Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Определение ледовязающих плоскостей антифризовых белков с помощью флуоресценции на основе аффинити ледовой плоскости

Published: January 15, 2014 doi: 10.3791/51185
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4, 1
1Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, 2National Institute of Neurological Disorders and Stroke, Porter Neuroscience Research Center, 3Research Institute of Genome-Based Biofactory, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 4The Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Institute of Biochemistry, Food Science, and Nutrition, The Hebrew University of Jerusalem

Summary

Антифризовые белки (AFPs) связываются с определенными плоскостями льда для предотвращения или замедления роста льда. Анализ сродства ледовых плоскостей на основе флуоресценции (FIPA) является модификацией оригинального метода травления льда для определения ледовых плоскостей, связанных с AFP. AFPs флуоресцентно помечены, включены в макроскопические одиночные кристаллы льда, и визуализированы под ультрафиолетовым светом.

Abstract

Антифризные белки (AFPs) выражаются в различных холодоугодных организмах для предотвращения или замедления внутреннего роста льда. AFPs связывают к специфически плоскостям льда через их лед-связывающие поверхности. Анализ сродства ледяной плоскости на основе флуоресценции (FIPA) представляет если использоваться для определения ледяных плоскостей, к которым связываются AFPs. FIPA основана на оригинальном методе офорта льда для определения ледовых самолетов, связанных с AFP. Он производит более четкие изображения в сокращенное экспериментальное время. В анализе FIPA, AFPs флуоресцентно помечены химерным тегом или ковалентным красителем, затем медленно включаются в макроскопический одиночный кристалл льда, который был предварительно создан в полушарии и ориентирован для определения а- и c-осей. Ледяное полушарие, связанное с AFP, изображено под ультрафиолетовым светом для визуализации плоскостей, связанных с AFP, с помощью фильтров для блокирования неспецифического света. Флуоресцентная маркировка AFPs позволяет в режиме реального времени контролировать Аосорпирование AFP во льду. Было установлено, что этикетки не влияют на самолеты, к которым связывают afPs. Анализ FIPA также вводит возможность связывать более одного по-разному помеченного AFP на одном и том же кристалле льда, чтобы помочь дифференцировать их связывающие плоскости. Эти применения FIPA помогают продвинуть наше понимание того, как AFPs связываются со льдом, чтобы остановить его рост и почему многие организмы, производящие AFP, выражают многочисленные АФП-изоформы.

Introduction

Производство антифризовых белков (AFPs) является важным механизмом выживания некоторых организмов, которые живут в среде, нагруженной льдом. До недавнего времени считалось, что единственной функцией AFPs было предотвращение или замедление роста внутренних кристаллов льда, которые блокировали бы кровообращение, причиняли повреждение тканей и осмотическое напряжение. Организмы, которые не могут терпеть какой-либо степени замерзания, такие как рыба, выражают AFPs полностью препятствовать росту кристалла льда1. Другие, такие как трава, замерзают толерантно и выражают AFPs для того чтобы ингибировать recrystallization льда который уменьшает образование больших кристаллов льда в ихтканях 2. Стабилизация мембран при низкой температуре является еще одной функцией, которая была предложена для AFPs3. Недавно была предложена новая роль для AFP антарктической бактерии, Marinomonas primoryensis, от покрытых льдом солоноватыхозер 4. Это AFP является частью гораздо большего белка адгезин5, который, как полагают, прикрепить бактерии к льду для лучшего доступа к кислороду и питательнымвеществам 6. Другие микробы, как известно, выделяет AFPs, которые могут изменить структуру льда, в котором они живут7.

AFPs были найдены в некоторых рыб, насекомых, растений, водорослей, бактерий, диатомовых и грибков. Они имеют удивительно различные последовательности и структуры в соответствии с их эволюцией от различных прародителей в различных случаях; и все же все они связываются со льдом и препятствуют его росту механизмом ингибирования адсорбции8. AFPs каждый из них имеет определенную поверхность, которая выступает в качестве своего ледовязательного участка (IBS). Они, как правило, были определены на сайте направлены мутагенез поверхностныхостатков 9-11. Предполагается, что IBS организует молекулы воды в ледопоем узоре, который соответствует конкретным плоскостям льда. Таким образом AFP формирует свой ligand перед связывать к ему5, 12. Ледяные плоскости могут быть определены их индексами Миллера, и различные AFPs могут связываться с различными плоскостями. Таким образом, тип I AFP от зимней камбалы связывается с 20-21 пирамидальныхплоскостей 13, тип III AFP связывает как первичную призму и пирамидальные плоскости с помощью соединения ледовязнойповерхности 11,14, в то время как ели budworm AFP, гиперактивный AFP, связывается одновременно как с первичными и базальнымиплоскостями 15,16. Другие гиперактивные AFPs, такие как MpAFP, связываются с несколькими плоскостями льда, о чем свидетельствует их полное покрытие одного полушариякристалла льда 5,17. Предполагается, что способность гиперактивных AFPs связывать базальные плоскости, а также другие плоскости, может объяснить их 10-кратную более высокую активность над умеренно активными AFPs18. Хотя эффективность гиперактивных AFPs хорошо документирована, их способность связываться с несколькими плоскостами льда до сих пор не понята.

Оригинальный метод определения AFP-связанных ледяных самолетов был разработан Чарльз Найт13,19. В этом методе макроскопический одиночный кристалл льда устанавливается на полый металлический стержень (холодный палец) и образуется в полушарии, погружая его в полушарие чашку, наполненную дегазацией воды. Затем полушарие погружается в разбавленный раствор AFPs и слой льда выращивается из раствора AFP в полушарии кристалла льда в течение нескольких часов, контролируемых температурой этиленгликола, циркулирующего через холодный палец. Кристалл льда удаляется из раствора, отделяется от холодного пальца и помещается в морозильную камеру от -10 до -15 градусов по Цельсию. Поверхность соскаблит острым лезвием, чтобы удалить замороженную поверхностную пленку раствора белка антифриза, а кристалл льда может сублимироваться не менее 3 часов. После сублимации ледяные плоскости, связанные AFPs, можно рассматривать как белые травленные узоры, полученные из остаточного белка. Ледяное полушарие может быть ориентировано на его c-оси иосей, чтобы найти базальные и призмы плоскостей льда, и определить миллер индексы травления патчи.

Здесь мы описываем модификацию оригинального метода определения AFP-связанных плоскостей льда, метод, который мы называем флуоресценцией на основе сродства ледяной плоскости (FIPA)11. AFPs флуоресцентно помечены либо химерные метки, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP)11,16,17,20, или с флуоресцентным красителем ковалентно связаны с AFP5,21. Флуоресцентно помеченные AFPs адсорбированы к одному кристаллу льда и заросли с помощью той же экспериментальной процедуры, что и оригинальные эксперименты по травлению льда. Степень привязки AFP к растущему полушарию льда может контролироваться на протяжении всего эксперимента с помощью ультрафиолетовой (УФ) лампы. После завершения эксперимента полушарие может быть непосредственно снято с холодного пальца и изображено без сублимации. Однако, при желании, полушарие может быть оставлено на сублимировать, чтобы визуализировать традиционный ледяной etch. Изменения, внесенные в методологию FIPA, сокращают традиционный протокол травления льда на несколько часов. Кроме того, существует потенциал для одновременного изображения нескольких AFPs, каждый с другой флуоресцентной этикеткой, чтобы визуализировать перекрывающиеся модели AFP-связанных ледяных плоскостей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Выращивание одиночных кристаллов льда

  1. Возьмите чистую металлическую кастрюлю (диаметр 15 см, высотой 4,5 см), которая вписывается в охлаждающую ванну этиленгликоль и может плавать на ней.
  2. Приготовьте цилиндрические формы поливинилхлорид (ПВХ) диаметром 4,5 см, высотой 3-4 см, толщиной 4 мм, распиловка секций из трубы.
    1. Вырезать выемку, (1 мм в ширину, 2 мм в высоту) с одной стороны (рисунок 1A).
    2. Подготовка столько форм, которые могут поместиться комфортно в кастрюлю (рисунок 1B).
      Примечание: Исследование показало, что поливиниловый спирт (PVA) может повлиять на ядро льда22. Однако в нашей открытой системе ПВХ мы не сталкивались с проблемами нетипичного образования льда.
  3. Нанесите легкую пленку вакуумной смазки на нижнее поверхностное кольцо каждой формы, которая является поверхностью с вырезом вырезать. Печать этой смазанный, зазубрины поверхности на металлическую кастрюлю с вырезами ориентированы от центра кастрюли. Будьте осторожны, чтобы не заполнить или помешать выемки с жиром.
  4. Добавьте 0,22 мкм фильтруемой и дегазации / деионизированной воды в центре кастрюли, но за пределами формы, и позволяют воде медленно проникать в формы через вырезы. Будьте осторожны, чтобы не ввести любые пузыри. Глубиной в слой воды должно быть около 5 мм.
  5. Поместите кастрюлю в контролируемую температурой ванну с этиленгликольом, охлаждаемую до -0,5 градусов по Цельсию. Сковорода должна быть идеально уровневой. При необходимости добавьте балластные веса по бокам кастрюли.
  6. После того, как кастрюля и вода достигли -0,5 градусов по Цельсию, добавьте небольшой кусочек льда к середине кастрюли, за пределами формы.
    1. Это будет нуклеат роста льда в суперколаемой воде по всей кастрюле и в формы. Небольшая выемка в нижней части каждой формы позволяет только один кристалл льда размножаться через, в результате чего один кристалл льда в каждой форме.
    2. Инкубировать на ночь, чтобы сформировать слой льда.
  7. В течение следующих трех дней добавляйте по 13 мл 4 градусов по Цельсию дегазированную/деионизированную воду в каждую форму один раз в день и опускайте температуру этиленгликоля после каждого добавления к -0,8 градусов по Цельсию в первый день, до -1,1 градусов по Цельсию на второй день и до -1,5 градусов по Цельсию на третий день.
    1. Инкубировать при таких температурах на ночь.
    2. К четырем дням формы должны быть полностью заполнены льдом.
  8. Вытяните формы с кастрюли, нажмите кристаллы льда из формы, и хранить на чистой поверхности, такие как лодка для взвешивания, в морозильной камере -20 градусов по Цельсию в течение примерно 1 часа до обработки.
  9. Вместо того, чтобы готовить много небольших одиночных кристаллов льда, большой одиночный кристалл льда объемом в несколько литров может быть подготовлен в инкубаторе постоянной температуры, как описаноРыцарем 23. Большой кристалл льда может храниться в течение года или более, если храниться в морозильной камере от -15 до -20 градусов по Цельсию. Части одного кристалла могут быть вырезаны из ледяной глымы с пилой по мере необходимости.

2. Определение сингулярности и ориентации ледового кристалла

  1. Определите, является ли лед, исключенный из формы, одним кристаллом, наблюдая в морозильной камере, между двумя скрещенными поляроидами (рисунок 1D).
    1. Если кристалл льда одинок, то никаких трещин или разрывов не должно быть видно, и направление света не должно меняться внутри кристалла льда.
      Примечание: Если морозильная камера недоступна, холодная комната может быть использована вместо этого во всех необходимых шагов, будучи осторожным, чтобы работать быстро и обрабатывать лед экономно.
  2. Из-за ледовой бирифрингии можно одновременно определить ориентациюc-оси. Используйте следующую информацию для определения ориентации:
    1. Когда c-осьточно параллельна свету случая, в теории, никакой свет не пройдет через скрещенные polaroids. Если случайный свет называется немного параллельно с c-оси,единый многоцветный спектр света передается через кристалл, когда он вращается между скрещенными поляроидами. Эта однородная передача возникает из оптической бездействия льда Ih вдоль его c-оси24. Базальная плоскость ледяного кристалла нормальная для c-оси.
    2. Когда c-осьдальше от параллельного к свету инцидента и кристалл льда вращается между скрещенными поляроидами, передаваемый свет будет чередоваться между 0-100% передачей с каждым 90 "вращения кристалла.
    3. Чаще всего, c-осибудет нормальным для круговой плоскости цилиндрического кристалла льда.
  3. Определите ориентацию топоровпо ледорубу25, что делается путем плотного обертывания кристалла льда в алюминиевую фольгу, тыкать небольшим отверстием с иглой в фольгу во льду на базальной плоскости (нормально к c-оси),и помещая его под вакуум в течение 20 минут.
    1. Эта обработка вызойет etch с шестиугольной симметрией на базальной плоскости, где-осибегут через vertices шестисторонней звезды (рисунок 2A).
    2. При желании кристалл льда можно разрезать пилой параллельной или перпендикулярной одной стороне шестиугольника, чтобы смонтировать его с первичной или вторичной плоскости призмы перпендикулярно холодному палецу, соответственно (рисунок 3).

3. Adsorption флуоресцентно помеченных белков антифриза к одному кристаллу льда

  1. Намонтировать один кристалл льда на холодный палец (рисунок 1C) сначала скучно полости в верхней части кристалла. Для этого чередуйте таяние льда с двумя алюминиевыми стержнями немного разного диаметра, но похожими на диаметр холодного пальца, чтобы сформировать полость, в которую может поместиться холодный палец.
  2. Охладите холодный палец до -0,5 градусов по Цельсию, поместите в ледяную полость и удерживайте кристалл льда на месте, пока он не замерзнет до металла (рисунок 2B). Избегайте пузырьков воздуха при прикреплении кристалла к пальцам, поскольку они препятствуют эффективной передаче тепла от пальца к стержням.
  3. Заполните чашку полушария, которая примерно в два раза больше диаметра кристалла льда с фильтрованной деионизированной водой или буфером, охлажденным примерно до 4 градусов Цельсия. Погрузите холодный кристалл льда, связанный пальцем, в чашку и удалите излишки воды или буфера таким образом, чтобы верхняя часть кристалла льда была примерно на уровне жидкого слоя, а лед не касался стенок чашки.
    1. Накройте чашку изоляцией и подохвьте температуру до -5 градусов по Цельсию.
    2. Подождите около 1 часа для кристалла льда, чтобы сформировать в полушарии, проверяя его состояние примерно каждые 20 минут (рисунок 2C).
    3. Лед будет принимать форму полушария чашку путем плавления и выращивания кристалла льда, но он никогда не должен переурой прикоснуться к стенке чашки. Между стеной и полушарием должен быть не менее 1 см зазора, и холодный палец не должен выступать из льда.
  4. Снимите чашку с кристалла льда и добавьте флуоресцентный белковый раствор в конечный объем 25-30 мл и желаемую концентрацию анализа, будьте осторожны, чтобы сохранить общий объем жидкости в чашке неизменным. Типичная концентрация АФП составляет 0,1 мг/мл.
    1. Повторное выкаранить кристалл льда в чашку так, чтобы верхняя часть кристалла льда была на уровне с жидкостью, а кристалл льда не касался стен чашки (рисунок 2D).
    2. Опустите холодную температуру пальца до -8 градусов по Цельсию и дайте белковому раствору замерзнуть в кристалле льда на 2-3 часа, часто помешивая раствор. Лед, образованный из белкового раствора, должен быть не менее 5 мм, прежде чем остановить рост льда.
  5. Удалите кристалл льда из чашки, при этом при этом прикрепленный к холодному палецу. Отсоедините лед от последнего, нагревая холодильное течение через холодный палец чуть выше 0 градусов по Цельсию и подождите, пока кристалл льда растает.
  6. Поместите кристаллическую плоскую сторону вниз на чистую поверхность, например, взвешивание блюдо, будьте осторожны, чтобы не коснуться новой формы льда и хранить при -20 градусов по Цельсию, по крайней мере 20 минут перед передачей.

4. Визуализация антифриз-белковых плоскостей льда

  1. Визуализация флуоресценции делается в затемненной морозильной камере или холодной комнате, путем размещения ледяной кристалл плоской стороне вниз под лампами с длиной волны конкретных фильтров возбуждения, чтобы возбудить флуоресцентные этикетки и фильтры излучения камеры, чтобы блокировать любой другой неспецифический свет. На основе шаблона можно оценить ледяные плоскости, связанные AFPs (рисунок 4).
  2. Если длина волны конкретных огней не доступны УФ-излучение окно может быть использовано вместо.
  3. Традиционные ледяные этичи также могут быть выполнены, просто позволяя полушарию льда сублимироваться при -20 градусов по Цельсию, по крайней мере 3 часа, после чего остаточный протеиновый порошок может стать видимым на поверхности льда (рисунок 5).
  4. Шаг 2.3 может быть повторен для того, чтобы определить ориентациюосей завершенного ледового полушария.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Подготовка и монтаж одного кристалла льда являются двумя этапами процедуры FIPA, где ошибки чаще всего. Определение того, является ли подготовленный кристалл льда одиночным, делается путем изучения его через скрещенные поляроиды (рисунок 1D),как указано в шаге 2.1 раздела протокола. Если для анализа FIPA используется многокристаллический кристалл льда, то результатом будет прекращение связывания AFPs на полушарии без согласованного связывающего шаблона (рисунок 6B). Если кристаллические интерфейсы льда расположены вокруг ледяных плоскостей, к которым AFP связывает конечный результат, может быть не интерпретируемым. По этой причине кристалл льда должен быть тщательно проверен на сингулярность, прежде чем переходить к следующим шагам. Для увеличения вероятности наличия одиночных кристаллов льда для анализа FIPA несколько должны быть сделаны в то же время.

Другой распространенной ошибкой является неправильное выравнивание кристаллических лиц холодным пальцем во время монтажа. Чтобы смонтировать первичную или вторичную призму лица перпендикулярно холодному персту, один кристалл льда должен быть сначала ориентирован на ледоруб, а затем вырезать на основе ориентации звездообразного etch (рисунки 2A и 3), как указано в шаге 2.3 раздела протокола. Если кристалл льда установлен неправильно конечный результат будет производить полушария, где экватор полушария не согласуется с симметрией плоскостей льда (рисунок 6C). Хотя это интерпретируемый результат, он будет менее информативным, чем правильно выровненный кристалл льда, так как самая большая окружность полушария находится на экваторе (рисунок 4).

Figure 1
Рисунок 1. Оборудование для выращивания и монтажа одиночных кристаллов льда. A)формы ПВХ. B) Пан в ванне этиленгликоль с ПВХ формы. C)Холодный палец с потоком этиленгликоль, показанный белой стрелкой. Белая пунктирной линии указывает на внутреннюю стену холодного пальца. D) Диаграмма скрещенных поляроидов для ориентации одного кристалла льда. Источник света желтый, скрещенные поляроиды серые, а один кристалл льда белый. Показана ориентация поляроидов (серые стрелки) и ледяной кристаллической ориентации (красные стрелки). Слева направо кристалл льда ориентирован таким образом, что c-ось перпендикулярна нижней поляроидной, 45 "к нижней поляроид, и параллельно свету инцидента. Свет, проходящий, хотя скрещенные поляроиды и лед будут казаться темными, светлыми или слабо разноцветными через верхний поляроид в зависимости от ориентации ледяного кристалла. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.

Figure 2
Рисунок 2. Подготовка ледового кристалла для FIPA. A)Определение ориентаций осей на ледяной etch с шестиугольной симметрией. Базальная плоскость кристалла параллельна плоскости страницы. B)Установка одного кристалла льда на холодный палец. C)Лед после образования в полушарии. D)Ледяное полушарие погружено в полусферическую чашку, наполненную белковым раствором. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.

Figure 3
Рисунок 3. Монтаж кристалла льда на основе ориентации. A) Диаграмма монтажа льда с (i) базальной плоскости, ii) первичной плоскости призмы, и (iii) вторичной плоскости призмы перпендикулярно холодному палецу. Для ориентаций (ii) и iii) кристалл льда должен быть разрезан пополам, как показано на рисунке. B) FIPA результаты Тихоокеанского синего помечены типа III nfeAFP8 после монтажа кристаллов льда с (i) базальной плоскости и (ii) первичной призмы плоскости перпендикулярно холодный палец. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.

Figure 4
Рисунок 4. Интерпретация самолетов, связанных с AFP, из результатов анализа FIPA. A)Представление связанных плоскостей льда Ih; и B)соответствующий результат анализа FIPA, когда один кристалл льда монтируется с первичной плоскостью призмы перпендикулярно холодному палецу. Панели представляют (i) базальные плоскости, (ii) первичная плоскость призмы, (iii) второстепенная плоскость призмы, (iv) пирамидальная плоскость выровненная с-осями, и (v) пирамидальная плоскость смещена к-осям. C) Морфология одного кристалла льда при выращении в растворе AFPs, которые связывают пирамидальные плоскости i) выровненыс -оси и ii) компенсируется из-осей. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.

Figure 5
Рисунок 5. Сравнение традиционных ледяных этш по сравнению с FIPA. A) (i) Традиционный etch типа I AFP (HPLC6 isoform) производства зимней камбалы (Pseudopleuronectes americanus) показан как первоначально произведенный Рыцарь и др.., (1991). ii) соответствующий анализ FIPA того же белка, помеченного с TRITC. B) (i) Традиционный etch четырехместного мутанта IBS (V9'/V19L/G20V/I41V) типа III nfeAFP11 (от японского угря pout zoarces elongatuskner)21. ii) соответствующий анализ FIPA того же белка, помеченного с TRITC. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.

Figure 6
Рисунок 6. Полушария в результате распространенных ошибок анализа FIPA. Анализ проводился на GFP-тегами типа III HPLC12-A16H. A)Оптимальный результат FIPA для сравнения. Кристалл льда был установлен с его основной призмой плоскости перпендикулярно холодному пальцем. B) анализ FIPA, который был непреднамеренно проведен с использованием ледяного полушария, состоящего из более чем одного кристалла. C)анализ FIPA, который был проведен на неправильном одном кристалле льда. Вторичная призма плоскости не была установлена точно перпендикулярно холодному персту. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.

Figure 7
Рисунок 7. Использование анализа FIPA для сравнения ледовязательности различных AFPs. Тихоокеанский синий помеченный тип III nfeAFP8 был объединен с TRITC-маркирован типом I AFP и был проведен единый анализ FIPA. A)Визуализация только типа III nfeAFP8. B)Визуализация типа I AFP только. C)Визуализация типа III nfeAFP8 и типа I AFP вместе. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.

Figure 8
Рисунок 8. FIPA умеренно активных и гиперактивных AFPs. A)анализ FIPA трех различных умеренно активных рыбных AFPs; i) TRITC-маркированный тип I AFP (HPLC6 isoform, Pseudopleuronectes americanus), (ii) TRITC-обозначенный тип II AFP (Ca2'-независимый изоформ, Longsnout браконьер), (iii) Тихоокеанско-голубой помеченный тип III AFP (nfeAFP8 isoform, зоорес elongatuskner). B)анализ FIPA трех различных гиперактивных AFPs; i) GFP-тегами MpAFP_RIV (Marinomonas primoryensis), (ii) TRITC помечены sbwAFP (Choristoneura fumiferana), (iii) GFP-тегами TmAFP (Tenebrio молитор). На всех изображениях c-ось перпендикулярно плоскости страницы. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.

Figure 9
Рисунок 9. Отношение флуоресцентного узора, производимого анализом FIPA, к ледо-кристаллической морфологии различных форм III AFP имутантов 11,21. A) (i) анализ FIPA С тегами GFP ЗАЭ-А16Н. ii) морфология кристаллов льда, производимая ЗАЭ-А16Н. B) (i) анализ FIPA с маркировкой TRITC nfeAFP11-V9. ii) морфология кристаллов льда, производимая nfeAFP11-V9. C) i) анализ FIPA с маркировкой TRITC дикого типа nfeAFP11. ii) ледо-кристаллическая морфология, производимая nfeAFP11 дикого типа. D)i) анализ FIPA с маркировкой TRITC wild-type nfeAFP6. ii) ледо-кристаллическая морфология, производимая nfeAFP6 дикого типа. C-осиориентации и масштаба баров, как указано. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Разработка метода вытравливания льда Чарльзом Найтом для определения связанных AFP ледовых плоскостей значительно продвинула исследования механизма связывания льда СФП. В то время как структуры AFPs могут быть решеныс помощью рентгеновской кристаллографии 26,27 не было очевидного метода для выобразования дополнительной поверхности на льду, к которому AFP связаны. Когда тип I AFP от зимней камбалы был первоначально охарактеризован, было предложено привязать к первичной призме плоскостейльда 28. Тем не менее, рыцарь в земле разорвать лед травления эксперименты типа I AFP показали, что они связываются с пирамидальных плоскостейльда 13. Этот результат стимулировал исследовательское сообщество AFP переосмыслить механизм связывания льда AFP и более точно определить ледовязающее лицо AFPs9. Оригинальные эксперименты рыцаря по травлению льда проводились с использованием местных AFPs, очищенных от организмов, производящих AFP. С развитием рекомбинантных AFPs и все более все более использование тегов GFP, была возможность расширить эти исследования на многие другие AFPs29.

Идея включения ковалентных флуоресцентных белковых красителей, таких как тетраметилродамин-5-(и 6)-изотиоцианат (ТРИТК), в анализ пришла только после успеха анализа GFP-сплавленного AFP FIPA11. Химерик флуоресцентные белковые метки и химические модификации ковалентными красителями наблюдались не влиять на ледовязающих моделей AFPs (рисунок 5). С первой, GFP сливается либо N- или C-терминал концы AFPs, которые часто хорошо удалены от IBS. Кроме того, между GFP и AFP может быть вставлен гибкий связующий звенья, позволяющий отодвинуть тег от поверхности льда. С последней стратегией маркировки заряженные боковые цепи, которые реагируют с ковалентными красителями, обычно находятся на поверхностях вдали от IBS. Если стратегии, представленные здесь для флуоресцентно маркировки AFPs не работают, введение цистеин от IBS для реакции с тиол-реактивных красителей является еще однимвариантом 30. Принимая меры для обеспечения того, чтобы флуоресцентные метки не влияли на связывание льда AFP, о чем свидетельствуют активность тепловой истерезии и морфологии кристаллов льда, мы уверены, что анализ FIPA показывает истинное представление моделей AFP, связывающих лед, как это было в первоначальном методе травления льда.

Есть несколько преимуществ флуоресцентной маркировки AFPs для анализа FIPA. Для проведения процедуры требуется меньше времени, поскольку сублимация льда для визуализации самолетов, связанных с AFP, не требуется. Включение помеченного белка в полушарие может контролироваться во время роста льда для оценки экспериментального завершения и AFP-связывающей модели могут быть записаны в любой момент. Это предотвращает неоправданно длительные эксперименты или преждевременное завершение роста льда. Флуоресцентная маркировка позволяет более четко визуализировать ШАБЛОН, связывающий AFP, чем это было возможно ранее, как это видно в сравнении результатов обоих методов, применяемых к типу I и типу III AFPs (рисунок 5). Тем не менее, после FIPA лед-etch может быть легко проведен путем размещения полушария в морозильной камере в течение нескольких часов, а это означает, что оба анализа могут быть сделаны на той же выборке, поскольку аналогичные концентрации AFP необходимы для обоих методов. Ценным преимуществом FIPA является возможность визуализировать более одного по-разному помечены AFP на том же полушарии льда (рисунок 7). Это полезно для иллюстрации различий в AFP ледовязающих плоскостей видели с различными типами AFP, изоформы, и активность мутантов.

Анализ FIPA уже был использован в нескольких исследованиях AFP. Он был использован для поддержки гипотезы о том, что базальная плоскость связывания является уникальным для гиперактивных AFPs и необходимы для их высокойактивности 18. Умеренно активные AFPs были найдены не связывать базальной плоскости (рисунок 8A), но многие гиперактивные AFPs полностью покрывают ледяное полушарие, в том числе базальной плоскости льда (рисунок 8B)5,20,31. Анализ FIPA также использовался для изучения функции конкретных остатков, связывающих лед. Например, анализ FIPA был проведен на нескольких изоформах и мутантах типа III, некоторые из которых предотвращают рост льда, а некоторые из них, как былоустановлено, формируют только лед 11,21,32. Из исследований было установлено, что конкретные остатки имеют важное значение для включения AFPs во льду и другие имеют важное значение в специфике плоскости льда (рисунок 9).

Другие методы изучения AFP-связывающих моделей на одиночных кристаллах льда включают прямое наблюдение с помощьюмикроскопии флуоресценции 16,33 и микрофлюиды34. Эти методы имеют преимущество чувствительности к динамике присоединения AFP к льду и мониторинга ледо формирования одновременности с близостью AFP к льду, но менее надежны по сравнению с методом FIPA в определении сродства к плоскостям льда. Молекулярная динамика также используется для прогнозирования ледоруба связывающей специфичности AFPs12,20,21,30,35. Используя анализ FIPA, наряду с другими доступными методами, мы изучим модели связывания ледовых плоскостей каждого AFPs, важность состава IBS при выборе ледяных плоскостей, и как связывание конкретных плоскостей связано с деятельностью AFP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Конфликт интересов не заявлен.

Acknowledgments

PLD занимает кафедру исследований в Области белковой инженерии. Эта работа финансировалась за счет гранта Канадских институтов исследований в области здравоохранения на PLD. Эта работа была также поддержана Грант-в-помощи для научных исследований от Японского общества содействия науке (JSPS) (No 23310171) и от Японского института био-ориентированных технологий научно-исследовательский институт (BRAIN). Мы благодарны докторам Крису Маршаллу и Майку Койперу за новаторскую работу, которая привела к FIPA. Мы также признательны д-ру Сакаэ Цуде за предоставление возможностей для некоторых из этих работ и д-ру Лори Грэму за создание флуоресцентных световых возбуждений и фильтров выбросов.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NESLAB RTE Refrigerating Bath/Circulators Thermo Scientific RTE7
Ethylene glycol, Premixed Antifreeze/Coolant Certified 29-3037-0 Common automotive antifreeze
Cold finger not available not available Custom made with brass (9 cm long, 1.5 cm outer diameter)
Hemispherical cup not available not available Custom made with resin (8 cm outer diameter, 6 cm inner diameter)
High Dual Output Lighting System Lightools Research LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX Additional and custom excitation filters can be purchased from Lightools Research
Camera Canon EOS 50D
Emission Filters Lightools Research LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG Filter ring adapter may be required to fit filter onto camera lens

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Devries, A. L. Antifreeze peptides and glycopeptides in cold-water fishes. Annu. Rev. Physiol. 45, 245-260 (1983).
  2. Sidebottom, C., et al. Phytochemistry - heat-stable antifreeze protein from grass. Nature. 406 (6793), 256-256 (2000).
  3. Tomczak, M. M., et al. A mechanism for stabilization of membranes at low temperatures by an antifreeze protein. Biophys. J. 82 (2), 874-881 (2002).
  4. Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A. Hyperactive Ca-dependent antifreeze protein in an antarctic bacterium. FEMS Microbiol. Lett. 245 (1), 67-72 (2005).
  5. Garnham, C. P., Campbell, R. L., Davies, P. L. Anchored clathrate waters bind antifreeze proteins to ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (18), 7363-7367 (2011).
  6. Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a bacterial antifreeze protein as an adhesin with ice-binding activity. Plos One. 7 (11), (2012).
  7. Raymond, J. A. Algal ice-binding proteins change the structure of sea ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), (2011).
  8. Raymond, J. A., Devries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (6), 2589-2593 (1977).
  9. Baardsnes, J., et al. New ice-binding face for type i antifreeze protein. FEBS Lett. 463 (1-2), 87-91 (1999).
  10. Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).
  11. Garnham, C. P., et al. Compound ice-binding site of an antifreeze protein revealed by mutagenesis and fluorescent tagging. Biochemistry. 49 (42), 9063-9071 (2010).
  12. Nutt, D. R., Smith, J. C. Dual function of the hydration layer around an antifreeze protein revealed by atomistic molecular dynamics simulations. J. Am. Chem. Soc. 130 (39), 13066-13073 (2008).
  13. Knight, C. A., Cheng, C. C., Devries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal-surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
  14. Antson, A. A., et al. Understanding the mechanism of ice binding by type iii antifreeze proteins. J. Mol. Biol. 305 (4), 875-889 (2001).
  15. Graether, S. P., et al. Beta-helix structure and ice-binding properties of a hyperactive antifreeze protein from an insect. Nature. 406 (6793), 325-328 (2000).
  16. Pertaya, N., Marshall, C. B., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. Direct visualization of spruce budworm antifreeze protein interacting with ice crystals: Basal plane affinity confers hyperactivity. Biophys. J. 95 (1), 333-341 (2008).
  17. Middleton, A. J., et al. Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site. J. Mol. Biol. 416 (5), 713-724 (2012).
  18. Scotter, A. J., et al. The basis for hyperactivity of antifreeze proteins. Cryobiology. 53 (2), 229-239 (2006).
  19. Knight, C. A., Wierzbicki, A., Laursen, R. A., Zhang, W. Adsorption of biomolecules to ice and their effects upon ice growth. 1. Measuring adsorption orientations and initial results. Crys. Growth Des. 1 (6), 429-438 (2001).
  20. Hakim, A., et al. Crystal structure of an insect antifreeze protein and its implications for ice binding. J. Biol. Chem. 288 (17), 12295-12304 (2013).
  21. Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Davies, P. L. Engineering a naturally inactive isoform of type iii antifreeze protein into one that can stop the growth of ice. FEBS Lett. 586 (21), 3876-3881 (2012).
  22. Holt, C. B. The effect of antifreeze proteins and poly(vinyl alcohol) on the nucleation of ice: A preliminary study. Cryo Letters. 24 (5), 323-330 (2003).
  23. Knight, C. A. A simple technique for growing large, optically ''perfect'' ice crystals. J. Glac. 42 (142), 585-587 (1996).
  24. Hobbs, P. V. Ice physics. , Clarendon Press. Oxford. 200-248 (1974).
  25. Knight, C. Formation of crystallographic etch pits on ice, and its application to the study of hailstones. J. Appl. Meteorol. 5 (5), 710-714 (1966).
  26. Yang, D. S., Sax, M., Chakrabartty, A., Hew, C. L. Crystal structure of an antifreeze polypeptide and its mechanistic implications. Nature. 333 (6170), 232-237 (1988).
  27. Sicheri, F., Yang, D. S. Ice-binding structure and mechanism of an antifreeze protein from winter flounder. Nature. 375 (6530), 427-431 (1995).
  28. Devries, A. L. Role of glycopeptides and peptides in inhibition of crystallization of water in polar fishes. Philos. T Roy. Soc. B. 304 (1121), 575-588 (1984).
  29. Pertaya, N., et al. Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces. Biophys. J. 92 (10), 3663-3673 (2007).
  30. Kondo, H., et al. Ice-binding site of snow mold fungus antifreeze protein deviates from structural regularity and high conservation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (24), 9360-9365 (2012).
  31. Mok, Y. F., et al. Structural basis for the superior activity of the large isoform of snow flea antifreeze protein. Biochemistry. 49 (11), 2593-2603 (2010).
  32. Takamichi, M., Nishimiya, Y., Miura, A., Tsuda, S. Fully active qae isoform confers thermal hysteresis activity on a defective sp isoform of type iii antifreeze protein. FEBS J. 276 (5), 1471-1479 (2009).
  33. Bar-Dolev, M., Celik, Y., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. New insights into ice growth and melting modifications by antifreeze proteins. J. R. Soc. Interface. 9 (77), 3249-3259 (2012).
  34. Celik, Y., et al. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (4), 1309-1314 (2013).
  35. Garnham, C. P., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. Novel dimeric beta-helical model of an ice nucleation protein with bridged active sites. BMC Struct. Biol. 11, (2011).

Tags

Химия Выпуск 83 Материалы Науки о жизни Оптика антифризовые белки Ледяная асорбция Флуоресцентная маркировка Плоскости решетки льда ледообразующие белки Одиночный кристалл льда
Определение ледовязающих плоскостей антифризовых белков с помощью флуоресценции на основе аффинити ледовой плоскости
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Basu, K., Garnham, C. P., Nishimiya, … More

Basu, K., Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Braslavsky, I., Davies, P. Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity. J. Vis. Exp. (83), e51185, doi:10.3791/51185 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter