 결과를 추가하고 모든 시험 본트 / A 농도에 걸쳐 일정한 배출 비율에 의해 입증되고 실패. 배 중화 버퍼의 추가,하지만, R독소의 민감한 검출 esults.
BONT 이외의 단백질 분해 효소는 A / E 기자를 절단 할 수 있기 때문에 해결되지 않을 경우 복잡한 매트릭스에 포함 된 비특이적 단백질 분해 효소는 잘못된 반응으로 이어질 수 있습니다. 비특이적 단백질 분해 효소는 음식 샘플과 내인성 또는 클로 스트 리듐 속의 세균 배양 상층 액으로 nonpurified 본트 제제를 사용하는 경우 도입 될 수있다. 철저한 비드 세척은 대부분 비특이적 인 단백질 분해 효소를 제거 할 수 있지만, 반응 버퍼에 단백질 분해 효소 억제제의 추가는 중요하다 (6) 수정 된 A / E 기자, BoTest KO (KO 기자를 사용하는 클로 스트 리듐 본트 / A 배양 상층 액에서 발견 된 특이 단백질 분해 효소의 활동을 보여줍니다 그림. ). KO 기자가 BONT / A 절단 부위가 돌연변이 된 것을 제외하고는 A / E 기자와 동일 그것이 더 이상 BONT / A. 의해 절단되도록 따라서 관찰 된 기자의 분열은 특이 단백질 분해 효소 활동의 결과. KO 기자 사이클의 높은 수준avage은 배양 상등액은 프로테아제 활성의 높은 수준을 포함 나타내고 있지만, 그 활동을 효과적으로 프로테아제 억제제의 첨가에 의해 무효화된다.
샘플 데이터는 간단한 버퍼 및 식품 행렬에서 높은 처리량 BONT / A 검출 용 프로토콜의 실용성을 입증. 특정 음식은 작은 분석의 조정이 필요할 수 있지만, 설명 된 프로토콜은 식품 유형의 대부분에 좋은 결과를 얻을 수 있어야합니다.
그림 1. 권장 플레이트 레이아웃입니다. 샘플이 가능한 가장자리 효과를 방지하기 위해 판의 내부 (60) 우물로 제한됩니다. 원하는대로 알 수없는 또는 표준 곡선의 샘플을 추가 할 수 있습니다. 모든 사용하지 않는 우물 기자 배양 동안 100 μL의 물이 가득해야합니다. cli를큰 이미지를 보려면 여기를 CK.
그림 2. 설명 프로토콜의 개요도. 프로토콜의 각 주요 단계는 레이블 상자로 표시하고 다음으로 추정 분석 타임 라인 (확장 할 수 없습니다)에 정렬됩니다. 비 식품 샘플은 샘플 처리를 요구하는 등 식품 샘플 하류의 프로토콜을 입력하지 마십시오. 미지에 대한 일련의 희석 생성 주위 점선 상자가이 옵션을 나타냅니다 만, 추천 단계. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
BONT / 기술 된 프로토콜을 사용하여 PBS에 holotoxin의 그림 3. 감지.정제 BONT / A holotoxin는 PBS로 아군 1 ㎚의 상측 본트 / A 농도 설명 프로토콜을 사용하여 테스트되었습니다. 모든 샘플 3 중으로 시험 하였다하고 오차 막대는 평균값의 표준 편차를 나타낸다. 보고 힘은 독소의 제조 업체의 마우스 생물 검정 시험을 기반으로합니다. 표준 곡선의 발광 비율 (434 nm에서의 여기에 따라 470 ㎚에 대한 526 nm에서의 방출의 비율)은 A / E 기자 2, 4 및 24 시간 배양 한 다음 측정 BONT / A 농도의 함수로서 플롯 팅 하였다 . 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
설명 된 프로토콜을 사용 BOTOX 약물 제품의도 4. 부량. 동결 건조 된 BOTOX 약물 제품의 단일 100 U 바이알 resuspe이었다 nded 220 ㎕의 0.9 % 생리 식염수에 희석 한, 정제 본트 / A의 holotoxin을 사용하여 PBS에서 만든 표준 곡선에 대한 미지수로 테스트했습니다. 샘플은 그 50 ㎕의 샘플을 중복의 10 배 바인딩 버퍼없이 테스트되었습니다 제외하고 설명하는 프로토콜에 따라 시험 하였다. 표준 곡선은 가변 슬로프 S 자형 용량 - 반응 방정식 표준 곡선 샘플의 발광 비율을 피팅하고 BONT / A 농도의 함수로서 플롯 팅하여 계산되었다. 는 A / E 기자와 24 시간 배양 한 다음 표준 곡선과 교차하는 각 미지 시료가 표시됩니다. 선형 범위 (점선 음영 처리 된 상자)에 속하는 미지 시료의 농도는 표준 곡선으로부터 보간했다. 각각의 BOTOX 불명위한 라벨 표지 된 힘에 기초하여 시료에 존재하는 유닛의 수이다. 오차 막대는 평균값의 표준 편차를 나타낸다.T는 = "_blank"> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
설명 된 프로토콜을 사용하여 BONT / A 아군 2 % 우유와 신선한 토마토 테스트 그림 5. 복구. 2 % 우유와 신선한 토마토의 샘플은 정제 BONT / A 복합체 아군과 설명 프로토콜을 사용하여 테스트되었습니다. 모든 샘플 3 중으로 시험 하였다하고 오차 막대는 평균값의 표준 편차를 나타낸다. (A) 2 % 우유와 신선한 토마토 표준 곡선의 출사 비율은,이 다음 4를 측정하고, A / E 리포터와 함께 24 시간 배양 하였다 그리고 본트 / A의 힘의 함수로 꾸몄다. 분석 실패에 토마토 시험 결과 동안 10 배 중화 버퍼를 포함하는 (B) 실패. 신선한 토마토의 샘플 또는 중립 배의 첨가없이 하나 설명 된 프로토콜에 따라 시험 하였다화 버퍼. 표시 데이터는 4 시간 시점입니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
복잡한 매트릭스를 테스트 할 때도 6. 프로테아제 억제가 요구된다. 듐 BONT / A (스트레인 홀 A) 배양 상등액은 직렬 PBS에 희석하고, 또는 프로테아제 억제제없이 반응 완충액에 첨가하고, 모두 하나 기재된 프로토콜을 사용하여 시험 하였다 / E와 KO 기자. 발광 비는 A / E 또는 KO 기자 모두 함께 24 시간 배양 한 다음 측정 BONT / A 역가의 함수로서 플롯 팅 하였다. KO 기자의 중요한 분열은 단백질 분해 효소 억제제를 첨가하지 않고 보였다 그러나 그들의 포함에 의해 부정되었다. 모든 샘플은 삼중 및 오류 B 시험 하였다ARS는 평균의 표준 편차를 나타냅니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 완충기 | 구성 | 보관 온도 | 안정 | 주의 사항 |
| 배 매트릭스 버퍼를 바인딩 | 500 mM의 HEPES-수산화 나트륨, 산도 7.1, 250 ㎜의 NaCl, 1 % 트윈 20, 5 %의 카제인, 0.05 % NaN3가 | -20 또는 -80 ° C | 해동시 4 ° C에서 5 일 최소 안정 | BoTest 매트릭스 보툴리눔 검출 키트와 함께 제공 |
| 배 매트릭스 세척 버퍼 | 119 mM의 인산염, 산도 7.4, 1,370 밀리미터의 NaCl, 27 mM의 KCl을, 1 % 트윈 20 | -20 또는 -80 ° C | 해동시 4 ° C에서 5 일 최소 안정 | BoTest 매트릭스 보툴리눔 검출 키트와 함께 제공 |
| 배 중화 버퍼 | 1 M HEPES-NaOH를, 산도 8.0, 1 M NaCl을 | 4 ° C | 4 ° C에서 최대 6 개월 동안 안정 | |
| 배 BoTest 반응 버퍼 | 500 mM의 HEPES-수산화 나트륨, 산도 7.1, 50 mM의 염화나트륨, 1 % 트윈 20, 100 μM ZnCl 2 | -20 또는 -80 ° C | 해동시 4 ° C에서 5 일 최소 안정 | BoTest 매트릭스 보툴리눔 검출 키트와 함께 제공 |
| BoTest A / E 기자 | 50 mM의 HEPES-NaOH를, 10 mM의 NaCl을, 15 % 글리세롤 20 μM | -80 ° C | 작은 분량 씩 보관합니다. 해동시 4 ° C에서 5 일 최소 안정. | BoTest 매트릭스 보툴리눔 검출 키트와 함께 제공 |
| 젤라틴 인산 버퍼 (GPB) | 33.3 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 산도 6.2, 2g / L의 젤라틴 | 4 ° C | 4 ° C에서 최대 1 개월 안정 | |
| 200X 디티 오 트레이 톨 (DTT) | 1 M DTT | -20 ° C | -20 ° C에서 최대 6 개월 동안 안정 | 하고 작은 (100 μL) 분취를 저장 |
| 1X PBS-T | 11.9 mM의 인산염, 산도 7.4, 137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 0.1 % 트윈 20 | 4 ° C | 4 ° C에서 최대 1 개월 안정 | 배 피셔에서 PBS (BP399-1)를 사용하여 만들 수 있습니다 |
| 매트릭스 구슬 (IP-A 구슬) | 자석 구슬은 공유 PBS에서 닭 방지 본트 / A 항체에 접합. 0.1 % 트윈 -20, 0.05 % 아 지드 화 나트륨, 0.25 % 카세인, 50 % 글리세롤 | -20 ° C | -20 ° C.에서 제거시 4 ° C에 5 일 최소 안정 -80 ° C에서 동결하지 마십시오 |
표 1. 설명 프로토콜에 필요한 버퍼. 배 중화버퍼는 매우 복잡한 (예 : 식품) 샘플과 정량되는 시료의 특성에 따라 필요하지 않을 수 있습니다.
| 소재 / 장비 명 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 / 설명 |
| BoTest 매트릭스 보툴리눔 신경 독소 검출 키트 | BioSentinel | A1015 | BONT / B와 F에 대한 검색 키트도 사용할 수 있습니다. |
| Varioskan 플래시 형광 마이크로 플레이트 리더 | 열 피셔 과학 | 5250040 | 434 nm의 여기 및 470 nm 내지 526 nm의 발광 기능이있는 대부분의 단색화 장치 또는 필터 기반의 단위를 사용할 수있다. |
| 96 - 웰 자석 구슬 분리 판 | V & P 과학 | VP771H | 다른 자기 플레이트를 사용할 수 있지만, 플레이트 B를 분리하도록 설계되어야우물의 측면 EADS. |
| 자석 구슬 호환 와셔 | BioTek | ELx405 VSRM | 선택 만 자동 판 세탁이 필요합니다. 다른 자기 비드 호환 플레이트 세탁기도 사용할 수 있지만, 사용하기 전에 테스트해야합니다. |
| 마이크로 원심 | 여러 | N / A | 선택 만 원심 분리를 필요로하는 샘플이 필요합니다. |
| MixMate 판 믹서 | 에펜 도르프 | 22674200 | |
| 궤도 셰이커 | 여러 | N / A | 온도 제어를 사용할 수있는 경우 실온에서 25 ° C에서 사용 |
| EDTA없는 프로테아제 억제제 정제 | 로슈 | 4693132001 | 단지 음식이나 환경 테스트에 필요합니다. 단백질 분해 효소 억제제는 EDTA-없어야합니다. |
| BONT / A | Metabiologics | N / A | 선택 만 표준화 및 정량화 목적에 필요한 |
| 블랙, 플랫 바닥 96 - 웰 플레이트 | NUNC | 237105 | 플레이트 처리 수 없습니다 |
| 96 - 웰 플레이트 밀봉 테이프 | 온도 과학 | 15036 |
표 2. 재료 및 기술 프로토콜에 필요한 장비. 일부 재료 및 장비는 선택하거나 사용 가능한 장비에 따라 대체 될 수 있습니다. 추가의 적합성 테스트 및 최적화는 다른 장비를 사용하는 경우 요구 될 수있다.
| 샘플 이름 | 볼륨 독소 | 볼륨 희석제 | [본트 / A] (MLD 50 / ㎖) 또는 (MLD 50 / g의 음식) | 로그 [본트 / A] (MLD 50 / ㎖) 또는 (MLD 50 / g의 음식) | D1 | 1,200 μL 스톡 | N / A | 30,000 | 4.48 |
| D2 | 300 ㎕의 D1 | 600 μL | 10,000 | 4 | |||||
| D3 | 90 μL D1 | 810 μL | 3000 | 3.48 | |||||
| D4 | 90 μL D2 | 810 μL | 1000 | 3 | |||||
| D5 | 90 ㎕의 D3 | 810 μL | (300) | 2.48 | |||||
| D6 | 90 μL D4 | 810 μL | (100) | 2 | |||||
| D7 | 90 μL D5 | 810 μL | (30) | 1.48 | |||||
| D8 | 90 ㎕의 D6 | 810 μL | 10 | 1 | |||||
| D9 | N / A | 1,400 μL | N / A | N / A | </ TR>
표 3. 표준 곡선의 샘플 희석 테이블이 테이블은 크기가 3.5 이상 구매시 절반 로그 희석의 표준 곡선을 생성합니다. 충분한 없음 BONT 빈 샘플 (D9)는 = 6 N을 실행하기 위해 생성됩니다. 원하는 경우 추가 희석을 추가 할 수 있습니다.
| 프로그램 이름 | 변하기 쉬운 | 값 | 댓글 |
| 프라임 | 시약 병 | ||
| 프라임 볼륨 | (400) | ||
| 프라임 유량 | 7 | ||
| 수상 후 적시? | N | ||
| 매트릭스 워시 | 시약 병 | 잔류 프로테아제 활성이 관찰되는 경우에 세척의 수는 증가 될 수있다. | |
| 방법 | |||
| 4 | |||
| / 흔들어 적신다 | 와이 | ||
| 시간을 만끽 | (180) | ||
| 적시하기 전에 흔들어? | N | ||
| 총리는 후 적시? | N | ||
| DISP | |||
| 볼륨 분배 | (300) | ||
| 유량에게 분배 | 5 | ||
| 높이를 분배 | (130) | ||
| 호르. 순위를 분배. | 0 | ||
| 대기음을 사용하지 않도록 설정? | 와이 | ||
| 바닥 세척 먼저? | N | ||
| 시작하기 전에 국무? | N | ||
| Aspir | |||
| 흡인 높이 | (40) | ||
| 호르. 기음 순위. | 0 | ||
| 흡인 평가 | 5 | ||
| 흡인 지연 | <TD> 0|||
| 십자로 대기음? | N | ||
| 흡인 최종? | 와이 | ||
| 최종 포부 지연 | 0 | ||
| 매트릭스 적신다 | 시간을 만끽 | (300) | 증가 흡수 기간은 점성 음식에서 비드 복구를 증가시킬 수있다. |
| 적시하기 전에 흔들어? | N | ||
| 마스터 워시 | 매트릭스 적신다 | 이 매트릭스는 적시 실행하는 '링크'프로그램과 함께 매트릭스 세척 프로그램. | |
| 매트릭스 워시 |
표 4. 자석 구슬 호환 자동화 와셔 프로그램 설정. 다음 프로그램은 와셔가 우물 옆에 것을 구슬을 당기는 자석이 장착되어 있다고 가정 스위칭 모듈 버퍼가되도록 설정되어 1X 세척 버퍼 ( 피BS-t)는이 프로그램은 BioTek ELx405에 특정한 밸브 A에 첨부되어 있습니다. 프로그래밍 지침은 기기 설명서를 참조하십시오. 다른 자기 비드 호환 자동 접시 와셔 또는 진공 매니 폴드에 사용될 수 있지만, 테스트 세탁 효율을 극대화 설정을 정의하고 세탁시 비드의 손실을 최소화하기 위해 요구 될 것이다. 세탁 다음과 구슬 복구의 초기 테스트에 관계없이 사용되는 특정 와셔의 추천합니다.
| 식품 매트릭스 | 미터 | 2 시간 | 4 시간 | 24 시간 | |||
| MLD (50) / G 음식 | MLD 50 /도 | MLD (50) / G 음식 | MLD 50 /도 | MLD (50) / G 음식 | MLD 50 /도 | ||
| 우유 | <TD> LOD(300) | 58 | (100) | 19 | (30) | 6 | |
| LOQ | 1000 | 193 | (300) | 58 | (100) | 19 | |
| EC (50) | 2,404 | 464 | 590 | 114 | 92 | 18 | |
| 신선한 토마토 | LOD | 1000 | 91 | (300) | 27 | (30) | 3 |
| LOQ | 1000 | 91 | 1000 | 91 | (100) | 9 | |
| EC (50) | 7,561 | 687 | 1,932 | 176 | 229 | 21 | |
표 5. 검출 한계 (LOD), 정량 한계 (LOQ), 반-MLOD 및 LOQ가 떨어지는 낮은 농도 데이터 포인트로 정의하는 동안 그림 2A에 표시된 2 % 우유와 신선한 토마토 테스트 aximal 유효 농도 (EC 50). EC (50)은 S 자형 용량 - 반응 곡선 맞춤에서 파생 노 본트 컨트롤 (N = 6), 각각 아래의 3 또는 10 중 하나를 표준 편차. 데이터는 MLD (50) / g의 음식과 200 μL 샘플 볼륨에서 잘 따라 테스트 총 MLD (50)의 양쪽에 제시되어있다.
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Discussion
이 프로토콜은 본트 / 복잡한 매트릭스에서 복잡한, holotoxin, 또는 클로 스트 리듐 속의 세균 배양액을 정량화하기위한 절차에 대해 설명합니다. 분석 감도 혈청 및 분석법에 걸쳐 달라질 수 있지만, 각각 매트릭스 세이 56, 60와 다른 BONT 혈청 형 (예 BONT / B, E 및 F)을 테스트 할 때 프로토콜은, 그러나, 동일하다. 이 프로토콜은 가능한 샘플의 모든 유형을 고려하지 않고, 몇몇 수정은 특정한 샘플 조성 및 원하는 애플리케이션에 따라 요구 될 수있다. 행렬은 식품 샘플 (예 : 식품 도전 테스트) 또는 제약 부형제 버퍼 (예 : 본트 기반 약물 제품 테스트)를 포함 할 수 있습니다. 단지 비 식품 (예를 들어, 동물 조직 또는 환경) 액체와 고체 시료는 식품 샘플로 취급되어야한다. 이 프로토콜은 200 μL / 잘 샘플 볼륨을 사용하지만, 적은 50 μL / 잘 배 Bindin의 볼륨에 해당하는 조정으로 테스트 할 수 있습니다G 버퍼. 50 μL보다 작은 샘플을 테스트하기 전에 ≥ 50 μL에 GPB 또는 PBS로 희석해야한다.
식품의 높은 변수 자연 식품 본트 검출 및 정량을위한 특별한 도전을 나타냅니다. 샘플의 pH, 점도, 이온 강도, 입자상 물질의 존재는 잠재적으로 식품 매트릭스 내 독소의 활성에 영향을주고, 독소가 정확 체외 부량 식품으로부터 분리 될 것을 필요로 할 수있다. 많은 음식이나 독소 제제도 제거 또는 만 BONT 특정 단백질 분해 효소의 활성을 측정하도록 단백질 기반의 기자를 사용하는 경우 비활성화해야합니다 내인성 단백질 분해 효소가 포함되어 있습니다. 이러한 제약 부형제 버퍼로도 간단하고, 잘 정의 된 버퍼 행렬, 정량화 35,56-59,61 전에 제거해야 본트 활동을 방해 화합물을 포함 할 수 있습니다. 면역은 빠르고, 높은 혈청 형 특정 BONT 푸리을 제공합니다문법을 없애는 방법하지만 "실제"음식, 환경, 의약품 샘플에서 발견되는 낮은 독소 농도를 분리하기 위해 선호도가 높은 항체가 필요합니다.
기술 된 프로토콜은 BONT / A 코어 holotoxin 56 독소 중쇄 수용체 도메인 향하는 안티 BONT / A 항체로 코팅 된 상자성 비드를 사용하여 독소를 정화한다. 클로스 트리 디움 종 그러나 자연적으로 연관 코어 holotoxin 이루어진 독소 복합체를 생산할 낮잠 62 ~ 64과. 낮잠은 위장관에서 단백 분해 효소의 공격으로부터 독소를 보호하고 소장 상피 세포 63,65 통해 독소 전송을 촉진하기 위하여 믿어진다. 넵스 코어 holotoxin (데이터는 도시하지 않음)에 IP-A 비드 안티 BONT / A 항체의 결합을 억제한다. 이 억제는 본트 / A holotoxin 및 낮잠에 해리 복잡하고 수 있도록 효과적인 독소의 원인, 6.25 ~ 이상으로 샘플의 pH를 증가시켜 안심IP-A에 결합하는 것은 66를 구슬로 장식한다. 이러한 이유로, 6.5 이상으로 시료의 pH를 조절하는 것은 상기 분석 (도 5b)의 성공에 매우 중요하다. 프로토콜에 사용되는 배 바인딩 버퍼는 표준 분석 조건으로 pH를 올릴 수 있도록 완충제가 들어 있습니다. 그러나, 많은 산성 식품은 결합 완충액의 완충 능력을 압도 할 수있다. 추가적인 10X 중화 버퍼는 크게 시료 완충 능력을 증가시키고 식품 행렬의 대부분을 중화한다.
분석을위한 또 다른 중요한 매개 변수는 샘플 이온 강도입니다. 원심 분리하여 샘플의 설명은 다음과 같은 면역 효과 비드 세척 및 복구를 위해 필요합니다. 신선한 토마토와 테스트 샘플을 간단하게 처리하고 원심 분리했을 때 더 본트 / 복구가 보이지 않았다 것으로 나타났다. 우리는 본트 / A는 원심 분리 동안 펠렛의 원인이되는 토마토의 육체에 연결하고 결석이 될 수 있다는 것을 가정시험 뜨는. 우리는 발견 BONT 개선 독소 복구 (그림 5B)의 결과로 매트릭스 사이의 pH가 제한된 상호 작용을 중화, 더 크게, 이온 강도를 증가 시키거나. BONT 복구에 필요한 것은 아니지만, 그것은 더 높은 염 농도는 또한 면역 침전의 엄격 성을 증가시키고 이하 비특이적 단백질 복구 결과, 특히 저염 식품에서 것을 증명하지 않지만, 예상된다.
샘플 pH와 프로토콜의 이온 강도의 조정은 10X 중화 완충액의 첨가에 의해 수행되고 음식의 광범위와 호환되어야한다. 배 중화 버퍼가 높은 완충 능력을 가지고 있지만, 일부 높은 산성 식품은 추가 pH 조정이 필요할 수 있습니다. 버퍼 또한 다음 샘플의 pH 시험은별로 분석 성능이 관찰되는 경우에 권장 및 샘플 볼륨이 허용됩니다. 추가로 pH 조정 해제의 첨가를 통해 달성 될 수있다1 M HEPES pH가 8 몰 볼륨, 필요한 경우. 가난한 결과는 주어진 재료로 볼 경우, 10 배 중화 버퍼가 1 M HEPES pH를 8로 대체 할 수 있으며 10 배 중화 버퍼에 의해 도입 된 추가 염화나트륨은 염도가 음식을하지만 모두를 위해 허용해야한다. PBS에 1.2 M까지의 NaCl 농도에서 설명 된 프로토콜을 테스트 할 때 유의 한 차이가 관찰되지 않았다.
이 프로토콜은 샘플의 대부분에 적용될 수 있지만, 산도, 이온 강도, 및 / 또는 프로테아제 콘텐츠의 극단에서 식품 분석으로 좋은 결과를 얻을 수없는 경우가 있습니다. 어떤 음식도별로 구슬 복구의 결과로, GPB의 추가 다음 너무 점성이 남아있을 수 있습니다. 이러한 PBS와 같은 간단한 버퍼와 샘플의 희석 결과를 향상시킬 수 있습니다. 세척의 수를 증가 시키거나 (증가 염화나트륨 농도) 엄격 씻어 EDTA없는 단백질 분해 효소 억제제의 농도가 증가하면 결과를 향상시킬 수있는 경우 비특이적 인 단백질 분해 효소 오 염이온이 관찰된다. 자동 판 세척을 사용하는 경우 악기의 청결도도 매우 중요합니다. 다른 실험실 분석에서 단백질 분해 효소 (예를 들어, 트립신)와 배관 및 분사 노즐의 오염은 분석 중에 단백질 분해 효소의 의도 도입으로 이어질 수 있습니다. 제조업체의 사용 설명서에 따라 와셔의 철저한 청소는 분석을 실행하기 전에하는 것이 좋습니다.
BoTest 매트릭스 분석은 복잡한 매트릭스에서 본트 검출과 정량에 대한 최초의 상용화, 활동 기반의 분석이다. 표준 마우스 생물학적 검정에 비해, 분석은 덜 비싸고, 빠르고, 특수한 설비 또는 동물 용 (56)과 관련된 윤리적 문제에 대한 필요없이 높은 스루풋 테스팅을 허용한다. 다른 생체 본트 검출 방법이 설명되어 있지만, 복잡한 샘플 매트릭스와 호환되도록 표시되지 않은, 전문 장비를 필요로하거나, 상업적으로 이용하실 수 없습니다르 35,42-44,46-55. 분석은 기존의 효소 결합 immunosorbant 분석 (ELISA) 기술은 독소의 질량을보고있는 반면, 독소 엔도 활동을 측정 활동 기반의 분석이다. 활동 기반 ELISA 분석법이 전술되었지만 이러한 분석법은 식품 행렬 작동하고 샘플 행렬 (41)로부터의 정화 독소를 포괄하지 입증되지 않았다. 매트릭스 화합물은 종종 본트 활동 35,56-59을 방해하기 때문에 독소가 샘플에서 정제되지 않은 경우 복잡한 시료의 독성의 중요한 과소가 발생할 수 있습니다.
프로토콜은 마스터되면 변형이 샘플 볼륨을 높이고 샘플 감도를 증가시키기 위해 이루어질 수있다. 예를 들어, 비즈 독소의 결합은 원심 분리에 의해 수집 전에 큰 벌크 샘플 (예를 들면 10 ㎖ 이상)에서 수행 될 수있다. 이러한 비드를 96 - 웰 플레이트에 첨가하고 설명 다음 정량 할 수있다D 프로토콜입니다. 하나의 로그보다 큰 감도의 증가는 증가 샘플 크기 (56) 관찰되었다. 따라서, 상기 설명한 프로토콜은 미량이라도 마우스 생물학적 검정에 의해 탐지되지 수도 시료에 함유 BONT의 양을 검출하기 위해 큰 양의 샘플과 함께 사용될 수있다.
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Disclosures
FM 독촉, TM 광장, F. Zeytin의, 및 WC 터커 BioSentinel 주식 BioSentinel의 직원 또는 소유자입니다 현재 생산이 보고서에서 제시 한 시약을 상용화했다.
Acknowledgments
저자는 가치있는 토론과 조언을 H. 올리바 레스와 D. Ruge에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 연구는 NSF SBIR 상 (BioSentinel 주식에 IIP-1127245)와 국방부 계약 (BioSentinel 주식에 W81XWH-07-2-0045)에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit | BioSentinel | A1015 | Detection kits for BoNT/B and F are also available. |
| Varioskan Flash fluorescence microplate reader | Thermo Fisher Scientific | 5250040 | Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 nm and 526 nm emission capability can be used. |
| 96-well Magnetic Bead Separation Plate | V&P Scientific | VP771H | Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well. |
| Magnetic Bead-Compatible Plate Washer | BioTek | ELx405 VSRM | Optional, only required for automated plate washing. Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use. |
| Microcentrifuge | Optional, only required for samples needing centrifugation. | ||
| MixMate plate mixer | Eppendorf | 22674200 | |
| Orbital Shaker | Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available | ||
| EDTA-free Protease Inhibitor Tablets | Roche | 4693132001 | Only required for food or environmental testing. Protease inhibitors must be EDTA-free. |
| BoNT/A | Metabiologics | Optional, only required for standardization and quantification purposes | |
| Black, Flat-bottomed 96-well Plates | NUNC | 237105 | Plates should not be treated |
| 96-well Plate Sealing Tape | Thermo Fisher Scientific | 15036 |
References
- Arnon, S. S., et al. Botulinum toxin as a biological weapon: medical and public health management. J. Am. Med. Assoc. 285, 1059-1070 (2001).
- Gill, D. M. Bacterial toxins: a table of lethal amounts. Microbiol. Rev. 46, 86-94 (1982).
- Montal, M. Botulinum neurotoxin: a marvel of protein design. Annu. Rev. Biochem. 79, 591-617 (2010).
- Lacy, D. B., Stevens, R. C. Sequence homology and structural analysis of the clostridial neurotoxins. J. Mol. Biol. 291, 1091-1104 (1999).
- Montecucco, C., Schiavo, G. Structure and function of tetanus and botulinum neurotoxins. Q. Rev. Biophys. 28, 423-472 (1995).
- Ahnert-Hilger, G., Munster-Wandowski, A., Holtje, M. Synaptic vesicle proteins: targets and routes for botulinum neurotoxins. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 364, 159-177 (2013).
- Yamasaki, S., et al. Cleavage of members of the synaptobrevin/VAMP family by types D and F botulinal neurotoxins and tetanus toxin. J. Biol. Chem. 269, 12764-12772 (1994).
- Schiavo, G., et al. Identification of the nerve terminal targets of botulinum neurotoxin serotypes A, D, and E. J. Biol. Chem. 268, 23784-23787 (1993).
- Schiavo, G., et al. Tetanus and botulinum-B neurotoxins block neurotransmitter release by proteolytic cleavage of synaptobrevin. Nature. 359, 832-835 (1992).
- Schiavo, G., et al. Botulinum G neurotoxin cleaves VAMP/synaptobrevin at a single Ala-Ala peptide bond. J. Biol. Chem. 269, 20213-20216 (1994).
- Rossetto, O., et al. SNARE motif and neurotoxins. Nature. 372, 415-416 (1994).
- Montecucco, C., Schiavo, G. Mechanism of action of tetanus and botulinum neurotoxins. Mol. Microbiol. 13, 1-8 (1994).
- Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365, 160-163 (1993).
- Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin C1 blocks neurotransmitter release by means of cleaving HPC-1/syntaxin. EMBO J. 12, 4821-4828 (1993).
- Cherington, M. Clinical spectrum of botulism. Muscle Nerve. 21, 701-710 (1998).
- Lindstrom, M., Korkeala, H. Laboratory diagnostics of botulism. Clin. Microbiol. Rev. 19, 298-314 (2006).
- Werner, S. B., Passaro, D., McGee, J., Schechter, R., Vugia, D. J. Wound botulism in California, 1951-1998: recent epidemic in heroin injectors. Clin. Infect. Dis. 31, 1018-1024 (2000).
- Passaro, D. J., Werner, S. B., McGee, J., MacKenzie, W. R., Vugia, D. J. Wound botulism associated with black tar heroin among injecting drug users. J. Am. Med. Assoc. 279, 859-863 (1998).
- Brook, I. Infant botulism. J. Perinatol. 27, 175-180 (2007).
- Arnon, S. S. Honey, infant botulism and the sudden infant death syndrome. West J. Med. 132, 58-59 (1980).
- Arnon, S. S. Infant botulism. Annu. Rev. Med. 31, 541-560 (1980).
- Peck, M. W., Stringer, S. C., Carter, A. T. Clostridium botulinum in the post-genomic era. Food Microbiol. 28, 183-191 (2011).
- Sharma, S. K., Whiting, R. C. Methods for detection of Clostridium botulinum toxin in foods. J. Food Prot. 68, 1256-1263 (2005).
- Sobel, J. Botulism. Clin. Infect. Dis. 41, 1167-1173 (2005).
- Chen, S. Clinical uses of botulinum neurotoxins: current indications, limitations and future developments. Toxins. 4, 913-939 (2012).
- Sinha, D., Karri, K., Arunkalaivanan, A. S. Applications of Botulinum toxin in urogynaecology. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 133, 4-11 (2007).
- Dmochowski, R., Sand, P. K. Botulinum toxin A in the overactive bladder: current status and future directions. BJU Int. 99, 247-262 (2007).
- Benecke, R., Dressler, D. Botulinum toxin treatment of axial and cervical dystonia. Disabil. Rehabil. 29, 1769-1777 (2007).
- Hunt, T., Clarke, K. Potency evaluation of a formulated drug product containing 150-kd botulinum neurotoxin type A. Clin. Neuropharmacol. 32, 28-31 (2009).
- Marchetti, A., et al. Retrospective evaluation of the dose of Dysport and BOTOX in the management of cervical dystonia and blepharospasm the REAL DOSE study. Mov. Disord. 20, 937-944 (2005).
- Wohlfarth, K., Sycha, T., Ranoux, D., Naver, H., Caird, D. Dose equivalence of two commercial preparations of botulinum neurotoxin type A: time for a reassessment. 25, 1573-1584 (2009).
- AOAC International, Clostridium botulinum and its toxins in foods (method 977.26 section 17.7.01). , (2001).
- Schantz, E. J., Kautter, D. A. Microbiological methods: standardized assay for Clostridium botulinum toxins. J. AOAC. 61, 96-99 (1978).
- Ferreira, J. L. Comparison of amplified ELISA and mouse bioassay procedures for determination of botulinal toxins A, B, E, and F. J. AOAC. Int. 84, 85-88 (2001).
- Directive 2003/15/EC of the European Parliament and of the Council. Official Journal of the European Union. , (2003).
- Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM Scientific Workshop on Alternative Methods to Refine, Reduce or Replace the Mouse LD50 Assay for Botulinum Toxin Testing. Report No. 08-6416, NIH. , (2008).
- Bitz, S. The botulinum neurotoxin LD50 test - problems and solutions. ALTEX. 27, 114-116 (2010).
- Balls, M. Replacing the animal testing of botulinum toxin: time to smooth out the wrinkles. Altern. Lab. Anim. 38, 1-2 (2010).
- Balls, M. Botulinum toxin testing in animals: the questions remain unanswered. Altern. Lab. Anim. 31, 611-615 (2003).
- Singh, A. K., Stanker, L. H., Sharma, S. K. Botulinum neurotoxin: where are we with detection technologies. Crit. Rev. Microbiol. 39, 43-56 (2013).
- Liu, Y. Y., Rigsby, P., Sesardic, D., Marks, J. D., Jones, R. G. A functional dual-coated (FDC) microtiter plate method to replace the botulinum toxin LD50 test. Anal. Biochem. 425, 28-35 (2012).
- Ouimet, T., Duquesnoy, S., Poras, H., Fournie-Zaluski, M. C., Roques, B. P. Comparison of Fluorigenic Peptide Substrates PL50, SNAPtide, and BoTest A/E for BoNT/A Detection and Quantification: Exosite Binding Confers High-Assay Sensitivity. J. Biomol. Screen. , (2013).
- Scotcher, M. C., Cheng, L. W., Stanker, L. H. Detection of botulinum neurotoxin serotype B at sub mouse LD(50) levels by a sandwich immunoassay and its application to toxin detection in milk. PLoS One. 5, (2010).
- Mason, J. T., Xu, L., Sheng, Z. M., O'Leary, T. J. A liposome-PCR assay for the ultrasensitive detection of biological toxins. Nat. Biotechnol. 24, 555-557 (2006).
- Ruge, D. R., et al. Detection of six serotypes of botulinum neurotoxin using fluorogenic reporters. Anal. Biochem. 411, 200-209 (2011).
- Hines, H. B., et al. Use of a recombinant fluorescent substrate with cleavage sites for all botulinum neurotoxins in high-throughput screening of natural product extracts for inhibitors of serotypes A, B, and E. Appl. Environ. Microbiol. 74, 653-659 (2008).
- Gilmore, M. A., et al. Depolarization after resonance energy transfer (DARET): a sensitive fluorescence-based assay for botulinum neurotoxin protease activity. Anal. Biochem. 413, 36-42 (2011).
- Capek, P., Dickerson, T. J. Sensing the deadliest toxin: technologies for botulinum neurotoxin detection. Toxins. 2, 24-53 (2010).
- Bagramyan, K., Barash, J. R., Arnon, S. S., Kalkum, M. Attomolar detection of botulinum toxin type A in complex biological matrices. PLoS One. 3, (2008).
- Wang, D., Baudys, J., Kalb, S. R., Barr, J. R. Improved detection of botulinum neurotoxin type A in stool by mass spectrometry. Anal. Biochem. 412, 67-73 (2011).
- Parks, B. A., et al. Quantification of botulinum neurotoxin serotypes A and B from serum using mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 9047-9053 (2011).
- Kalb, S. R., Goodnough, M. C., Malizio, C. J., Pirkle, J. L., Barr, J. R. Detection of botulinum neurotoxin A in a spiked milk sample with subtype identification through toxin proteomics. Anal. Chem. 77, 6140-6146 (2005).
- Kalb, S. R., et al. The use of Endopep-MS for the detection of botulinum toxins A, B, E, and F in serum and stool samples. Anal. Biochem. 351, 84-92 (2006).
- Boyer, A. E., et al. From the mouse to the mass spectrometer: detection and differentiation of the endoproteinase activities of botulinum neurotoxins A-G by mass spectrometry. Anal. Chem. 77, 3916-3924 (2005).
- Barr, J. R., et al. Botulinum neurotoxin detection and differentiation by mass spectrometry. Emerg. Infect. Dis. 11, 1578-1583 (2005).
- Dunning, F. M., et al. Detection of botulinum neurotoxin serotype A, B, and F proteolytic activity in complex matrices with picomolar to femtomolar sensitivity. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7687-7697 (2012).
- Jones, R. G., Ochiai, M., Liu, Y., Ekong, T., Sesardic, D. Development of improved SNAP25 endopeptidase immuno-assays for botulinum type A and E toxins. J. Immunol. Methods. 329, 92-101 (2008).
- Ekong, T. A., Feavers, I. M., Sesardic, D. Recombinant SNAP-25 is an effective substrate for Clostridium botulinum type A toxin endopeptidase activity in vitro. Microbiology. 143 (pt 10), 3337-3347 (1997).
- Shone, C. C., Roberts, A. K. Peptide substrate specificity and properties of the zinc-endopeptidase activity of botulinum type B neurotoxin. Eur. J. Biochem. 225, 263-270 (1994).
- Piazza, T. M., et al. In vitro detection and quantification of botulinum neurotoxin type e activity in avian blood. Appl. Environ. Microbiol. 77, 7815-7822 (2011).
- Mizanur, R. M., Gorbet, J., Swaminathan, S., Ahmed, S. A. Inhibition of catalytic activities of botulinum neurotoxin light chains of serotypes A, B and E by acetate, sulfate and calcium. Int. J. Biochem. Mol. Biol. 3, 313-321 (2012).
- Sugii, S., Sakaguchi, G. Molecular construction of Clostridium botulinum type A toxins. Infect. Immun. 12, 1262-1270 (1975).
- Sharma, S. K., Ramzan, M. A., Singh, B. R. Separation of the components of type A botulinum neurotoxin complex by electrophoresis. Toxicon. 41, 321-331 (2003).
- Bryant, A. M., Davis, J., Cai, S., Singh, B. R. Molecular composition and extinction coefficient of native botulinum neurotoxin complex produced by Clostridium botulinum hall A strain. Protein. J. 32, 106-117 (2013).
- Kukreja, R. V., Singh, B. R. Comparative role of neurotoxin-associated proteins in the structural stability and endopeptidase activity of botulinum neurotoxin complex types A and E. 46, 14316-14324 (2007).
- Eisele, K. H., Fink, K., Vey, M., Taylor, H. V. Studies on the dissociation of botulinum neurotoxin type A complexes. Toxicon. 57, 555-565 (2011).
