Kromosommaleri er en nyttig metode for å studere organisering av cellekjernen og utviklingen av karyotypen. Her demonstrerer vi en tilnærming for å isolere og forsterke spesifikke interesseområder fra enkeltpolytenkromosomer som senere brukes til to- og tredimensjonal fluorescerende in situ hybridisering (FISH).
Fluorescerende in situ hybridisering (FISH) av hele arm kromosom sonder er en robust teknikk for å kartlegge genomiske regioner av interesse, oppdage kromosomale omorganiseringer, og studere tredimensjonal (3D) organisering av kromosomer i cellekjernen. Fremveksten av laserfangstmikrodisseksjon (LCM) og hel genomforsterkning (WGA) gjør det mulig å skaffe store mengder DNA fra enkeltceller. Den økte følsomheten til WGA-settene fikk oss til å utvikle kromosommaling og bruke dem til å utforske kromosomorganisasjon og evolusjon i ikke-modellorganismer. Her presenterer vi en enkel metode for å isolere og forsterke de eukromatiske segmentene av enkelt polytene kromosomarmer fra eggstokksykepleierceller av den afrikanske malaria mygg Anopheles gambiae. Denne prosedyren gir en effektiv plattform for å skaffe kromosommaling, samtidig som den reduserer den totale risikoen for å introdusere utenlandsk DNA til prøven. Bruken av WGA tillater flere runder med reforsterkning, noe som resulterer i høye mengder DNA som kan brukes til flere eksperimenter, inkludert 2D og 3D FISH. Vi demonstrerte at de utviklede kromosommalingene med hell kan brukes til å etablere korrespondansen mellom eukromatiske deler av polytene og mititotiske kromosomarmer i An. gambiae. Samlet sett gir foreningen av LCM og enkeltkromosom WGA et effektivt verktøy for å skape betydelige mengder mål-DNA for fremtidige cytogenetiske og genomiske studier.
Kromosommaling er en nyttig teknikk for å studere utviklingen av karyotyper 1-5 og for å visualisere cytogenetiske abnormiteter via hybridisering av fluorescerende merket kromosomalt DNA 1,6-8. Denne metoden brukes også til å studere 3D-dynamikken i kromosomområder i utvikling 9 og patologi 10. Differensialt merkede kromosommaling brukes til visualisering av individuelle mititotiske 11,12, meiotiske 13,14eller interfase ikke-polytene 15,16 og polytenen 9,11,17 kromosomer. En enkel og robust protokoll for å oppnå kromosommaling ville være svært nyttig for å utvide denne teknikken til ikke-modellorganismer, for eksempel mygg. Anopheles gambiae komplekset er en gruppe på syv morfologisk uutslettelige mygg som varierer i oppførsel og tilpasning, inkludert evnen til å overføre malaria. Disse myggene tjener som en utmerket modell for bedre å forstå utviklingen av nært beslektede arter som varierer sterkt i deres vektorkapasitet. De fleste cytogenetiske studier i malaria mygg har blitt gjort ved hjelp av velutviklede, svært polyteniserte kromosomer (gjennomgått i 18,19). De lesbare bandingmønstrene til polytene kromosomer tillot forskere å demonstrere sammenhengen mellom polymorfiske inversjoner og økologiske tilpasninger i Anopheles gambiae 20. Også vevsspesifikke 21 og artsspesifikke 22 trekk ved 3D polytene kromosomorganisasjon har blitt karakterisert i An. macullipennis-komplekset. Studier av mititotiske kromosomer kan imidlertid gi ytterligere viktig informasjon. For eksempel har et høyere nivå av heterokromatinpolymorfisme observert i mititotiske kromosomer blitt korrelert med redusert parringsaktivitet og fruktbarhet i An. gambiae 23. Korrespondansen mellom eukromatiske segmenter av polytene og mititotiske kromosomarmer kan være vanskelig å etablere bare ved å sammenligne deres relative lengder. Dette skyldes at heterokromatin utgjør en betydelig del av mitotiske kromosomer, men er underrepresentert i polyfinkromosomer 24. Tilgjengeligheten av kromosommaling for malaria mygg ville tillate forskere å utvide cytogenetiske studier betydelig ved å inkludere flere arter, samtidig som de betydelig reduserer kostnadene og tiden i analysene av karyotypisk evolusjon og 3D-dynamikk av kromosomer i denne gruppen epidemiologisk viktige insekter.
For å oppnå store strekninger av kromosomer har mikrodeseksjon blitt en integrert teknikk for å manipulere og isolere spesifikke interesseregioner av kromosomal komplement. Kombinert med full genomforsterkning (WGA) resulterer mikrodeseksjon i kraftige nedstrømsapplikasjoner, inkludert FISH 11,12 og neste generasjons genomsekvensering 25-27. Tidligere krevde teknikken bruk av spesialiserte mikrodesisseksjonsnåler som måtte kontrolleres manuelt av en erfaren bruker 28. Fremrykningen av laserfangstmikrodisseksjon (LCM) har resultert i et forenklet verktøy som er bedre egnet for å isolere enkeltceller 29,30 eller individuelle kromosomer 31-33 med redusert risiko for forurensning. Denne tilnærmingen lar brukeren studere de genetiske heterogeniteter og kromosomale abnormiteter som forekommer i enkeltceller, i stedet for et konsensuslandskap som skyldes sammenslåing av flere celler sammen 34-36. Flere metoder har blitt brukt til å forsterke DNA-et som produseres fra mikrodesisseksjon. DOP-PCR, en teknikk som er nyttig for forsterkning av svært repeterende sekvenser, har blitt brukt til å forsterke mikrodisserte kromosomer fra arter, inkludert gresshopper 37, spiny ål 38og Nile tilapia 39. Mer nylig har det PCR-baserte GenomePlex WGA4 Single Cell-settet og multippel forskyvningsforsterkningsbasert (MDA) Repli-G Single Cell kit blitt verdifulle verktøy for eksperimenter som involverer genetisk analyse av enkeltmenneskeceller samt kromosomer40-42, inkludert B-kromosomsystemene i gresshopper 37 og gresshopper 43. Disse to settene har hver fordeler og ulemper, men deres tilsynelatende overlegenhet over andre tilgjengelige forsterkningssystemer har blitt demonstrert 44.
Mengden DNA som kan fås fra et enkelt kromosom eller et kromosomsegment er betydelig mindre enn for en hel kjerne. Derfor er mikrodeseksjon, forsterkning og etterfølgende analyse av et enkelt kromosom langt mer utfordrende, spesielt i organismer med små genomer som i Drosophila eller Anopheles. Selv om maling er utviklet fra enkelt mikrodisserte kromosomer av et menneske 33 og en veps 45, krevde et vellykket FISH-eksperiment flere (minst 10-15) mikrodisserte mitotiske kromosomer av en fruktflue 11. Imidlertid vil evnen til å mikrodissektere og forsterke et enkelt kromosom være viktig for (i) å redusere sjansen for forurensning med materiale fra et annet kromosom, (ii) minimere antall kromosomale preparater som trengs for mikrodisseksjon, (iii) senke nukleotid og strukturell polymorfisme av den mikrodissifiserte prøven i både FISK og sekvensering av nedstrømsapplikasjoner. Polytene kromosomer som finnes i mange dipteranske arter gir en unik mulighet til å skaffe seg en mye høyere startmengde av DNA. De gir også en høyere oppløsning og kromosomstruktur som ikke kan oppnås ved bruk av mitotiske kromosomer. Denne ekstra oppløsningen kan være avgjørende for å visualisere kromosomale omorganiseringer, kromatinstruktur og kromosomale segmenter som skal mikrodisserte 28,46.
Her presenterer vi en prosedyre for effektivt å isolere et eukromatisk segment fra en enkelt polytenkromosomarm, forsterke DNA og bruke det i nedstrøms FISKEapplikasjoner i malaria mygg. Først bruker vi LCM for å isolere og trekke ut en enkelt kromosomarm fra spesiallagde membransklier. For det andre brukes WGA til å forsterke DNA-et fra det mikrodisserte materialet. For det tredje hybridiserer vi det forsterkede DNA-et i FISH-eksperimenter til polytene squashpreparater 47, metafase og interfasekromosom lysbilder 48, samt 3D ovarial hele monteringsprøver. Denne prosedyren er gjort for å kunne male et flertall av eukromatin i kromosomale armer av An. gambiae.
Det er flere trinn som er avgjørende for å lykkes med å forsterke DNA fra mikrodisserte polytenkromosomprøver. Protokollen benytter bruk av LCM, en metode som både øker den generelle effektiviteten og reduserer eksponeringen for utenlandsk DNA ved å fjerne samspillet mellom fysiske verktøy og prøven. Forsterkning av utenlandsk DNA er imidlertid fortsatt den største potensielle fallgruven i dette eksperimentet. Under hele prosessen er det derfor viktig å holde prøvene beskyttet mot forurensning. Gjennom glideforberedelses- og mikrodesisseksjonsfasene er det viktig å vaske disseksjonsnåler, lysbilder, dekselslipper, samt arbeidsområdet. Det anbefales også å UV behandle alt gjeldende utstyr (nåler, sklier, deksler) før bruk.
Membranen på disseksjonsskredene gjør spredning av kromosomene svært vanskelig. Det er viktig å bruke mer av eggstokken (halvparten til et helt par eggstokkene) når du lager disse lysbildene, for å gi større sjanse for å finne en godt spredt kjerne. Det anbefales også å bruke friskt vev når du lager lysbilder, da forsterkningsgraden ser ut til å falle etter hvert som vev i alderen 49 og kromosomspredning blir mer utfordrende. Utarbeidelsen av lysbilder for mikrodisseksjon er det mest tidkrevende trinnet i denne protokollen. Kromosomer må være godt spredt for å unngå utilsiktet oppkjøp av uønsket materiale. Giemsa farging gjør det mulig for brukeren å sjekke spredningskvaliteten med et fasekontrastmikroskop før bruk av mikrodeseksjonssystemet.
Kombinasjonen av mikrodisseksjon og forsterkning gir mulighet til å trekke ut og analysere kromosomale fragmenter som varierer i størrelse fra små interesseregioner til et flertall av armene. Denne protokollen gjør det mulig for brukeren å få DNA fra morfologisk forskjellige regioner som inversjoner, spesifikke eukromatiske bånd og interbands, telomerisk, sentromerisk og interkalær heterochromatin. Brukeren kan bruke de genererte malingssondene til å undersøke avvikende kromosomer, studere inter-arter homologi på bestemt loci, eller karakterisere romlig organisering av kromosomer i en intakt 3D-kjerne. For å utvikle kromosommaling valgte vi eukromatiske segmenter for å unngå hybridisering av repeterende DNA med flere kromosomale regioner. Som et resultat fikk vi arm-spesifikt maleri uten å bruke en konkurrent, som totalt genomisk DNA eller C0t-1 DNA-fraksjon.
Vi valgte å bruke GenomePlex WGA- og REPLI-G-settene basert på vurderinger som sammenlignet effektiviteten og frafallshastigheten til flere forsterkningssett 40,44. Begge settene presterte best blant de tilgjengelige metodene i begge frafallsfrekvensen (GenomePlex hadde en rate på 12,5% sammenlignet med REPLI-gs 37,5%) og prosentandel av forsterkede markører (GenomePlex hadde en forsterkningshastighet på 45,24 % sammenlignet med REPLI-gs 30,0 %) 40. GenomePlex-settet ga også en høyere mengde DNA, og gjorde det dermed til en bedre kandidat for flere nedstrømsteknikker. Et reforsterkningssett for GenomePlex-systemet er også tilgjengelig, noe som muliggjør ytterligere forsterkning av DNA. Det er imidlertid viktig å merke seg at forsterkning ikke er perfekt. Muligheten er fortsatt at vellykket forsterkning kan introdusere feil eller ha en skjevhet mot spesifikk loci i målet DNA. Det er viktig å vurdere den endelige fragmentstørrelsen på de tilgjengelige genomforsterkningsmetodene. GenomePlex fragmentering resulterer i et bibliotek med fragmenter fra 200-500 bp, mens REPLI-g-settet produserer fragmenter omtrent 10-20 kb i størrelse. Den tiltenkte nedstrøms anvendelsen av denne protokollen er FISH, noe som gjør GenomePlex-settet til et mer gjennomførbart alternativ, da det ga ønsket fragmentstørrelse og muligheten til å merke DNA-fragmenter direkte gjennom WGA. Lange DNA-molekyler produsert av REPLI-g-forsterkningen må fragmenteres i nedstrøms nick-oversettelsesmerkingsreaksjon.
Denne protokollen er tilpasset for å forsterke DNA fra en enkelt polytenkromosomarm. Andre protokoller krever gruppering av mange (vanligvis 10-30) kromosomfragmenter for å kunne forsterke prøven 7,11,28,40. Selv om sammenslåing av flere kromosomer er mulig ved hjelp av vår metode, understreker den økte sannsynligheten for prøveforurensning viktigheten av å starte eksperimentet med så få kromosomer som mulig. Hvis polytene kromosomer ikke er tilgjengelige, kan vår protokoll tilpasses for bruk i mititotiske kromosomer. Det kan imidlertid være nødvendig å samle 10-15 mitotiske kromosomer før forsterkning for vellykket FISH 11. Forsterkningsbias er lavere med høye mengder startmal DNA 50. Polytene kromosomer gir omtrent 512 kopier av en enkelt DNA-sekvens og 1024 kopier av to homologe DNA-sekvenser. Dermed vil sammenslåing av mititotiske kromosomer bidra til å øke den generelle kvaliteten på DNA-produktet etter forsterkning.
Denne prosedyren har mange potensielle bruksområder i cytogenetiske og genomiske studier. Her brukte vi kromosommaling for å etablere korrespondansen mellom eukromatiske segmenter av polytene og mititotiske kromosomarmer i An. gambiae. De samme malesondene kan brukes på cytogenetisk karakterisering av An. gambiske cellelinjer. Omfattende genomiske omorganiseringer og endringer i kromosomtall er vanlige trekk ved cellelinjene 51,52. Aneuploidy, polyploidy og kromosomale omorganiseringer som translokasjoner, inversjoner, slettinger og ringkromosomer har blitt oppdaget i forskjellige myggcellelinjer 53,54. Klassiske cytogenetiske observasjoner 55 og fysisk kartlegging 56 har vist forekomsten av helarms kromosomale translokasjoner i utviklingen av malaria mygg. Derfor kan mikro uoppdaget materiale brukes sammen med FISH-eksperimenter for å sammenligne homologi av kromosomale regioner mellom arter. Vi utførte vellykket 3D FISH med 2R-maleri sonde på polytene kromosomer i hele mount ovarie sykepleierceller. Denne metoden vil lette sporing av kromosombaner og studere atomarkitekturen i Anopheles. Teknikker som DNA genotyping 57,58, neste generasjons genomsekvensering 26,27, fysisk og linkage kartutvikling, og generering av sonder for kromosommaling 33,59 alle kan dra nytte av arm- og regionspesifikk mikrodesinfeksjon. Ved å kombinere LCM-teknologi og fremme encellet WGA, demonstrerer vi en effektiv, praktisk metode for å produsere rimelige mengder DNA fra en enkelt polyfinkromosomarm.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av stipendet fra National Institutes of Health 1R21AI094289 til Igor V. Sharakhov
Acetic acid | Fisher Scientific | A491-212 | |
Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
Propionic acid | Sigma-Aldrich | 402907 | |
Membrane slides 1.0 PET | Zeiss | 415190-9051-000 | |
Buffer tablets “GURR” | Life Technologies | 10582-013 | |
KaryoMAX Giemsa Stain | Life Technologies | 10092-013 | |
ThermoBrite Slide Denaturation/Hybridization System | Abbott Molecular | 30-144110 | |
Vacufuge vacuum concentrator | Eppendorf | 22820001 | |
Spectroline Microprocessor-Controlled UV Crosslinker XL-1000 | Fisher Scientific | 11-992-89 | |
Thermo Scientific NanoDrop | Fisher Scientific | ND-2000 | |
REPLI-g Single Cell Kit | Qiagen | 150343 | |
GenomePlex Single Cell Kit (WGA4) | Sigma-Aldrich | WGA4-10RXN | |
GenomePlex WGA Reamplification Kit (WGA3) | Sigma-Aldrich | WGA3-50RXN | |
MZ6 Leica stereomicroscope | Leica | VA-OM-E194-354 | A different stereomicroscope can be used |
Olympus CX41 Phase Microscope | Olympus | CX41RF-5 | A different phase microscope can be used |
PALM MicroBeam Laser Microdissection Microscope | Zeiss | ||
Thermomixer | Eppendorf | 22670000 | |
10x PBS | Invitrogen | P5493 | |
50x Denhardt’s solution | Sigma-Aldrich | D2532 | |
99% Formamide | Fisher Scientific | BP227500 | |
Dextran sulfate sodium salt | Sigma | D8906 | |
20x SSC buffer | Invitrogen | AM9765 | |
ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Fermentas | R0141, R0151, R0161, R0171 | |
Cy3-dUTP, Cy5-dUTP | GE Healthcare | PA53022, PA55022 | |
BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | |
DNA polymerase I | Fermentas | EP0041 | |
DNase I | Fermentas | EN0521 | |
Spermine | Sigma-Aldrich | S3256-1G | |
Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-1G | |
Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP3581 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E0396-25G | |
PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-25G | |
EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | |
Triton-X100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
AdhesiveCap 500 clear | Zeiss | 415190-9211-000 | |
QIAamp DNA Micro Kit (50) | Qiagen | 56304 | |
Genomic DNA Clean and Concentrator Kit | Zymo Research | D4010 | |
37% Paraformaldehyde | Fisher Scientific | F79-500 |