Summary
不凍タンパク質(AFP)は、氷の特定の平面に結合して、氷の成長を防ぐか、または遅くします。蛍光ベースの氷面親和性(FIPA)分析は、AFP結合した氷面の決定のためのオリジナルの氷エッチング法の改変である。AFPは蛍光標識され、巨視的な単氷結晶に組み込まれ、UV光下で可視化されます。
Abstract
不凍タンパク質(AFP)は、内部の氷の成長を防ぐか、または遅くするために、様々な冷たい硬い生物で発現されています。AFPは、氷結合表面を通して特定の氷の平面に結合する。蛍光ベースの氷面アフィニティー(FIPA)解析は、AfPが結合する氷面を決定するために使用される修正技術です。FIPAは、AFP結合の氷面を決定するための元の氷エッチング方法に基づいています。それは短い実験の時間でより明確なイメージを作り出す。FIPA分析では、AfPSはキメラタグまたは共有色素で蛍光標識され、その後ゆっくりと巨視的な単氷結晶に組み込まれ、半球に予知され 、a軸 と c軸を決定するように配向されています。AFPバウンド氷半球はUV光の下で画像化され、非特異光を遮断するフィルターを使用してAFPバウンド平面を視覚化する。AfPsの蛍光標識により、AFPの氷への吸着をリアルタイムに監視できます。ラベルは、AMP がバインドする平面に影響を与えないことが判明しました。FIPA分析では、同じ単氷結晶上で複数の異なるタグ付きAFPを結合し、結合面を区別するオプションも導入されています。FIPAのこれらのアプリケーションは、AAFPがその成長を止めるために氷に結合する方法と、多くのAFP生産生物が複数のAFPアイソフォームを発現する理由についての理解を深めるのに役立っています。
Introduction
不凍タンパク質(AMP)の生産は、氷を含んだ環境に生息する一部の生物の重要な生存メカニズムです。最近まで、AMPの唯一の機能は、循環を妨げ、組織損傷、浸透ストレスを引き起こす内部氷結晶の成長を予防または遅くすることであると考えられていた。魚のようないかなる程度の凍結を許容できない生物は、氷晶成長を完全に阻害するAMPを発現する1。草などの他の人は、凍結耐性であり、それらの組織中の大きな氷の結晶の形成を減少させる氷再結晶を阻害するAMPを発現する2。低温での膜の安定化は、AfPS3に対して提案されたもう一つの機能です。最近、氷に覆われた汽水湖4から南極細菌マリノモナスプリモレンシスのAFPに新しい役割が示唆された。このAFPは、酸素と栄養素へのより良いアクセスのために細菌を氷に付着すると考えられているはるかに大きなアフェシンタンパク質5の一部である6。他の微生物は、彼らが住んでいる氷の構造を変更する可能性があるAMPを分泌することが知られています7.
AMPは、いくつかの魚、昆虫、植物、藻類、細菌、珪藻類、および真菌で発見されています。彼らは様々な機会に異なる前駆者からの進化と一致する著しく発散的な配列と構造を有する。しかし、それらはすべて氷に結合し、吸着阻害メカニズム8によってその成長を阻害する。AfP はそれぞれ、氷結合部位(IBS)として機能する特定のサーフェスを持っています。これらは、典型的には、9-11の表面残基の部位特異的突然変異誘発によって同定された。IBSは、氷の特定の平面に一致する氷のようなパターンで水分子を配置するために仮説されています。したがって、AFPは5,12に結合する前にリガンドを形成する。氷面はミラーインデックスによって定義することができ、異なるAMPは異なる平面に結合することができます。したがって、冬のヒラメからのタイプI AFPは20-21錐形の平面13に結合し、III型AFPは複合氷結合表面11,14を使用して一次プリズムとピラミッド面の両方を結合し、スプルース・ブドワームAFPは多動性AFPである一次面と基礎面15,16の両方に同時に結合する。 MPAFPなどの他の多動性AfPは、単一の氷結晶半球5,17の完全なカバレッジによって示されるように、複数の氷面に結合する。これは、多動性AMPが基底面を結合する能力と他の平面が、適度に活動的なAMP18に対する10倍の高い活性を占める可能性があると仮定されている。多動性AMPの効率は十分に文書化されていますが、複数の氷面に結合する能力はまだ理解されていません。
AFPに結合した氷面を決定するための元の方法は、チャールズナイト13,19によって開発されました。この方法では、マクロ的な単一の氷の結晶を中空の金属棒(冷指)に取り付け、脱気水で満たされた半球カップに水没させることによって半球に形成される。その後、半球はAFPsの希薄溶液に沈め、氷の層はAFP溶液から氷結晶半球に数時間にわたって成長し、冷たい指を循環するエチレングリコールの温度によって制御される。氷の結晶を溶液から取り出し、冷たい指から取り外し、-10〜-15°Cの冷凍室に入れた。表面を鋭い刃で削り取って不凍タンパク質溶液の凍結表面膜を除去し、氷晶を少なくとも3時間昇華させた。昇華後、AFPによって結合された氷面は、残留タンパク質に由来する白色のエッチングパターンと見なすことができる。氷半球は、そのc軸と-軸に向けて、氷の基底面およびプリズム平面を見つけ、エッチングされたパッチのミラー指数を決定することができます。
ここでは、AFP結合した氷の平面を決定するための元の方法の改変について述べているが、我々は蛍光ベースの氷面親和性(FIPA)11と呼ぶ方法である。このAFPは、緑色蛍光タンパク質(GFP)11、16、17、20などのキメラタグで蛍光標識されるか、またはAFP5,21に共有結合した蛍光色素を有する。蛍光標識されたAFPは、単一の氷結晶に吸着され、元の氷エッチング実験と同じ実験手順を使用して生い茂る。成長する氷半球に対するAFP結合の程度は、紫外線(UV)ランプを使用して実験全体を通して監視することができる。実験が完了した後、半球は冷たい指から直接取り除かれ、昇華することなく画像化することができます。しかし、必要に応じて、半球を昇合したままにして、伝統的な氷のエッチングを視覚化することができます。FIPAの方法論に導入された変更は、従来の氷エッチングプロトコルを数時間短縮する。さらに、それぞれ異なる蛍光標識を持つ複数のAfPsを同時にイメージングして、AFP結合した氷面の重複するパターンを視覚化する可能性があります。
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Protocol
1. 単一の氷の結晶を成長
- エチレングリコール冷却浴に収まり、浮遊できるきれいな金属鍋(直径15cm、高さ4.5cm)を取ります。
- ポリ塩化ビニル(PVC)円筒形金型(直径4.5cm、高さ3〜4cm、厚さ4mm)をパイプから鋸で準備します。
- 片方(図1A)のノッチ(幅1mm、高さ2mm)を切ります。
- 鍋に快適に収まる金型を多く準備します(図1B)。
注: 研究は、ポリビニルアルコール(PVA)が氷の核化22に影響を与えることができることを示しました。しかし、私たちのオープンモールドPVCシステムでは、非定型の氷形成の問題に遭遇していません。
- 各金型の底面リングに真空グリースの光フィルムを塗布し、ノッチを切り取った表面です。このグリースを塗ったノッチサーフェスを、フライパンの中央から離れた位置に向けたノッチを持つ金属鍋にシールします。油を塗ったり、グリスでノッチを妨げないように注意してください。
- 0.22 μmを濾過・脱気/脱イオン水を鍋の中心に加え、金型の外側に加え、ノッチを通してゆっくりと金型に入るようにします。気泡を導入しないように注意してください。水層は約5mmの深さでなければなりません。
- 鍋を温度制御エチレングリコール浴槽に入れ、-0.5°Cに冷却します。 鍋は完全にレベルでなければなりません。必要に応じて、鍋の側面にバラストウェイトを追加します。
- 鍋と水が-0.5 °Cに達した後、鍋の真ん中に小さな氷を、型の外側に加えます。
- これは鍋を横切って型に過冷却水の氷の成長を有核します。各金型の底部にある小さなノッチは、1つの氷の結晶だけが伝播し、各金型に単一の氷の結晶をもたらします。
- 一晩インキュベートして氷の層を形成する。
- 次の3日間で、1日1回、各金型に4°C脱気/脱イオン水の13mlを加え、1日目に-0.8°C、2日目に-1.1°C、3日目に-1.5°Cに添加した後、エチレングリコール浴の温度を低下させます。
- これらの温度で一晩インキュベートします。
- 4日目までに、金型は完全に氷で満たされるべきです。
- 鍋から金型を引き出し、氷の結晶を金型から押し出し、計量ボートなどのきれいな表面に約1時間-20°Cの冷凍庫で保管してから取り扱います。
- 多くの小さな単氷結晶を調製するのではなく、数リットルの体積の大きな単一氷結晶を、ナイト23で説明したように一定温度インキュベーターで調製することができる。大きな氷の結晶は、-15〜-20°Cの冷凍庫で覆われておけば1年以上保存することができます。単結晶の一部は、必要に応じて鋸で氷ブロックから切断することができます。
2. 氷結晶の特異点と配向の決定
- 金型から排出された氷が、2つの交差したポラロイドの間のフリーザールームで観察することによって単結晶であるかどうかを判断する(図1D)。
- 氷の結晶が単一の場合、亀裂や不連続性は見られないので、氷の結晶の中で光の方向が変化してはいけません。
注: 冷凍室が利用できない場合は、必要なすべての手順で冷たい部屋を使用することができ、迅速に作業し、氷を控えめに扱う際に注意が必要です。
- 氷の結晶が単一の場合、亀裂や不連続性は見られないので、氷の結晶の中で光の方向が変化してはいけません。
- 氷の複屈折のために 、c軸の向きを同時に決定することがあります。次の情報を使用して、向きを決定します。
- c軸が入射光と正確に平行である場合、理論的には、交差したポラロイドを通過する光はありません。入射光がc軸と平行からわずかにタイトルが付けられている場合、交差したポラロイド間で回転すると、均一な多色スペクトルの光が結晶を透過します。この均一な透過率は、そのc軸24に沿った氷Ihの光学的不活性から生じる。氷の結晶の基底面は、c軸に垂直である。
- c軸が入射光と平行から離れ、氷の結晶が交差したポラロイド間で回転すると、透過光は結晶の90°回転ごとに0-100%の透過率の間で交互になります。
- 最も一般的には 、c軸は円筒状の氷の結晶の円形平面に垂直になります。
- 氷の結晶をアルミニウム箔でしっかりと包み、小さな穴をホイルを通して基底面の氷に突き刺し(c軸に垂直)、20分間真空下に置くことによって行われる氷の穴25によって軸の向きを決定する。
- この処理は、基底面に六角形対称のエッチングを生成し、-axesが6面の星の頂点を通って走る(図2A)。
- 必要であれば、氷結晶は、それぞれ冷たい指に垂直な一次または二次プリズム面とそれを取り付けるために六角形の一方の側に平行または垂直の鋸で切断することができる(図3)。
3. 蛍光標識不凍タンパク質の単一氷結晶への吸着
- 冷たい指 (図1C)に、最初にキャビティを結晶の上部にボーリングして、単一の氷の結晶を取り付けます。これを行うには、わずかに異なる直径の2つのアルミニウム棒で氷を交互に融解し、冷たい指の直径に似ているが、冷たい指が合うことができる空洞を形成する。
- 冷たい指を-0.5°Cに冷却し、氷の空洞に入れ、氷の結晶が金属に凍るまで所定の位置に保持します(図2B)。水晶を指に取り付ける際は、指からロッドへの熱の効率的な伝達を妨げるため、気泡を避けてください。
- 氷晶の直径の約2倍の半球状のカップを、濾過された脱イオン水または緩衝液で満たし、約4°Cに冷却する。 冷たい指に結合した氷の結晶をカップに浸し、氷の結晶の上部が液体層とほぼ同じレベルで、氷がカップの壁に触れていないような余分な水または緩衝液を取り除きます。
- カップを断熱材で覆い、温度を-5 °Cに下げます。
- 氷の結晶が半球になるまで約1時間待ち、約20分ごとにその状態を確認します(図2C)。
- 氷は氷の結晶を溶かして成長させることによって半球形のカップの形を取りますが、カップの壁に触れて成長してはいけません。壁と半球の間に少なくとも1cmの隙間があり、冷たい指が氷から突き出てはいけない。
- 氷の結晶からカップを取り出し、蛍光タンパク質溶液を25〜30mlの最終体積と所望の分析濃度に加え、カップ中の全液量を変えない所見に注意してください。典型的な AFP 濃度は 0.1 mg/ml です。
- 氷の結晶の上部が液体と同じレベルにあり、氷の結晶がカップの壁に触れていないように、カップに氷の結晶を再結合します(図2D)。
- 冷たい指の温度を-8°Cに落とし、タンパク質溶液を氷晶中に2〜3時間凍結させ、溶液を頻繁に攪拌する。タンパク質溶液から形成された氷は、氷の成長を止める前に少なくとも5mmでなければなりません。
- 冷たい指に取り付けながら、カップから氷の結晶を取り除きます。冷たい指を通して冷媒を0°Cのすぐ上に温めて後者から氷を取り外し、氷の結晶が溶けるまで待ちます。
- 水晶平らな面を計量皿などのきれいな表面に下ろし、新たに氷を形成しないように注意し、手渡す前に少なくとも20分間-20°Cで保存してください。
4. 不凍タンパク質結合氷の平面の可視化
- 蛍光の可視化は、暗くなった冷凍庫または冷たい部屋で行われ、氷結晶を波長特異的な励起フィルタ付きランプの下に置き、蛍光標識とカメラエミッションフィルタを励起して他の非特異的光を遮断する。パターンに基づいて、AMP によって結合された氷面を推定することができます(図4)。
- 波長固有のライトが使用できない場合は、代わりに UV ライト ボックスを使用できます。
- 従来の氷のエッチングは、氷半球が-20°Cで少なくとも3時間昇華するようにすることで、氷表面に残留タンパク質粉末が見えるようにすることによっても行うことができる(図5)。
- ステップ 2.3 を繰り返して、完成した氷半球の -軸の方向を決定できます。
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Representative Results
単一の氷の結晶の準備および取付けは、エラーが最も一般的に行われるFIPA手順の2つのステップである。プロトコルセクションのステップ2.1で概説したように、調製された氷結晶が単一であるかどうかを調べることによって、交差したポラロイド(図1D)を調べることによって決定する。多結晶性の氷結晶がFIPA分析に使用される場合、結果は、コヒーレント結合パターンなしで半球上のAfPSの不連続結合となります (図6B)。氷の結晶インターフェースが、AFPが最終的な結果を結合する氷面の周りに配置されている場合、解釈できない可能性があります。このため、氷の結晶は、次のステップに進む前に、特異性を慎重にチェックする必要があります。FIPA分析のために単氷結晶を有する確率を高めるために、同時にいくつか作るべきである。
もう一つの一般的なエラーは、マウント中にクリスタルの顔を冷たい指に正しく合わせなくてすみます。冷たい指に垂直な一次または二次のプリズム面を取り付けるには、プロトコルセクションのステップ2.3で概説したように、単一の氷の結晶は、まず氷の穴によって配向し、次に星形のエッチングの向き(図2Aおよび3)に基づいて切断されなければならない。氷の結晶が取り付けられずれ場合、最終的な結果は、半球の赤道が氷面の対称性と一致しない半球を生成します(図6C)。これは解釈可能な結果ですが、半球の最大円周が赤道にあるため、正しく整列した氷の結晶よりも有益ではありません(図4)。
図 1.単一の氷の結晶を成長させ、取り付けるための装置。)PVC金型。 B)PVCモールド付きエチレングリコール浴中のパン。 C)白矢印で示したエチレングリコールの流れを有する冷指。白い破線は冷たい指の内壁を示します。 D)単一の氷結晶を配向するための交差したポラロイドの図。光源は黄色で、交差したポラロイドは灰色で、単一の氷の結晶は白です。ポラロイド(灰色の矢印)と氷結晶の向き(赤い矢印)の向きが示されています。左から右に氷の結晶は 、c-軸が底ポラロイドに対して垂直、下のポラロイドに45°、入射光に平行になるように配向されます。交差したポラロイドと氷を通過する光は、氷の結晶の向きに応じて、上部ポラロイドを通して暗い、明るい、またはかすかに多色に見えます。 ここをクリックすると、より大きな画像を表示できます。
図 2.FIPA用の氷の結晶を準備しています。A) 六角形対称の氷のエッチングによる軸の方向を決定する。結晶の基底面は、ページの平面に平行です。 B)冷たい指に単氷結晶を取り付ける。 C)半球に形成した後の氷。 D)氷半球はタンパク質溶液で満たされた半球カップに沈んだ。 ここをクリックすると、より大きな画像を表示できます。
図 3.配向に基づいて氷の結晶を取り付けます。A)(i)基底面、(ii)原始プリズム平面、および(iii)冷たい指に垂直な二次プリズム面を有する氷を取り付ける図。向き(ii)と(iii)の場合、氷の結晶は図に示すように半分に切らなければなりません。 B)太平洋青色標識型III nfeAFP8のFIPA結果は、(i)基底面と(ii)冷たい指に垂直な一次プリズム面を有する氷の結晶を取り付けた後である。 ここをクリックすると、より大きな画像を表示できます。
図 4.FIPA 解析結果からの AFP バインド平面の解釈。A) Ih氷の結合された平面の表現;B)は、単一の氷の結晶が冷たい指に垂直な一次プリズム面で取り付けられる場合の対応するFIPA分析結果である。パネルは、(i)基底面平面、(ii)プライマリプリズム平面、(iii)二次プリズム平面、(iv)軸に整列されたピラミッド面、および(v)角錐面を-軸にオフセットして表します。C)錐面を結合するAMPの溶液で成長した単一の氷結晶の形態は、-axesとii)軸からオフセットされた-axesに整列する。ここをクリックすると、より大きな画像を表示できます。
図 5.伝統的な氷のエッチングとFIPAの比較。A)(i) 冬のヒラメ(シュードプラメネクテス・アメリカヌス)によって生成されたI型AFP(HPLC6アイソフォーム)の伝統的なエッチングは、もともとKnightらら(1991)によって生成されたように示されている。(ii) TRITCで標識された同じタンパク質の対応するFIPA分析。B)(i)IVS変異体の伝統的なエッチング(V9Q/V19L/G20V/I41V)のIII型nfeAFP11(日本ウナギパウト・ゾアルセス・エロンガトゥスナーから)21。(ii) TRITCで標識された同じタンパク質の対応するFIPA分析。ここをクリックすると、より大きな画像を表示できます。
図 6.共通の FIPA 解析エラーから生じる半球。 GFP タグ付き III HPLC12-A16H に対して分析を行った。 A) 比較に最適な FIPA 結果。氷の結晶は冷たい指に垂直なその主要なプリズム平面と取り付けられました。 B)複数の結晶からなる氷半球を用いて誤って行ったFIPA解析。 C)不整列単氷結晶に対して行われたFIPA分析。二次プリズム面は冷たい指に対して正確に垂直に取り付けられていた。 ここをクリックすると、より大きな画像を表示できます。
図 7.FIPA 解析を使用して異なる AMP の氷結合パターンを比較する。 太平洋ブルーラベルタイプIII nfeAFP8をTRITCラベル付きタイプI AFPと組み合わせ、FIPA分析を1回行った。 A) タイプ III nfeAFP8 のみの視覚化。 B)タイプ I AFP のみの視覚化。 C)タイプ III nfeAFP8 とタイプ I AFP の視覚化を一緒に行う。 ここをクリックすると、より大きな画像を表示できます。
図 8.中程度のアクティブおよび多動性のAfPのFIPA。A)3つの異なる適度に活性な魚のAMPのFIPA分析;(i) TRITCラベル付きタイプI AFP(HPLC6アイソフォーム、シュードプリユーロネクテス・アメリカヌス)、(ii)TRITCラベル付きタイプII AFP(Ca2+独立アイソフォーム、ロングスノーポーチャー)、(iii)パシフィックブルーラベルタイプIII AFP(nfeAFP8アイソフォーム、ゾアルセ・エロンガトゥスクチャク)。B)3つの異なる多動性AMPのFIPA分析;(i) GFP タグ付きMpAFP_RIV (マリノモナス プリモリエンシス), (ii) TRITC ラベル sbwAFP (チョリトマヌラ フミフェラナ), (iii) GFP タグ付きTmAFP (テネブリオモリター).すべてのイメージにおいて、c-軸はページの平面に対して垂直です。ここをクリックすると、より大きな画像を表示できます。
図 9.FIPA解析によって生成された蛍光パターンと、異なるタイプIII AFPアイソフォームおよび変異体の氷結晶形態との関係11,21.A)(i) GFP タグ付き QAE-A16H の FIPA 分析。(ii) QAE-A16Hにより生成された氷結晶形態 B) (i) TRITC ラベル nfeAFP11-V9Q の FIPA 分析。(ii) nfeAFP11-V9Qによって生成された氷結晶形態C)(i) TRITC標識野生型 nfeAFP11 の FIPA 分析.(ii) 野生型nfeAFP11によって生成される氷結晶形態 D)(i) TRITC標識野生型 nfeAFP6 の FIPA 分析(ii) 野生型nfeAFP6によって生成される氷結晶形態C軸方向とスケールバーは、示されているとおりです。 ここをクリックすると、より大きな画像を表示できます。
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Discussion
AFP結合した氷面の決定のためのチャールズ・ナイトによる氷エッチング法の開発は、AfPによる氷結合のメカニズムに関する研究を大幅に進めた。AMPの構造はX線結晶学26,27 によって解決できるのに対し、AFPが結合した氷上の相補表面を推測する明白な方法はなかった。冬ヒラメからのタイプI AFPが最初に特徴づけられたとき、それは氷28の主要プリズム面に結合すると仮定された。しかし、ナイトのI型AFPの画期的な氷エッチング実験は、彼らが氷13のピラミッド面に結合することを示した。この結果は、AFPの研究コミュニティにAFPアイスバインディングのメカニズムを再考させ、AMP9の氷結合面をより正確に決定することを刺激した。ナイトのオリジナルの氷エッチング実験は、AFP生産生物から精製されたネイティブのAMPを使用して行われました。組換え AMP の開発と GFP タグの使用の増加に伴い、これらの研究を他の多くの AMP29に拡大する機会がありました。
テトラメチルローダミン-5(および6)-イソチオシアネート(TRITC)などの共有蛍光タンパク質色素を分析に組み込むという考えは、GFP融合AFP FIPA分析11の成功後に生まれた。キメラ蛍光タンパク質タグおよび共有色素による化学修飾は、AfPSの氷結合パターンに影響を与えないと観察されている(図5)。前者では、GFP は、多くの場合、IBS から除去される、AMP の N または C- 端末端に融合されます。また、GFPとAFPの間に柔軟なリンカーを挿入して、タグを氷面から押し出すことができます。後者の標識戦略では、共有化染料と反応する荷電側鎖は、通常、IBSから離れた表面上にあります。ここで示すAMPの蛍光標識に関する戦略が機能しない場合、チオール反応性染料と反応するためにIBSから離れたシステインの導入は、別の選択肢30である。熱ヒステリシス活性や氷結晶形態によって判断されるように、蛍光標識がAFPの氷結合に影響を与えないようにするための措置を講じることで、FIPA分析は、元の氷エッチング法のようにAFPの氷結合パターンの真の表現を示していると確信しています。
FIPA分析のためにAfPSを蛍光的に標識することにはいくつかの利点があります。AFP行きの飛行機の視覚化のための氷の昇華は必要ないので、手順に必要な時間が短くなります。半球への標識タンパク質の組み込みは、氷の成長中に監視して実験完了を評価することができ、AFP結合パターンは任意の時点で記録することができる。これは不必要に長い実験、または氷の成長の早期完了を防ぐ。蛍光標識により、I型とIII型AMPに適用される両方の方法の結果の比較に見られるように、エッチングで以前に可能なAFP結合パターンの可視化が可能になります (図5)。しかし、ポストFIPA氷エッチングは、半球を数時間冷凍庫に入れることで簡単に行うことができるので、両方の方法で同様のAFP濃度が必要であるため、両方の分析を同じサンプルで行うことができます。FIPA の利点は、同じ氷半球上で複数の異なるラベル付き AFP を視覚化できることです (図 7)。これは、異なる AFP タイプ、アイソフォーム、およびアクティビティ変異体で見られる AFP 氷結合平面の違いを示すのに役立ちます。
FIPA分析は、すでにいくつかのAFP研究で使用されています。基礎面結合は多動性のAfPに特有であり、その高活性18に必要であるという仮説を支持するために使用されてきた。中程度活性なAfPは基底面を結合しないことが判明した(図8A)が、多くの多動性AMPは氷の基礎面を含む氷半球を完全に覆っている(図8B)5,20,31。FIPA解析は、特定の氷結合残渣の機能を研究するためにも使用されています。例えば、FIPA解析は、いくつかのIII型アイソフォームおよび変異体について行われ、そのうちのいくつかは氷の成長を妨げ、そのうちのいくつかは氷11、21、32のみを形成することが判明した。研究から、特定の残留物は、氷面の特異性において重要であるAMPの中にAfPsを組み込む上で重要であることがわかった(図9)。
単一氷結晶上のAFP結合パターンを研究する他の方法としては、蛍光顕微鏡16,33 およびマイクロ流体解析34による直接観察が挙げられる。これらの方法は、AFPの氷への付着のダイナミックさに対する感受性と、AFPの氷への親和性を持つ氷形成の類似性の監視の利点を有するが、氷面への親和性を決定する際のFIPA法と比較して、あまり堅牢ではない。分子動力学は、AMP12,20,21,30,35の氷面結合特異性を予測するためにも使用されている。FIPA分析を用いて、他の利用可能な技術と共に、各AMPの氷面結合パターン、氷面を選択する際のIBSの組成の重要性、および特定の平面の結合がAFP活動にどのように関連しているかを学んでいます。
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Disclosures
利益相反は宣言されていません。
Acknowledgments
PLDは、カナダのプロテインエンジニアリング研究委員長を務めています。この研究は、カナダ保健研究所からPLDへの助成金によって資金提供されました。また、日本学術振興会(JSPS)(第23310171)と日本バイオ志向技術研究振興機構(BRAIN)の科学研究助成も支援しました。クリス・マーシャル博士とマイク・カイパー博士のFPAに先駆けての研究に感謝しています。また、津田栄博士が本研究の一部に施設を提供し、蛍光灯の励起フィルターや発光フィルターを設置してくれたローリー・グラハム博士にも感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NESLAB RTE Refrigerating Bath/Circulators | Thermo Scientific | RTE7 | |
| Ethylene glycol, Premixed Antifreeze/Coolant | Certified | 29-3037-0 | Common automotive antifreeze |
| Cold finger | not available | not available | Custom made with brass (9 cm long, 1.5 cm outer diameter) |
| Hemispherical cup | not available | not available | Custom made with resin (8 cm outer diameter, 6 cm inner diameter) |
| High Dual Output Lighting System | Lightools Research | LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX | Additional and custom excitation filters can be purchased from Lightools Research |
| Camera | Canon | EOS 50D | |
| Emission Filters | Lightools Research | LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG | Filter ring adapter may be required to fit filter onto camera lens |
References
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