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Neuroscience

Isolierung und Quantifizierung von Botulinum Neurotoxin aus komplexen Matrices Mit den Botest Matrix Assays

doi: 10.3791/51170 Published: March 3, 2014

Summary

Die Botest Matrix Botulinum-Neurotoxin (BoNT) Nachweisassays schnell zu reinigen und zu quantifizieren BoNT aus einer Reihe von Probenmatrix. Hier präsentieren wir ein Protokoll für den Nachweis und die Quantifizierung von BoNT sowohl aus festen und flüssigen Matrices und zeigen die Assay mit BOTOX, Tomaten und Milch.

Abstract

Für Pharma-, Umwelt-, und Lebensmittelstichproben ist eine genaue Erfassung und Quantifizierung von Botulinum-Neurotoxin (BoNT) in komplexen Matrices erforderlich. Schnelle Prüfung von BoNT Lebensmittel während Ausbruch Forensik, Patientendiagnose und die Lebensmittelsicherheit Tests erforderlich, während genaue Wirksamkeitsprüfung ist für BoNT-basierten Wirkstoffproduktherstellung und die Sicherheit der Patienten erforderlich. Die weit verbreitete Maus-Bioassay für BoNT-Tests ist sehr empfindlich aber es fehlt die Präzision und Durchsatz für schnelle und Routine BoNT Tests erforderlich. Darüber hinaus hat die Verwendung von Tieren in der Bioassay Anrufe Medikament Regulierungsbehörden und Tierschutz Befürworter in den USA und im Ausland, um den Maus-Bioassay für BoNT Versuche ersetzen geführt. Mehrere in vitro-Assays Ersatz entwickelt worden, die gut mit gereinigtem BoNT in einfachen Puffern zu arbeiten, aber die meisten haben nicht gezeigt, für Tests in hoch komplexen Matrices zu sein. Hier wird ein Protokoll zum Nachweis vonBoNT in komplexen Matrices mit den Botest Matrix-Tests vorgestellt. Der Test besteht aus drei Teilen: Der erste Teil beinhaltet die Herstellung der Proben für die Prüfung, ist der zweite Teil eine Immunpräzipitation Schritt mit Anti-BoNT Antikörper-beschichteten paramagnetischen Kügelchen zu BoNT aus der Matrix zu reinigen, und der dritte Teil quantifiziert des isolierten BoNT des proteolytischen Aktivität unter Verwendung eines fluorogenen Reporter. Das Protokoll wird für die Hochdurchsatz-Tests in 96-Well-Platten mit flüssigen und festen Matrizen geschrieben und benötigt ca. 2 h manuelle Vorbereitung mit Gesamttestzeiten von 4-26 h je nach Probentyp, Toxin Last und gewünschte Empfindlichkeit. Daten für BoNT / A-Tests mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, einem Medikament, Kulturüberstand, 2% Milch und frischen Tomaten dargestellt und umfasst Erörterung kritischer Parameter für den Test erfolgreich.

Introduction

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Botulinum-Neurotoxine (BoNT) sind die tödlichsten Stoffe bekannt, mit intravenöser Menschen bei 1-3 ng geschätzte letale Dosen / kg 1,2. Sieben strukturell ähnlichen Serotypen von BoNT, die mit A bis G bestehen, die jeweils aus einer schweren Kette Domäne für Zellbindung, Aufnahme und Translokation in das Cytosol und eine leichte Kette, die eine Zink-Endopeptidase 05.03 kodiert verantwortlich. Die exquisite Toxizität der BoNT ergibt sich aus, zum Teil, seine spezifische Bindung und Aufnahme in die Motor-Neuronen an der neuromuskulären Endplatte 6. Einmal im Inneren des Neurons, die leichte Kette Endopeptidase spaltet spezifisch eine oder mehrere der löslichen N-Ethylmaleimid-sensitiver Faktor Attachment-Protein-Rezeptor (SNARE) Proteine, die für Vesikelfusion erforderlich, die Hemmung der Freisetzung von Neurotransmittern und führt zu schlaffer Lähmung 14.07. Allgemein bekannt als die Krankheit "Botulismus" Lähmung der Membran und Rippenmuskeln durch BoNT bekannten führt letztendlichAtemversagen und Tod, es sei denn eine frühzeitige Diagnose und Behandlung erhalten.

Menschenlebensmittelbedingten Botulismus wird am häufigsten mit BoNT-Serotypen A, B, E verbunden sind, und F (BoNT / A, BoNT / B, etc.) und in der Regel ergibt sich aus der Einnahme von kontaminierten Lebensmitteln 15,16, obwohl, mehrere Fälle von Wundbotulismus wurden unter intravenös Drogen 17,18 wiesen. In den Vereinigten Staaten, ist Säuglingsbotulismus von der Einnahme von Clostridium-Sporen durch Kinder unter dem Alter von einem daraus resultierenden die häufigste Form des Botulismus 19-21. Allerdings wurden lebensmittelbedingten Ausbrüche von BoNT unsachgemäße Einmachen und Lebensmittelverarbeitung resultierenden sowohl in den Vereinigten Staaten und im Ausland berichtet. Zwischen 2000-2009 wurden mindestens 338 Fälle von lebensmittelbedingten Botulismus weltweit, darunter sechs Todesfälle 22 berichtet. Die Fähigkeit zu lebensmittelbedingten Botulismus Ausbrüche rasch und sensibel zu erfassen ist ein entscheidender Hinweis darauf, dass eine frühe Diagnose helfen könnte 23,24. Darüber hinaus werden Nachweismethoden, die kostengünstig und Routinelebensmitteltests ermöglichen eine verbesserte Ernährungssicherheit führen.

BoNT des neuronalen Spezifität und langen biologischen Halbwertszeit macht es eine starke therapeutische auch. In den Vereinigten Staaten, sind BoNT-basierte Medikamente, die von der Food and Drug Administration für die Behandlung von kosmetischen Bedingungen und neuromuskuläre bedingten Erkrankungen einschließlich Glabellafalten, zervikale Dystonie, Migräne-Kopfschmerzen, überaktive Blase, und Strabismus genehmigt. Zahlreiche "off-label"-Anwendungen werden dokumentiert, einschließlich der Hochdosis-Behandlungen für schwere Muskelfunktionsstörungen 25-28. Genaue Toxin Quantifizierung ist entscheidend für die richtige Dosierung, wie Unterdosierung kann zu unwirksame Behandlung führen, während eine Überdosierung bringt Patienten mit einem Risiko von potenziell schädlichen Nebenwirkungen. Leider ist keine standardisierte Potenz Testprotokoll über Hersteller geteilt, was zu Einheit Definition Ungleichheiten zwischen BoNT-basierten Wirkstoff products 29-31.

Der Standardtest für BoNT ist der Maus-Bioassay, in der BoNT-haltigen Proben werden intraperitoneal in Mäuse injiziert und die Zahl der Todesfälle registriert über 1-7 Tage 16,32,33. Der Maus-Bioassay ist sehr empfindlich mit Nachweisgrenzen (LOD) von 5-10 pg BoNT / A 34, aber ethische Bedenken über Tierversuche, die hohen Kosten der Ausbildung von Personal und die Aufrechterhaltung Tierhaltung, lange Testzeiten und das Fehlen von standardisierte Protokolle führte Anrufe auf standardisierte, tierversuchsfreie Test BoNT-und Quantifizierungsmethoden 35-39 zu entwickeln. Kürzlich wurden mehrere alternative BoNT Quantifizierungsmethoden entwickelt, die Maus oder in der Nähe von Maus-Bioassay-Empfindlichkeit 40-49 bieten. Diese Methoden verwenden häufig Fluoreszenz, Massenspektrometrie, oder immunologische Methoden und bieten Testzeiten deutlich kürzer als der Maus-Bioassay, ohne Tierversuche. Massenspektrometrie-Ansätze mit immunologischen Techniq kombiniertues wurde gezeigt, nachzuweisen und zu quantifizieren BoNT in Lebensmitteln und anderen komplexen Proben enthielten jedoch, Personal Training Anforderungen und Spezialausrüstung Grenze diese Assays 50-55. Die meisten anderen alternativen Assays sind nicht ohne weiteres auf komplexe Stichproben oder fehlt die Routine für BoNT Prüfung erforderlichen Durchsatz. Die hohe Variabilität der Lebensmittelprobe Viskosität, pH-Wert, Salzgehalt und Matrixbestandteile stellt eine besondere Herausforderung bei dem Versuch, in-vitro-Testverfahren mit einer Empfindlichkeit, die extreme Wirksamkeit von BoNT entsprechen zu entwickeln. Selbst einfache und relativ gutartig Puffersysteme, wie die von Aufwirbelung von BoNT-basierte Arzneimittel entstehen, enthalten Salz, Eiweiß, Zucker und Stabilisatoren (zB Hilfsstoffe), die wesentlichen Einfluss in vitro Wirksamkeit von BoNT 56. Toxin Reinigung wird für die genaue Prüfung der Wirksamkeit von allen, aber die einfachsten Proben 56-59 erforderlich.

DieBotest Matrix-Tests wurden für die schnelle Hochdurchsatz ausgelegt und konsistente Quantifizierung von BoNT von sehr komplexen Proben mit Hilfe von Geräten häufig in Forschungslabors 56,60 gefunden. Diese Assays verwenden paramagnetischen Kügelchen kovalent an Serotyp-spezifischen Anti-BoNT-Antikörper verbunden, zu binden und zu maskieren BoNT von einer Probe und entfernen störende Matrix Verbindungen durch Waschen. Nach dem Waschen wird gebundenen BoNT proteolytischen Aktivität dann in einer optimierten Reaktionspuffer mit einem Reporter mit der BoNT-Serotyp getestet kompatibel quantifiziert. Diese Reporter sind fluorogene Proteine, bestehend aus einem N-terminalen cyan fluoreszierende Protein (GFP)-Komponente und eine C-terminale gelb fluoreszierendes Protein-Derivat (Venus)-Einheit durch ein BoNT Substrat, SNAP25 Reste 141-206 oder Synaptobrevin Reste 33-94 verbunden, die die Botest A / E oder B / D / F / G-Reporter, beziehungsweise 45. Reporter Spaltung durch BoNT wird mit Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) überwacht. Wenn ter Reporter ist intakt, Anregung von CFP führt FRET zur Venus, Abschrecken CFP-Emission und spannende Venus Emission. Spaltung des Reporters durch BoNT verhindert FRET, was zu einem Anstieg der GFP-Emission und Abnahme der Venus-Emission. BoNT-Aktivität kann dann quantitativ mit dem Verhältnis der GFP und Venus-Emissionen gemessen werden. LOD unter 3 pg sind aus einer breiten Palette von Lebensmitteln mit einem Hochdurchsatz-96-Well-Plattenformat 56 möglich. Erhöhte Empfindlichkeit kann durch größere Probenvolumina erzielt werden, da der Test ermöglicht Konzentration des Toxins auf die Oberfläche der Kügelchen.

Die Botest Matrix Assays für BoNT A, B, E und F wurden entwickelt und mit Lebensmittel-, Pharma-und Umweltproben 56,60 getestet. Hier beschreiben wir Verfahren für die Durchführung dieser Tests für den Nachweis von BoNT bei geringer Komplexität (zB Pharma-, BoNT in Puffer) und hoher Komplexität (zB Lebensmittel-, Umwelt-) Proben. Spezielle Verarbeitungsmethodenmehrere Probentypen werden in diesem Protokoll adressiert und Probentypen hier nicht beschrieben sind, können in der Regel mit einer Kombination der vorgestellten Methoden angepasst werden. Das Protokoll wurde entwickelt und getestet, mit BoNT / A, jedoch ist anpassungsfähig an andere BoNT-Serotypen unter Verwendung ihres jeweiligen Assays wie anderswo 56,60 demonstriert.

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Protocol

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1. Vorbereitung der Assay-Reagenzien

  1. Tauwetter 200x Dithiothreitol (DTT), 10x Matrix Bindungspuffer (10x Binding Puffer bezeichnet), 10x Neutralisationspuffer (Lebensmittel-oder pH-Ungleichgewicht Proben) und 10x Botest Reaktionspuffer (10x Reaktionspuffer bezeichnet) bei Raumtemperatur (RT) für 15 min oder bis sie vollständig aufgetaut. Siehe Tabelle 1 für eine Liste von Puffern und Reagenzien in diesem Protokoll verwendet. Siehe Tabelle 2 für eine Liste von Materialien und Geräten für dieses Protokoll erforderlich.
  2. Mischen Sie die aufgetauten Puffer für 5 Sek. mischen. 10x Neutralisationspuffer, 200xDTT und 10x Reaktionspuffer sollte klar angezeigt, während der Puffer 10x Binding wird ein trübes Aussehen haben. Wärmen Sie die 10x Reaktionspuffer für 5 min bei 37 ° C und wiederholen Verwirbelung, wenn sie nach dem Auftauen trüb erscheint.
  3. Generieren Sie 3,8 ml 1x Reaktionspuffer.
    1. Beschriften Sie eine 15 ml konischen Röhrchen "1x Reaktionspuffer" und fügen 3,42 ml Molekularbiologie watäh, 380 ul 10x Reaktionspuffer und 19 ul 200x DTT. Mix-Puffer gut durch Inversion.
    2. Schneiden Sie ein Einzel EDTA-freie Protease-Inhibitor-Tablette in Quartalen mit einem sauberen Rasierklinge, und fügen Sie ein Viertel der Tablette zum 1x Reaktionspuffer (die restlichen Tablet-Anteil kann bei 4 ° C für eine spätere Verwendung gespeichert werden). NB Proteaseinhibitoren kann nicht erforderlich sein, wenn unter Verwendung von gereinigtem Toxin und einfache Puffer (zB Pharma-Proben).
    3. Vortex die 1x Reaktionspuffer, bis die Protease-Tablette vollständig gelöst ist.
  4. Wärmen Sie die Matrix A-Kügelchen (IP-A-Perlen bezeichnet) für 20 min bei RT.
  5. Auftauen Botest A / E Reporter (A / E Reporter bezeichnet) bei RT vor Licht geschützt.
  6. Beschriften Sie eine 15 ml konischen Röhrchen "0,5 uM A / E-Reporter" und fügen Sie 45 ul der 20 uM A / E Reporter Lager zu 1,8 ml 1x Reaktionspuffer. Gründlich mischen durch Pipettieren und Lagerung auf Eis vor Licht geschützt.

2. Stehenard Curve Mustererstellung

Die hier beschriebene Standardkurve erstreckt 10-30,000 mLD 50 / g Lebensmittel oder pro ml Puffer in Halb log Verdünnungen (Tabelle 3). Der Anwender ist frei, um alternative Konzentrationen anwendbar zu verwenden.

  1. Festnageln und Inkubation der Matrizen mit Referenzmaterial. Generieren Sie die Standardkurve mit einem Verdünnungsmittel der gleichen Matrix als dem Unbekannten, wenn möglich, um Matrixeffekte zu reduzieren. Gelatine verwenden Phosphatpuffer (GPB) oder Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) als Verdünnungsmittel, wenn zusätzliche, BoNT-negative Matrix nicht verfügbar ist (z. B. Feld oder BoNT Ausbruch Stichproben). Generieren Sie die Standardkurve durch Aufstocken BoNT / A in die Matrix der Wahl nach dem geeigneten Protokoll unten.
    1. Geringe Komplexität Proben (zB PBS, GPB, oder pharmazeutische)
      1. 10 ml des entsprechenden Puffers zu einem 15 ml konischen Röhrchen und beiseite stellen. Diese Probe wird als Verdünnungsmittel für die standar verwendet werdend Kurve und unbekannte Verdünnungen (Abschnitt 4).
      2. 1,2 ml Puffer, um ein Mikrozentrifugenröhrchen.
      3. ACHTUNG: Dieser Schritt verwendet BoNT und äußerste Vorsicht beim Umgang mit und der Entsorgung von Reagenzien und Materialien, die in Kontakt mit dem Toxin kommen, verwendet werden. Verwendung von persönlicher Schutzausrüstung und entsorgen Sie alle Materialien müssen nach dem US Department of Labor OSHA-Richtlinien für BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) durchgeführt werden. Hinzufügen BoNT / A zu der 1,2 ml Probe, so dass die Endkonzentration 30.000 mLD 50 / ml (36.000 mLD 50 insgesamt).
    2. Flüssiglebensmittelproben (oder andere komplexe flüssige Proben) Anmerkung: Die erste Prüfung wird empfohlen, um das Volumen des geklärten Überstandes von Proben der Partikel (. Z. B. Zellstoff) in flüssigen Matrices gewonnen bestimmen variieren. Dieses Protokoll setzt voraus, mindestens 1,2 ml geklärte Überstand wird von einem 1,4 ml samp wiederhergestellt werdenle. Stichprobengröße zu erhöhen, wenn nötig.
      1. 10 ml Flüssignahrung mit einem 15 ml konischen Röhrchen und zur Seite legen. Diese Probe wird als Verdünnungsmittel für die Standardkurve und unbekannte Verdünnungen (Abschnitt 4) verwendet werden.
      2. Wiegen Sie eine leere 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und notieren Sie seine Masse.
      3. Fügen Sie 1,4 ml des flüssigen Lebensmittels auf die Mikrozentrifugenröhrchen eingewogen.
      4. Erneut wiegen die Mikrozentrifugenröhrchen und berechnen Sie die Masse der Lebensmittelprobe hinzugefügt, indem die Masse des leeren Rohr.
      5. ACHTUNG: Dieser Schritt verwendet BoNT und äußerste Vorsicht beim Umgang mit und der Entsorgung von Reagenzien und Materialien, die in Kontakt mit dem Toxin kommen, verwendet werden. Verwendung von persönlicher Schutzausrüstung und entsorgen Sie alle Materialien müssen nach dem US Department of Labor OSHA-Richtlinien für BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) durchgeführt werden. Hinzufügen BoNT / A zu der 1,4 ml Probe in einer Endkonzentration von 30.000 mLD 50 / g Nahrung.
      6. Incubate das Verdünnungsmittel und versetzt Proben bei RT oder bei 4 ° C für 2 Stunden, um die BoNT Zeit mit der Lebensmittelmatrix in Wechselwirkung zu geben, imitiert einen natürlichen Verunreinigungen.
    3. Feste Lebensmittelproben (oder andere feste Proben) Hinweis: Erste Tests wird empfohlen, die Lautstärke der Überstand aus homogenisiert und geklärt Proben nach der Zugabe von 1 ml GPB / g Lebensmittel gewonnen zu bestimmen. Dieses Protokoll wird vorausgesetzt, dass mindestens 1,2 ml geklärte Überstand wird aus einer 2-g-Probe gewonnen werden. Stichprobengröße zu erhöhen, wenn nötig.
      1. Wiegen Sie 10 g feste Probe in ein 50 ml konischen Röhrchen und beiseite stellen. Dies wird als Verdünnungsmittel verwendet werden.
      2. Wiegen Sie 2 g festen Lebensmittelprobe in einen zweiten 50 ml konischen Röhrchen.
      3. ACHTUNG: Dieser Schritt verwendet BoNT und äußerste Vorsicht beim Umgang mit und der Entsorgung von Reagenzien und Materialien, die in Kontakt mit dem Toxin kommen, verwendet werden. Verwendung von persönlicher Schutzausrüstung und die ordnungsgemäße Entsorgung des gesamten Materialss muss nach dem US Department of Labor OSHA-Richtlinien für BoNT (http://www.osha.gov/SLTC/botulism/index.html) durchgeführt werden. Hinzufügen BoNT / A zu der Oberfläche der Probe von 2 g bis zu einer Endkonzentration von 30.000 mLD 50 / g Futter (60,000 Gesamt mLD 50).
      4. Inkubation des Verdünnungsmittels und dotierten Proben bei RT oder 4 ° C für 2 Stunden, um die BoNT Zeit, um mit der Lebensmittelmatrix interagieren zu geben, imitiert einen natürlichen Verunreinigungen.
  2. Beispiel Homogenisierung und Puffereinstellung. Verarbeiten Sie die Standardkurve versetzt Probe und Verdünnungsmittel oben nach Probentyp erzeugt.
    1. Geringe Komplexität Proben
      1. Keine weiteren Probenaufbereitung notwendig.
    2. Flüssige Lebensmittelproben (oder andere komplexe flüssige Proben)
      1. Keine Proben Homogenisierung notwendig.
      2. In 140 ul 10x Neutralisationspuffer auf 1,4 ml Probe versetzt und 1 ml 10x NeutralizatIonen bis zur 10 ml Probe Verdünnungspuffer. Mix Proben gut durch Inversion.
      3. Beide Proben teilweise Klärung durch Zentrifugation für 10 min bei 6.000 × g und 4 ° C. Entnehmen Sie umgehend die Überstände und Transfer zum neuen Röhren.
    3. Feste Lebensmittelproben (oder andere feste Proben)
      1. 2 ml GPB (1 ml GPB / g Lebensmittel) auf die 2 g BoNT / A-dotierten feste Nahrung Probe und 10 ml GPB an die 10 g Probe Verdünnungsmittel.
      2. Homogenisieren der Proben unter Verwendung von Stößel bis gründlich gemischt. Abhängig von der Art der Probe kann es zu kleinen Stücken von Material, das nicht homogenisiert werden kann, was akzeptabel ist sein. Alternativ können mechanische Homogenisierung Methoden verwendet werden. Verwendung von einem Mixer wird nicht empfohlen, da es ebenso wie das Toxin zu inaktivieren vernebeln.
      3. Hinzufügen 1:10 Volumen 10x Neutralisationspuffer zum Probenverdünnungsmittel, bezogen auf das ungefähre Volumen (z. B. 2 ml, wenn das Volumen 20 ml). Extrapolierendas Gesamtvolumen der BoNT / A-dotierten Probe und fügen 1/10tel Volumen 10x Neutralisationspuffer. Mix Proben gut durch Inversion.
      4. Beide Proben teilweise Klärung durch Zentrifugation für 10 min bei 6.000 × g und 4 ° C. Entnehmen Sie umgehend die Überstände und Transfer zum neuen Röhren.
  3. Bereiten Standardkurve serielle Verdünnungen für die Prüfung
    1. Mit der BoNT / A-dotierten Standardkurve Probe als D1 und die nonspiked Probe als Verdünnungsmittel nach Tabelle 3 zu erzeugen, die restlichen Standardkurve Proben in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.

3. Bereiten unbekannten Proben

Dieser Abschnitt kann parallel zum Abschnitt 2 abgeschlossen werden.

  1. Bestimmen Sie die Anzahl und Verdünnungen der Unbekannten. Testen Unbekannten in dreifacher Ausfertigung, wenn möglich.
    1. Für qualitative Assays, führen die Unbekannten ohne weitere Verdünnung als erforderlich, um die Probe als beschrie verarbeitenunten Bett.
    2. Für quantitative Assays werden mindestens zwei 1:10-Verdünnung Proben, wie unten beschrieben, um sicherzustellen, dass eine oder mehrere Proben innerhalb des linearen Bereichs des Assays Reaktion fallen. Generieren Verdünnungen Verwendung eines Verdünnungsmittels von der gleichen Matrix als unbekannt, wenn möglich, um Matrixeffekte zu reduzieren, wie in Abschnitt 3 beschrieben. Andernfalls verwenden PBS oder GPB als Verdünnungsmittel.
  2. Generieren und Verdünnen unbekannten Proben nach Probentyp.
    1. Geringe Komplexität Unbekannten (zB PBS, GPB, oder pharmazeutische)
      1. In mindestens 750 ul unbekannt ein Mikrozentrifugenröhrchen Unbekannte Verdünnung 1 zu erzeugen.
      2. In 675 ul Verdünnungsmittel, um zwei Mikrozentrifugenröhrchen Unbekannt Verdünnung 2 und 3 bezeichnet. Das Verdünnungsmittel ist gleich für Standardkurve Generation verwendet Material sein.
      3. Serienmäßig verdünnen Verdünnung 1 durch die Übertragung von 75 ul der Verdünnung 1 in den Verdünnungs 2 und Mischrohr.
      4. Serienmäßig DILUTE 2 Verdünnung durch die Übertragung von 75 ul der Verdünnung 2 in den Verdünnungs 3 Rohr-und Misch.
    2. Flüssige Nahrung Unbekannten (oder andere komplexe flüssige Proben) Hinweis: Erste Tests wird empfohlen, das Volumen der Überstand von Proben geklärt erholt wie in Abschnitt 3 zu bestimmen. Stichprobengröße zu erhöhen, wenn nötig.
      1. In ≥ 875 ul der Flüssigkeit unbekannt ein Mikrozentrifugenröhrchen.
      2. In 1:10 Volumen 10x Neutralisation Puffer auf die Probe (zB 87,5 ul für eine 875 ul Probe).
      3. Teilweise Klärung der Probe durch Zentrifugation für 10 min bei 6.000 × g und 4 ° C. Den Überstand in ein neues Röhrchen sofort übertragen. Dies ist ein Unbekannter Verdünnung.
      4. In 675 ul Verdünnungsmittel zu zwei Röhren Unbekannt Verdünnung 2 und 3 bezeichnet. Das Verdünnungsmittel werden die gleichen verarbeiteten Materials für Standardkurve Generation verwendet wird.
      5. Serienmäßig verdünnen Verdünnung 1 durch ÜberweisungRing 75 ul der Verdünnung 1 in den Verdünnungs 2 Rohr und Mischen.
      6. Serienmäßig verdünnen Verdünnung 2 durch die Übertragung von 75 ul der Verdünnung 2 in den Verdünnungs 3 Rohr-und Misch.
    3. Feste Nahrung Unbekannten (oder andere feste Proben) Hinweis: Erste Tests wird empfohlen, das Volumen der Überstand von Proben geklärt erholt wie in Abschnitt 3 zu bestimmen. Stichprobengröße zu erhöhen, wenn nötig.
      1. Wiegen Sie 2 g Fest unbekannten Probe in ein 50 ml konischen Röhrchen.
      2. 2 ml GPB (1 ml GPB / g Lebensmittel) auf die 2 g feste Probe.
      3. Homogenisieren der Proben, wie in Abschnitt 3.2.3.2 beschrieben.
      4. Hinzufügen 1:10 Volumen 10x Neutralisierungspuffer auf der Probe basierend auf der ungefähren Volumen (z. B. 0,4 ml, wenn das Volumen 4 ml). Mix Proben gut durch Inversion.
      5. Teilweise Klärung der Probe durch Zentrifugation für 10 min bei 6.000 × g und 4 ° C. SOFORTy Transfer ≥ 750 ul Überstand in ein Reaktionsgefäß. Dies ist ein Unbekannter Verdünnung.
      6. In 675 ml Verdünnungsmittel zu zwei Röhren Unbekannt Verdünnung 2 und 3 bezeichnet. Das Verdünnungsmittel werden die gleichen verarbeiteten Materials für Standardkurve Generation verwendet wird.
      7. Serienmäßig verdünnen Verdünnung 1 durch die Übertragung von 75 ul der Verdünnung 1 in den Verdünnungs 2 und Mischrohr.
      8. Serienmäßig verdünnen Verdünnung 2 durch die Übertragung von 75 ul der Verdünnung 2 in den Verdünnungs 3 Rohr-und Misch.

4. Endgültige Klärung Beispiel

Wenn der Test flüssigen oder festen Lebensmittelproben, Zentrifuge alle Proben für 5 min bei ≥ 14.000 x g in einer Mikro vollständig zu klären, die Proben. Entnehmen Sie umgehend die Überstände und Transfer zum neuen Röhren.

5. Teller-Setup und BoNT / A Pull-Down-

  1. Die spezielle Plattenlayout ist anwendungsabhängig, aber verwenden Sie nicht die Außenseite Brunnen soRandeffekte zu vermeiden. Jeder unbekannten Probe und Standardkurve Probe D1-D8 erfordert 3 Brunnen, während Probe D9 benötigt 6 Brunnen. Eine vorgeschlagene Plattenanordnung ist in 1 gezeigt.
  2. In 20 ul 10x Bindepuffer in jede Vertiefung eingesetzt werden.
  3. Gib 200 ul jeder Verdünnung geklärt und unbekannt jeweils drei Vertiefungen (sechs Bohrungen D9) zum dreifachen Tests. Mischen Sie die Platte für 10 Sekunden auf einem Mikromischer.
  4. Fügen Sie die IP-A Perlen.
    1. Vortex die IP-A-Kügelchen für 10 Sekunden mit der höchsten Geschwindigkeit. Weiter Vortex wenn Perlen sind nicht vollständig suspendiert und homogen.
    2. Je 20 ul IP-A Perlen zu jeder Probe auch.
    3. Mischen Sie die Platte für 30 Sekunden auf einem Mikromischer.
  5. Inkubiere die Platte unter Verwendung einer rotierenden Platte Brutschrank für 2 h bei 750 rpm, 25 ° C oder RT. Assay-Leistung hängt stark von Erzeugung und Aufrechterhaltung des IP-A Perlensuspension während aller Inkubationsschritte. Immer wieder zu suspendieren Perlen mit einem Mikrospät Mischer nach dem Pelletieren und pflegen Sie die Suspension mit einer Umlauf Mikrotiterplattenschüttler während aller Inkubationsschritte.

6. Teller Waschen und Resuspension Bead

  1. Entweder von Hand oder durch Verwendung eines magnetischen Kügelchen kompatibel automatischen Plattenwäscher, waschen. Eine automatisierte Plattenwasch für magnetische Kügelchen konfiguriert erhöht Assay Durchsatz.
    1. Handwasch
      1. Beschriften Sie eine 50 ml konischen Röhrchen "1x Wash Buffer" und fügen Sie 45 ml Molekularbiologie Wasser und 5 ml 10x Waschpuffer Matrix. Mix-Puffer gut durch Inversion.
      2. Die Platte aus dem sich drehenden Platte Inkubator.
      3. Sofort legen Sie die Platte auf einem 96-Loch-Magnetperle Trennplatte für 5 min.
      4. Während die Platte auf dem 96-Loch-Magnetperle Trennplatte, entfernen und entsorgen Sie die Überstände aus den Probenbehältern mit einem Ein-oder Mehrkanalpipette. Saugen Sie nichtPerlen-visuell die angesaugte Puffer in der Pipettenspitze für zufällige Raupenabziehgeschwindigkeit überwachen. Wenn die Entfernung bezeugt wird, die Spitze Inhalte sanft zurück in den Brunnen, reseparate, und wiederholen Sie die Entfernung.
      5. In 300 ul 1x Waschpuffer zu jeder Probe auch.
      6. Voll resuspendieren die Perlen durch das Mischen der Platte für 30 Sekunden auf einem Mikromischer.
      7. Die Platte auf der 96-Loch-Magnetperle Trennplatte für 2 min.
      8. Entfernen und entsorgen Sie die Überstände aus den Probenbehältern wie zuvor.
      9. Wiederholen Sie die Schritte 6.1.1.5-6.1.1.8 drei weitere Male für insgesamt 4 Waschvorgängen.
      10. Mit der Platte auf dem 96-Loch-Magnetperle Trennplatte, Sichtprüfung der Brunnen noch Stand Vorgang zu bestätigen; mit einer Pipette, um überschüssige Restpuffer wie nötig entfernen. Einige Puffer in den Vertiefungen bleiben und muss darauf geachtet werden, Wulstentfernungsmittel oder Wulst Austrocknen zu verhindern.
      11. In 50 ul 1x Reaktionspuffer zu jeder Probe gut mischen und die Platte für 30 sec auf einem Mikromischer vollständig resuspendieren Perlen. Wenn nötig, mit einer Pipette vollständig resuspendieren Perlen.
    2. Automatisierte Plattenwasch
      1. Setup-Programm und die Unterlegscheibe nach Tabelle 4 enthält. Sauber und bündig die Scheibe mit hoher Qualität (zB Nanopure-) Wasser.
      2. Prime die Scheibe, indem Sie das Programm "Prime".
      3. Die Platte aus dem sich drehenden Platte Inkubator.
      4. Sofort wird die Platte auf dem 96-Loch-Magnetperle Trennplatte auf dem Plattenreiniger.
      5. Führen Sie das Link-Programm "Master Wash". Der erste Programmschritt ein 5 min Inkubation Schritt, in dem die Scheibe stationär ist.
      6. Nach Abschluss des Programms, entfernen Sie die Platte aus der Waschmaschine, 50 ul 1x Reaktionspuffer zu jeder Probe gut und mischen Sie die Platte für 30 Sekunden auf einem Mikromischer vollständig resuspendieren Perlen. Wenn nötig, mit einer Pipette vollständig resuspendieren Perlen.

    7. Assay Initiierung und Inkubation

    1. In 50 ul 0,5 uM A / E Reporter (siehe Abschnitt 1) ​​zu jeder Probe gut mischen und für 30 Sekunden auf einem Mikromischer vollständig resuspendieren Perlen.
    2. 100 l Wasser zu jedem ungenutzten gut auf der Platte, um Randeffekte zu vermeiden.
    3. Verschließen Sie die Platte mit Plattendichtband und inkubieren Sie die Platte mit einer rotierenden Platte Inkubator bei 750 rpm, 25 ° C oder RT. Schützen Sie die Platte aus Licht während der Inkubation.

    8. Datenerhebung und Datenanalyse

    Anmerkung: Dieser Test ist ein Echtzeit-Assays, die mehrmals gemessen werden kann, bis die gewünschte Empfindlichkeit erhalten werden kann, gibt es keine Stoppreagenzien. Empfohlene Initiallesezeiten sind 2, 4, und 24 Stunden Inkubationszeit mit Assay-Empfindlichkeit steigt mit Inkubationszeit.

    1. Die Datensammlung
      1. Bei jedem Lesezeit, entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator Drehplatte, entfernen Sie die Dichtunging-Band, und sofort wird die Platte auf dem 96-Loch-Magnetperle Trennplatte. Damit sich die Kügelchen für 2 min zu trennen.
      2. Die Platte wird in der Mikroplatten-Reader und Messung der Emissionen bei ~ 470 und ~ 526 nm unter Anregung bei 434 nm ~.
      3. Wenn zusätzliche Lesezeiten gewünscht werden, resuspendieren die Perlen für 30 Sekunden auf der Mikromischer, verschließen Sie die Platte, und kehren Sie die Platte an der Drehplatte Inkubator.
    2. Datenanalyse
      1. Berechnung der Emissionsverhältnis für jede Probe berechnet, indem die relative Fluoreszenzeinheit (RFU)-Wert bei 526 nm von der RFU-Wert bei 470 nm ist.
      2. Zeichnen Sie die Emissionsverhältnis gegen den log [BoNT / A] für die Standardkurve Datenpunkten. Je nach BoNT / A Potenzreihe getestet, wird eine sigmoidale Dosis-Wirkungs-Kurve erhalten werden (siehe Repräsentative Ergebnisse).
      3. Setzen Sie die Standardkurve mit dem variablen Daten Steigung Dosis-Antwort-Kurve Y = Bottom + (Top-Bottom) / (1 ​​+10 ^ ((logEC 50-X) * Hang)), wobei X dieLogarithmus der Konzentration, Y die Reaktion und Y beginnt unten und geht mit einer S-Form der Spitze.
      4. Bestimmen Sie die Nachweisgrenzen (LOD), Grenzwerte (LOQ) und halb-maximale effektive Konzentration (EC 50). Nachweisgrenzen sind als Muster mit einem Emissionsverhältnis weniger als 3 Standardabweichungen (SDs) unter den Blindkontrollen definiert (n = 6). (N = 6) Grenzen der Quantifizierung als eine Probe mit einem Emissionsverhältnis weniger als 10 SDs unter den Blindkontrollen definiert. EC 50 von der sigmoidalen Dosis-Antwort-Kurvenanpassung bestimmt.
      5. Interpolieren die Potenz von unbekannten Proben gegen die sigmoidale Dosis-Wirkungs-Standardkurve.
        1. Für quantitative Ergebnisse sollte der unbekannten Probe ideal im linearen Bereich der Standardkurve fallen. Ungefähr dem linearen Teil der Standardkurve durch Berechnung des Gesamttestantwortfensters 20-80% (z. B. wenn das Emissionsverhältnis der Standardkurve ranges 0,5-2,5 würde der lineare Bereich der Bereich der Standardkurve, die im Bereich von 0,9 bis 2,1 sein).
        2. Für die qualitative Ergebnisse, vergleichen Sie die unbekannten Probe gegen die LOD und LOQ der Standardkurve.
        3. Unbekannten Proben Extrapolieren Sie nicht über die Grenzen der Standardkurve.

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Representative Results

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Ein Diagramm, das die Schritte in der beschriebenen Protokoll ist in Fig. 2 gezeigt. Der Test benötigt zwischen 4-26 Stunden, je nach Probentyp und die gewünschte Testempfindlichkeit zu vervollständigen, aber nur ~ 2 Stunden von Hands-on-Zeit. Der Assay wird in 96-Well-Platten durchgeführt und je nach Art der Prüfung durchgeführt wird, ermöglicht Dreifachprüfung von bis zu 20 Proben einschließlich Standards pro Platte.

Fig. 3 zeigt repräsentative Testergebnisse mit BoNT / A-Holotoxin in PBS versetzt und mit dem beschriebenen Protokoll folgende 2, 4 und 24 h Inkubation mit dem A / D-Reporter getestet. Gereinigtes BoNT / A Holotoxin wurde für dieses Experiment ausgewählt, weil seine definierte Molekulargewicht von ~ 150 kDa, im Vergleich zu den breiter definierten 700-900 kDa für die Toxin-Komplex, und Reinheit ermöglichen sehr genaue Spick in genauen Konzentrationen. Der Emissionsgrad, das Verhältnis der Emission bei 526 nm zu derjenigen bei 470 nm nach Anregung bei 434nm, zu jedem Zeitpunkt wird gegen BoNT / A-Konzentration (MLD-50-Wert wird auf die Wirksamkeitsprüfung der BoNT / A Herstellers basiert) aufgetragen. Spaltung des Reporters durch BoNT wird als eine Reduktion der Emissionsgrad, die mit unseren Plattenleser im Bereich zwischen etwa 2,7 für das intakte Reporter bis etwa 0,7 für das vollständig gespalten Reporter gemessen. Es ist wichtig zu beachten, dass, da jedes Fluoreszenz-Plattenlesegerät Maßnahmen in RFU, der tatsächliche Wert des Emissionsgrades wird in Abhängigkeit von der Plattenlesegerät verwendet wird. Längerer Inkubationszeit mit den Reporter zu erhöhten Reporter Spaltung, wie durch die Linksverschiebung der Kurve zu sehen. Die Datenpunkte, dreifach getestet, zeigen geringe SD der mittleren und folgen Sie den erwarteten Trend der erhöhten Emissionsverhältnis mit verminderter Toxinbelastung. Ausfall des Tests, um diesen Trend zu folgen erwartet möglicherweise einen Fehler während der Verdünnung Generation oder Daten Plotten anzuzeigen. Die Emissionsverhältnisse der Kontrollen ohne BoNT / A bleiben auch stabil During die Inkubation (Abbildung 3, Einschub), was das Fehlen von nicht-spezifische Protease-Aktivität.

Ein Beispiel für dieses Protokoll verwenden, um pharmazeutische BoNT / A-Proben zu quantifizieren, ist in Fig. 4 gezeigt. Eine Standardkurve wurde in PBS mit gereinigtem BoNT / A-Holotoxin erzeugt und parallel Verdünnungen der Arzneistoffprodukt aus einer 100 U Phiole lyophilisiertes BOTOX in 0,9% Kochsalzlösung rehydriert erzeugt verarbeitet. (Idealerweise würde die Standardkurve der Referenz viele BOTOX zusammengesetzt sein, aber ein solches Material nicht zur Verfügung stehen.) Die Proben wurden unter Verwendung des beschriebenen Protokolls mit der Ausnahme, daß 50 ul-Proben wurden in doppelter ohne die Verwendung von 10x Bindungspuffer getestet getestet. Die Standardkurve wurde als Funktion von BoNT / A-Konzentration nach 24 h Inkubation mit dem A / E Reporter aufgetragen. Der Emissionsgrad von jeder unbekannten Probe wurde dann durch Auftragen von ihrem Schnittpunkt in der Standardkurve visualisiert. In diesem Assay wird die Zeilenar Abschnitt der Standardkurve (die Assay-Response Fenster 20-80%) fällt zwischen einem Emissionsgrad von 2,11 bis 1,05 und wird durch die gestrichelten Kasten in der Figur angegeben. Die Konzentrationen in den drei Unbekannten, die in diesem linearen Bereich fallen wurden dann von der Standardkurve (Abbildung 4, Einschub) interpoliert. Dieses Beispiel zeigt die allgemeine Methode, die verwendet würde, um gegen eine Standardkurve zu erfassen oder zu quantifizieren jede unbekannte Probe werden.

Frische Tomaten und 2% Milch wurden ausgewählt, um die Leistung und Empfindlichkeit unter Verwendung sowohl einen Feststoff (Tomate) und Liquid-Food (2% Milch)-Matrix des Protokolls zu demonstrieren. BoNT / A-Komplex der Kern Holotoxin und Neurotoxin-assoziierte Proteine ​​(NAP) enthielt, wurde für diese Versuche ausgewählt, da diese Vorbereitung gleicht der bei einer natürlichen Kontamination Clostridium-Toxin produziert. Wie in 5A, Wiederherstellung von BoNT / A, gemessen als die Spaltung der A / D-Reporter gezeigt, mit b beobachtetoth Matrizen. Erhöhte Inkubationszeit mit dem Reporter-Assay-Empfindlichkeit erhöht, aber nicht zu einer verminderten Emissionsverhältnisse für die Toxin keine Kontrollen (5A, Einschübe) führen, was die beobachteten Ergebnisse Spaltung von BoNT / A und nicht über unspezifische Protease tragen aus der Nahrung in die Assays. Wie bei Fig. 3, die Datenanzeigen geringe Variabilität und folgt der erwartete Trend verringerte Reporter Spaltung mit verringerten Toxinkonzentration.

Die BoNT / A LOD, LOQ und EC 50 für beide Lebensmittel an jedem gezeigten Zeitpunkt sind in Tabelle 5 zusammengefasst. Der LOD und LOQ sind als die niedrigste Konzentration Probe mit einem Emissionsgrad von weniger als drei und zehn SDs unten Hintergrund (Proben, die keine BoNT / A) definiert. Diese Grenzwerte sind für die getesteten Datenpunkte beschränkt, obwohl Interpolation auf die sigmoidale Dosis-Wirkungs-Kurve verwendet werden, um niedrigere theoretischen Grenzen zu berechnen. Einige Matrix-zu-Matrix Variabilität in der LOD und LOQ wird erwartet, wie Matrix-Effekte kann die Verbindlichkeit des Toxins an die Perlen und die Wieder Perlen beim Waschen zu beeinflussen. Während es scheint, dass es mehr Toxin Erholung von 2% Milch als Tomaten von den Daten in Fig. 5A, viel von dieser Differenz ergibt sich aus der weiteren Verdünnung erforderlich, um Tomatenproben in GPB homogenisieren.

Zusätzlich dazu, dass eine feste Lebensmittelmatrix, Tomaten sind eine bemerkenswerte Probentyp in dem pH-Wert und Ionenstärke Einstellung durch Zugabe von Neutralisationspuffer 10x erreicht, ist entscheidend für den Erfolg Assay. 5B zeigt Assayantworten beim Testen Tomaten mit oder ohne Einbeziehung Die Neutralisation der 10x-Puffer. Bei Nichtbeachtung der 10x Neutralisationspuffer zu einer schlechten Wiedergewinnung von BoNT / A von Proben hinzuzufügen und um einen konstanten Emissionsverhältnis in allen getesteten BoNT / A-Konzentrationen nachgewiesen. Zugabe des Neutralisationspuffer 10x, obwohl, rrgebnisse in empfindlichen Nachweis des Toxins.

Die unspezifische Proteasen in komplexen Matrices enthalten können, um Fehlalarme führen, wenn nicht angesprochen, da andere als BoNT Proteasen können die A / E Reporter spalten. Die unspezifische Proteasen können endogen Lebensmittelprobe oder bei Verwendung nicht-gereinigte BoNT Zubereitungen wie Clostridium Kulturüberständen eingeführt werden. Gründliches Waschen Wulst werden die meisten nicht-spezifische Proteasen zu entfernen, jedoch ist die Zugabe von Proteaseinhibitoren zu dem Reaktionspuffer kritischen Fig. 6 zeigt unspezifische Proteaseaktivität in Clostridium BoNT / A-Kulturüberständen festgestellt unter Verwendung eines modifizierten A / E Reporter Botest KO (KO Reporter. ). Die KO-Reporter ist der gleiche wie der A / D-Reporter mit der Ausnahme, dass die BoNT / A-Spaltstelle mutiert worden ist, so dass es nicht mehr von BoNT / A gespalten Daher führt jede beobachteten Reporter Abspaltung von unspezifischen Protease-Aktivität. Die hohe KO-Reporter cleAvage zeigt die Kulturüberstand enthält eine hohe Protease-Aktivität, aber die Aktivität wird wirksam durch die Zugabe von Proteaseinhibitoren negiert.

Die Probendaten zeigen die Nützlichkeit des Protokolls für Hochdurchsatz-BoNT / A-Erkennungs in einfachen Puffern und Lebensmittel-Matrices. Bestimmte Nahrungsmittel können verlangen, kleinen Test Anpassungen, aber die beschriebenen Protokoll sollte gute Ergebnisse mit der Mehrheit der Arten von Lebensmitteln zu erhalten.

Figur 1
Abbildung 1. Empfohlene Plattenbelegung. Proben werden zu den inneren 60 Vertiefungen der Platte beschränkt, mögliche Randeffekte zu vermeiden. Unbekannte oder Standardkurve Proben können nach Wunsch hinzugefügt werden. Alle nicht verwendeten Wells sollten während Reporter Inkubation mit 100 ul Wasser gefüllt werden. Klick hier für eine größere Ansicht.

Figur 2
2. Schematische Übersicht der beschriebenen Protokoll. Jeder Hauptschritt in dem Protokoll von einem markierten Feld angezeigt und ausgerichtet neben einer geschätzten Testzeitachse (nicht maßstabsgetreu). Nonfood-Proben benötigen keine Probenaufbereitung und so geben Sie das Protokoll hinter der Lebensmittelproben. Die gestrichelten Rahmen um Verdünnungs Generation für die Unbekannten zeigt dies ist optional, wird aber empfohlen, Schritt. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Fig. 3
3. Nachweis von BoNT / A-Holotoxin in PBS unter Verwendung des beschriebenen Protokolls.Gereinigtes BoNT / A-Holotoxin wurde in PBS versetzt und unter Verwendung des beschriebenen Protokolls mit einem oberen BoNT / A-Konzentration von 1 nM. Alle Proben wurden in dreifacher Ausführung getestet, und die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung des Mittelwerts. Berichtet Potenz auf Maus-Bioassay Prüfung des Toxins des Herstellers basiert. Das Emissionsverhältnis (das Verhältnis der Emission bei 526 nm bis 470 nm nach Anregung bei 434 nm) von der Standardkurve wurde nach 2, 4 und 24 h Inkubation mit A / E Reporter gemessen und als Funktion der BoNT / A-Konzentration . Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Fig. 4
Abbildung 4. Quantifizierung von BOTOX Medikament mit dem beschriebenen Protokoll. Eine einzige 100 U Fläschchen lyophilisierter BOTOX Medikament war resuspe nded in 220 &mgr; l 0,9% Kochsalzlösung seriell verdünnt und als Unbekannte gegen eine Standardkurve in PBS unter Verwendung von gereinigtem BoNT / A-Holotoxin gemacht getestet. Proben wurden gemäß dem Protokoll beschrieben, außer daß 50 ul-Proben wurden ohne 10x Bindungspuffer doppelt getestet getestet. Die Standardkurve wurde durch Einsetzen des Emissionsgrades der Standardkurvenproben, um die variable Steigung sigmoidale Dosis-Wirkungs-Gleichung und wird als eine Funktion von BoNT / A-Konzentration aufgetragen berechnet. Jeder unbekannten Probe wird gezeigt, wo es mit der Standardkurve schneidet, nach einer 24-stündigen Inkubation mit dem A / D-Reporter. Die Konzentrationen der unbekannten Proben innerhalb des linearen Bereichs (gestrichelte schattierte Box) fallenden wurden aus der Standardkurve interpoliert. Das Etikett für jeden BOTOX unbekannt ist die Anzahl der Einheiten in der Stichprobe auf Basis beschriftet Potenz vorhanden. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung des Mittelwerts.t = "_blank"> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Figur 5
Abbildung 5. Wiederherstellung von BoNT / A-dotierten 2% Milch und frischen Tomaten Prüfung mit dem beschriebenen Protokoll. Proben von 2% Milch und frischen Tomaten wurden mit gereinigtem BoNT / A-Komplex versetzt und getestet mit dem beschriebenen Protokoll. Alle Proben wurden dreifach getestet und die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung des Mittelwerts. (A) Der Emissionsgrad von 2% Milch und frischen Tomaten Standardkurven wurden nach 2 gemessen, 4 und 24 h Inkubation mit A / E Reporter und als Funktion von BoNT / A Potenz. (B) Die Nichtbeachtung der Neutralisation 10x Puffer während Tomaten-Testergebnisse in Testversagen. Proben von frischen Tomaten wurden nach dem beschriebenen Protokoll entweder mit oder ohne Zusatz von 10x Neutral getestetsierung Puffer. Die dargestellten Daten für die 4 Stunden Zeitpunkt. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Fig. 6
6. Proteaseinhibitoren sind erforderlich, wenn die Prüfung komplexen Matrices. Clostridium BoNT / A (Stamm Halle A) Kulturüberstand wurde seriell in PBS verdünnt und getestet unter Verwendung des beschriebenen Protokolls mit oder ohne Protease-Inhibitoren zu dem Reaktionspuffer und mit sowohl der A / E und KO Reportern. Der Emissionsgrad wurde nach 24 Stunden Inkubation sowohl mit dem A / E oder KO-Reporter gemessen und als Funktion von BoNT / A Potenz. Signifikante Spaltung des KO-Reporter wurde ohne Zusatz von Protease-Inhibitoren gesehen, aber wurde durch ihre Aufnahme negiert. Alle Proben wurden in dreifacher Ausfertigung und der Fehler b getestetars stellen die Standardabweichung des Mittelwerts. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Puffer Zusammensetzung Lagertemperatur Stabilität Aufzeichnungen
10x Matrix Binding Buffer 500 mM HEPES-NaOH, pH 7.1, 250 mM NaCl, 1% Tween-20, 5% Casein, 0,05% NaN 3 -20 Oder -80 ° C Stabil für mindestens fünf Tage bei 4 ° C nach dem Auftauen Lieferung mit Botest Matrix A Botulinum Detection Kit
Matrix 10x Waschpuffer 119 mM Phosphat, pH 7,4, 1,370 mM NaCl, 27 mM KCl, 1% Tween-20 -20 Oder -80 ° C Stabil für mindestens fünf Tage bei 4 ° C nach dem Auftauen Lieferung mit Botest Matrix A Botulinum Detection Kit
10x Neutralisierungspuffer 1 M HEPES-NaOH, pH 8,0, 1 M NaCl 4 ° C Stall für bis zu sechs Monate bei 4 ° C
Botest 10x Reaktionspuffer 500 mM HEPES-NaOH, pH 7,1, 50 mM NaCl, 1% Tween-20, 100 &mgr; M ZnCl 2 -20 Oder -80 ° C Stabil für mindestens fünf Tage bei 4 ° C nach dem Auftauen Lieferung mit Botest Matrix A Botulinum Detection Kit
Botest A / E Reporter 20 &mgr; M in 50 mM HEPES-NaOH, 10 mM NaCl, 15% Glycerin -80 ° C Lagerung in kleinen Portionen. Stabil für mindestens fünf Tage bei 4 ° C nach dem Auftauen. Lieferung mit Botest Matrix A Botulinum Detection Kit
Gelatine Phosphatpuffer (GPB) 33.3 mM NaH 2 PO 4, pH 6,2, 2 g / l Gelatine 4 ° C Stabil bis zu 1 Monat bei 4 ° C
200x Dithiothreitol (DTT) 1 M DTT -20 ° C Stabil für bis zu 6 Monate bei -20 ° C Stellen und kleine (100 ul) Aliquots speichern
1x PBS-t 11,9 mM Phosphat, pH 7,4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,1% Tween-20 4 ° C Stabil bis zu 1 Monat bei 4 ° C Kann mit 10x PBS von Fisher (BP399-1) werden
Matrix A Perlen (IP-A Perlen) Magnetic Beads kovalent an Huhn anti-BoNT / A-Antikörper in PBS konjugiert. 0,1% Tween-20, 0,05% Natriumazid, 0,25% Casein und 50% Glycerol -20 ° C Stabil für mindestens fünf Tage bei 4 ° C bei der Entfernung von -20 ° C. Nicht einfrieren bei -80 ° C

Tabelle 1. Puffer für den beschriebenen Protokoll erforderlich. 10x Die NeutralisationPuffer ist nur bei sehr komplexen (zB Nahrungsmittel) Proben und je nach der Natur der zu untersuchenden Proben nicht erforderlich.

Name der Material / Ausrüstung Firma Katalognummer Kommentare / Beschreibung
Botest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit BioSentinel A1015 Nachweis-Kits für BoNT / B und F sind ebenfalls erhältlich.
Varioskan Flash-Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader Thermo-Fisher Scientific 5250040 Die meisten Monochromator-oder Filterbasis Einheiten mit 434 nm Anregung und 470 nm und 526 nm Emissionsvermögen verwendet werden.
96-Loch-Magnetic Bead Separation Teller V & P Scientific VP771H Andere Magnetplatten verwendet werden, jedoch sollte die Platte entwickelt, um die b trennenEADS an der Seite des Brunnens.
Magnetic Bead-Kompatibel Platte Waschmaschine BioTek ELx405 VSRM Optional, nur für die automatisierte Plattenwäsche erforderlich. Andere magnetische Kügelchen-kompatiblen Plattenscheiben können auch verwendet werden, sollte aber vor der Verwendung getestet werden.
Mikrozentrifuge Verschiedene N / A Optional, nur für Proben benötigen Zentrifugation erforderlich.
MixMate Tellermischer Eppendorf 22674200
Orbital Shaker Verschiedene N / A Gebraucht bei RT oder bei 25 ° C Wenn die Temperaturregelung erhältlich
EDTA-freie Protease Inhibitor Tabletten Roche 4693132001 Nur für Lebensmittel-oder Umweltprüfung erforderlich ist. Protease-Hemmer muss EDTA-frei sein.
BoNT / A Metabiologics N / A Optional, nur für die Standardisierung und Quantifizierung Zwecke benötigt
Schwarz, Flachboden-96-Well-Platten NUNC 237105 Die Platten sollten nicht behandelt werden
96-Well-Platten-Dichtband Thermo Scientific 15036

Tabelle 2. Materialien und Ausrüstung für das beschriebene Protokoll erforderlich. Einige Materialien und Geräte sind optional und können in Abhängigkeit von der verfügbaren Ausrüstung ersetzt werden. Zusätzliche Eignungsprüfung und Optimierung können, wenn mit alternativen Anlagen erforderlich sein.

</ Tr>
Sample Name Volume Toxin Volume Verdünnungs [BoNT / A] (MLD 50 / ml) oder (MLD 50 / g Lebensmittel) log [BoNT / A] (MLD 50 / ml) oder (MLD 50 / g Lebensmittel) D1 Auf 1.200 ul N / A 30.000 4,48
D2 300 ul D1 600 ul 10.000 4
D3 90 ul D1 810 ul 3000 3,48
D4 90 ul D2 810 ul 1000 3
D5 90 ul D3 810 ul 300 2,48
D6 90 ul D4 810 ul 100 2
D7 90 ul D5 810 ul 30 1,48
D8 90 ul D6 810 ul 10 1
D9 N / A 1400 ul N / A N / A

Tabelle 3:. Verdünnungstabelle für Standardkurve Proben Diese Tabelle erzeugt eine Standardkurve im Halb log Verdünnungen über 3,5 Größenordnungen. Genug Kein BoNT Blindprobe (D9) erzeugt wird, um eine n = 6 laufen. Zusätzliche Verdünnungen können, falls gewünscht, zugegeben werden.

<td> 0
Programmname Variable Wert Kommentare
Primzahl Reagenzienflasche A
Prime Volume 400
Prime Flow Rate 7
Genießen Nach Prime? N
Matrix Wash Reagenzienflasche A Die Anzahl der Wäschen kann erhöht werden, wenn Rest Protease-Aktivität beobachtet werden.
Verfahren
4
Genießen / schütteln Y
Genießen Dauer 180
Schütteln Sie vor einweichen? N
Prime Nach einweichen? N
Disp
Dispense Volume 300
Dispense Flow Rate 5
Dispense Höhe 130
Hor. Dispense Pos. 0
Deaktivieren absaugen? Y
Bottom Wash First? N
Prime, Vor dem Start? N
Aspir
Aspiration Höhe 40
Hor. Saugen Sie Pos. 0
Aspiration bewerten 5
Aspiration Verzögerung
Quer absaugen? N
Schluss Aspiration? Y
Schluss Aspiration Verzögerung 0
Matrix Genießen Genießen Dauer 300 Erhöhte Einweichzeit kann Wulst Erholung von viskoser Lebensmittel zu erhöhen.
Schütteln Sie vor einweichen? N
Master-Wash Matrix Genießen Dies ist ein "Link" Programm zu laufen die Matrix und Matrix Soak Wash Programme zusammen.
Matrix Wash

Tabelle 4. Magnetic Bead-kompatiblen automatisierten Plattenwaschprogrammeinstellungen. Folgende Programme davon aus, dass die Platte Scheibe ist mit einem Magneten, die Perlen zieht an der Seite der Brunnen und ausgestattet, dass der Puffer-Schaltmodul wird so eingestellt, dass 1x Wash Buffer ( PBS-t) ist, um das Ventil A beigefügt Diese Programme speziell für die BioTek ELx405 sind. Finden Sie in der Instrumentenhandprogrammieranleitung bei. Andere magnetische Kügelchen kompatibel automatischen Plattenwascher oder Vakuumleitungen können verwendet werden, jedoch werden die Tests erforderlichen Einstellungen, die Wascheffizienz zu maximieren definieren und Perlenverlust zu minimieren beim Waschen werden. Erste Tests der Wulst Erholung nach dem Waschen ist unabhängig von der jeweiligen Plattenwasch verwendet empfohlen.

<td> LOD
Lebensmittelmatrix Metrisch 2 Stunden 4 Stunden 24-Stunden-
mLD 50 / g Lebensmittel mLD 50 / gut mLD 50 / g Lebensmittel mLD 50 / gut mLD 50 / g Lebensmittel mLD 50 / gut
Milch 300 58 100 19 30 6
LOQ 1000 193 300 58 100 19
EC 50 2404 464 590 114 92 18
Frische Tomaten LOD 1000 91 300 27 30 3
LOQ 1000 91 1000 91 100 9
EC 50 7561 687 1932 176 229 21

Tabelle 5. Nachweisgrenzen (LOD), Grenzwerte (LOQ) und Halb maximal effektive Konzentration (EC 50) für die 2% Milch und frischen Tomaten Tests in 2A gezeigt. Die EG-50 von der sigmoidalen Dosis-Antwort-Kurve fit abgeleitet, während die LOD und LOQ werden als die niedrigste Konzentration Datenpunkt, fällt definiert entweder 3 oder 10 Standardabweichungen unterhalb des BoNT ohne Kontrollen (n = 6) auf. Die Daten werden sowohl mLD 50 / g Lebensmittel-und Gesamt mLD 50 s getestet pro Vertiefung in 200 ul Probenvolumen vorgestellt.

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Discussion

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Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Quantifizierung von BoNT / A-Komplex, Holotoxin oder Clostridium Kulturüberstand in komplexen Matrices. Das Protokoll ist das gleiche, jedoch bei der Prüfung anderer BoNT-Serotypen (z. B. BoNT / B, E und F) mit ihren jeweiligen Matrix-Assays 56,60, obwohl die Empfindlichkeit des Assays werden in Serotypen und Assays variieren. Dieses Protokoll ist nicht für jede Art von Probe möglich Rechnung und je nach der spezifischen Probenzusammensetzung und der gewünschten Anwendung können einige Modifikationen erforderlich sein. Matrizen können Lebensmittelproben (zB Lebensmittel Herausforderung Prüfung) oder pharmazeutischen Hilfsstoff Puffer (z. B. BoNT-basierten Wirkstoffproduktprüfung) enthalten. Komplexe Nonfood (zB Tiergewebe oder-Umwelt-) flüssigen und festen Proben sollten als Lebensmittelproben behandelt werden. Dieses Protokoll verwendet 200 &mgr; l / Vertiefung Probenvolumina, aber so wenig wie 50 &mgr; l / kann auch durch eine entsprechende Anpassung an das Volumen 10x Bindin prüfendeng Puffer. Proben kleiner als 50 ul sollte mit GPB oder PBS auf ≥ 50 ul vor dem Test verdünnt werden.

Die sehr variable Art von Lebensmitteln stellt eine besondere Herausforderung für BoNT Detektion und Quantifizierung in Lebensmitteln. Beispiel pH-Wert, Viskosität, Ionenstärke und der Gegenwart von Partikeln können alle potentiell die Aktivität des Toxins in der Lebensmittelmatrix und erfordern, dass das Toxin aus der Nahrung für eine genaue, quantitative in vitro isoliert werden. Viele Lebensmittel oder Toxinpräparate enthalten auch endogene Proteasen, die entfernt oder bei Verwendung Reportern auf Proteinbasis, um sicherzustellen, dass nur BoNT-spezifische Protease-Aktivität gemessen wird, inaktiviert werden muß. Selbst einfache, gut definierte Puffer Matrizen, wie pharmazeutische Hilfsstoff Puffer, können Verbindungen, die mit BoNT-Aktivität, die vor der Quantifizierung 35,56-59,61 entfernt werden müssen, stört enthalten. Immunpräzipitation bietet eine schnelle, hoch Serotyp-spezifischen BoNT purifizierung Verfahren erfordert aber Antikörper mit hoher Affinität, die niedrigen Toxinkonzentrationen in der "realen Welt" Lebensmittel-, Umwelt-und Pharma Proben gefunden zu isolieren.

Die beschriebenen Protokoll reinigt das Toxin mit paramagnetischen Kügelchen mit Anti-BoNT / A-Antikörper gegen das Toxin-Rezeptor-Domäne der schweren Kette von BoNT / A-Kern Holotoxins 56 beschichtet sind. Clostridium-Arten, aber natürlich produzieren Toxin-Komplexe, die aus dem Kern in Verbindung Holotoxins mit NAP 62-64. Die NAP schützen das Toxin aus Protease-Angriff in der Magen-Darm-Trakt und sind vermutlich Toxin-Transport über den Darm Epithel 63,65 erleichtern. Die NAP hemmen die Bindung von IP-Kügelchen Anti BoNT / A-Antikörper mit dem Kern-Holotoxin (Daten nicht gezeigt). Diese Hemmung wird durch Erhöhen des pH der Probe auf über ~ 6,25, wodurch die BoNT / A-Komplex in Holotoxin und NAP dissoziieren und eine effektive Toxin entlastetBindung an die IP-A 66 Perlen. Aus diesem Grund Einstellen des pH der Probe auf über 6,5 ist entscheidend für den Erfolg des Assays (Fig. 5B). Die Binding-Puffer 10x im Protokoll verwendet wird, enthält ein Puffermittel helfen den pH zu erhöhen, um Standard-Testbedingungen. Allerdings können viele saure Lebensmittel die Pufferkapazität der Binding-Puffer zu überwältigen. Der zusätzliche Puffer 10x Neutralisation der Probe Pufferkapazität stark erhöht und sollte die meisten Lebensmittel Matrizen zu neutralisieren.

Ein weiterer wichtiger Parameter für den Test ist die Probenionenstärke. Für eine effektive Wulst Waschen und Erholung nach Immunpräzipitation Klärung der Proben durch Zentrifugation erforderlich. Testen mit frischen Tomaten ergeben, dass keine BoNT / A Erholung wurde gesehen, wenn die Proben einfach verarbeitet und zentrifugiert. Wir vermuten, dass BoNT / A kann mit dem Tomatenfleisch verbinden wodurch es während der Zentrifugation pelletieren und zu fehlt dieÜberstand getestet. Wir fanden, dass die Erhöhung der Ionenstärke oder mehr deutlich, Neutralisation der pH begrenzten Wechselwirkungen zwischen BoNT und der Matrix zu einer verbesserten Rückgewinnung Toxin (Fig. 5B). Zwar nicht für BoNT Wiederherstellung erforderlich, wird erwartet, wenn auch nicht bewiesen, dass höhere Salzkonzentrationen wird auch die Stringenz der Immunpräzipitation zu erhöhen und führen zu weniger unspezifischen Proteingewinnung, insbesondere bei niedriger Salz Lebensmittel.

Beispiel pH und Ionenstärke-Einstellungs im Protokoll wird durch die Zugabe von Neutralisationspuffer 10x durchgeführt und sollte mit einer breiten Palette von Lebensmitteln kompatibel ist. Während der Neutralisation 10x Puffer hat eine hohe Pufferkapazität, können einige sehr sauren Lebensmitteln zusätzliche pH-Einstellung. Prüfung von Proben-pH folgenden Puffer hinaus wird empfohlen, wenn schlechte Leistung des Tests beobachtet und Probenvolumen ermöglicht. Weitere pH-Einstellung kann durch die Zugabe von n erreicht werdenMall Volumen 1 M HEPES, pH 8, falls erforderlich. Die zusätzliche NaCl durch die Neutralisationspuffer 10x eingeführt sollte akzeptabel sein für alle außer den salzigsten Lebensmittel, jedoch kann 10x Neutralisationspuffer mit 1 M HEPES pH 8, ersetzt werden, wenn schlechte Ergebnisse sind mit einem Lebensmittel zu sehen. Es wurden keine signifikanten Unterschiede beobachtet werden, wenn die Prüfung der beschriebenen Protokoll bei NaCl-Konzentrationen bis zu 1,2 M in PBS.

Während dieses Protokoll ist für die meisten Proben kann Lebensmittel an den Extremen der pH-Wert, Ionenstärke und / oder Proteasegehalt nicht zu guten Ergebnissen mit dem Assay. Einige Lebensmittel können auch noch zu viskos nach der Zugabe von GPB, was zu schlechten Wulst Erholung. Die Patientenproben mit einem einfachen Puffer wie PBS können die Ergebnisse zu verbessern. Erhöhung der Anzahl der Waschanlagen oder Wasch Stringenz (durch Erhöhung der NaCl-Konzentration) und die Erhöhung der Konzentration von EDTA-freie Protease-Inhibitoren können auch Ergebnisse verbessern, wenn unspezifische Protease kontamiIonen beobachtet wird. Sauberkeit Instrument ist auch sehr wichtig bei der Verwendung von automatischen Plattenwasch. Verschmutzung der Sanitär-und Einspritzdüsen mit Proteasen (z. B. Trypsin) von anderen Labortests können während des Tests auf die unbeabsichtigte Einführung von Proteasen führen. Gründliche Reinigung der Platte Scheibe gemäß den Hersteller Handbuch ist, bevor Sie den Test empfohlen.

Die Botest Matrix-Tests sind die ersten in den Handel, Prozess Assays für BoNT Detektion und Quantifizierung in komplexen Matrices. Im Vergleich zur Standard-Maus-Bioassay, ist der Test schnell, kostengünstiger und ermöglicht Hochdurchsatz-Tests ohne die Notwendigkeit für spezialisierte Einrichtungen oder ethische Bedenken in Bezug auf Tiernutzung 56. Andere in vitro BoNT Nachweismethoden sind beschrieben worden, aber noch nicht gezeigt worden, mit komplexen Matrices kompatibel zu sein, erfordern spezielle Ausrüstung oder sind nicht im Handel available 35,42-44,46-55. Die Tests sind auch aktivitätsbasierten Assays, die Toxin Endoproteaseaktivität zu messen, während traditionelle-Enzym-Immuntest (ELISA)-Techniken berichten nur Toxin Masse. Activity-basierten ELISA-Assays wurden bisher beschrieben, aber diese Tests nicht nachgewiesen, dass mit der Nahrung Matrizen arbeiten und nicht die Reinigung des Toxins umfassen von der Probenmatrix 41. Signifikanten Unterschätzung der Toxizität von komplexen Proben kann auftreten, wenn das Toxin nicht von der Probe gereinigt, da Matrixverbindungen oft mit der BoNT Aktivität 35,56-59 stören.

Sobald das Protokoll beherrschen, können Modifikationen vorgenommen, Probenvolumina zu erhöhen und Probenempfindlichkeit werden. Beispielsweise die Bindung des Toxins an die Perlen können in größeren Volumenproben (beispielsweise 10 ml oder mehr) vor dem Sammeln durch Zentrifugation durchgeführt werden. Diese Perlen können dann auf eine 96-Well-Platte aufgenommen und untersucht nach dem beschreibend-Protokoll. Erhöht die Empfindlichkeit größer als eine Protokoll haben mit erhöhter Probengröße 56 beobachtet worden. Somit kann das beschriebene Protokoll mit größerem Volumen Proben verwendet, um zu erfassen, selbst Spurenmengen von BoNT in Proben, die von dem Maus-Bioassay unentdeckt enthalten sein.

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Disclosures

FM Dunning, TM Piazza, F. Zeytin und WC Tucker sind Mitarbeiter oder Eigentümer von BioSentinel Inc. BioSentinel derzeit produziert und hat einige der Reagenzien in diesem Bericht kommerzialisiert.

Acknowledgments

Die Autoren danken H. Olivares und D. Ruge für wertvolle Diskussionen und Rat. Diese Forschung wurde zum Teil durch eine NSF SBIR Auszeichnung (IIP-1127245 zu BioSentinel Inc.) und einem Department of Defense Vertrag (W81XWH-07-2 bis 0045 um BioSentinel Inc.) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit BioSentinel A1015 Detection kits for BoNT/B and F are also available.
Varioskan Flash fluorescence microplate reader Thermo Fisher Scientific 5250040 Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 nm and 526 nm emission capability can be used.
96-well Magnetic Bead Separation Plate V&P Scientific VP771H Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.
Magnetic Bead-Compatible Plate Washer BioTek ELx405 VSRM Optional, only required for automated plate washing.  Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.
Microcentrifuge Optional, only required for samples needing centrifugation.
MixMate plate mixer Eppendorf 22674200
Orbital Shaker Used at room temperature or at 25 °C If temperature control is available
EDTA-free Protease Inhibitor Tablets Roche 4693132001 Only required for food or environmental testing. Protease inhibitors must be EDTA-free.
BoNT/A Metabiologics Optional, only required for standardization and quantification purposes
Black, Flat-bottomed 96-well Plates NUNC 237105 Plates should not be treated
96-well Plate Sealing Tape Thermo Fisher Scientific 15036

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References

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Isolierung und Quantifizierung von Botulinum Neurotoxin aus komplexen Matrices Mit den Botest Matrix Assays
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Dunning, F. M., Piazza, T. M., Zeytin, F. N., Tucker, W. C. Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays. J. Vis. Exp. (85), e51170, doi:10.3791/51170 (2014).More

Dunning, F. M., Piazza, T. M., Zeytin, F. N., Tucker, W. C. Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays. J. Vis. Exp. (85), e51170, doi:10.3791/51170 (2014).

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