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Chemistry

फ्लोरेसेंस आधारित आइस प्लेन एफ़िनिटी द्वारा एंटीफ्रीज प्रोटीन के आइस-बाइंडिंग विमानों का निर्धारण

Published: January 15, 2014 doi: 10.3791/51185
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4, 1
1Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, 2National Institute of Neurological Disorders and Stroke, Porter Neuroscience Research Center, 3Research Institute of Genome-Based Biofactory, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 4The Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Institute of Biochemistry, Food Science, and Nutrition, The Hebrew University of Jerusalem

Summary

एंटीफ्रीज प्रोटीन (AFPs) बर्फ के विशिष्ट विमानों को रोकने या धीमी बर्फ के विकास को रोकने के लिए बांधते हैं। फ्लोरेसेंस आधारित आइस प्लेन एफ़िनिटी (FIPA) विश्लेषण एएफपी-बाध्य बर्फ विमानों के निर्धारण के लिए मूल बर्फ-नक़्क़ाशी विधि का एक संशोधन है । AFPs फ्लोरोसेंटी लेबल, स्थूल एकल बर्फ क्रिस्टल में शामिल हैं, और यूवी प्रकाश के तहत कल्पना की ।

Abstract

आंतरिक बर्फ के विकास को रोकने या धीमा करने के लिए विभिन्न प्रकार के ठंडे-हार्डी जीवों में एंटीफ्रीज प्रोटीन (एएफपी) व्यक्त किए जाते हैं। AFPs अपने बर्फ बाध्यकारी सतहों के माध्यम से बर्फ के विशिष्ट विमानों के लिए बांध । फ्लोरेसेंस आधारित आइस प्लेन एफ़िनिटी (FIPA) विश्लेषण एक संशोधित तकनीक है जिसका उपयोग बर्फ के विमानों को निर्धारित करने के लिए किया जाता है, जिसके लिए AFPs बांधते हैं । FIPA एएफपी-बाध्य बर्फ विमानों का निर्धारण करने के लिए मूल बर्फ नक़्क़ाशी विधि पर आधारित है । यह एक छोटा प्रयोगात्मक समय में स्पष्ट छवियों का उत्पादन करता है। FIPA विश्लेषण में, AFPs फ्लोरोसेंट रूप से एक चिमरिक टैग या एक सहसंयोजक डाई के साथ लेबल किया जाता है, फिर धीरे-धीरे एक स्थूल एकल बर्फ क्रिस्टल में शामिल किया जाता है, जिसे गोलार्द्ध में पूर्वतृित किया गया है और ए-और सी-कुल्हाड़ियोंको निर्धारित करने के लिए उन्मुख किया गया है। एएफपी-बाध्य बर्फ गोलार्द्ध को यूवी लाइट के नीचे इमेज किया गया है ताकि एएफपी-बाध्य विमानों को गैर-विशिष्ट प्रकाश को अवरुद्ध करने के लिए फिल्टर का उपयोग करके कल्पना की जा सके । AFPs के फ्लोरोसेंट लेबलिंग बर्फ में एएफपी सोखने की वास्तविक समय निगरानी की अनुमति देता है । लेबल उन विमानों को प्रभावित नहीं करने के लिए पाए गए हैं, जिनके लिए AFPs बांधते हैं । FIPA विश्लेषण भी एक ही बर्फ क्रिस्टल पर एक से अधिक अलग टैग एएफपी बांधने के लिए मदद करने के लिए अपने बाध्यकारी विमानों अंतर विकल्प का परिचय । FIPA के इन अनुप्रयोगों के लिए कैसे AFPs बर्फ के लिए बांध अपने विकास को रोकने के लिए और क्यों कई एएफपी उत्पादक जीवों कई एएफपी isoforms व्यक्त की हमारी समझ अग्रिम मदद कर रहे हैं ।

Introduction

एंटीफ्रीज प्रोटीन (एएफपीएस) का उत्पादन कुछ जीवों का एक महत्वपूर्ण अस्तित्व तंत्र है जो बर्फ से लदे वातावरण में रहते हैं। हाल ही में जब तक, यह सोचा गया था कि AFPs का एकमात्र कार्य आंतरिक बर्फ क्रिस्टल के विकास को रोकना या धीमा करना था जो परिसंचरण को अवरुद्ध करेगा, ऊतक क्षति का कारण बनेगा, और ऑस्मोटिक तनाव। ऐसे जीव जो किसी भी हद तक ठंड बर्दाश्त नहीं कर सकते, जैसे मछली, बर्फ क्रिस्टल विकास को पूरी तरह से बाधित करने के लिए AFPs व्यक्त करते हैं1। घास जैसे अन्य लोग सहिष्णु को फ्रीज करते हैं और बर्फ के पुनर्क्रिस्टलाइजेशन को बाधित करने के लिए AFPs व्यक्त करते हैं जो उनके ऊतकों में बड़े बर्फ क्रिस्टल के गठन को कम करता है2। कम तापमान में झिल्ली का स्थिरीकरण एक और कार्य है जो एएफपीएस3के लिए सुझाया गया था । हाल ही में, बर्फ से ढकी खारी झीलों4से अंटार्कटिक जीवाणु, मैरिनोमोनास प्राइमोरिएन्सिसके एएफपी के लिए एक उपन्यास की भूमिका का सुझाव दिया गया था । यह एएफपी एक बहुत बड़ा आसॅ्टेसिन प्रोटीन5 का हिस्सा है जो ऑक्सीजन और पोषक तत्वों तक बेहतर पहुंच के लिए जीवाणु को बर्फ से जोड़ना माना जाता है6. अन्य रोगाणुओं को AFPs को स्रावित करने के लिए जाना जाता है, जो बर्फ की संरचना को बदल सकता है जिसमें वे7रहते हैं।

एएफपीएस कुछ मछली, कीड़े, पौधों, शैवाल, बैक्टीरिया, डायटोम, और कवक में पाया गया है। उनके पास विभिन्न अवसरों पर विभिन्न जनकों से उनके विकास के अनुरूप उल्लेखनीय भिन्न दृश्य और संरचनाएं हैं; और फिर भी वे सब बर्फ को बांध और सोखने-अवरोध तंत्र8द्वारा अपने विकास को बाधित . एएफपीएस प्रत्येक की एक विशिष्ट सतह होती है जो इसकी आइस-बाइंडिंग साइट (आईबीएस) के रूप में कार्य करती है। इन्हें आम तौर पर सतह अवशेषों9-11के साइट-निर्देशित म्यूटेगेनिसिस द्वारा पहचाना जाता है। आईबीएस बर्फ की तरह पैटर्न है कि बर्फ के विशिष्ट विमानों से मेल खाता है में पानी के अणुओं की व्यवस्था करने के लिए परिकल्पना की है । इस प्रकार एएफपी5, 12के लिए बाध्यकारी से पहले अपनी ligand रूपों । बर्फ विमानों को उनके मिलर सूचकांकों द्वारा परिभाषित किया जा सकता है, और विभिन्न AFPs विभिन्न विमानों के लिए बाध्य कर सकते हैं । इस प्रकार, प्रकार मैं एएफपी सर्दियों से 20-21 पिरामिड विमानों को बांधता है13,प्रकार III एएफपी एक यौगिक बर्फ बाध्यकारी सतह11,14का उपयोग कर प्राथमिक चश्मे और पिरामिड विमानों दोनों बांधता है, जबकि सजाना बुडवार एएफपी, एक अतिसक्रिय एएफपी, प्राथमिक और बेसल दोनों विमानों के लिए एक साथ बांधता है15,16। अन्य अतिसक्रिय AFPs, जैसे कि एमपीएएफपी, कई बर्फ विमानों से बांधते हैं, जैसा कि एकल बर्फ क्रिस्टल गोलार्द्धों5,17के अपने पूर्ण कवरेज द्वारा दिखाया गया है। यह परिकल्पना की गई है, कि बेसल विमान के साथ-साथ अन्य विमानों को बांधने के लिए अतिसक्रिय AFPs की क्षमता, मामूली रूप से सक्रिय AFPs 18 पर उनकी10गुना उच्च गतिविधि के लिए खाते में हो सकता है । हालांकि अतिसक्रिय AFPs की दक्षता अच्छी तरह से प्रलेखित है, उनके कई बर्फ विमानों को बांधने की क्षमता अभी भी समझ में नहीं आ रहा है ।

एएफपी-बाध्य बर्फ विमानों का निर्धारण करने के लिए मूल विधि चार्ल्स नाइट१३,१९द्वारा विकसित की गई थी । इस विधि में, एक स्थूल एकल बर्फ क्रिस्टल एक खोखले धातु रॉड (ठंडी उंगली) पर रखा जाता है और इसे एक गोलार्द्ध में जलमग्न करके एक गोलार्द्ध में बनता है जो डेगासेड पानी से भरा हुआ है। फिर, गोलार्द्ध AFPs के एक पतला समाधान में डूबे हुए है और बर्फ की एक परत कई घंटे ठंडी उंगली के माध्यम से घूम एथिलीन ग्लाइकोल के तापमान से नियंत्रित पर बर्फ क्रिस्टल गोलार्द्ध पर एएफपी समाधान से उगाया जाता है । बर्फ क्रिस्टल को समाधान से हटा दिया जाता है, ठंडी उंगली से अलग किया जाता है, और -10 से -15 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर कमरे में रखा जाता है। सतह को एंटीफ्रीज प्रोटीन समाधान की जमे हुए सतह फिल्म को हटाने के लिए एक तेज ब्लेड के साथ स्क्रैप किया जाता है और बर्फ क्रिस्टल को कम से कम 3 घंटे के लिए सब्लिमेट करने की अनुमति है। उदात्तीकरण के बाद, एएफपीएस से बंधे बर्फ विमानों को अवशिष्ट प्रोटीन से प्राप्त सफेद नक़्क़ाशी पैटर्न के रूप में देखा जा सकता है। बर्फ गोलार्द्ध को बर्फ के बेसल और चश्मे के विमानों का पता लगाने और नक़्क़ाशी पैच के मिलर सूचकांकों का निर्धारण करने के लिए अपने सी-अक्ष और एक-कुल्हाड़ियोंके लिए उन्मुख किया जा सकता है।

यहां हम बर्फ के एएफपी-बाध्य विमानों का निर्धारण करने के लिए मूल विधि के संशोधन का वर्णन करते हैं, एक विधि जिसे हम फ्लोरेसेंस आधारित आइस प्लेन ए आत्मीयता (FIPA)11के रूप में संदर्भित करते हैं । एएफपी को फ्लोरोसेंट रूप से या तो एक चिमरिक टैग के साथ लेबल किया जाता है, जैसे कि ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी)11,16,17,20,या फ्लोरोसेंट डाई के साथ सहसंयोजक रूप से एएफपी5,21से बंधे होते हैं। फ्लोरोसेंटी लेबल वाले एएफपीएस को एक ही बर्फ क्रिस्टल में सोख दिया जाता है और मूल बर्फ-नक़्क़ाशी प्रयोगों के रूप में एक ही प्रयोगात्मक प्रक्रिया का उपयोग करके ऊंचा हो जाता है। बढ़ती बर्फ गोलार्द्ध के लिए बाध्यकारी एएफपी की हद तक एक पराबैंगनी (यूवी) दीपक का उपयोग कर प्रयोग भर में निगरानी की जा सकती है । प्रयोग पूरा होने के बाद, गोलार्द्ध को सीधे ठंडी उंगली से दूर ले जाया जा सकता है और बिना किसी उदात्तीकरण के इमेज किया जा सकता है। हालांकि, यदि वांछित है, तो गोलार्द्ध को पारंपरिक बर्फ की कल्पना करने के लिए छोड़ दिया जा सकता है। FIPA पद्धति के लिए शुरू की संशोधनों कई घंटे से पारंपरिक बर्फ नक़्क़ाशी प्रोटोकॉल छोटा । इसके अतिरिक्त, एएफपी-बाध्य बर्फ विमानों के ओवरलैपिंग पैटर्न की कल्पना करने के लिए, एक अलग फ्लोरोसेंट लेबल के साथ एक साथ कई AFPs इमेजिंग की क्षमता है।

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Protocol

1. एकल बर्फ क्रिस्टल बढ़ रहा है

  1. एक साफ धातु पैन (15 सेमी व्यास, 4.5 सेमी ऊंचा) लें जो फिट बैठता है, और एक एथिलीन ग्लाइकोल कूलिंग बाथ पर तैर सकता है।
  2. पाइप से वर्गों को जोड़कर पॉलीविनाइल क्लोराइड (पीवीसी) बेलनाकार मोल्ड, (4.5 सेमी व्यास, 3-4 सेमी ऊंचा, 4 मिमी मोटी) तैयार करें।
    1. एक पायदान काटें, (1 मिमी चौड़ा, 2 मिमी ऊंचा) एक तरफ (चित्रा 1A)।
    2. जितने मोल्ड तैयार करें जो पैन (चित्रा 1 बी)में आराम से फिट हो सकते हैं।
      नोट: एक अध्ययन से पता चला है कि पॉलीविनाइल अल्कोहल (PVA) बर्फ नाभिक22को प्रभावित कर सकता है । हालांकि, हमारे खुले मोल्ड पीवीसी प्रणाली में हम असामान्य बर्फ गठन की समस्याओं का सामना नहीं किया है ।
  3. प्रत्येक मोल्ड के नीचे की सतह की अंगूठी के लिए वैक्यूम तेल की एक हल्की फिल्म लागू करें, जो पायदान कट आउट के साथ सतह है। पैन के केंद्र से दूर उन्मुख पायदान के साथ एक धातु पैन पर इस ग्रीज्ड, नॉच्ड सतह को सील करें। चिकनाई के साथ पायदान को भरने या बाधा डालने के लिए नहीं सावधान रहें।
  4. पैन के केंद्र में 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर और डिगैस/डिवोनाइज्ड पानी जोड़ें, लेकिन मोल्डों के बाहर, और पानी को धीरे-धीरे पायदान के माध्यम से मोल्डों में प्रवेश करने की अनुमति दें। किसी भी बुलबुले पेश करने के लिए नहीं सावधान रहें। पानी की परत लगभग 5 मिमी गहरी होनी चाहिए।
  5. पैन को तापमान नियंत्रित एथिलीन ग्लाइकोल बाथ में -0.5 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा रखें। पैन पूरी तरह से लेवल होना चाहिए। यदि आवश्यक हो तो पैन के किनारों में गिट्टी वजन जोड़ें।
  6. पैन और पानी के बाद -0.5 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच गया है, मोल्डों के बाहर, पैन के बीच में बर्फ का एक छोटा सा टुकड़ा जोड़ें।
    1. यह पैन के पार और मोल्डों में सुपरकूल्ड पानी में बर्फ की वृद्धि को नाभिित करेगा। प्रत्येक मोल्ड के तल पर छोटे पायदान केवल एक बर्फ क्रिस्टल के माध्यम से प्रचार करने के लिए अनुमति देता है, प्रत्येक मोल्ड में एक ही बर्फ क्रिस्टल में जिसके परिणामस्वरूप ।
    2. बर्फ की एक परत बनाने के लिए रात भर इनक्यूबेट करें।
  7. अगले तीन दिनों में दिन में एक बार प्रत्येक मोल्ड में 13 मिलीलीटर 4 डिग्री सेल्सियस/डिएकॉल्ड पानी जोड़ें और एक दिन में -0.8 डिग्री सेल्सियस के अलावा, दो दिन में -1.1 डिग्री सेल्सियस और तीन दिन में -1.5 डिग्री सेल्सियस तक एथिलीन ग्लाइकोल बाथ का तापमान छोड़ दें।
    1. रात भर उन तापमान पर इनक्यूबेट ।
    2. चार दिन तक, मोल्ड पूरी तरह से बर्फ से भर जाना चाहिए।
  8. मोल्ड्स को पैन से खींचें, बर्फ के क्रिस्टल को मोल्ड्स से बाहर धकेलें, और हैंडलिंग से पहले लगभग 1 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में एक-20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में, एक साफ सतह पर स्टोर करें, जैसे कि एक वजनी नाव।
  9. कई छोटे एकल बर्फ क्रिस्टल तैयार करने के बजाय, एक बड़े एकल बर्फ क्रिस्टल मात्रा में कई लीटर नाइट23द्वारा वर्णित एक निरंतर तापमान इनक्यूबेटर में तैयार किया जा सकता है। बड़े बर्फ क्रिस्टल एक साल या उससे अधिक के लिए संग्रहीत किया जा सकता है अगर एक -15 से -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में कवर रखा । एकल क्रिस्टल के कुछ हिस्सों को आवश्यकतानुसार देखा के साथ बर्फ ब्लॉक से काटा जा सकता है।

2. आइस क्रिस्टल की विलक्षणता और अभिविन्यास का निर्धारण

  1. निर्धारित करें कि मोल्ड से निष्कासित बर्फ दो पार पोलरॉइड (चित्रा 1D)के बीच, फ्रीजर कमरे में देख कर एक क्रिस्टल है या नहीं।
    1. यदि बर्फ क्रिस्टल एकल है, तो कोई दरार या विच्छेदन नहीं देखा जाना चाहिए, और प्रकाश की दिशा बर्फ क्रिस्टल के भीतर नहीं बदलना चाहिए।
      नोट: यदि फ्रीजर कक्ष उपलब्ध नहीं है, तो एक ठंडे कमरे का उपयोग सभी आवश्यक चरणों में किया जा सकता है, जल्दी से काम करने और बर्फ को संयम से संभालने के लिए सतर्क किया जा रहा है।
  2. बर्फ के कारण, कोई भी एक ही समय में सी-अक्ष के अभिविन्यास का निर्धारण कर सकता है। अभिविन्यास निर्धारित करने के लिए निम्नलिखित जानकारी का उपयोग करें:
    1. जब सी-अक्ष घटना प्रकाश के समानांतर होता है, सिद्धांत रूप में, कोई प्रकाश पार पोलरॉइड से गुजरता नहीं होगा। यदि घटना प्रकाश सी-अक्ष के साथ समानांतर से थोड़ा शीर्षक है, प्रकाश का एक समान बहुरंगी स्पेक्ट्रम क्रिस्टल के माध्यम से प्रेषित किया जाता है जब यह पार polaroids के बीच घुमाया जाता है । यह यूनिफॉर्म ट्रांसमिट बर्फ की ऑप्टिकल निष्क्रियता से उत्पन्न होतीहै जो इसके सी-एक्सिस24के साथ है । आइस क्रिस्टल का बेसल प्लेन सी-एक्सिसतक सामान्य है।
    2. जब सी-एक्सिसघटना प्रकाश के समानांतर से आगे होता है और बर्फ क्रिस्टल को पार पोलरॉइड के बीच घुमाया जाता है, तो प्रेषित प्रकाश क्रिस्टल के हर 90 डिग्री रोटेशन के साथ 0-100% ट्रांसमिशन के बीच वैकल्पिक होगा।
    3. सबसे अधिक, सी-अक्ष बेलनाकार बर्फ क्रिस्टल के परिपत्र विमान के लिए सामान्य हो जाएगा।
  3. 25 बर्फ खड़ा जो एल्यूमीनियम पन्नी में कसकर बर्फ क्रिस्टल लपेटकर कियाजाता है द्वारा एककुल्हाड़ियों के अभिविन्यास का निर्धारण, बेसल विमान (सी-धुरीके लिए सामांय) पर बर्फ में पन्नी के माध्यम से एक सुई के साथ एक छोटे से छेद poking, और यह 20 मिनट के लिए वैक्यूम के नीचे रखकर ।
    1. यह उपचार बेसल विमान पर षट्कोणीय समरूपता के साथ एक नक़्क़ाशी का उत्पादन करेगा, जहां एक-कुल्हाड़ी छह तरफा स्टार (चित्रा 2A)के vertices के माध्यम से चलाते हैं ।
    2. यदि वांछित है, तो बर्फ क्रिस्टल को षट्भुज के एक तरफ समानांतर या लंबवत के साथ काटा जा सकता है ताकि इसे क्रमशः (चित्रा 3)के लिए ठंडी उंगली के लंबवत प्राथमिक या माध्यमिक चश्मे वाले विमान के साथ माउंट किया जा सके।

3. फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीफ्रीज प्रोटीन का एक ही आइस क्रिस्टल पर सोखने

  1. क्रिस्टल के शीर्ष में एक गुहा को पहले उबाऊ करके ठंडी उंगली (चित्रा 1C) पर एक बर्फ क्रिस्टल माउंट करें। ऐसा करने के लिए, वैकल्पिक थोड़ा अलग व्यास के एक दो एल्यूमीनियम छड़ के साथ बर्फ पिघलने, लेकिन ठंडी उंगली के व्यास के समान, गुहा जिसमें ठंडी उंगली फिट कर सकते है फार्म के लिए ।
  2. ठंडी उंगली को -0.5 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें, बर्फ गुहा में रखें, और बर्फ क्रिस्टल को तब तक रखें जब तक कि यह धातु (चित्रा 2B)में जमा न हो जाए। उंगली से क्रिस्टल संलग्न करते समय हवा के बुलबुले से बचें क्योंकि वे उंगली से रॉड तक गर्मी के कुशल हस्तांतरण में बाधा डालते हैं।
  3. एक गोलार्द्ध कप भरें जो फ़िल्टर किए गए डियोनाइज्ड पानी या बफर के साथ बर्फ क्रिस्टल के व्यास से लगभग दोगुना होता है, जो लगभग 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होता है। ठंडी उंगली से बंधे बर्फ क्रिस्टल को कप में जलमग्न करें और अतिरिक्त पानी या बफर को हटा दें ताकि बर्फ क्रिस्टल का शीर्ष तरल परत के साथ लगभग स्तर पर हो और बर्फ कप की दीवारों को नहीं छू रही है।
    1. कप को इन्सुलेशन के साथ कवर करें और तापमान को -5 डिग्री सेल्सियस तक कम करें।
    2. बर्फ क्रिस्टल के लिए लगभग 1 घंटे रुको एक गोलार्द्ध में फार्म, अपनी स्थिति की जांच लगभग हर 20 मिनट (चित्रा 2C)।
    3. बर्फ पिघलने और बर्फ क्रिस्टल बढ़ रही द्वारा गोलार्द्ध कप का आकार ले जाएगा, लेकिन यह कप दीवारों को छूने के लिए कभी नहीं अतिवृद्धि करना चाहिए । दीवार और गोलार्द्ध के बीच कम से कम 1 सेमी का अंतर होना चाहिए और ठंडी उंगली बर्फ से नहीं फैलनी चाहिए।
  4. बर्फ क्रिस्टल से कप निकालें और 25-30 मिलीलीटर और वांछित विश्लेषण एकाग्रता की अंतिम मात्रा में फ्लोरोसेंट प्रोटीन समाधान जोड़ें, कप में कुल तरल मात्रा को अपरिवर्तित रखने के लिए सावधान रहें। एक ठेठ एएफपी एकाग्रता 0.1 मिलीग्राम /
    1. बर्फ क्रिस्टल को कप में फिर से सबमिट करें ताकि बर्फ क्रिस्टल का शीर्ष तरल के साथ स्तर पर हो और बर्फ क्रिस्टल कप की दीवारों (चित्रा 2D)को नहीं छू रहा है।
    2. ठंडी उंगली के तापमान को -8 डिग्री सेल्सियस तक छोड़ दें और प्रोटीन समाधान को 2-3 घंटे के लिए बर्फ क्रिस्टल में फ्रीज कर दें, समाधान को अक्सर हिलाते हैं। प्रोटीन सॉल्यूशन से बनने वाली बर्फ की ग्रोथ रोकने से पहले कम से कम 5 एमएम होनी चाहिए।
  5. अभी भी ठंडी उंगली से जुड़े हुए कप से बर्फ क्रिस्टल निकालें। ठंडी उंगली के माध्यम से शीतलक को 0 डिग्री सेल्सियस से ऊपर तक गर्म करके उत्तरार्द्ध से बर्फ को अलग करें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि बर्फ क्रिस्टल पिघल न जाए।
  6. क्रिस्टल फ्लैट साइड को एक साफ सतह पर नीचे रखें, जैसे कि एक वजनी पकवान, सावधान किया जा रहा है कि नए रूप की बर्फ को न छुएं और सौंपने से पहले कम से कम 20 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर न करें।

4. बर्फ के एंटीफ्रीज-प्रोटीन-बाध्य विमानों का दृश्य

  1. फ्लोरेसेंस का विज़ुअलाइज़ेशन एक अंधेरे फ्रीजर या कोल्ड रूम में किया जाता है, बर्फ क्रिस्टल फ्लैट साइड को तरंगदैर्ध्य विशिष्ट उत्तेजन फिल्टर के साथ लैंप के नीचे रखकर फ्लोरोसेंट लेबल और कैमरा उत्सर्जन फिल्टर को उत्तेजित करने के लिए किसी अन्य गैर-विशिष्ट प्रकाश को अवरुद्ध करने के लिए किया जाता है। पैटर्न के आधार पर, एएफपीएस से बंधे बर्फ के विमानों का अनुमान लगाया जा सकता है (चित्रा 4)।
  2. यदि तरंगदैर्ध्य विशिष्ट रोशनी उपलब्ध नहीं है एक यूवी लाइट बॉक्स के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  3. पारंपरिक बर्फ के etches को भी कम से कम 3 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर आइस गोलार्द्ध को अधीन करने की अनुमति देकर किया जा सकता है, जिसके बाद अवशिष्ट प्रोटीन पाउडर बर्फ की सतह (चित्रा 5)पर दिखाई दे सकता है।
  4. चरण 2.3 को पूरा बर्फ गोलार्द्ध के -अक्षों के अभिविन्यास को निर्धारित करने के लिए दोहराया जा सकता है।

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Representative Results

तैयारी और एकल बर्फ क्रिस्टल के बढ़ते FIPA प्रक्रिया के दो कदम हैं, जहां त्रुटियों सबसे अधिक किया जाता है । यह निर्धारित करना कि तैयार आइस क्रिस्टल को पार पोलरॉइड (चित्रा 1D)के माध्यम से जांच करके किया जाता है, जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग के चरण 2.1 में उल्लिखित है। यदि एफआईपीए विश्लेषण के लिए मल्टीक्रिस्टलाइन आइस क्रिस्टल का उपयोग किया जाता है, तो परिणाम सुसंगत बाध्यकारी पैटर्न (चित्रा 6B)के बिना गोलार्द्ध पर एएफपीएस का असतत बाध्यकारी होगा। यदि बर्फ क्रिस्टल इंटरफेस बर्फ विमानों के आसपास स्थित है जो एएफपी अंतिम परिणाम बांधता है व्याख्या योग्य नहीं हो सकता है । इस कारण से, अगले चरणों पर जाने से पहले बर्फ क्रिस्टल को ध्यान से व्यक्तित्व की जांच की जानी चाहिए। FIPA विश्लेषण के लिए एकल बर्फ क्रिस्टल होने की संभावना को बढ़ाने के लिए कई एक ही समय में किया जाना चाहिए ।

एक और आम त्रुटि गलत तरीके से बढ़ते के दौरान ठंडी उंगली के साथ क्रिस्टल चेहरे संरेखित है । प्राथमिक या माध्यमिक चश्मे को ठंडी उंगली के लंबवत चेहरे को माउंट करने के लिए, एकल बर्फ क्रिस्टल को पहले बर्फ के खड़ा होने से उन्मुख किया जाना चाहिए, फिर स्टार के आकार के नक़्क़ाशी (आंकड़े 2 ए और 3)के अभिविन्यास के आधार पर काटा जाना चाहिए, जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग के चरण 2.3 में उल्लिखित है। यदि बर्फ क्रिस्टल को गलत तरीके से रखा जाता है तो अंतिम परिणाम एक गोलार्द्ध का उत्पादन करेगा जहां गोलार्द्ध की भूमध्य रेखा बर्फ विमानों (चित्रा 6C)की समरूपता के साथ संरेखित नहीं होती है। हालांकि यह एक व्याख्यात्मक परिणाम है, यह एक सही ढंग से गठबंधन बर्फ क्रिस्टल की तुलना में कम जानकारीपूर्ण होगा क्योंकि गोलार्द्ध की सबसे बड़ी परिधि भूमध्य रेखा (चित्रा 4)पर है।

Figure 1
चित्रा 1. बढ़ते और बढ़ते एकल बर्फ क्रिस्टल के लिए उपकरण। A)पीवीसी मोल्ड्स। B)पीवीसी मोल्ड्स के साथ एथिलीन ग्लाइकोल बाथ में पैन। C)सफेद तीर द्वारा दिखाए गए एथिलीन ग्लाइकोल के प्रवाह के साथ ठंडी उंगली। सफेद धराशायी रेखा ठंडी उंगली की भीतरी दीवार को इंगित करती है। घ)एक बर्फ क्रिस्टल उन्मुख करने के लिए पार पोलारॉइड का आरेख। प्रकाश स्रोत पीला है, पार पोलारॉइड ग्रे हैं और एकल बर्फ क्रिस्टल सफेद है। पोलरॉइड (ग्रे तीर) और आइस क्रिस्टल ओरिएंटेशन (लाल तीर) का अभिविन्यास इंगित किया जाता है। बाएं से दाएं बर्फ क्रिस्टल इस तरह उन्मुख है कि सी-अक्ष नीचे पोलरॉइड, 45 डिग्री से नीचे पोलरॉइड और घटना प्रकाश के समानांतर लंबवत है। प्रकाश गुजर हालांकि पार पोलरॉइड और बर्फ बर्फ क्रिस्टल के अभिविन्यास के आधार पर शीर्ष पोलरॉइड के माध्यम से अंधेरे, प्रकाश, या बेहोशी से बहुरंगी दिखाई देगा। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2। FIPA के लिए आइस क्रिस्टल तैयार करना। ए)हेक्सागोनल समरूपता के साथ बर्फ नक़्क़ाशी द्वारा कुल्हाड़ियों झुकाव का निर्धारण करना। क्रिस्टल का बेसल प्लेन पेज के प्लेन के समानांतर है। ख)ठंडी उंगली पर एकल बर्फ क्रिस्टल बढ़ते । ग) गोलार्द्ध में बनाने के बाद बर्फ । घ)बर्फ गोलार्द्ध प्रोटीन समाधान से भरा गोलार्द्ध कप में डूबा हुआ है। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3। ओरिएंटेशन के आधार पर बढ़ते बर्फ क्रिस्टल। A)के साथ बढ़ते बर्फ का आरेख (i) बेसल प्लेन, (ii) एक प्राथमिक चश्मे का विमान, और (iii) ठंडी उंगली के लंबवत एक माध्यमिक चश्मे का विमान। झुकाव (ii) और (iii) के लिए बर्फ क्रिस्टल को आधे में काटा जाना चाहिए, जैसा कि आंकड़े में दिखाया गया है। B)प्रशांत नीले लेबल प्रकार III nfeAFP8 के FIPA परिणाम के साथ बढ़ते बर्फ क्रिस्टल के बाद (i) बेसल विमान और (ii) एक प्राथमिक चश्मे विमान ठंडी उंगली के लंबवत । बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4. FIPA विश्लेषण परिणामों से एएफपी-बाध्य विमानों की व्याख्या । A)आईएच बर्फ के बाध्य विमानों का प्रतिनिधित्व; और ख)इसी FIPA विश्लेषण परिणाम जब एकल बर्फ क्रिस्टल एक प्राथमिक चश्मे विमान ठंडी उंगली के लंबवत के साथ मुहिम शुरू की है । पैनल (i) बेसल विमान, (ii) प्राथमिक चश्मे विमान, (iii) माध्यमिक चश्मे विमान, (iv) पिरामिड विमान ए-कुल्हाड़ियोंके साथ गठबंधन का प्रतिनिधित्व करते हैं, और (v) पिरामिड विमान एक-कुल्हाड़ियोंके लिए ऑफसेट होता है। C)एफ़पी के समाधान में उगाए जाने वाले एक आइस क्रिस्टल की आकृति विज्ञान जो पिरामिड विमानों को बांधता है) ए-कुल्हाड़ियोंऔर ii के अनुरूप) ए-कुल्हाड़ियोंसे ऑफसेट होता है। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5। पारंपरिक बर्फ etches बनाम FIPA की तुलना। A) (i) शीतकालीन फ्लॉन्डर(स्यूडोप्लेनेक्ट्स अमेरिकनस)द्वारा उत्पादित टाइप I एएफपी (एचपीएलसी6 आइसोफॉर्म) का पारंपरिक नक़्क़ाशी मूल रूप से नाइट एट अल(1991) द्वारा उत्पादित दिखाया गया है। (ii) टीआरआईटीसी के साथ लेबल किए गए उसी प्रोटीन का संबंधित एफआईपीए विश्लेषण। B)(i) एक चौगुनी IBS उत्परिवर्ती (V9Q/V19L/G20V/I41V) के प्रकार III nfeAFP11 (जापानी ईल पोटा Zoarces लम्बीसे)21के पारंपरिक नक़्क़ाशी । (ii) टीआरआईटीसी के साथ लेबल किए गए उसी प्रोटीन का संबंधित एफआईपीए विश्लेषण। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6. सामान्य एफआईपीए विश्लेषण त्रुटियों के परिणामस्वरूप गोलार्द्ध। GFP-टैग प्रकार III HPLC12-A16H पर विश्लेषण किया गया । A)तुलना के लिए एक इष्टतम FIPA परिणाम। बर्फ क्रिस्टल ठंडी उंगली के लिए लंबवत अपने प्राथमिक चश्मे विमान के साथ मुहिम शुरू की थी । B)FIPA विश्लेषण जो अनजाने में एक से अधिक क्रिस्टल से बना बर्फ गोलार्द्ध का उपयोग करके आयोजित किया गया था । C)FIPA विश्लेषण जो एक गलत लहस्ती एकल बर्फ क्रिस्टल पर आयोजित किया गया था। माध्यमिक चश्मे विमान ठंडी उंगली के लिए बिल्कुल लंबवत नहीं था । बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7। विभिन्न AFPs के बर्फ बाध्यकारी पैटर्न की तुलना करने के लिए FIPA विश्लेषण का उपयोग करना। प्रशांत नीले लेबल प्रकार III nfeAFP8 TRITC लेबल प्रकार मैं एएफपी के साथ संयुक्त किया गया था और एक एकल FIPA विश्लेषण आयोजित किया गया था । A)केवल टाइप III nfeAFP8 का दृश्य। B)केवल टाइप आई एएफपी का दृश्य। C)टाइप III nfeAFP8 और टाइप आई एएफपी का विजुअलाइजेशन एक साथ। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्रा 8। मामूली सक्रिय और अतिसक्रिय एएफपी का एफआईपीए। A)तीन अलग-अलग मामूली सक्रिय मछली एएफपी का एफआईपीए विश्लेषण; (i) ट्राइटीसी-लेबल टाइप I AFP (HPLC6 isoform, स्यूडोप्लेन्स अमेरिकनस),(ii) ट्राइटीसी-लेबल टाइप II एएफपी (सीए2+-इंडिपेंडेंट आइसोफॉर्म, लंग्सनआउट शिकारी), (iii) प्रशांत-नीले लेबल वाले प्रकार III एएफपी (nfeAFP8 आइसोफॉर्म, जोरसेसgat elonuskner)। B)तीन अलग अतिसक्रिय एएफपी का FIPA विश्लेषण; (i) जीएफपी-टैगेड मप्रAFP_RIV(मैरिनोमोनास प्राइमेरिनेन्सिस),(ii) ट्राईटीसी लेबल वाले एसबीडब्ल्यूएएफपी(चोरिस्टोनुरा फ्यूमिफेराना),(iii) जीएफपी-टैगेड टीएमएएफपी(टेनेब्रियो मोलिटर)। सभी छवियों में, सी-अक्ष पृष्ठ के विमान के लंबवत है। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 9
चित्रा 9। विभिन्न प्रकार III एएफपी आइसोफॉर्म और म्यूटेंट11,21के आइस-क्रिस्टल आकृति विज्ञान के लिए FIPA विश्लेषण द्वारा उत्पादित फ्लोरोसेंट पैटर्न का संबंध। A)(i) जीएफपी-टैग किए गए क्यूएई-A16H का FIPA विश्लेषण। (ii) क्यूएई-ए16एच द्वारा उत्पादित आइस क्रिस्टल आकृति विज्ञान। B)(i) TRITC-लेबल nfeAFP11-V9Q का FIPA विश्लेषण । (ii) nfeAFP11-V9Q द्वारा उत्पादित आइस क्रिस्टल आकृति विज्ञान। C)(i) TRITC-लेबल वाले जंगली-प्रकार nfeAFP11 का एफआईपीए विश्लेषण। (ii) जंगली प्रकार के nfeAFP11 द्वारा उत्पादित आइस-क्रिस्टल आकृति विज्ञान। घ)(i) TRITC लेबल जंगली प्रकार nfeAFP6 के FIPA विश्लेषण । (ii) जंगली प्रकार के nfeAFP6 द्वारा उत्पादित आइस-क्रिस्टल आकृति विज्ञान। सी-एक्सिसझुकाव और स्केल बार संकेत के रूप में दिए गए हैं। बड़ी छवि देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

एएफपी के निर्धारण के लिए चार्ल्स नाइट द्वारा बर्फ नक़्क़ाशी विधि का विकास-बाध्य बर्फ विमानों ने AFPs द्वारा बर्फ बाध्यकारी के तंत्र पर बहुत उन्नत अध्ययन किया । जबकि AFPs की संरचनाओं एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी द्वारा हल किया जा सकता है२६,२७ वहां बर्फ पर पूरक सतह है जो एएफपी बाध्य deducing के लिए कोई स्पष्ट तरीका था । जब सर्दियों के फ्लॉन्डर से टाइप I एएफपी को शुरू में विशेषता थी, तो यह28बर्फ के प्राथमिक चश्मे के विमानों से बांधने के लिए परिकल्पना की गई थी। हालांकि, नाइट के प्रकार के बर्फ नक़्क़ाशी प्रयोगों को तोड़ने की जमीन मैं एएफपी से पता चला है कि वे बर्फ13के पिरामिड विमानों के लिए बांध । इस परिणाम ने एएफपी अनुसंधान समुदाय को एएफपी आइस बाइंडिंग के तंत्र पर पुनर्विचार करने और एएफपीएस9के बर्फ-बाध्यकारी चेहरे को अधिक सटीकता से निर्धारित करने के लिए प्रेरित किया । नाइट के मूल बर्फ नक़्क़ाशी प्रयोग एएफपी उत्पादक जीवों से शुद्ध देशी AFPs का उपयोग किया गया । पुनः संमिलित एएफपीएस के विकास और जीएफपी टैग के बढ़ते उपयोग के साथ, इन अध्ययनों को कई अन्य एएफपीएस29तक विस्तारित करने का अवसर मिला ।

सहसंयोजक फ्लोरोसेंट प्रोटीन रंगों को शामिल करने का विचार, जैसे टेट्रामेथाइलरोडमाइन-5-(और 6)-आइसोथियोसायनेट (ट्राइटीसी), विश्लेषण में जीएफपी-फ्यूज्ड एएफपी एफआईपीए की सफलता के बाद ही आया11का विश्लेषण । चिमरिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग और सहसंयोजक रंगों द्वारा रासायनिक संशोधनों को AFPs (चित्रा 5)के बर्फ बाध्यकारी पैटर्न को प्रभावित नहीं करने के लिए देखा गया है । पूर्व के साथ, जीएफपी को एएफपी के एन-या सी-टर्मिनल सिरों से जोड़ा जाता है, जिन्हें अक्सर आईबीएस से अच्छी तरह से हटा दिया जाता है। इसके अलावा, एक लचीला लिंकर जीएफपी और एएफपी के बीच डाला जा सकता है टैग बर्फ की सतह से दूर धकेल दिया जा करने की अनुमति । बाद लेबलिंग रणनीति के साथ, सहसंयोजक रंगों के साथ प्रतिक्रिया करने वाली आवेशित साइड चेन आमतौर पर आईबीएस से दूर सतहों पर होती हैं। यदि फ्लोरोसेंटली लेबलिंग AFPs के लिए यहां प्रस्तुत रणनीतियों काम नहीं करते हैं, थिओल प्रतिक्रियाशील रंगों के साथ प्रतिक्रिया के लिए IBS से दूर एक सिस्टीन की शुरूआत एक और विकल्प30है । फ्लोरोसेंट लेबल सुनिश्चित करने के लिए उपाय करके एएफपी बर्फ बाध्यकारी को प्रभावित नहीं करते हैं, जैसा कि थर्मल हिस्टीरेसिस गतिविधि और आइस क्रिस्टल आकृति विज्ञान द्वारा आंका जाता है, हमें विश्वास है कि FIPA विश्लेषण एएफपी बर्फ बाध्यकारी पैटर्न का सही प्रतिनिधित्व दिखाता है, जैसा कि यह मूल बर्फ-नक़्क़ाशी विधि में किया था ।

FIPA विश्लेषण के लिए एफएफपी को लेबल करने के लिए फ्लोरोसेंटी रूप से कई लाभ हैं। इस प्रक्रिया के लिए कम समय की आवश्यकता है क्योंकि एएफपी-बाध्य विमानों के दृश्य के लिए बर्फ की उदात्तीकरण की आवश्यकता नहीं है । गोलार्द्ध में लेबल प्रोटीन के समावेश की निगरानी प्रयोगात्मक पूर्णता का आकलन करने के लिए बर्फ के विकास के दौरान की जा सकती है और एएफपी-बाध्यकारी पैटर्न किसी भी बिंदु पर दर्ज किया जा सकता है । यह अनावश्यक रूप से लंबे प्रयोगों, या बर्फ के विकास के समय से पहले पूरा होने से रोकता है । फ्लोरोसेंट लेबलिंग नक़्क़ाशी के साथ पहले से संभव की तुलना में स्पष्ट एएफपी-बाध्यकारी पैटर्न दृश्य की अनुमति देता है, जैसा कि टाइप I और टाइप III एएफपीएस (चित्रा 5)पर लागू दोनों तरीकों से परिणामों की तुलना में देखा जाता है। हालांकि, एक के बाद FIPA बर्फ-etch आसानी से कई घंटे के लिए एक फ्रीजर में गोलार्द्ध रखकर आयोजित किया जा सकता है, जिसका अर्थ है कि दोनों विश्लेषण एक ही नमूने पर किया जा सकता है के बाद से इसी तरह एएफपी सांद्रता दोनों तरीकों के लिए आवश्यक हैं । FIPA का एक मूल्यवान लाभ एक ही बर्फ गोलार्द्ध (चित्रा 7)पर एक से अधिक अलग लेबल एएफपी कल्पना करने की क्षमता है । यह विभिन्न एएफपी प्रकार, आइसोफॉर्म और गतिविधि म्यूटेंट के साथ देखे गए एएफपी आइस-बाइंडिंग विमानों में मतभेदों को चित्रित करने के लिए उपयोगी है।

FIPA विश्लेषण पहले से ही कई एएफपी अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है । इसका उपयोग इस परिकल्पना का समर्थन करने के लिए किया गया है कि बेसल प्लेन बाइंडिंग अतिसक्रिय एएफपीएस के लिए अद्वितीय है और उनकी उच्चगतिविधिके लिए आवश्यक है । मामूली रूप से सक्रिय AFPs बेसल विमान (चित्रा 8A) बांध नहीं पाया गया, लेकिन कई अतिसक्रिय AFPs पूरी तरह से बर्फ गोलार्द्ध को कवर, बर्फ के बेसल विमान सहित (चित्रा 8B)5,20,31। विशिष्ट बर्फ-बाध्यकारी अवशेषों के कार्य का अध्ययन करने के लिए एफआईपीए विश्लेषण का भी उपयोग किया गया है। उदाहरण के लिए, एफआईपीए विश्लेषण कई प्रकार III आइसोफॉर्म और म्यूटेंट पर किया गया था, जिनमें से कुछ बर्फ के विकास को रोकते हैं, और जिनमें से कुछ केवल बर्फ11,21,32को आकार देने के लिए पाए गए हैं। अध्ययनों से, यह पाया गया कि विशेष अवशेष बर्फ में AFPs के समावेश में महत्वपूर्ण हैं और अन्य बर्फ विमान विशिष्टता (चित्रा 9)में महत्वपूर्ण हैं।

एकल बर्फ क्रिस्टल पर एएफपी-बाध्यकारी पैटर्न का अध्ययन करने के लिए अन्य तरीकों में फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी१६,३३ और माइक्रोफ्लुइडिक्स३४द्वारा प्रत्यक्ष अवलोकन शामिल है । इन तरीकों बर्फ के लिए एएफपी के लगाव के गतिशील के लिए संवेदनशीलता का लाभ है और बर्फ के लिए एएफपी की आत्मीयता के साथ simultaneity आकार देने बर्फ की निगरानी, लेकिन कम मजबूत बर्फ विमानों के लिए आत्मीयता का निर्धारण करने में FIPA विधि की तुलना कर रहे हैं । आणविक गतिशीलता का उपयोग एएफपीएस12,20,21,30,35की आइस-प्लेन बाइंडिंग विशिष्टता की भविष्यवाणी करने के लिए भी किया जा रहा है। FIPA विश्लेषण का उपयोग करना, अन्य उपलब्ध तकनीकों के साथ, हम प्रत्येक AFPs के बर्फ विमान बाध्यकारी पैटर्न सीख रहे हैं, बर्फ विमानों के चयन में IBS की संरचना के महत्व, और कैसे विशिष्ट विमानों के बाध्यकारी एएफपी गतिविधि से संबंधित है ।

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Disclosures

हितों का कोई टकराव घोषित नहीं किया गया ।

Acknowledgments

PLD प्रोटीन इंजीनियरिंग में कनाडा अनुसंधान कुर्सी रखती है । इस काम को कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थानों से पीएलएडी के लिए अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था । इस काम को जापान सोसायटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (जेएसपीएस) (नंबर 23310171) और जापान बायो ओरिएंटेड टेक्नोलॉजी रिसर्च एडवांसमेंट इंस्टीट्यूशन (ब्रेन) से वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए ग्रांट-इन-एड का भी समर्थन मिला । हम अग्रणी काम है कि FIPA के नेतृत्व के लिए Drs. क्रिस मार्शल और माइक Kuiper के लिए आभारी हैं । हम इस कार्य में से कुछ के लिए सुविधाएं प्रदान करने के लिए और फ्लोरोसेंट प्रकाश उमंग और उत्सर्जन फिल्टर स्थापित करने के लिए डॉ लॉरी ग्राहम को भी आभारी हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NESLAB RTE Refrigerating Bath/Circulators Thermo Scientific RTE7
Ethylene glycol, Premixed Antifreeze/Coolant Certified 29-3037-0 Common automotive antifreeze
Cold finger not available not available Custom made with brass (9 cm long, 1.5 cm outer diameter)
Hemispherical cup not available not available Custom made with resin (8 cm outer diameter, 6 cm inner diameter)
High Dual Output Lighting System Lightools Research LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX Additional and custom excitation filters can be purchased from Lightools Research
Camera Canon EOS 50D
Emission Filters Lightools Research LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG Filter ring adapter may be required to fit filter onto camera lens

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References

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रसायन विज्ञान अंक ८३ सामग्री जीवन विज्ञान प्रकाशिकी एंटीफ्रीज प्रोटीन बर्फ सोखने फ्लोरोसेंट लेबलिंग बर्फ जाली विमानों बर्फ बाध्यकारी प्रोटीन एकल बर्फ क्रिस्टल
फ्लोरेसेंस आधारित आइस प्लेन एफ़िनिटी द्वारा एंटीफ्रीज प्रोटीन के आइस-बाइंडिंग विमानों का निर्धारण
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Basu, K., Garnham, C. P., Nishimiya, … More

Basu, K., Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Braslavsky, I., Davies, P. Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity. J. Vis. Exp. (83), e51185, doi:10.3791/51185 (2014).

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