Summary
Frostskyddsmedel (AFPs) binder till specifika isplan för att förhindra eller bromsa istillväxten. Fluorescensbaserad isplanstillhörighet (FIPA) analys är en modifiering av den ursprungliga is-etsningsmetoden för bestämning av AFP-bundna isplan. AFPs är fluorescerande märkta, införlivade i makroskopiska enstaka iskristaller och visualiserade under UV-ljus.
Abstract
Frostskyddsmedel (AFPs) uttrycks i en mängd kalla hårdföra organismer för att förhindra eller bromsa den inre istillväxten. AfPs binder till specifika isplan genom sina isbindande ytor. Fluorescensbaserad fipa-analys (Ice Plane Affinity) är en modifierad teknik som används för att bestämma de isplan som AFP:erna binder till. FIPA bygger på den ursprungliga isetsningsmetoden för att bestämma AFP-bundna isplan. Det ger tydligare bilder på kortare försökstid. I FIPA-analys är AFP fluorescerande märkta med en chimerisk tagg eller ett kovalent färgämne och införlivas sedan långsamt i en makroskopisk enda iskristall, som har förformats till ett halvklot och är orienterad för att bestämma a- och c- axlarna. Den AFP-bundna ishalvan avbildas under UV-ljus för att visualisera AFP-bundna plan med hjälp av filter för att blockera ospecificerat ljus. Fluorescerande märkning av AFPs möjliggör realtidsövervakning av AFP-adsorption i is. Etiketterna har visat sig inte påverka de plan som afp-adresser binder till. FIPA-analys introducerar också möjligheten att binda mer än en olikmärkt AFP på samma enda iskristall för att hjälpa till att skilja deras bindande plan åt. Dessa tillämpningar av FIPA bidrar till att öka vår förståelse för hur AFP binder till is för att stoppa dess tillväxt och varför många AFP-producerande organismer uttrycker flera AFP-isoformer.
Introduction
Produktionen av frostskyddsmedel (AFP) är en viktig överlevnadsmekanism hos vissa organismer som lever i isfyllda miljöer. Fram till nyligen trodde man att afps enda funktion var att förhindra eller bromsa tillväxten av inre iskristaller som skulle blockera cirkulationen, orsaka vävnadsskador och osmotisk stress. Organismer som inte tål någon grad av frysning, såsom fisk, uttrycker AFPs för att helt hämma iskristalltillväxt1. Andra, såsom gräs, är frystoleranta och uttrycker AFPs för att hämma isomkristallisering som minskar bildandet av stora iskristaller i derasvävnader 2. Stabilisering av membran vid låg temperatur är ännu en funktion som föreslogs för AFPs3. Nyligen föreslogs en ny roll för AFP av en antarktisk bakterie, Marinomonas primoryensis, från istäckta bräckta sjöar4. Denna AFP är en del av ett mycket större adhesinprotein5 som tros fästa bakterien på is för bättre tillgång till syre och näringsämnen6. Andra mikrober är kända för att utsöndra AFPs, vilket kan förändra strukturen hos den is där de bor7.
AFPs har hittats i vissa fiskar, insekter, växter, alger, bakterier, kiselalger och svampar. De har anmärkningsvärt olika sekvenser och strukturer som överensstämmer med deras utveckling från olika stamceller vid olika tillfällen; och ändå binder de alla till is och hämmar dess tillväxt genom adsorptionshämningsmekanismen8. AfPs har var och en en en specifik yta som fungerar som dess isbindningsställe (IBS). Dessa har vanligtvis identifierats genom platsstyrd mutagenes av ytrester9-11. IBS är hypotesen att ordna vattenmolekyler i ett isliknande mönster som matchar specifika isplan. Således bildar AFPen dess ligand, innan att binda till den5, 12. Isplan kan definieras av deras Miller-index, och olika AFP:er kan binda till olika plan. Således binder typ I AFP från vinterflounder till 20-21 pyramidplan13, typ III AFP binder både primära prisma- och pyramidalplan med hjälp av en sammansatt isbindningsyta11,14, medan granknoppmasken AFP, en hyperaktiv AFP, binder samtidigt till både de primära och basala planen15,16. Andra hyperaktiva AFPs, såsom MpAFP, binder till flera isplan som framgår av deras fullständiga täckning av englashalvor5,17. Det är hypotesen att hyperaktiva AFPs förmåga att binda basalplanet, liksom andra plan, kan stå för deras 10-faldiga högre aktivitet över måttligt aktiva AFPs18. Även om effektiviteten hos hyperaktiva AFPs är väl dokumenterad, är deras förmåga att binda till flera isplan fortfarande inte förstådd.
Den ursprungliga metoden för att bestämma de AFP-bundna isplanen utvecklades av Charles Knight13,19. I denna metod monteras en makroskopisk enda iskristall på en ihålig metallstav (kallt finger) och bildas till ett halvklot genom att nedsänka den till en halvklotformad kopp fylld med avgasat vatten. Sedan är halvklotet nedsänkt i en utspädd lösning av AFPs och ett lager is odlas från AFP-lösningen på iskristallhalvan under flera timmar som styrs av temperaturen på etylenglykol som cirkulerar genom det kalla fingret. Iskristallen avlägsnas från lösningen, lossnar från det kalla fingret och placeras i ett -10 till -15 °C frysrum. Ytan skrapas med ett vasst blad för att ta bort den frusna ytfilmen av frostskyddsproteinlösning och iskristallen får sublimera i minst 3 timmar. Efter sublimering kan isplan som binds av AFP ses som vita etsade mönster som härrör från restprotein. Ishalvan kan vara inriktad på dess c-axel och en-axlar, för att lokalisera de basala och prisma planen av is, och bestämma Miller index för de etsade fläckarna.
Här beskriver vi en ändring av den ursprungliga metoden för att bestämma AFP-bundna isplan, en metod som vi kallar fluorescensbaserad isplanstillhörighet (FIPA)11. AFP:erna är fluorescerande märkta med antingen en chimerisk tagg, såsom grönt fluorescerande protein (GFP)11,16,17,20, eller med ett fluorescerande färgämne som är kovalent bundet till AFP5,21. Fluorescerande märkta AFPs adsorberas till en enda iskristall och övervuxen med samma experimentella förfarande som de ursprungliga isetsningsexperimenten. Omfattningen av AFP som binder till den växande ishalvan kan övervakas under hela experimentet med hjälp av en ultraviolett (UV) lampa. När experimentet är klart kan halvklotet tas direkt av det kalla fingret och avbildas, utan sublimering. Men om så önskas kan halvklotet lämnas att sublimera för att visualisera en traditionell is etch. Ändringar som införts i FIPA-metoden förkortar det traditionella isetsningsprotokollet med flera timmar. Dessutom finns det potential för att samtidigt avbilda flera AFPs, var och en med en annan fluorescerande etikett, för att visualisera de överlappande mönstren hos AFP-bundna isplan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Växande enstaka iskristaller
- Ta en ren metallpanna (15 cm diameter, 4,5 cm hög) som passar in i och kan flyta på ett etylenglykolkylbad.
- Förbered polyvinylklorid (PVC) cylindriska mögel, (4,5 cm diameter, 3-4 cm hög, 4 mm tjock), genom att såga sektioner från ett rör.
- Skär ett hack (1 mm brett, 2 mm högt) på ena sidan (figur 1A).
- Förbered så många formar som kan passa bekvämt i pannan (bild 1B).
Obs: En studie visade att polyvinylalkohol (PVA) kan påverka iskärnan22. Men i vårt öppna PVC-system har vi inte stött på problem med atypisk isbildning.
- Applicera en ljusfilm av vakuumfett på bottenytan på varje form, vilket är ytan med skåran utskuren. Försegla denna insmorda, hakade yta på en metallpanna med skårorna orienterade bort från mitten av pannan. Var försiktig så att du inte fyller eller hindrar skårorna med fett.
- Tillsätt 0,22 μm filtrerat och avgasat/avjoniserat vatten i mitten av pannan, men utanför formar, och låt vattnet långsamt komma in i formarna genom skårorna. Var försiktig så att du inte introducerar några bubblor. Vattenskiktet ska vara ca 5 mm djupt.
- Placera pannan i ett temperaturkontrollerat etylenglykolbad kylt till -0,5 °C. Pannan ska vara helt jämn. Lägg till ballastvikter på sidorna av pannan om det behövs.
- När pannan och vattnet har nått -0,5 °C, tillsätt en liten isbit till mitten av pannan, utanför formarna.
- Detta kommer att nukleera istillväxten i det superkylda vattnet över pannan och in i formarna. Det lilla hacket i botten av varje form tillåter bara en iskristall att sprida sig igenom, vilket resulterar i en enda iskristall i varje form.
- Inkubera över natten för att bilda ett lager is.
- Under de kommande tre dagarna tillsätt 13 ml avgasat/avjoniserat vatten till varje form en gång om dagen och släpp temperaturen på etylenglykolbadet efter varje tillsats till -0,8 °C dag ett, till -1,1 °C dag två och till -1,5 °C dag tre.
- Inkubera vid dessa temperaturer över natten.
- Dag fyra ska formarna vara helt fyllda med is.
- Dra bort formarna från pannan, tryck ut iskristallerna ur formarna och förvara på en ren yta, till exempel en vägningsbåt, i en -20 °C frys i cirka 1 timme före hantering.
- I stället för att förbereda många små enstaka iskristaller kan en stor enda iskristall flera liter i volym förberedas i en konstant temperaturinkubator som beskrivs av Knight23. Den stora iskristallen kan förvaras i ett år eller mer om den förvaras täckt i en -15 till -20 °C frys. Delar av enstaka kristaller kan skäras från isblocket med en såg efter behov.
2. Bestämma iskristallens singularitet och orientering
- Bestäm om isen som utvisas från formen är en enda kristall genom att observera i ett frysrum, mellan två korsade polaroider (figur 1D).
- Om iskristallen är singel, bör inga sprickor eller avbrott ses, och ljusriktningen bör inte ändras inom iskristallen.
Obs: Om ett frysrum inte är tillgängligt kan ett kylrum användas istället i alla nödvändiga steg, var försiktig med att arbeta snabbt och hantera isen sparsamt.
- Om iskristallen är singel, bör inga sprickor eller avbrott ses, och ljusriktningen bör inte ändras inom iskristallen.
- På grund av isbirefringence kan man bestämma orienteringenav c-axeln samtidigt. Använd följande information för att bestämma orienteringen:
- När c-axelnär exakt parallell med inincidentsljuset kommer inget ljus i teorin att passera genom de korsade polaroiderna. Om inständeljuset är något från parallell med c-axelnöverförs ett enhetligt flerfärgsspektrum av ljus genom kristallen när det roteras mellan de korsade polaroiderna. Denna enhetliga transmittance uppstår från den optiska inaktiviteten hos is Ih längs dess c-axel24. Iskristallens basala plan är normalt för c-axeln.
- När c-axelnär längre från parallell till instlande ljuset och iskristallen roteras mellan de korsade polaroiderna, växlar det överförda ljuset mellan 0-100% transmittance med varje 90° rotation av kristallen.
- Oftast kommer c-axelnatt vara normal för det cirkulära planet i den cylindriska iskristallen.
- Bestäm orienteringen av a-axlarnagenom ispitting25 som görs genom att linda iskristallen tätt i aluminiumfolie, peta ett litet hål med en nål genom folien i isen på basalplanet (normalt till c-axeln)och placera den under vakuum i 20 minuter.
- Denna behandling kommer att producera en etsning med sexkantig symmetri på basalplanet, där a-axlarnalöper genom den sexsidiga stjärnans hörn (figur 2A).
- Om så önskas kan iskristallen skäras med en såg som antingen är parallell eller vinkelrät mot ena sidan av hexagonen för att montera den med ett primärt eller sekundärt prismaplan vinkelrätt mot det kalla fingret (figur 3).
3. Adsorption av fluorescerande märkta frostskyddsproteiner till en enda iskristall
- Montera en enda iskristall på det kalla fingret (bild 1C) genom att först borra en hålighet i kristallens överst. För att göra detta, alternera smältning av isen med två aluminiumstavar med något annorlunda diameter, men liknar diametern på det kalla fingret, för att bilda håligheten som det kalla fingret kan passa in i.
- Kyl det kalla fingret till -0,5 °C, placera i ishålan och håll iskristallen på plats tills den fryser till metallen (figur 2B). Undvik luftbubblor när du fäster kristallen på fingret eftersom de hindrar effektiv överföring av värme från fingret till stången.
- Fyll en halvklotformade kopp som är ungefär dubbelt så stor som iskristallens diameter med filtrerat avjoniserat vatten eller buffert, kyld till cirka 4 °C. Sänk ner den kalla fingerbundna iskristallen i koppen och ta bort överflödigt vatten eller buffert så att toppen av iskristallen är ungefär jämn med vätskeskiktet och isen inte vidrör koppväggarna.
- Täck koppen med isolering och sänk temperaturen till -5 °C.
- Vänta ungefär 1 timme tills iskristallen bildas till ett halvklot och kontrollera dess status ungefär var 20:e minut (bild 2C).
- Isen kommer att ta formen av den halvklotformade koppen genom att smälta och odla iskristallen, men den får aldrig växa för att röra vid koppväggarna. Det bör finnas minst ett 1 cm mellanrum mellan väggen och halvklotet och det kalla fingret bör inte sticka ut från isen.
- Ta bort koppen från iskristallen och tillsätt den fluorescerande proteinlösningen till en slutlig volym på 25-30 ml och önskad analyskoncentration, var noga med att hålla den totala vätskevolymen i koppen oförändrad. En typisk AFP-koncentration är 0,1 mg/ml.
- Återsubmerera iskristallen i koppen så att toppen av iskristallen är i nivå med vätskan och iskristallen inte vidrör koppväggarna (figur 2D).
- Släpp kallfingertemperaturen till -8 °C och låt proteinlösningen frysa in i iskristallen i 2-3 timmar och rör om lösningen ofta. Isen som bildas från proteinlösningen bör vara minst 5 mm innan istillväxten stoppas.
- Ta bort iskristallen från koppen medan den fortfarande är fastsatt på det kalla fingret. Lossa isen från den senare genom att värma kylvätskan genom det kalla fingret till strax över 0 °C och vänta tills iskristallen smälter av.
- Placera den kristallplatta sidan ner på en ren yta, till exempel en vägningsskål, var försiktig så att du inte rör vid den nybildade isen och förvara den på -20 °C i minst 20 minuter innan du lämnar.
4. Visualisering av frostskyddsproteinbundna isplan
- Visualisering av fluorescens görs i en mörk frys eller kylrum, genom att placera iskristallens plana sida ner under lampor med våglängdsspecifika excitationsfilter för att excite fluorescerande etiketten och kameraemissionsfilter för att blockera något annat ospecificerat ljus. Baserat på mönstret kan de isplan som är bundna av AFP uppskattas (figur 4).
- Om våglängdsspecifika lampor inte finns tillgängliga kan en UV-ljuslåda användas istället.
- Traditionella isetches kan också utföras enkelt genom att låta ishalvan sublimera vid -20 °C i minst 3 timmar, varefter restproteinpulver kan bli synligt på isytan (figur 5).
- Steg 2.3 kan upprepas för att bestämma orienteringen av a-axlarnapå den färdiga ishalvan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Förberedelse och montering av den enda iskristallen är de två stegen i FIPA-förfarandet där fel oftast görs. Att avgöra om den beredda iskristallen är enkel görs genom att undersöka den genom korsade polaroider (figur 1D),enligt vad som beskrivs i steg 2.1 i protokollavsnittet. Om en multikristallina iskristall används för FIPA-analysen kommer resultatet att bli en oavbrutet bindning av afp-klorna på halvklotet utan ett sammanhängande bindningsmönster (figur 6B). Om iskristallgränssnitten finns runt de isplan som AFP binder slutresultatet till kanske det inte går att tolka. Av denna anledning bör iskristallen noggrant kontrolleras för singularitet innan den går vidare till nästa steg. För att öka sannolikheten för att ha enstaka iskristaller för FIPA-analysen bör flera göras samtidigt.
Ett annat vanligt fel är att felaktigt justera kristallansiktena med det kalla fingret under monteringen. För att montera de primära eller sekundära prisma-ytorna vinkelrätt mot det kalla fingret måste den enda iskristallen först inriktas genom ispitting och sedan skäras baserat på orienteringen av den stjärnformade etsningen (figurerna 2A och 3), enligt vad som beskrivs i steg 2.3 i protokollavsnittet. Om iskristallen monteras feljusterat kommer slutresultatet att ge upphov till ett halvklot där halvklotets ekvator inte överensstämmer med isplanens symmetri (figur 6C). Även om detta är ett tolkningsbart resultat, kommer det att vara mindre informativt än en korrekt justerad iskristall eftersom halvklotets största omkrets ligger vid ekvatorn (figur 4).
Figur 1. Utrustning för odling och montering av enstaka iskristaller. A)PVC-formar. B) Panorera i etylenglykolbad med PVC-mögel. C) Kallt finger med flöde av etylenglykol som visas av den vita pilen. Den vita streckade linjen anger det kalla fingrets innervägg. D) Diagram över korsade polaroider för orientering av en enda iskristall. Ljuskällan är gul, korsade polaroider är grå och den enda iskristallen är vit. Polaroidens orientering (grå pilar) och iskristallorientering (röda pilar) anges. Från vänster till höger är iskristallen orienterad så att c-axelnär vinkelrät mot bottenpolaroiden, 45° mot bottenpolaroiden och parallell med instvinnljuset. Ljuset som passerar genom de korsade polaroiderna och isen kommer att verka mörkt, ljust eller svagt mångfärgat genom den övre polaroiden beroende på iskristallens orientering. Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 2. Förbereder iskristall för FIPA. A) Bestämma axlarnas orienteringar med isetsning med sexkantig symmetri. Kristallens basala plan är parallellt med sidans plan. B) Montera den enda iskristallen på det kalla fingret. C) Is efter att ha bildat till halvklotet. D) Ishalvan nedsänkt i halvklotkopp fylld med proteinlösning. Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 3. Montering av iskristall baserad på orientering. A) Diagram över monteringsis med i) basalplanet, ii) ett primärt prismaplan och iii) ett sekundärt prismaplan vinkelrätt mot det kalla fingret. För orienteringarna ii och iii skall iskristallen skäras i hälften, vilket visas i figuren. B) FIPA-resultat av stillahavsblåmärkt typ III nfeAFP8 efter montering av iskristaller med i) basalplanet och ii) ett primärt prismaplan vinkelrätt mot det kalla fingret. Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 4. Tolkning av AFP-bundna plan från FIPA:s analysresultat. A) Representation av de bundna planen i Ih ice; och B)motsvarande FIPA-analysresultat när den enda iskristallen är monterad med ett primärt prismaplan vinkelrätt mot det kalla fingret. Panelerna representerar i) basalplan, ii) primärt prismaplan, iii) sekundärt prismaplan, iv) pyramidplan i linje med a-axlarnaoch (v) pyramidplanet förskjutet till a-axlarna. C) Morfologi av en enda iskristall när den odlas i lösning av AFPs som binder pyramidala plan i) i linje med a-axlarnaoch ii) förskjutningen från a-axlarna. Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 5. Jämförelse av traditionella isetches jämfört med FIPA. A) (i) Den traditionella etsningen av typ I AFP (HPLC6 isoform) som produceras av vinterskrubbskädda (Pseudopleuronectes americanus) visas som ursprungligen producerad av Knight et al., (1991). ii) Motsvarande FIPA-analys av samma protein märkt med TRITC. B) i) Traditionell etsning av en fyrdubbel IBS-mutant (V9Q/V19L/G20V/I41V) av typ III nfeAFP11 (från den japanska ålpipan Zoarces elongatuskner)21. ii) Motsvarande FIPA-analys av samma protein märkt med TRITC. Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 6. Halvklot till följd av vanliga FIPA-analysfel. Analyser utfördes på GFP-märkt typ III HPLC12-A16H. A) Ett optimalt FIPA-resultat för jämförelse. Iskristallen monterades med sitt primära prismaplan vinkelrätt mot det kalla fingret. B) FIPA-analys som oavsiktligt utfördes med hjälp av en ishalva bestående av mer än en kristall. C) FIPA-analys som utfördes på en feljusterad enda iskristall. Det sekundära prismaplanet var inte monterat exakt vinkelrätt mot det kalla fingret. Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 7. Använda FIPA-analys för att jämföra isbindningsmönster för olika AFP: er. Stillahavsblåmärkt typ III nfeAFP8 kombinerades med TRITC-märkt typ I AFP och en enda FIPA-analys genomfördes. A) Visualisering av endast typ III nfeAFP8. B) Visualisering av endast typ I AFP. C) Visualisering av typ III nfeAFP8 och typ I AFP tillsammans. Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 8. FIPA för måttligt aktiva och hyperaktiva AFP: er. A) FIPA-analys av tre olika måttligt aktiva fisk-AFP: er; i) TRITC-märkt typ I AFP (HPLC6 isoform, Pseudopleuronectes americanus), ii) TRITC-märkt typ II AFP(Ca2+-oberoende isoform, Longsnout poacher), iii) Stillahavsblåmärkt typ III AFP (nfeAFP8 isoform, Zoarces elongatuskner). B) FIPA-analys av tre olika hyperaktiva afp-adresser, i) GFP-märkt parlamentsledamotAFP_RIV (Marinomonas primoryensis), ii) TRITC-märkt sbwAFP (Choristoneura fumiferana), iii) GFP-märkt TmAFP (Tenebrio molitor). I alla bilder är c-axelnvinkelrät mot sidans plan. Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 9. Förhållandet mellan fluorescerande mönster som produceras genom FIPA-analys och iskristallmorfologi av olika typ III AFP-isoformer ochmutanter 11,21. A) i) FIPA-analys av GFP-märkt QAE-A16H. ii) Iskristallmorfologi som framställts av QAE-A16H. B) i) FIPA-analys av TRITC-märkt nfeAFP11-V9Q. ii) Iskristallmorfologi producerad av nfeAFP11-V9Q. C) i) FIPA-analys av TRITC-märkta vilda nfeAFP11. ii) Morfologi av iskristaller som framställts av nfeAFP11 av vildtyp. D) i) FIPA-analys av TRITC-märkta vilda nfeAFP6. ii) Morfologi av iskristaller som framställts av nfeAFP6 av vildtyp. C-axelorienteringar och skalstänger är som anges. Klicka här om du vill visa större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Charles Knights utveckling av isetsningsmetoden för bestämning av AFP-bundna isplan har i hög grad avancerat studier om mekanismen för isbindning av afps. Medan strukturer av AFP kunde lösas genom röntgenkristallografi26,27 fanns det ingen uppenbar metod för att härleda den kompletterande ytan på is som AFP band till. När typ I AFP från vinter skrubbskädda ursprungligen karakteriserades, var det hypotetiskt att binda till de primära prisma planen av is28. Knights banbrytande isetsningsexperiment av typ I AFP visade dock att de binder till pyramidala isplan13. Detta resultat stimulerade AFP:s forskarsamhälle att ompröva mekanismen för AFP-isbindning och mer exakt bestämma det isbindande ansiktet på AFPs9. Knights ursprungliga isetsningsförsök gjordes med hjälp av inhemska AFP:er som renats från de AFP-producerande organismerna. Med utvecklingen av rekombinanta AFP och den ökande användningen av GFP-taggar fanns det möjlighet att utöka dessa studier till många andra AFP29.
Idén att införliva kovalenta fluorescerande proteinfärgämnen, såsom tetramethylrhodamine-5-(och 6)-isothiocyanate (TRITC), kom först efter framgången med GFP-smälta AFP FIPA-analyser11. De chimeriska fluorescerande proteintaggar och kemiska modifieringarna genom kovalenatfärgämnen har observerats inte påverka afp-ornas isbindningsmönster (figur 5). Med den förstnämnda smälts GFP till antingen N- eller C-terminaländarna på AFPs, som ofta avlägsnas väl från IBS. Dessutom kan en flexibel länkare sättas in mellan GFP och AFP så att taggen kan skjutas bort från isytan. Med den senare märkningsstrategin är de laddade sidokedjorna som reagerar med de kovavfärgade färgämnena vanligtvis på ytor bort från IBS. Om de strategier som presenteras här för fluorescerande märkning av AFP inte fungerar, är införandet av en cystein bort från IBS för reaktion med tiolreaktiva färgämnen ett annat alternativ30. Genom att vidta åtgärder för att se till att fluorescerande etiketter inte påverkar AFP:s isbindning, vilket bedöms av termisk hysteresaktivitet och iskristallmorfologi, är vi övertygade om att FIPA-analysen visar sann representation av AFP:s isbindningsmönster, som den gjorde i den ursprungliga isetsningsmetoden.
Det finns flera fördelar med att fluorescerande märka de stora ekonomiska arbetsförmedlingarna för FIPA-analysen. Mindre tid krävs för proceduren eftersom sublimering av is för visualisering av AFP-bundna plan inte behövs. Införlivandet av märkt protein på halvklotet kan övervakas under isens tillväxt för att bedöma experimentell färdigställande och AFP-bindande mönster kan registreras när som helst. Detta förhindrar onödigt långa experiment eller förtida slutförande av istillväxt. Den fluorescerande märkningen möjliggör tydligare AFP-bindande mönstervisualisering än tidigare möjligt med etsning, vilket ses i jämförelsen av resultat från båda metoderna som tillämpas på typ I- och typ III-AFP:er (figur 5). En is-etsning efter FIPA kan dock enkelt utföras genom att placera halvklotet i en frys i flera timmar, vilket innebär att båda analyserna kan göras på samma prov eftersom liknande AFP-koncentrationer behövs för båda metoderna. En värdefull fördel med FIPA är förmågan att visualisera mer än en olikmärkt AFP på samma ishalva (figur 7). Detta är användbart för att illustrera skillnader i AFP isbindande plan sett med olika AFP-typer, isoformer och aktivitetsmutanter.
FIPA-analys har redan använts i flera AFP-studier. Det har använts för att stödja hypotesen att basal planbindning är unik för hyperaktiva AFPs och nödvändig för deras höga aktivitet18. Måttligt aktiva afps befanns inte binda basalplanet (figur 8A) men många hyperaktiva AFPs täcker helt ishalvan, inklusive det basala isplanet (figur 8B)5,20,31. FIPA-analys har också använts för att studera funktionen hos specifika isbindande rester. Till exempel utfördes FIPA-analys på flera isoformer och mutanter av typ III, av vilka några förhindrar istillväxt, och några av dem har visat sig bara formais 11,21,32. Av studierna konstaterades att särskilda resthalter är viktiga för att afp-flygen ska införlivas i is, och andra är viktiga för isplansspecifikiteten (figur 9).
Andra metoder för att studera AFP-bindande mönster på enstaka iskristaller inkluderar direkt observation av fluorescensmikroskopi16,33 och mikrofluidik34. Dessa metoder har fördelen av känslighet för dynamiken i AFP:s fastsättning på is och övervakning av isformningssimultanitet med AFP:s affinitet till isen, men är mindre robusta jämfört med FIPA-metoden för att bestämma affiniteten till isplanerna. Molekylär dynamik används också för att förutsäga isplansbindningsspecifikiteten för AFPs12,20,21,30,35. Med hjälp av FIPA-analys, tillsammans med andra tillgängliga tekniker, lär vi oss isplansbindningsmönstren för varje AFP, vikten av IBS sammansättning vid val av isplan och hur bindning av specifika plan är relaterad till AFP-aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter har deklarerats.
Acknowledgments
PLD innehar Canada Research Chair i proteinteknik. Detta arbete finansierades av ett bidrag från Canadian Institutes of Health Research till PLD. Detta arbete stöddes också av ett bidrag till stöd för vetenskaplig forskning från Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (nr 23310171) och från Japan Bio-oriented Technology Research Advancement Institution (BRAIN). Vi är tacksamma mot Drs. Chris Marshall och Mike Kuiper för banbrytande arbete som ledde till FIPA. Vi är också tacksamma mot Dr. Sakae Tsuda för att tillhandahålla faciliteter för en del av detta arbete och till Dr. Laurie Graham för att ha inrättat fluorescerande ljusexcitations- och utsläppsfilter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NESLAB RTE Refrigerating Bath/Circulators | Thermo Scientific | RTE7 | |
| Ethylene glycol, Premixed Antifreeze/Coolant | Certified | 29-3037-0 | Common automotive antifreeze |
| Cold finger | not available | not available | Custom made with brass (9 cm long, 1.5 cm outer diameter) |
| Hemispherical cup | not available | not available | Custom made with resin (8 cm outer diameter, 6 cm inner diameter) |
| High Dual Output Lighting System | Lightools Research | LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX | Additional and custom excitation filters can be purchased from Lightools Research |
| Camera | Canon | EOS 50D | |
| Emission Filters | Lightools Research | LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG | Filter ring adapter may be required to fit filter onto camera lens |
References
- Devries, A. L. Antifreeze peptides and glycopeptides in cold-water fishes. Annu. Rev. Physiol. 45, 245-260 (1983).
- Sidebottom, C., et al. Phytochemistry - heat-stable antifreeze protein from grass. Nature. 406 (6793), 256-256 (2000).
- Tomczak, M. M., et al. A mechanism for stabilization of membranes at low temperatures by an antifreeze protein. Biophys. J. 82 (2), 874-881 (2002).
- Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A. Hyperactive Ca-dependent antifreeze protein in an antarctic bacterium. FEMS Microbiol. Lett. 245 (1), 67-72 (2005).
- Garnham, C. P., Campbell, R. L., Davies, P. L. Anchored clathrate waters bind antifreeze proteins to ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (18), 7363-7367 (2011).
- Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a bacterial antifreeze protein as an adhesin with ice-binding activity. Plos One. 7 (11), (2012).
- Raymond, J. A. Algal ice-binding proteins change the structure of sea ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), (2011).
- Raymond, J. A., Devries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (6), 2589-2593 (1977).
- Baardsnes, J., et al. New ice-binding face for type i antifreeze protein. FEBS Lett. 463 (1-2), 87-91 (1999).
- Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).
- Garnham, C. P., et al. Compound ice-binding site of an antifreeze protein revealed by mutagenesis and fluorescent tagging. Biochemistry. 49 (42), 9063-9071 (2010).
- Nutt, D. R., Smith, J. C. Dual function of the hydration layer around an antifreeze protein revealed by atomistic molecular dynamics simulations. J. Am. Chem. Soc. 130 (39), 13066-13073 (2008).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., Devries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal-surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
- Antson, A. A., et al. Understanding the mechanism of ice binding by type iii antifreeze proteins. J. Mol. Biol. 305 (4), 875-889 (2001).
- Graether, S. P., et al. Beta-helix structure and ice-binding properties of a hyperactive antifreeze protein from an insect. Nature. 406 (6793), 325-328 (2000).
- Pertaya, N., Marshall, C. B., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. Direct visualization of spruce budworm antifreeze protein interacting with ice crystals: Basal plane affinity confers hyperactivity. Biophys. J. 95 (1), 333-341 (2008).
- Middleton, A. J., et al. Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site. J. Mol. Biol. 416 (5), 713-724 (2012).
- Scotter, A. J., et al. The basis for hyperactivity of antifreeze proteins. Cryobiology. 53 (2), 229-239 (2006).
- Knight, C. A., Wierzbicki, A., Laursen, R. A., Zhang, W. Adsorption of biomolecules to ice and their effects upon ice growth. 1. Measuring adsorption orientations and initial results. Crys. Growth Des. 1 (6), 429-438 (2001).
- Hakim, A., et al. Crystal structure of an insect antifreeze protein and its implications for ice binding. J. Biol. Chem. 288 (17), 12295-12304 (2013).
- Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Davies, P. L. Engineering a naturally inactive isoform of type iii antifreeze protein into one that can stop the growth of ice. FEBS Lett. 586 (21), 3876-3881 (2012).
- Holt, C. B. The effect of antifreeze proteins and poly(vinyl alcohol) on the nucleation of ice: A preliminary study. Cryo Letters. 24 (5), 323-330 (2003).
- Knight, C. A. A simple technique for growing large, optically ''perfect'' ice crystals. J. Glac. 42 (142), 585-587 (1996).
- Hobbs, P. V. Ice physics. , Clarendon Press. Oxford. 200-248 (1974).
- Knight, C. Formation of crystallographic etch pits on ice, and its application to the study of hailstones. J. Appl. Meteorol. 5 (5), 710-714 (1966).
- Yang, D. S., Sax, M., Chakrabartty, A., Hew, C. L. Crystal structure of an antifreeze polypeptide and its mechanistic implications. Nature. 333 (6170), 232-237 (1988).
- Sicheri, F., Yang, D. S. Ice-binding structure and mechanism of an antifreeze protein from winter flounder. Nature. 375 (6530), 427-431 (1995).
- Devries, A. L. Role of glycopeptides and peptides in inhibition of crystallization of water in polar fishes. Philos. T Roy. Soc. B. 304 (1121), 575-588 (1984).
- Pertaya, N., et al. Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces. Biophys. J. 92 (10), 3663-3673 (2007).
- Kondo, H., et al. Ice-binding site of snow mold fungus antifreeze protein deviates from structural regularity and high conservation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (24), 9360-9365 (2012).
- Mok, Y. F., et al. Structural basis for the superior activity of the large isoform of snow flea antifreeze protein. Biochemistry. 49 (11), 2593-2603 (2010).
- Takamichi, M., Nishimiya, Y., Miura, A., Tsuda, S. Fully active qae isoform confers thermal hysteresis activity on a defective sp isoform of type iii antifreeze protein. FEBS J. 276 (5), 1471-1479 (2009).
- Bar-Dolev, M., Celik, Y., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. New insights into ice growth and melting modifications by antifreeze proteins. J. R. Soc. Interface. 9 (77), 3249-3259 (2012).
- Celik, Y., et al. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (4), 1309-1314 (2013).
- Garnham, C. P., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. Novel dimeric beta-helical model of an ice nucleation protein with bridged active sites. BMC Struct. Biol. 11, (2011).
