Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Isolering och kvantifiering av botulinneurotoxin Från Komplexa matriser med de BoTest Matrix Analyser

doi: 10.3791/51170 Published: March 3, 2014

Summary

Den BoTest Matrix botulinum neurotoxin (BoNT) detektionsanalyser snabbt rena och kvantifiera BoNT från en rad olika provmatriser. Här presenterar vi ett protokoll för detektion och kvantifiering av BoNT från både fasta och flytande matriser och visar analysen med Botox, tomater, och mjölk.

Abstract

Det krävs noggrann detektering och kvantifiering av botulinumtoxin (BoNT) i komplexa matriser för läkemedels-, miljö-, och livsmedelsprov testning. Behövs Rapid BoNT testning av livsmedel under utbrottskriminalteknik, patientens diagnos, och livsmedelssäkerhet testning medan exakt potens tester krävs för BoNT-baserade läkemedlet produkttillverkning och patientsäkerhet. Den används flitigt bioassay med möss för BoNT testning är mycket känslig men saknar precision och kapacitet som behövs för snabb och rutin BoNT testning. Dessutom har bioassay användning av djur lett till samtal med läkemedelsprodukt tillsynsmyndigheter och förespråkare djur-rättigheter i USA och utomlands för att ersätta musen bioassay för BoNT testning. Flera in vitro ersättningsanalyser har utvecklats som fungerar bra med renat BoNT i enkla buffertar, men de flesta har inte visat sig gälla för att testa i mycket komplexa matriser. Här, ett protokoll för detektion avBoNT i komplexa matriser med hjälp av BoTest Matrix analyserna presenteras. Analysen består av tre delar: Den första delen handlar om förberedelse av proverna för testning, är den andra delen ett immunoprecipitation steg med hjälp av anti-BoNT antikroppsbelagda paramagnetiska kulor för att rena BoNT från matrisen, och den tredje delen kvantifierar isolerade BoNT s proteolytiska aktivitet med användning av ett fluorogent reporter. Protokollet som är skriven för hög genomströmning testning i 96-brunnars plattor med användning av både flytande och fasta matriser och kräver ca 2 h av manuell beredning med totala analystider 4-26 h beroende på den provtyp, toxin belastning, och önskad känslighet. Data presenteras för BoNT / A-testning med fosfatbuffrad koksaltlösning, en läkemedelsprodukt, odlingssupernatant, 2% mjölk, och färska tomater och inkluderar diskussion av kritiska parametrar för analys framgång.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Botulinneurotoxiner (BoNTs) är de dödligaste ämnen som är kända, med intravenösa humana dödliga doser beräknas till 1-3 ng / kg 1,2. Sju strukturellt liknande serotyper av BoNT, märkta A till och med G, föreligger, var och en bestående av en tung kedja-domänen är ansvarig för cellbindning, upptag och translokering in i cytosolen och en lätt kedja som kodar för ett zink-endopeptidas 3-5. Den utsökta toxicitet BoNT resultat av delvis dess specifika bindande och träder i motoriska nervceller i den neuromuskulära förbindelsen 6. Väl inne i neuron, den lätta kedjan endopeptidas specifikt klyver en eller flera av den lösliga N-etylmaleimid-känslig faktor fastsättning proteinreceptor (SNARE) proteiner som krävs för vesikelfusion, hämmande neurotransmittorfrisättning och som leder till förlamning 7-14. Allmänt känd som sjukdomen "botulism", förlamning av membranet och interkostal muskler av BoNT slutändan resulterar iandningssvikt och död om inte tidig diagnos och behandling mottas.

Human livsmedelsburna botulism är oftast förknippas med BoNT serotyperna A, B, E, och F (BoNT / A, BoNT / B, etc) och oftast resulterar från intag av förorenad mat 15,16, även om flera fall av sårbotulism rapporterades bland sprutnarkomaner 17,18. I USA, är spädbarn botulism till följd av intag av Clostridium sporer av barn under ett års ålder den vanligaste formen av botulism 19-21. Dock var livsmedelsburna BoNT utbrott till följd av felaktig hemkonservering och livsmedelsförädling rapporterats i både USA och utomlands. Mellan 2000-2009 var minst 338 fall av livsmedelsburna botulism rapporterats över hela världen inklusive sex dödsfall 22. Förmågan att snabbt och känsligt upptäcka livsmedelsburna botulism utbrott är en viktig indikation på att kunna bistå tidig diagnos 23,24. Dessutom kommer detektionsmetoder som tillåter kostnadseffektiv och rutin mat testning leda till förbättrad livsmedelssäkerhet.

BoNT s neuronal specificitet och lång biologisk halveringstid gör det också en potent terapeutiskt. I USA, är BoNT-baserade läkemedel som godkänts av Food and Drug Administration för behandling av kosmetiska villkor och neuromuskulära relaterade sjukdomar inklusive glabellaveck, cervikal dystoni, migrän, överaktiv blåsa och skelning. Många program "off-label" är dokumenterade, inklusive höga doser behandlingar för svår muskeldysfunktion 25-28. Exakt toxin kvantifiering är avgörande för korrekt dosering, eftersom underdosering kan leda till ineffektiv behandling medan överdosering sätter patienter med risk för potentiellt skadliga biverkningar. Tyvärr är ingen standardiserad potens analysprotokoll delas mellan tillverkare, vilket resulterar i definitionsenhet ojämlikheter mellan BoNT-baserade läkemedlet produCTS 29-31.

Den standardtest för BoNT är bioassay med möss där BoNT-innehållande prover injiceras intraperitonealt på möss och antalet dödsfall registrerats under 1-7 dagar 16,32,33. Musen bioassay är mycket känslig med detektionsgräns (LOD) på 5-10 pg BoNT / A 34, men etiska oro över djuranvändning, de höga kostnaderna för att utbilda personal och upprätthålla djuranläggningar, långa analystider, och bristen på standardiserade protokoll ledde till samtal för att utveckla standardiserade, djurfria BoNT testning och kvantifieringsmetoder 35-39. Nyligen har flera alternativa BoNT kvantifieringsmetoderna utvecklats som erbjuder mus eller nästan bioassay på möss känslighet 40-49. Dessa metoder använder ofta fluorescens, masspektrometri, eller immunologiska metoder och erbjuda analystider avsevärt kortare än bioassay med möss utan djur. Mass-spektrometri strategier i kombination med immunologisk techniqderingar har visat att detektera och kvantifiera BoNT som finns i livsmedel och andra komplexa prover, men krav utbildning av personal och specialutrustning gräns dessa analyser 50-55. De flesta andra alternativa analyser inte är lätt tillämpliga på komplexa provtestning eller saknar kapacitet som krävs för rutin BoNT testning. Den mycket varierande karaktär av livsmedelsprov viskositet, pH, salthalt, och matrisbeståndsdelar utgör en särskilt svår utmaning när man försöker utveckla in vitro analysmetoder med känslighet för att matcha den extrema styrkan av BoNT. Dessutom, även enkla och förhållandevis godartade buffertsystem, såsom de som följer av resuspension av BoNT-baserade läkemedelsprodukter, innehåller salt, albumin, och socker stabilisatorer (dvs. hjälpämnen) som väsentligt påverkar in vitro BoNT potens 56. Toxin rening krävs för noggrann aktivitetstestning av alla utom de enklaste av proverna 56-59.

DenBoTest Matrix-analyser var utformade för snabb, hög genomströmning, och konsekvent kvantifiering av BoNT från mycket komplexa prover med utrustning som vanligen finns i forskningslaboratorier 56,60. Dessa analyser använder paramagnetiska pärlor kovalent kopplade till serotyp-specifika anti-Bont antikroppar att binda och binda BoNT ur ett prov och sedan ta bort störande matrisföreningar genom tvättning. Efter tvätt, är bunden BoNT proteolytiska aktiviteten sedan kvantifieras i en optimerad reaktionsbuffert med hjälp av en reporter kompatibelt med BoNT serotyp som testas. Dessa reportrar är fluorogena proteiner som består av en N-terminal cyan fluorescerande protein (GFP)-grupp och en C-terminal gula fluorescerande proteinderivat (Venus)-del förenade genom en BoNT substrat, SNAP25 rester 141-206 eller synaptobrevin rester 33-94 utgör den BoTest A / E eller B / D / F / G reportrar, respektive 45. Reporter klyvning med BoNT övervakas med Försters resonansenergiöverföring (FRET). När than reporter är intakt, excitation av den gemensamma fiskeripolitiken leder FRET till Venus, härdning CFP utsläpp och spännande Venus utsläpp. Klyvning av reporter av BoNT förhindrar FRET, vilket leder till en ökning av GFP emission och minskning i Venus emission. BoNT aktivitet kan sedan mätas kvantitativt med hjälp av förhållandet mellan den gemensamma fiskeripolitiken och Venus utsläpp. LOD under 3 pg är möjligt från en mängd olika livsmedel med en hög genomströmning 96-brunnar format 56. Ökad känslighet kan erhållas med användning av större provvolymer, eftersom analysen möjliggör koncentration av toxinet på pärlans yta.

De BoTest Matrix analyser för BoNTs A, B, E, och F har utvecklats och testats med livsmedel, läkemedel, och miljöprover 56,60. Här beskriver vi rutiner för att utföra dessa analyser för detektion av BoNT i låg komplexitet (t.ex. läkemedel, BoNT i buffert) och hög komplexitet (t.ex. livsmedel, miljö) prover. Särskilda bearbetningsmetoderflera provtyper behandlas i detta protokoll och provtyper som inte beskrivs här kan oftast anpassas med hjälp av en kombination av de presenterade metoderna. Protokollet har utvecklats och testats med BoNT / A, men kan anpassas till andra BoNT serotyper använder sina respektive analyser som visats på annat håll 56,60.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Framställning av analysreagens

  1. Thaw 200x ditiotreitol (DTT), 10x Matrisbindningsbuffert (10x bindningsbuffert i det följande), 10x neutraliseringsbuffert (livsmedel eller pH obalanse prover endast), och 10x BoTest reaktionsbuffert (10 x reaktionsbuffert nedan) vid rumstemperatur (RT) under 15 min eller tills den är helt upptinad. Se tabell 1 för en lista över buffertar och reagenser som används i detta protokoll. Se tabell 2 för en lista på material och utrustning som krävs för detta protokoll.
  2. Vortexa upptinade buffertar för 5 sek för att blanda. 10x neutralisering buffert, 200xDTT och 10x reaktionsbuffert skall vara klar medan 10x Bindning buffert kommer att ha ett grumligt utseende. Värm 10x reaktionsbuffert under 5 min vid 37 ° C och upprepa virvling om den är grumlig efter upptining.
  3. Generera 3.8 ml 1x Reaction buffert.
    1. Märk ett 15 ml koniskt rör "1x Reaction buffer" och tillsätt 3,42 ml molekylärbiologi grade water, 380 l 10x reaktionsbuffert och 19 pl 200x DTT. Blanda buffert väl genom inversion.
    2. Skär en EDTA-fri proteashämmare tablett i kvartal med en ren rakblad och lägga en fjärdedel av tabletten till 1x Reaction buffert (den återstående tablettdelen kan lagras vid 4 ° C för senare användning). NB Proteashämmare kanske inte vara nödvändigt om du använder renat toxin och enkla buffertar (t.ex. läkemedelsprover).
    3. Vortex det 1x Reaction buffert tills proteas tabletten är helt upplöst.
  4. Värm matrisen A-pärlor (IP-A-kulor följande) under 20 min vid RT.
  5. Tina BoTest A / E reporter (A / E reporter härefter) vid RT skyddad från ljus.
  6. Märk ett 15 ml koniskt rör "0,5 ^ M A / E reporter" och tillsätt 45 ìl av 20 mikroM A / E reporter lager till 1,8 ml 1x Reaction buffert. Blanda väl genom att pipettera och lagra på is skyddas från ljus.

2. Standard Curve Sample Generation

Standardkurvan som beskrivs här sträcker sig över 10-30,000 MLD 50 / g mat eller per ml buffert i halv-log-utspädningar (tabell 3). Slutanvändaren är gratis att använda alternativa koncentrationer som är tillämpligt.

  1. Tillsatta och inkubering av matriser med referensmaterialet. Generera standardkurvan med användning av ett utspädningsmedel av samma matris som det okända, om möjligt, för att reducera matriseffekter. Använd gelatinfosfatbuffert (GPB) eller fosfat saltlösning (PBS) som spädningsmedel, om ytterligare, BoNT-negativa matris inte är tillgänglig (t.ex. på friland eller BoNT utbrott provtestning). Generera standardkurvan genom tillsatta BoNT / A i matrisen val efter lämpligt protokoll nedan.
    1. Låg komplexitet prover (t.ex. PBS, GPB, eller läkemedel)
      1. Tillsätt 10 ml av den lämpliga bufferten till ett 15 ml koniskt rör och sattes åt sidan. Detta prov kommer att användas som spädningsmedel för den standard kurva och okända späd (avsnitt 4).
      2. Tillsätt 1,2 ml buffert till ett mikrocentrifugrör.
      3. VARNING: Detta steg används BoNT och extrem försiktighet måste iakttas vid hantering och kassering av reagenser och material som kommer i kontakt med giftet. Användning av personlig skyddsutrustning och korrekt omhändertagande av alla material måste utföras enligt US Department of Labor OSHA riktlinjer för BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html). Lägg BoNT / A till 1,2 ml prov så att den slutliga koncentrationen är 30.000 MLD 50 / ml (36.000 MLD 50 totalt).
    2. Flytande livsmedelsprover (eller andra komplexa vätskeprov) Anm: Ett första test rekommenderas för att bestämma volymen av supernatant som tagits från klar prover som partiklar (. T.ex. massa) av likvida matriser kommer att variera. Detta protokoll förutsätter minst 1,2 ml klar supernatant kan realiseras genom en 1,4 ml sample. Öka provstorleken om det behövs.
      1. Lägg till 10 ml flytande mat till ett 15 ml koniskt rör och ställ den åt sidan. Detta prov kommer att användas som spädningsmedel för standardkurvan och okända späd (avsnitt 4).
      2. Väg en tom 1,5 ml mikrocentrifugrör och anteckna dess massa.
      3. Lägg till 1,4 ml av det flytande livsmedlet till den vägda mikrocentrifugrör.
      4. Väg åter mikrocentrifugrör och beräkna provets vikt läggs maten genom att subtrahera massan av det tomma röret.
      5. VARNING: Detta steg används BoNT och extrem försiktighet måste iakttas vid hantering och kassering av reagenser och material som kommer i kontakt med giftet. Användning av personlig skyddsutrustning och korrekt omhändertagande av alla material måste utföras enligt US Department of Labor OSHA riktlinjer för BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html). Lägg BoNT / A till 1,4 ml prov i en slutlig koncentration av 30000 MLD 50 / g mat.
      6. Inkubatorte utspädningsmedlet och spikade prover vid RT eller 4 ° C under 2 h till att ge den BoNT tid att samverka med livsmedelsmatrisen, imitera en naturlig förorening.
    3. Fasta livsmedelsprover (eller andra fasta prover) Anm: Ett första test rekommenderas för att bestämma volymen av supernatant som tagits från homogeniserade och klar prov efter tillsats av 1 ml GPB / g livsmedel. Detta protokoll förutsätter att åtminstone 1,2 ml klar supernatant kan realiseras genom en 2 g prov. Öka provstorleken om det behövs.
      1. Väg upp 10 g fast prov i ett 50 ml koniskt rör och sattes åt sidan. Detta kommer att användas som utspädningsmedel.
      2. Väg in 2 g fast livsmedelsprov in i en andra 50 ml koniska rör.
      3. VARNING: Detta steg används BoNT och extrem försiktighet måste iakttas vid hantering och kassering av reagenser och material som kommer i kontakt med giftet. Användning av personlig skyddsutrustning och korrekt hantering av allt materials måste utföras enligt US Department of Labor OSHA riktlinjer för BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html). Lägg BoNT / A till ytan av den 2 g prov till en slutlig koncentration av 30000 MLD 50 / g mat (60000 totala MLD 50).
      4. Inkubera utspädningsmedlet och spetsade prover vid RT eller 4 ° C under 2 h till att ge den BoNT tid att samverka med livsmedelsmatrisen, imitera en naturlig förorening.
  2. Prov homogenisering och buffertjustering. Bearbeta spetsade standardkurvan prov och spädningsmedel som genereras ovan enligt provtyp.
    1. Låg komplexitet prover
      1. Inga ytterligare prov behandling är nödvändig.
    2. Flytande livsmedelsprover (eller andra komplexa vätskeprov)
      1. Inget prov homogenisering är nödvändig.
      2. Lägg till 140 l 10x neutraliseringsbuffert till 1,4 ml spetsade prov och 1 ml 10x Neutralization buffert till spädningsprovet 10 ml. Blanda proverna väl genom inversion.
      3. Delvis klargöra båda proverna genom centrifugering i 10 min vid 6000 xg och 4 ° C. Omedelbart tas supernatanterna och överföra till nya rör.
    3. Fasta livsmedelsprover (eller andra fasta prover)
      1. Tillsätt 2 ml GPB (1 ml GPB / g livsmedel) till 2 g BoNT / A-spetsade fast prov mat och 10 ml GPB till 10 g spädningsprov.
      2. Homogeni proverna med hjälp av en mortelstöt tills ordentligt blandat. Beroende på typen av prov, kan det finnas små bitar av material som inte kan homogeniseras, vilket är acceptabelt. Alternativt kan mekanisk homogenisering metoder användas. Rekommenderas inte användning av en mixer eftersom det kan inaktivera och aerosol toxinet.
      3. Lägg till 1:10 volym på 10x neutraliseringsbuffert till spädningsprovet baseras på den ungefärliga totala volymen (t.ex. 2 ml om volymen är 20 ml). Extrapoleraden totala volymen av BoNT / A-spetsade provet och lägg 1/10-dels volym av 10x Neutralisation buffert. Blanda proverna väl genom inversion.
      4. Delvis klargöra båda proverna genom centrifugering i 10 min vid 6000 xg och 4 ° C. Omedelbart tas supernatanterna och överföra till nya rör.
  3. Förbered standardkurvan seriespädningar för att testa
    1. Användning av BoNT / A-spetsade standardkurva prov såsom D1 och den nonspiked provet såsom utspädningsmedel, generera de återstående standardkurva prover i 1,5 ml mikrocentrifugrör i enlighet med tabell 3.

3. Förbered okända prov

Detta avsnitt kan fyllas parallellt med avsnitt 2.

  1. Bestäm antalet och utspädningar av okända. Testa okända i tre exemplar om möjligt.
    1. För kvalitativa analyser, kör de okända utan någon ytterligare utspädning än vad som krävs för att bearbeta provet som descrisäng nedan.
    2. För kvantitativa analyser Bered minst två 1:10 utspädning prover, såsom beskrivs nedan, för att säkerställa att ett eller flera prover falla inom det linjära intervallet för testsvaret. Generera späd använda ett spädmedel med samma matris som det okända, om möjligt, för att minska matriseffekter som beskrivs i avsnitt 3. Annars använder PBS eller GPB som spädningsmedel.
  2. Generera och späda okända prover beroende på provtyp.
    1. Låg komplexitet okända (t.ex. PBS, GPB, eller farmaceutiskt)
      1. Lägg till minst 750 l okända till en mikrocentrifugrör att generera Okänd utspädning 1.
      2. Lägg till 675 l spädningsmedel till två mikrocentrifugrör märkta Okänd utspädning 2 och 3. Utspädningsmedlet kommer att vara samma material som används för standardkurva generation.
      3. Serie späd utspädning 1 genom att överföra 75 l av utspädning 1 in i utspädnings 2 röret och blanda.
      4. Seriellt dilute utspädning 2 genom att överföra 75 l av utspädning 2 in i utspädnings 3 röret och blanda.
    2. Flytande livsmedel okända (eller andra komplexa vätskeprov) Anm: Ett första test rekommenderas för att bestämma volymen av supernatant som tagits från klar prover som diskuteras i avsnitt 3. Öka provstorleken om det behövs.
      1. Lägg ≥ 875 | il av det flytande okända till ett mikrocentrifugrör.
      2. Lägg till 1:10 volym på 10x neutraliseringsbuffert till provet (t.ex. 87.5 ul för en 875 l prov).
      3. Delvis klargöra provet genom centrifugering under 10 min vid 6000 x g och 4 ° C. Omedelbart överföra supernatanten till ett nytt rör. Detta är Okänd utspädning 1.
      4. Lägg till 675 l spädningsmedel till två rör märkta Okänd utspädning 2 och 3. Utspädningsmedlet kommer att vara samma bearbetat material som används för standardkurva generation.
      5. Serie späd utspädning 1 genom överlåtelsering 75 pl utspädning 1 in i utspädnings 2 röret och blandning.
      6. Serie utspädd utspädning 2 genom att överföra 75 l av utspädning 2 in i utspädnings 3 röret och blanda.
    3. Fasta livsmedel okända (eller andra fasta prover) Anm: Ett första test rekommenderas för att bestämma volymen av supernatant som tagits från klar prover som diskuteras i avsnitt 3. Öka provstorleken om det behövs.
      1. Väg in 2 g fast okänt prov i ett 50 ml koniskt rör.
      2. Tillsätt 2 ml GPB (1 ml GPB / g livsmedel) till 2 g fast prov.
      3. Homogeni proverna som beskrivs i avsnitt 3.2.3.2.
      4. Lägg till 1:10 volym på 10x neutraliseringsbuffert till provet utifrån den ungefärliga totala volymen (t.ex. 0,4 ml om volymen är 4 ml). Blanda proverna väl genom inversion.
      5. Delvis klargöra provet genom centrifugering under 10 min vid 6000 x g och 4 ° C. Immediately överföring ≥ 750 pl supernatant till ett mikrocentrifugrör. Detta är Okänd utspädning 1.
      6. Lägg till 675 ml spädningsvätska till två rör märkta Okänd utspädning 2 och 3. Utspädningsmedlet kommer att vara samma bearbetat material som används för standardkurva generation.
      7. Serie späd utspädning 1 genom att överföra 75 l av utspädning 1 in i utspädnings 2 röret och blanda.
      8. Serie utspädd utspädning 2 genom att överföra 75 l av utspädning 2 in i utspädnings 3 röret och blanda.

4. Final Prov Förtydligande

Om testning flytande eller fasta livsmedelsprover, centrifugera alla prover för 5 min vid ≥ 14.000 xg i mikro att helt klarlägga proverna. Omedelbart tas supernatanterna och överföra till nya rör.

5. Plate Setup och BoNT / A Pull Down

  1. Den specifika plattan layouten är applikationsberoende, men inte använda utanför brunnarna såför att undvika kanteffekter. Varje okända provet och standardkurva prov D1-D8 kräver 3 brunnar medan prov D9 kräver 6 brunnar. En föreslagen plattslayouten visas i fig. 1.
  2. Tillsätt 20 ^ il 10 x bindningsbuffert till varje brunn för att användas.
  3. Lägg till 200 l av varje klar utspädning och okänd för var och en av tre brunnar (sex brunnar för D9) för tre exemplar att testa. Blanda plattan under 10 sek på en mikroblandare.
  4. Lägg till IP-A-pärlor.
    1. Vortex IP-A-pärlor för 10 sekunder på högsta hastighet. Fortsätt vortex om pärlor inte är helt suspenderas och homogen.
    2. Pipettera 20 mikroliter IP-A-pärlor till varje prov väl.
    3. Blanda plattan under 30 sek på en mikroblandare.
  5. Inkubera plattan med användning av en roterande platta inkubator under 2 h vid 750 rpm, 25 ° C eller rumstemperatur. Assay prestanda är i hög grad beroende på att generera och underhålla IP-A pärlsuspension under alla inkubationssteg. Alltid återsuspendera pärlorna med en MicroPsen blandare efter pelletering och bibehålla suspensionen med hjälp av en orbital mikrotiterplatta shaker under alla inkubationssteg.

6. Plate Tvätt och Bead Resuspension

  1. Tvätta plattorna antingen för hand eller med hjälp av en magnetisk pärla kompatibel automatiserad plattvättare. En automatiserad plattvättare konfigurerad för magnetiska kulor ökar kraftigt analyskapacitet.
    1. Manuell tvätt
      1. Märk ett 50 ml koniskt rör "1x tvättbuffert" och tillsätt 45 ml molekylärbiologi grade vatten och 5 ml 10x Matrix tvättbuffert. Blanda buffert väl genom inversion.
      2. Avlägsna plattan från den roterande plattan inkubator.
      3. Placera omedelbart plattan på en 96-håls magnetisk pärla separationsplatta i 5 min.
      4. Medan du håller plattan på 96 brunnar magnetisk pärla separationsplatta, försiktigt bort och kassera supernatanterna från provbrunnarna med hjälp av en en-eller flerkanals pipett. Inte aspirerapärlor-visuellt övervaka det insugna buffert i pipettspetsen för oavsiktlig borttagning pärla. Om borttagning är bevittnat, försiktigt lägga spets innehållet tillbaka till brunnen, reseparate, och upprepa borttagning.
      5. Lägg till 300 l 1x tvättbuffert i varje provbrunn.
      6. Fullt resuspendera kulorna genom blandning plattan under 30 sek på en mikroblandare.
      7. Inkubera plattan i 96-brunnars magnetisk pärla separationsplatta för 2 min.
      8. Ta bort och kassera supernatanterna från provbrunnarna som tidigare.
      9. Upprepa steg 6.1.1.5-6.1.1.8 tre gånger för totalt fyra tvättar.
      10. Med plattan på 96 brunnar magnetisk pärla separationsplatta, visuellt inspektera brunnarna för att bekräfta ens överstående borttagning, använd en pipett för att avlägsna överskott kvarvarande buffert som behövs. Vissa buffert kvar i brunnarna och man måste vara försiktig för att undvika pärla borttagning eller pärla torkning.
      11. Tillsätt 50 l 1x Reaction buffert till varje prov väl och blanda plattan för 30 SEc. på en mikroblandare för att helt resuspendera kulorna. Vid behov, använd en pipett för att helt resuspendera kulorna.
    2. Automatiserad Plate Tvättning
      1. Inställning och program brickan enligt tabell 4. Rengör och spola brickan med hög kvalitet (t.ex. nanorent) vatten.
      2. Prime brickan genom att köra programmet "prime".
      3. Avlägsna plattan från den roterande plattan inkubator.
      4. Placera omedelbart plattan på 96 brunnar magnetisk pärla separationsplatta på tallriken brickan.
      5. Kör på länken programmet "Mästare Wash". Den första programsteg är en 5 min inkuberingssteg där brickan blir stillastående.
      6. Efter programmet avslutats, ta bort plattan från brickan, tillsätt 50 l 1x Reaction buffert till varje prov väl, och blanda plattan i 30 sekunder på en mikroblandare att helt resuspendera kulorna. Vid behov, använd en pipett för att helt resuspendera kulorna.

    7. Analys Initiation och inkubation

    1. Lägg till 50 ^ 0,5 ^ M A / E reporter (se avsnitt 1) ​​till varje prov väl och blanda i 30 sekunder på en mikroblandare att helt resuspendera kulorna.
    2. Tillsätt 100 l vatten till varje oanvänd väl på plattan för att undvika kanteffekter.
    3. Förslut plattan med plattförseglingstejp och inkubera plattan med användning av en roterande platta inkubator vid 750 rpm, 25 ° C eller rumstemperatur. Skydda plåten från ljus under inkubation.

    8. Datainsamling och analys

    OBS: Denna analys är en realtids-analys som kan mätas flera gånger tills önskad känslighet erhålls finns det inga stoppreagens som krävs. Rekommenderade initiala lästa tider är 2, 4, och 24 timmars inkubationstid med analyskänsligheten ökar med inkubationstid.

    1. Datainsamling
      1. Vid varje läsa tid, ta bort plattan från den roterande plattan inkubator, avlägsna förseglingenningstejp, och omedelbart placera plattan på 96 brunnar magnetisk pärla separationsplattan. Tillåt pärlorna separera under 2 min.
      2. Placera plattan i mikroplattläsaren och mäta utsläppen vid ~ 470 och ~ 526 nm under excitation vid ~ 434 nm.
      3. Om ytterligare avläsningstider önskas, resuspendera kulorna i 30 sek på mikroplattan biandaren återförslut plattan, och återföra plattan till den roterande plattan inkubator.
    2. Dataanalys
      1. Beräkna förhållandet utsläppet för varje prov genom att dividera den relativa fluorescensen enhet (RFU) värde vid 526 nm av RFU-värdet vid 470 nm.
      2. Rita förhållandet emissions mot log [BoNT / A] för standardkurvan datapunkter. Beroende på BoNT / A-potens testade området kommer en sigmoidal dos-responskurva erhållas (se Representativa resultat).
      3. Montera standardkurvan data med variabel lutning dos-responskurva Y = Botten + (Top-Bottom) / (1 ​​+ 10 ^ ((logEC 50-X) * Hillslope)) där X ärlogaritmen av koncentrationen, Y är svaret, och Y börjar på botten och går till början med en sigmoidal form.
      4. Bestäm om detektionsgränser (LOD), rapporteringsgräns (LOQ), och halv-maximal effektiv koncentration (EC50). Detektionsgränser definieras som ett prov som har en emissionsförhållande mindre än tre standardavvikelser (SD) under blankprov (n = 6). Gräns ​​definieras som ett prov som har ett förhållande utsläpp mindre än 10 SD under blankprov (n = 6). EC 50 bestäms från sigmoidal dos-responskurva passform.
      5. Interpolera styrkan av okända prover mot sigmoidal dos-respons standardkurva.
        1. För kvantitativa resultat bör det okända provet idealt faller inom den linjära delen av standardkurvan. Ungefärlig den linjära delen av standardkurvan genom att beräkna den totala analyssvar fönstret 20-80% (t.ex. om förhållandet mellan utsläpp av standardkurvan rAnges 0,5-2,5 skulle det linjära området vara den del av den standardkurva som sträcker sig från 0,9 till 2,1).
        2. För kvalitativa resultat, jämföra det okända provet mot LOD och LOQ för standardkurvan.
        3. Inte extrapolera okända prover utöver gränserna för standardkurvan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ett diagram som sammanfattar de steg i den beskrivna protokollet visas i fig. 2. Analysen kräver mellan 4-26 timmar att slutföra, beroende på provtyp och önskad analyskänslighet, men bara ~ 2 timmar av praktisk tid. Analysen utförs i 96-brunnsplattor och, beroende på den typ av tester som skall utföras, möjliggör triplikat testning av upp till 20 prover inklusive standarder per platta.

Figur 3 visar representativa analysresultat med användning av BoNT / A holotoxin spiked in i PBS och testades med det beskrivna protokollet efter 2, 4, och 24 h inkubation med A / E reporter. Renat BoNT / A holotoxin valdes för detta experiment, eftersom dess definierade molekylvikt av ~ 150 kDa, jämfört med den bredare definition 700-900 kDa för toxinkomplexet och renhet tillåta mycket exakt spiking vid exakta koncentrationer. Emissionsgrad, förhållandet mellan emission vid 526 nm för att vid 470 nm efter excitation vid 434nm, vid varje tidpunkt plottas mot BoNT / A-koncentration (MLD 50 värde är baserat på BoNT / A-tillverkarens potency test). Klyvning av reportern av BoNT mäts som en minskning av emissionsgraden, som i vår plattläsare varierar mellan ca 2,7 för det intakta reporter till omkring 0,7 för den fullständigt spjälkade reportern. Det är viktigt att notera att, eftersom var och en plattläsare åtgärder fluorescens i RFUs kommer det faktiska värdet för förhållandet för utsläpp vara beroende av den plattläsare användes. Långvarig inkubationstid med reportern resulterar i ökad reporter klyvning som ses av den vänstervridning i kurvan. De datapunkter, som testades i tre exemplar, visa låg SD av medelvärdet och följa den förväntade trenden av ökat förhållande för utsläpp med minskad toxin belastning. Fel på analysen för att följa detta förväntade trenden kan indikera ett fel under späd generation eller data plottning. Utsläppsförhållanden av kontrollerna innehåller ingen BoNT / A förblir också stadig During inkubationen (figur 3, inlägg), vilket indikerar avsaknaden av icke-specifik proteasaktivitet.

Ett exempel på användning av detta protokoll för att kvantifiera läkemedels BoNT / A-prov visas i Figur 4. En standardkurva genererades i PBS med renat BoNT / A holotoxin och behandlas parallellt med utspädningar av läkemedelsprodukt som genereras från en enda 100 U injektionsflaska med frystorkad BOTOX rehydratiserades i 0,9% saltlösning. (Idealt skulle standardkurvan vara sammansatt av referens massor av BOTOX men sådant material inte var lätt tillgänglig.) Prover testades med användning av den beskrivna protokollet, med undantaget att 50 ul prover testades i duplikat utan användning av 10x bindningsbuffert. Standardkurvan plottades som en funktion av BoNT / A-koncentration efter 24 h inkubation med A / E reporter. Förhållandet utsläpp av varje okänt prov visualiserades sedan genom att plotta den korsar över standardkurvan. I denna analys, linjenar delen av standardkurvan (testsvaret fönstret 20-80%) ligger mellan en emissionsförhållande av 2,11-1,05 och indikeras med den streckade rutan i figuren. Koncentrationerna av de tre obekanta som faller inom denna linjära området var sedan interpoleras från standardkurvan (fig 4, inlägg). Detta exempel visar den allmänna metod som skulle användas för att identifiera eller kvantifiera något okänt prov mot en standardkurva.

Färska tomater och 2% mjölk valdes för att demonstrera protokollet prestanda och känslighet med både en fast (tomat) och flytande livsmedel (2% mjölk) matris. BoNT / A-komplex som består av kärnan holotoxin och neurotoxinassocierade proteiner (NFP) valdes för dessa experiment eftersom detta preparat liknar de toxiner som produceras under en naturlig förorening Clostridium. Såsom visas i fig. 5A, återvinning av BoNT / A, mätt som spjälkning av A / E reporter, observeras med both matriser. Ökad inkubationstid med reportern ökar analysens känslighet, men resulterar inte i minskade utsläppskvoter för inga toxin kontroller (Figur 5A, inläggningar), som anger de observerade klyvningsresultat från BoNT / A och inte icke-specifik proteas överföring från maten i assay. Som med figur 3, de data visar låg variabilitet och följer den förväntade trenden av minskade reporter klyvning med minskad toxinkoncentrationen.

Den BoNT / A LOD, LOQ, och EC 50 för både livsmedel vid varje tidpunkt som visas är sammanfattade i tabell 5. LOD och LOQ definieras som provets lägsta koncentrationen med en emissionsförhållande lägre än tre och tio SDs nedan bakgrunden (proven utan BoNT / A), respektive. Dessa gränser är begränsade till de testade datapunkter, även om interpolation till sigmoidal dos-respons-kurva kan användas för att beräkna lägre teoretiska gränser. Vissa matris-till-matris variabilitet i LOD och LOQ förväntas, eftersom matriseffekter kan påverka bindningen av toxinet till pärlorna och återvinning av pärlor under tvätt. Även om det skulle visa sig att det fanns mer toxin återhämtning från 2% mjölk än tomater från data i figur 5A, mycket av denna skillnad är resultatet av ytterligare utspädning som krävs för att homogenisera tomatprover i GPB.

Förutom att vara ett livsmedel i fast matris, tomater är en anmärkningsvärd provtyp där pH och jonstyrka justering uppnås genom tillsats av 10x Neutralisering buffert, är kritisk för analys framgång. Figur 5B illustrerar analyssvar vid provning av tomater med eller utan införande av 10x Neutralisering bufferten. Underlåtenhet att lägga till neutraliseringsbuffert resultat 10x i dålig återhämtning av BoNT / A från prover och visas av ett konstant förhållande utsläpp i alla testade BoNT / A-koncentrationer. Tillsats av 10x neutraliseringsbuffert dock resultat i känslig detektering av toxinet.

Ospecifika proteaser som finns i komplexa matriser kan leda till falska positiva om den inte beaktas eftersom andra än BoNT proteaser kan klyva A / E reporter. Ospecifika proteaser kan vara endogena till provet mat eller introduceras vid användning av icke-renade BoNT beredningar såsom Clostridium odlingssupernatanter. Grundlig pärla tvätt tar bort de flesta icke-specifika proteaser, men är kritisk tillägg av proteashämmare till reaktionsbufferten Figur 6 visar ospecifik proteasaktivitet finns i Clostridium BoNT / A kultursupernatanter med hjälp av en modifierad A / E reporter, BoTest KO (KO reporter. ). Den KO reporter är den samma som den A / E reporter med undantaget att BoNT / A-spaltningsstället har muterats så att den inte längre spjälkas av BoNT / A. Därför resulterar varje observerad reporter klyvning från icke-specifik proteas aktivitet. De höga nivåerna av KO reporter cleAvage indikerar odlingssupernatanten innehåller en hög nivå av proteasaktivitet, men att aktiviteten effektivt hämmas genom tillsats av proteasinhibitorer.

Exempeldata visar användbarheten av protokollet för hög genomströmning BoNT / A upptäckt i enkla buffertar och livsmedelsmatriser. Vissa livsmedel kan kräva små analys justeringar, men den beskrivna protokollet ska ge goda resultat med de flesta typer av livsmedel.

Figur 1
Figur 1. Föresplattslayouten. Prover är begränsade till de inre 60 brunnarna i plattan för att undvika eventuella kanteffekter. Okända eller standardkurva prover kan tillföras om så önskas. Alla oanvända brunnar bör fyllas med 100 l vatten under reporter inkubation. Click här för att visa en större bild.

Figur 2
Figur 2. Schematisk översikt av det beskrivna protokollet. Varje större steg i protokollet indikeras av en märkt box och inriktade bredvid uppskattad analystidslinjen (ej i skala). Nonfood prover inte kräver urval bearbetning och så in i protokollet nedströms livsmedelsprover. Den streckade rutan kring seriespäd generation för de okända visar att detta är en frivillig, men rekommenderas, steg. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 3
Figur 3. Detektion av BoNT / A-holotoxin i PBS med användning av det beskrivna protokollet.Renat BoNT / A holotoxin spetsades i PBS och testade med den beskrivna protokollet med en övre BoNT / En koncentration av 1 nM. Alla prover testades i tre exemplar och felstaplarna representerar standardavvikelsen av medelvärdet. Rapporterad potens är baserad på tillverkarens bioassay på möss testning av toxinet. Förhållandet utsläppet (förhållandet av emissionen vid 526 nm till 470 nm vid excitering vid 434 nm) för standardkurvan mättes efter 2, 4, och 24 h inkubation med A / E reporter och plottades som en funktion av BoNT / A-koncentration . Klicka här för att visa en större bild.

Figur 4
Figur 4. Kvantifiering av BOTOX läkemedelsprodukt med den beskrivna protokollet. En enda 100 E injektionsflaska med frystorkat BOTOX läkemedlet var resuspe nded i 220 ^ il 0,9% koksaltlösning, serieutspäddes och testades såsom okända mot en standardkurva som framställts i PBS med användning av renat BoNT / A holotoxin. Prov testades i enlighet med den beskrivna protokollet med undantag av att 50 | il prover testades utan 10x bindningsbuffert i duplikat. Standardkurvan beräknades genom att passa förhållandet utsläpp av standardkurvan proven till variabel lutning sigmoidal dos-responsekvation och plottas som en funktion av BoNT / A-koncentration. Varje okänt prov visas där det skär med standardkurvan efter en 24 timmars inkubering med A / E reporter. Koncentrationerna av de okända proven faller inom det linjära området (streckad skuggade rutan) interpolerades från standardkurvan. Etiketten för varje BOTOX okända är antalet enheter i provet utifrån märkta styrkan. Felstaplar representerar standardavvikelsen för medelvärdet.t = "_blank"> Klicka här för att visa en större bild.

Figur 5
Figur 5. Återvinning av BoNT / A-spetsade 2% mjölk och färska tomater tester med beskrivna protokollet. Prov på 2% mjölk och färska tomater spetsades med renat BoNT / Komplex och testade med den beskrivna protokollet. Alla prover testades i tre exemplar och felstaplarna representerar standardavvikelsen för medelvärdet. (A) Förhållandet utsläppet i 2% mjölk och färska tomater standardkurvor mättes efter 2, 4, och 24 h inkubation med A / E reporter och ritas som en funktion av BoNT / A potens. (B) Underlåtenhet att inkludera 10x neutraliseringsbuffert under tomattestresultat i analys misslyckande. Prover av färsk tomat testades enligt den beskrivna protokollet antingen med eller utan tillsats av 10x Neutralsering buffert. Data som visas är för 4 tim tidspunkt. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 6
Figur 6. Proteashämmare krävs vid testning av komplexa matriser. Clostridium BoNT / A (stammen Hall A) odlingssupernatant serieutspäddes i PBS och testades med användning av den beskrivna protokoll antingen med eller utan proteasinhibitorer sättes till reaktionsbuffert och med både A / E och KO reportrar. Förhållandet utsläppet mättes efter 24 timmars inkubering med både A / E eller KO reportrar och plottades som en funktion av BoNT / A-potens. Betydande klyvning av KO reportern sågs utan tillsats av proteashämmare men förnekas av deras integration. Alla prover testades i tre exemplar och felet bars representerar standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att visa en större bild.

Buffert Komposition Förvaringstemperatur Stabilitet Anmärkningar
10x Matrix Binding Buffer 500 mM HEPES-NaOH, pH 7,1, 250 mM NaCl, 1% Tween-20, 5% kasein, 0,05% NaN3 -20 Eller -80 ° C Stabil i minst fem dagar vid 4 ° C vid tining Levereras med BoTest matris A Botulinum Detection Kit
10x Matrix tvättbuffert 119 mM fosfat, pH 7,4, 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 1% Tween-20 -20 Eller -80 ° C Stabil i minst fem dagar vid 4 ° C vid tining Levereras med BoTest matris A Botulinum Detection Kit
10x neutraliseringsbuffert 1 M HEPES-NaOH, pH 8,0, 1 M NaCl 4 ° C Stabil i upp till sex månader vid 4 ° C
10x BoTest Reaktionsbuffert 500 mM HEPES-NaOH, pH 7,1, 50 mM NaCl, 1% Tween-20, 100 uM ZnCl2 -20 Eller -80 ° C Stabil i minst fem dagar vid 4 ° C vid tining Levereras med BoTest matris A Botulinum Detection Kit
BoTest A / E Reporter 20 | iM i 50 mM HEPES-NaOH, 10 mM NaCl, 15% glycerol -80 ° C Förvara i små portioner. Stabil i minst fem dagar vid 4 ° C vid tining. Levereras med BoTest matris A Botulinum Detection Kit
Gelatin fosfatbuffert (GPB) 33,3 mM NaH 2 PO 4, pH 6,2, 2 g / L gelatin 4 ° C Stabil i upp till 1 månad vid 4 ° C
200x ditiotreitol (DTT) 1 M DTT -20 ° C Stabil i upp till sex månader vid -20 ° C Ringa och lagra små (100 pl) alikvoter
1x PBS-t 11,9 mM fosfat, pH 7,4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,1% Tween-20 4 ° C Stabil i upp till 1 månad vid 4 ° C Kan göras med användning 10x PBS från Fisher (BP399-1)
Matrix A Pärlor (IP-A Pärlor) Magnetiska pärlor kovalent konjugerat till kyckling anti-BoNT / A antikropp i PBS. 0,1% Tween-20, 0,05% natriumazid, 0,25% kasein och 50% glycerol -20 ° C Stabil i minst fem dagar vid 4 ° C vid avlägsnande från -20 ° C. INTE frys vid -80 ° C

Tabell 1. Buffertar behövs för den beskrivna protokollet. 10x neutraliseringBuffert är bara för mycket komplexa (t.ex. livsmedel) prov och kan inte krävas beroende på den typ av prover som analyseras.

Namn på Material / utrustning Company Katalognummer Kommentar / Beskrivning
BoTest matris A Botulinum-neurotoxin Detection Kit BioSentinel A1015 Detection kit för BoNT / B och F är också tillgängliga.
Varioskan Flash fluorescensmikroplattläsare Thermo-Fisher Scientific 5250040 De flesta monokromator-eller filterbaserade enheter med 434 nm excitation och 470 nm och 526 nm förmåga emission kan användas.
96-brunnars Magnetic Bead Separation Plate V & P Scientific VP771H Andra magnetiska plattor kan användas, men plattan bör vara utformade för att separera de bEADS på sidan av brunnen.
Magnetic Bead-kompatibel Plate Bricka BioTek ELx405 VSRM Tillval, endast för automatiserad platt tvätt. Andra magnetiska pärla-kompatibel platta brickor kan också användas, men bör testas före användning.
Mikrocentrifug Various N / A Tillval, endast för prover som behöver centrifugering.
MixMate plattan blandare Eppendorf 22674200
Orbital Shaker Various N / A Används vid rumstemperatur eller vid 25 ° C. Om temperaturkontroll är tillgänglig
EDTA-fri proteashämmare tabletter Roche 4693132001 Krävs endast för livsmedel eller miljöprovning. Proteashämmare måste vara EDTA-fri.
BoNT / A Metabiologics N / A Tillval, endast för standardisering och kvantifiering ändamål
Svart, platt botten 96-brunnar NUNC 237105 Plattorna ska inte behandlas
96-brunnar Sealing Tape Thermo Scientific 15036

Tabell 2. Material och utrustning som krävs för den beskrivna protokollet. Vissa material och utrustning är frivilliga eller kan ersättas beroende på vilken utrustning som finns tillgänglig. Ytterligare lämplighetstester och optimering kan behövas om du använder alternativ utrustning.

</ Tr>
Prov namn Volym Toxin Volym diluent [BoNT / A] (MLD 50 / ml) eller (MLD 50 / g föda) log [BoNT / A] (MLD 50 / ml) eller (MLD 50 / g föda) D1 1200 | il lager N / A 30000 4,48
D2 300 pl D1 600 | il 10000 4
D3 90 | il D1 810 | il 3000 3,48
D4 90 | il D2 810 | il 1000 3
D5 90 | il D3 810 | il 300 2,48
D6 90 | il D4 810 | il 100 2
D7 90 | il D5 810 | il 30 1,48
D8 90 | il D6 810 | il 10 1
D9 N / A 1400 | il N / A N / A

Tabell 3:. Spädningstabell för standardkurva prover Denna tabell genererar en standardkurva i halv-log-utspädningar över 3,5 tiopotenser. Nog Nej BoNT blankprov (D9) genereras för att köra en n = 6. Ytterligare spädningar kan läggas till om så önskas.

<td> 0
Programnamn Variabel Värde Kommentarer
Prime Reagensflaska ETT
Prime Volym 400
Prime Flöde 7
Blöt Efter Prime? N
Matrix Wash Reagensflaska ETT Antalet tvättar kan ökas om rest proteasaktiviteten observeras.
Metod
4
Sug / Shake Y
Blöt Varaktighet 180
Skaka innan Blöt? N
Prime Efter Blöt? N
Disp
Dispensera Volym 300
Fördela Flöde 5
Dispensera Höjd 130
Hor. Fördela Pos. 0
Inaktivera Aspirera? Y
Botten Tvätta först? N
Prime Före start? N
Aspir
Överladdning Höjd 40
Hor. Aspirera Pos. 0
Aspiration Rate 5
Överladdning Delay
Korsvis Aspirera? N
Final aspiration? Y
Final aspiration Delay 0
Matrix Soak Blöt Varaktighet 300 Ökad blöt varaktighet kan öka pärla återhämtning från mer viskösa livsmedel.
Skaka innan Blöt? N
Ledar Wash Matrix Soak Detta är en "länk" program för att köra Matrix Blöt och Matrix Diskprogram tillsammans.
Matrix Wash

Tabell 4. Magnetic Bead-kompatibel automatiserad plattvättare programinställningar. Följande program anta att plattvättare är utrustad med en magnet, som drar pärlor till sidan av brunnarna och att buffertkopplingsmodulen är konfigurerad så att 1x tvättbuffert ( PBS-t) är ansluten till ventil A. Dessa program är specifika för BioTek ELx405. Se instrumentets bruksanvisning för programinstruktioner. Andra magnetisk pärla-kompatibel automatisk plåtbrickor eller vakuumgrenrör kan användas, men kommer tester krävas för att definiera inställningar som maximerar tvätteffekt och minimera pärla förlust under tvätt. Initial testning av vulsten återhämtning efter tvättning rekommenderas oavsett den specifika plattvättare användas.

<td> LOD
Mat Matrix Metriska 2 hr 4 tim 24 hr
MLD 50 / g livsmedel MLD 50 / brunn MLD 50 / g livsmedel MLD 50 / brunn MLD 50 / g livsmedel MLD 50 / brunn
Mjölk 300 58 100 19 30 6
LOQ 1000 193 300 58 100 19
EC 50 2404 464 590 114 92 18
Färska tomater LOD 1000 91 300 27 30 3
LOQ 1000 91 1000 91 100 9
EC 50 7561 687 1932 176 229 21

Tabell 5. Detektionsgräns (LOD), rapporteringsgräns (LOQ), och halv-meteraximal effektiva koncentrationen (EC50) för 2% mjölk och färsk tomat testning visas i figur 2A. EC 50 är härledd från den sigmoidala dos-respons-kurvanpassning medan LOD och LOQ definieras som den lägsta koncentration datapunkt som faller antingen 3 eller 10 standardavvikelser under inga BoNT kontroller (n = 6), respektive. Uppgifterna presenteras i både MLD 50 / g mat och totala MLD 50 s testats per brunn i 200 ^ provvolym.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Detta protokoll beskriver förfaranden för att kvantifiera BoNT / Komplex, holotoxin eller Clostridium odlingssupematant i komplexa matriser. Protokollet är densamma, men när man testar andra BoNT serotyper (t.ex. BoNT / B, E, och F) med deras respektive Matrix analyser 56,60, även om analyskänsligheten varierar mellan serotyper och analyser. Detta protokoll tar inte hänsyn till varje typ av prov är möjligt och vissa modifieringar kan krävas beroende på det specifika provet sammansättning och önskade tillämpningen. Matriser kan innefatta livsmedelsprover (t.ex. livsmedel utmaning test) eller farmaceutiskt hjälpämne buffertar (t.ex. BoNT-baserade läkemedlet produkttester). Komplexa nonfood (t.ex. djurvävnad eller miljö) vätska och fasta prover bör behandlas som livsmedelsprover. Detta protokoll använder 200 l / brunn provvolymer men så lite som 50 l / brunn kan testas med en motsvarande justering av volymen på 10x Binding buffert. Prover mindre än 50 l ska spädas med GPB eller PBS till ≥ 50 ^ före testning.

Den mycket varierande karaktär av livsmedel utgör en särskild utmaning för BoNT detektion och kvantifiering i livsmedel. Prov pH, viskositet, jonstyrka och närvaron av partiklar kan alla potentiellt påverka aktiviteten av toxinet i livsmedelsmatrisen och nödvändiggöra att toxin isoleras från mat för noggrann, in vitro-kvantifiering. Många livsmedel eller beredningar toxin innehåller också endogena proteaser som måste tas bort eller inaktiveras vid användning av proteinbaserade reportrar att säkerställa att endast BoNT-specifik proteas aktivitet mäts. Även enkla, väldefinierade buffert matriser, såsom farmaceutiska hjälpämnesbuffertar, kan innehålla ämnen som stör BoNT aktivitet som måste tas bort innan kvantifiering 35,56-59,61. Immunoutfällning erbjuder en snabb, mycket serotypspecifikt BoNT puriringsmetod men kräver antikroppar med hög affinitet för att isolera de låga toxinhalter som finns i "real-world" mat, miljö-, och läkemedelsprover.

Den beskrivna protokollet renar toxin med hjälp av paramagnetiska kulor belagda med anti-BoNT / A-antikroppar riktade mot toxinet tung kedja receptor domänen i BoNT / A kärna holotoxin 56. Clostridium arter dock naturligt producera toxinkomplex som består av kärn holotoxin tillsammans med nationella handlingsplaner 62-64. De nationella handlingsplanerna skyddar giftet från proteas attack i mag-tarmkanalen och tros underlätta toxin transport över tarmen epitel 63,65. De NFP inhibera bindningen av IP-A bead anti-BoNT / A-antikroppar mot kärnan holotoxin (data visas ej). Denna hämning är lättad genom att öka provets pH till över ~ 6,25, vilket gör att BoNT / Komplex dissociera i holotoxin och nationella handlingsplanerna och möjliggör effektiv toxinbindning till IP-A-pärlor 66. Av denna anledning att justera provets pH till över 6,5 är kritisk för framgången hos analysen (Figur 5B). Den 10x Bindning buffert som används i protokollet innehåller en buffert för att bidra till att höja pH-värdet till standardanalysförhållanden. Emellertid kan många sura livsmedel väldiga buffringskapacitet bindningsbufferten. Den extra 10x neutraliseringsbuffert ökar kraftigt provbuffertkapacitet och bör neutralisera de flesta livsmedelsmatriser.

En annan viktig parameter för analysen är provets jonstyrka. Förtydligande av proverna genom centrifugering krävs för effektiv pärla tvätt och återhämtning efter immunoutfällning. Provning med färska tomater visade att ingen BoNT / A återhämtning sågs när proverna helt enkelt bearbetas och centrifugeras. Vi antog att BoNT / A kan associera med tomatköttet orsakar det till pellets under centrifugering och blir frånvarande fråntestade supernatant. Vi fann att en ökning av jonstyrkan eller, mer påtagligt, neutralisera pH begränsade interaktioner mellan BoNT och matrisen resulterar i förbättrad toxin återhämtning (figur 5B). Även om det inte krävs för BoNT återhämtning förväntas, men inte visat, att högre saltkoncentrationer också kommer att öka stringensen i immunoprecipitation och resultera i mindre ospecifik protein återhämtning, särskilt i låga salt livsmedel.

Prov pH och jonstyrka justering av protokollet genomförs genom tillsats av 10x Neutralisering buffert och bör vara förenlig med ett brett urval av livsmedel. Medan 10x neutraliseringsbuffert har hög buffertkapacitet, kan vissa mycket sura livsmedel kräver ytterligare pH-justering. Provning av prov pH följande buffert tillägg rekommenderas om dålig analysprestanda observeras och provvolymen tillåter. Ytterligare pH-justering kan uppnås genom tillägg av sköpcentret volymer av 1 M HEPES, pH 8, om så erfordras. Den extra NaCl infördes av 10x Neutralisering bufferten bör vara acceptabelt för alla utom de saltaste mat, men kan 10x neutraliseringsbuffert ersätts med 1 M HEPES pH 8 om dåliga resultat ses med ett visst livsmedel. Inga signifikanta skillnader har observerats när man testar den beskrivna protokollet vid NaCl-koncentrationer upp till 1,2 M i PBS.

Även om detta protokoll är tillämpligt på de flesta prover, får livsmedel vid extrema pH, jonstyrka, och / eller proteas innehåll inte ge goda resultat med analysen. Vissa livsmedel kan också förbli alltför trögflytande efter tillägg av GPB, vilket resulterar i dålig pärla återhämtning. Förspädning av prover med en enkel buffert såsom PBS kan förbättra resultaten. Att öka antalet tvättar eller tvätta stringens (genom att öka NaCl koncentration) och öka koncentrationen av EDTA-fri proteashämmare kan också förbättra resultat om icke-specifik proteas förorenadjon observeras. Instrument renlighet är också mycket viktigt när man använder automatisk platt tvätt. Kontaminering av VVS och insprutningsmunstyckena med proteaser (t.ex. trypsin) från andra laboratorieanalyser kan leda till oavsiktlig införsel av proteaser under analysen. Noggrann rengöring av plattan brickan enligt tillverkarens bruksanvisning rekommenderas innan du kör testet.

De BoTest Matrix analyserna är de första kommersialiserade, aktivitetsbaserade analyser för BoNT detektion och kvantifiering i komplexa matriser. Jämfört med vanlig mus bioassay, är analysen snabbt, billigare, och ger hög genomströmning testning utan behovet av specialiserade anläggningar eller etiska bekymmer angående djuranvändning 56. Andra in vitro Bont detektionsmetoder har beskrivits men har inte visat sig vara kompatibel med komplexa provmatriser, kräver specialiserad utrustning, eller inte är kommersiellt tillgänglle 35,42-44,46-55. Analyserna är också aktivitetsbaserade analyser som mäter toxin endoproteasaktivitet, medan traditionella enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA)-tekniker endast rapportera toxinmassan. Aktivitetsbaserade ELISA-analyser har tidigare beskrivits men dessa analyser inte visat att jobba med livsmedelsmatriser och inte omfattar rening av toxinet från provmatrisen 41. Betydande underskattning av toxiciteten av komplexa prover kan uppstå om giftet inte renas från provet eftersom matrisföreningar stör ofta med BoNT aktivitet 35,56-59.

När protokollet är behärskar, kan modifieringar göras för att öka provvolymer och öka provkänslighet. Till exempel, bindning av toxinet till kulorna kan utföras i större, bulkprover (t.ex. 10 ml eller mer) innan samlingen genom centrifugering. Dessa pärlor kan sedan läggas till en 96-brunnar och analyseras efter att beskrivad-protokollet. Ökningar i känslighet som är större än en log har observerats med ökad provstorlek 56. Således kan den beskrivna protokollet användas med större volymprover för att upptäcka även små mängder av BoNT som finns i prover som kan gå oupptäckt av bioassay på möss.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

FM Dunning, TM Piazza, F. Zeytin, och WC Tucker är anställda eller ägare av BioSentinel Inc. BioSentinel närvarande tillverkar och har kommersialiserat en del av de reagenser som presenteras i denna rapport.

Acknowledgments

Författarna vill tacka H. Olivares och D. Ruge för värdefulla diskussioner och rådgivning. Denna forskning stöds delvis av en NSF SBIR utmärkelse (IIP-1.127.245 till BioSentinel Inc.) samt en försvarsdepartementet kontrakt (W81XWH-07-2-0045 till BioSentinel Inc.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit BioSentinel A1015 Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate reader Thermo Fisher Scientific 5250040 Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 nm and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation Plate V&P Scientific VP771H Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer BioTek ELx405 VSRM Optional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
Microcentrifuge Optional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixer Eppendorf 22674200
Orbital Shaker Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor Tablets Roche 4693132001 Only required for food or environmental testing. Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/A Metabiologics Optional, only required for standardization and quantification purposes
Black, Flat-bottomed 96-well Plates NUNC 237105 Plates should not be treated
96-well Plate Sealing Tape Thermo Fisher Scientific 15036

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arnon, S. S., et al. Botulinum toxin as a biological weapon: medical and public health management. J. Am. Med. Assoc. 285, 1059-1070 (2001).
  2. Gill, D. M. Bacterial toxins: a table of lethal amounts. Microbiol. Rev. 46, 86-94 (1982).
  3. Montal, M. Botulinum neurotoxin: a marvel of protein design. Annu. Rev. Biochem. 79, 591-617 (2010).
  4. Lacy, D. B., Stevens, R. C. Sequence homology and structural analysis of the clostridial neurotoxins. J. Mol. Biol. 291, 1091-1104 (1999).
  5. Montecucco, C., Schiavo, G. Structure and function of tetanus and botulinum neurotoxins. Q. Rev. Biophys. 28, 423-472 (1995).
  6. Ahnert-Hilger, G., Munster-Wandowski, A., Holtje, M. Synaptic vesicle proteins: targets and routes for botulinum neurotoxins. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 364, 159-177 (2013).
  7. Yamasaki, S., et al. Cleavage of members of the synaptobrevin/VAMP family by types D and F botulinal neurotoxins and tetanus toxin. J. Biol. Chem. 269, 12764-12772 (1994).
  8. Schiavo, G., et al. Identification of the nerve terminal targets of botulinum neurotoxin serotypes A, D, and E. J. Biol. Chem. 268, 23784-23787 (1993).
  9. Schiavo, G., et al. Tetanus and botulinum-B neurotoxins block neurotransmitter release by proteolytic cleavage of synaptobrevin. Nature. 359, 832-835 (1992).
  10. Schiavo, G., et al. Botulinum G neurotoxin cleaves VAMP/synaptobrevin at a single Ala-Ala peptide bond. J. Biol. Chem. 269, 20213-20216 (1994).
  11. Rossetto, O., et al. SNARE motif and neurotoxins. Nature. 372, 415-416 (1994).
  12. Montecucco, C., Schiavo, G. Mechanism of action of tetanus and botulinum neurotoxins. Mol. Microbiol. 13, 1-8 (1994).
  13. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365, 160-163 (1993).
  14. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin C1 blocks neurotransmitter release by means of cleaving HPC-1/syntaxin. EMBO J. 12, 4821-4828 (1993).
  15. Cherington, M. Clinical spectrum of botulism. Muscle Nerve. 21, 701-710 (1998).
  16. Lindstrom, M., Korkeala, H. Laboratory diagnostics of botulism. Clin. Microbiol. Rev. 19, 298-314 (2006).
  17. Werner, S. B., Passaro, D., McGee, J., Schechter, R., Vugia, D. J. Wound botulism in California, 1951-1998: recent epidemic in heroin injectors. Clin. Infect. Dis. 31, 1018-1024 (2000).
  18. Passaro, D. J., Werner, S. B., McGee, J., MacKenzie, W. R., Vugia, D. J. Wound botulism associated with black tar heroin among injecting drug users. J. Am. Med. Assoc. 279, 859-863 (1998).
  19. Brook, I. Infant botulism. J. Perinatol. 27, 175-180 (2007).
  20. Arnon, S. S. Honey, infant botulism and the sudden infant death syndrome. West J. Med. 132, 58-59 (1980).
  21. Arnon, S. S. Infant botulism. Annu. Rev. Med. 31, 541-560 (1980).
  22. Peck, M. W., Stringer, S. C., Carter, A. T. Clostridium botulinum in the post-genomic era. Food Microbiol. 28, 183-191 (2011).
  23. Sharma, S. K., Whiting, R. C. Methods for detection of Clostridium botulinum toxin in foods. J. Food Prot. 68, 1256-1263 (2005).
  24. Sobel, J. Botulism. Clin. Infect. Dis. 41, 1167-1173 (2005).
  25. Chen, S. Clinical uses of botulinum neurotoxins: current indications, limitations and future developments. Toxins. 4, 913-939 (2012).
  26. Sinha, D., Karri, K., Arunkalaivanan, A. S. Applications of Botulinum toxin in urogynaecology. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 133, 4-11 (2007).
  27. Dmochowski, R., Sand, P. K. Botulinum toxin A in the overactive bladder: current status and future directions. BJU Int. 99, 247-262 (2007).
  28. Benecke, R., Dressler, D. Botulinum toxin treatment of axial and cervical dystonia. Disabil. Rehabil. 29, 1769-1777 (2007).
  29. Hunt, T., Clarke, K. Potency evaluation of a formulated drug product containing 150-kd botulinum neurotoxin type A. Clin. Neuropharmacol. 32, 28-31 (2009).
  30. Marchetti, A., et al. Retrospective evaluation of the dose of Dysport and BOTOX in the management of cervical dystonia and blepharospasm the REAL DOSE study. Mov. Disord. 20, 937-944 (2005).
  31. Wohlfarth, K., Sycha, T., Ranoux, D., Naver, H., Caird, D. Dose equivalence of two commercial preparations of botulinum neurotoxin type A: time for a reassessment. 25, 1573-1584 (2009).
  32. AOAC International, Clostridium botulinum and its toxins in foods (method 977.26 section 17.7.01). (2001).
  33. Schantz, E. J., Kautter, D. A. Microbiological methods: standardized assay for Clostridium botulinum toxins. J. AOAC. 61, 96-99 (1978).
  34. Ferreira, J. L. Comparison of amplified ELISA and mouse bioassay procedures for determination of botulinal toxins A, B, E, and F. J. AOAC. Int. 84, 85-88 (2001).
  35. Directive 2003/15/EC of the European Parliament and of the Council. Official Journal of the European Union. (2003).
  36. Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM Scientific Workshop on Alternative Methods to Refine, Reduce or Replace the Mouse LD50 Assay for Botulinum Toxin Testing. Report No. 08-6416, NIH. (2008).
  37. Bitz, S. The botulinum neurotoxin LD50 test - problems and solutions. ALTEX. 27, 114-116 (2010).
  38. Balls, M. Replacing the animal testing of botulinum toxin: time to smooth out the wrinkles. Altern. Lab. Anim. 38, 1-2 (2010).
  39. Balls, M. Botulinum toxin testing in animals: the questions remain unanswered. Altern. Lab. Anim. 31, 611-615 (2003).
  40. Singh, A. K., Stanker, L. H., Sharma, S. K. Botulinum neurotoxin: where are we with detection technologies. Crit. Rev. Microbiol. 39, 43-56 (2013).
  41. Liu, Y. Y., Rigsby, P., Sesardic, D., Marks, J. D., Jones, R. G. A functional dual-coated (FDC) microtiter plate method to replace the botulinum toxin LD50 test. Anal. Biochem. 425, 28-35 (2012).
  42. Ouimet, T., Duquesnoy, S., Poras, H., Fournie-Zaluski, M. C., Roques, B. P. Comparison of Fluorigenic Peptide Substrates PL50, SNAPtide, and BoTest A/E for BoNT/A Detection and Quantification: Exosite Binding Confers High-Assay Sensitivity. J. Biomol. Screen. (2013).
  43. Scotcher, M. C., Cheng, L. W., Stanker, L. H. Detection of botulinum neurotoxin serotype B at sub mouse LD(50) levels by a sandwich immunoassay and its application to toxin detection in milk. PLoS One. 5, (2010).
  44. Mason, J. T., Xu, L., Sheng, Z. M., O'Leary, T. J. A liposome-PCR assay for the ultrasensitive detection of biological toxins. Nat. Biotechnol. 24, 555-557 (2006).
  45. Ruge, D. R., et al. Detection of six serotypes of botulinum neurotoxin using fluorogenic reporters. Anal. Biochem. 411, 200-209 (2011).
  46. Hines, H. B., et al. Use of a recombinant fluorescent substrate with cleavage sites for all botulinum neurotoxins in high-throughput screening of natural product extracts for inhibitors of serotypes A, B, and E. Appl. Environ. Microbiol. 74, 653-659 (2008).
  47. Gilmore, M. A., et al. Depolarization after resonance energy transfer (DARET): a sensitive fluorescence-based assay for botulinum neurotoxin protease activity. Anal. Biochem. 413, 36-42 (2011).
  48. Capek, P., Dickerson, T. J. Sensing the deadliest toxin: technologies for botulinum neurotoxin detection. Toxins. 2, 24-53 (2010).
  49. Bagramyan, K., Barash, J. R., Arnon, S. S., Kalkum, M. Attomolar detection of botulinum toxin type A in complex biological matrices. PLoS One. 3, (2008).
  50. Wang, D., Baudys, J., Kalb, S. R., Barr, J. R. Improved detection of botulinum neurotoxin type A in stool by mass spectrometry. Anal. Biochem. 412, 67-73 (2011).
  51. Parks, B. A., et al. Quantification of botulinum neurotoxin serotypes A and B from serum using mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 9047-9053 (2011).
  52. Kalb, S. R., Goodnough, M. C., Malizio, C. J., Pirkle, J. L., Barr, J. R. Detection of botulinum neurotoxin A in a spiked milk sample with subtype identification through toxin proteomics. Anal. Chem. 77, 6140-6146 (2005).
  53. Kalb, S. R., et al. The use of Endopep-MS for the detection of botulinum toxins A, B, E, and F in serum and stool samples. Anal. Biochem. 351, 84-92 (2006).
  54. Boyer, A. E., et al. From the mouse to the mass spectrometer: detection and differentiation of the endoproteinase activities of botulinum neurotoxins A-G by mass spectrometry. Anal. Chem. 77, 3916-3924 (2005).
  55. Barr, J. R., et al. Botulinum neurotoxin detection and differentiation by mass spectrometry. Emerg. Infect. Dis. 11, 1578-1583 (2005).
  56. Dunning, F. M., et al. Detection of botulinum neurotoxin serotype A, B, and F proteolytic activity in complex matrices with picomolar to femtomolar sensitivity. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7687-7697 (2012).
  57. Jones, R. G., Ochiai, M., Liu, Y., Ekong, T., Sesardic, D. Development of improved SNAP25 endopeptidase immuno-assays for botulinum type A and E toxins. J. Immunol. Methods. 329, 92-101 (2008).
  58. Ekong, T. A., Feavers, I. M., Sesardic, D. Recombinant SNAP-25 is an effective substrate for Clostridium botulinum type A toxin endopeptidase activity in vitro. Microbiology. 143 (pt 10), 3337-3347 (1997).
  59. Shone, C. C., Roberts, A. K. Peptide substrate specificity and properties of the zinc-endopeptidase activity of botulinum type B neurotoxin. Eur. J. Biochem. 225, 263-270 (1994).
  60. Piazza, T. M., et al. In vitro detection and quantification of botulinum neurotoxin type e activity in avian blood. Appl. Environ. Microbiol. 77, 7815-7822 (2011).
  61. Mizanur, R. M., Gorbet, J., Swaminathan, S., Ahmed, S. A. Inhibition of catalytic activities of botulinum neurotoxin light chains of serotypes A, B and E by acetate, sulfate and calcium. Int. J. Biochem. Mol. Biol. 3, 313-321 (2012).
  62. Sugii, S., Sakaguchi, G. Molecular construction of Clostridium botulinum type A toxins. Infect. Immun. 12, 1262-1270 (1975).
  63. Sharma, S. K., Ramzan, M. A., Singh, B. R. Separation of the components of type A botulinum neurotoxin complex by electrophoresis. Toxicon. 41, 321-331 (2003).
  64. Bryant, A. M., Davis, J., Cai, S., Singh, B. R. Molecular composition and extinction coefficient of native botulinum neurotoxin complex produced by Clostridium botulinum hall A strain. Protein. J. 32, 106-117 (2013).
  65. Kukreja, R. V., Singh, B. R. Comparative role of neurotoxin-associated proteins in the structural stability and endopeptidase activity of botulinum neurotoxin complex types A and E. 46, 14316-14324 (2007).
  66. Eisele, K. H., Fink, K., Vey, M., Taylor, H. V. Studies on the dissociation of botulinum neurotoxin type A complexes. Toxicon. 57, 555-565 (2011).
Isolering och kvantifiering av botulinneurotoxin Från Komplexa matriser med de BoTest Matrix Analyser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dunning, F. M., Piazza, T. M., Zeytin, F. N., Tucker, W. C. Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays. J. Vis. Exp. (85), e51170, doi:10.3791/51170 (2014).More

Dunning, F. M., Piazza, T. M., Zeytin, F. N., Tucker, W. C. Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays. J. Vis. Exp. (85), e51170, doi:10.3791/51170 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter