Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Анализируя черепно-лицевой морфогенеза у рыбок данио Использование 4D конфокальной микроскопии

doi: 10.3791/51190 Published: January 30, 2014

Summary

Конфокальной микроскопии Покадровый является мощным средством полезно для характеристики эмбрионального развития. Здесь мы описываем методологию и охарактеризовать черепно-лицевой морфогенез в дикого типа, а также PDGFRA, smad5 и SMO мутантные эмбрионы.

Abstract

Покадровой обработки изображений является метод, который позволяет для прямого наблюдения процесса формообразования, или генерация формы. Благодаря своей оптической прозрачности и аменабельности к генетической манипуляции, данио эмбрионов стал популярным модельным организмом, с которой для выполнения покадровой анализ формообразования в живых эмбрионов. Конфокальной визуализации живого данио эмбриона требует, чтобы ткань интерес упорно метили флуоресцентным маркером, таким как трансгена или вводили краситель. Процесс требует, чтобы эмбрион находится под наркозом и удерживается на месте таким образом, что здоровое развитие протекает нормально. Параметры для визуализации необходимо установить для учета для трехмерного роста и сбалансировать требования решении отдельных клеток при получении быстрые снимки развития. Наши результаты демонстрируют способность выполнять долгосрочный в естественных изображений флуоресцентных меченных эмбрионов данио и обнаруживать различные поведения тканей вчерепная нервного гребня, которые вызывают черепно-лицевые аномалии. Развивающие задержки, вызванные анестезией и монтажа минимальны, и эмбрионы невредимым процессом. Покадровый отображаемого эмбрионы могут быть возвращены в жидкой среде, а затем отображены или фиксированной на более поздних точек в развитии. С увеличением обилия трансгенных данио линий и хорошо характеризуется отображением судьбы и методов трансплантации, визуализации любого желаемого ткани можно. Таким образом, покадровой в естественных изображений сочетает мощно с данио генетических методов, в том числе анализа мутантных и микроинъекции эмбрионы.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Черепно-лицевой морфогенез является сложным многоэтапным процессом, который требует скоординированных взаимодействий между несколькими типами клеток. Большинство черепно-скелета происходит от клеток нервного гребня, многие из которых должен мигрировать из дорсальной части нервной трубки в переходных структурах, называемых глоточных арки 1. Как и во многих тканях, морфогенез черепно-лицевой скелет является более сложным, чем можно понять, статических изображений эмбрионов в конкретных развития времени. Хотя это занимает много времени для выполнения, в естественных условиях покадровой микроскопии обеспечивает непрерывный взгляд на клетки развивающегося эмбриона и тканей. Каждое изображение в серии покадровой придает контекст с другими, и помогает следователь движение к выведению почему явление происходит, а не выводя то, что происходит в это время.

В естественных изображений, таким образом, мощным описательный инструмент для экспериментальных подходов кдеконструировать пути, которые ведут морфогенез. Данио рерио Данио является популярным генетическая модель позвоночных эмбрионального развития, и особенно хорошо подходит для работы с изображениями в естественных морфогенеза. Современные, удобные методы трансгенеза и геномной модификации быстро развиваются количество инструментов, доступных для рыбок данио исследователей. Эти инструменты повышения уже надежные методы для генетических манипуляций и микроскопии. В естественных изображений практически любого ткани практически в любой желаемой генетической контексте ближе к реальности, чем фантазии.

Морфогенетические движения фарингеальных дуг руководствуются взаимодействия между нервного гребня и прилегающей эпителия, как эктодермы и энтодермы сигнализации. Есть множество сигнальных молекул, выраженные эпителия, которые необходимы для управления морфогенез черепно-лицевых скелетных элементов. Среди этих сигнальных молекул, Еж Соник (Тсс) является критически важным еили черепно-лицевого развития 2-8. Тсс выражается как в устной эктодермы и глотки энтодермы 2,6,9,10. Экспрессия Shh в энтодерме регулирует морфогенетические движения арок 10, структурирование нервного гребня в арках 10, и роста черепно-лицевой скелет 11.

Сигнализации Bmp также критически важно для черепно-лицевого развития 12 и может изменить морфогенез фарингеальных дуг. Сигнализации Bmp регулирует спинной / вентральной паттерна гребня внутри фарингеальных дуг 13,14. Срыв smad5 у рыбок данио вызывает серьезные дефекты небные и отказ хрящей в Меккеля на предохранитель соответствующим по срединной линии 15. Кроме того, мутанты также отображать сокращения и слияния в вентральной элементов хряща, с 2-го, 3-го, а иногда и 4-й глотки арки элементов, слитых на средней линии 15. Эти гибриды настоятельно рекомендую, что передача сигналов Bmp направляет морфогенез этих глотки элементов.

Сигнализации PDGF необходимо для черепно-лицевого развития, но имеет неизвестные роли в глотки арки формообразования. Оба мышей и рыбок данио мутанты PDGFRA имеют глубокое средней зоны лица clefting 16-18. По крайней мере, у рыбок данио это средней зоны лица clefting является из-за сбоя надлежащего миграции клеток нервного гребня 16. Клетки нервного гребня продолжают выражать PDGFRA после того как они вошли в глотки арки. Кроме того, PDGF лиганды выражаются лица эпителия и в фарингеальных дуг 16,19,20, таким образом сигнализации PDGF может также играть роль в морфогенезе фарингеальных дуг следующих миграции. Тем не менее, анализ морфогенеза фарингеальных дуг в PDGFRA мутантов не были выполнены.

Здесь мы демонстрируем в естественных условиях конфокальной микроскопии pharyngulстадии трансгенных данио и описать морфогенез фарингеальных дуг в течение этого периода. Мы также продемонстрировать, ткани поведения, которые страдают от мутаций, которые нарушают BMP, PDGF и Тсс сигнальные пути.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Животноводство и мутантных аллелей

  1. Поднимите и породы данио, как описано 21.
  2. Данио рерио мутантные аллели, используемые в этом исследовании, были PDGFRA b1059 16, smad5 B1100 22, и SMO B577 23. Источники для этих рыбок данио штаммов включают Zirc.

2. Приготовление растворов и реализует

Примечание: Все решения и реализует можно сделать заранее и хранить для будущего использования.

  1. Сделать эмбриона СМИ (EM), как описано выше 21.
  2. Сделать 4 г / л MS-222 (Tricaine). Растворите 4 г динатрийфосфат (Na 2 HPO 4) в 450 мл стерильной воды. Добавить 2 г MS-222 в растворе. Отрегулируйте рН до 7,0-7,2 в. Добавить стерильную воду до общего объема 500 мл.
  3. Дополнительно: Сделайте 4 г / л гвоздичное масло. Взвесьте 0,2 г чистого гвоздичное масло в 50 мл коническую трубку. Добавить EM до общего объема 50 мл. Хранить при 4 ° С.
  4. Сделать 3% methylcelluloсебе. Принесите 50 мл ЭМ + 0,1 М HEPES до кипения. Снять с огня. Движение в 1,5 г метилцеллюлозы, пока раствор не является однородным. Хранить при 4 ° С.
  5. Сделать 0,2% агарозы. Добавить 0,1 г агарозы до 50 мл ЭМ. Bring Em до кипения в микроволновой печи или на плите и убедитесь, что агарозы растворится. Алиготе в 500 мкл объемы в микропробирок и хранить при 4 ° С. Примечание: Объемы можно регулировать по мере необходимости.
  6. Сделать капиллярные кочерги. Поместите каплю супер клей внутри 0,9 мм ID капиллярной трубки. Вставка 4-5 см длиной 6 фунтов тестовой мононити лески внутри капиллярной трубки так, что примерно 3-4 мм от линии выходит за пределы конца трубки.
  7. Сделайте два мостиком покровные на образце. Супер-клей 22 х 22-1 защитное стекло на каждом конце 24 х 60-1 покровного стекла, оставляя средний бесплатно. Сделать синглов (1 небольшая крышка стекла в конце) для эмбрионов менее чем за один день старого, удваивает (2 маленьких покровные стекла в верхней части друг с другом в конце) для эмбрионов от одного до четырех гн я старый, или тройки (3 маленьких покровных стекол друг на друга за конец) для эмбрионов пять дней и старше.
  8. Наполните 10 мл шприц с высокой вакуумной смазки. Примечание: вакуумной смазки служит в качестве герметика, чтобы предотвратить дегидратацию образцов в течение длительных периодов времени, и имеет низкий потенциал токсичности по сравнению с более летучих герметиков.

3. Монтаж эмбрионов данио для конфокальной микроскопии (см. Рисунок 1)

  1. Подготовка обезболивающий среду. Растопить аликвоты 0,2% агарозы, не в микроволновой печи в течение 20-секундными интервалами до полного жидкость. Смешайте 8 мкл MS-222 в 192 мкл 0,2% агарозы или 5 мкл 4 г / л гвоздичного масла в 195 мкл 0,2% агарозы. Поддерживать в 42 ° C нагревательный блок. Примечание: Длительное воздействие MS-222 вызывает сильные задержки в развитии, чем гвоздичного масла делает в эмбриональном рыбок данио 24.
  2. При необходимости вручную dechorionate невылупившиеся трансгенные эмбрионы должны быть проанализированы непосредственно перед анализом. Использование щипцов, медленно тэар хориона открыта до эмбрион не освобождается.
  3. Обезболить эмбрионов рыбок данио. Добавить 1 мл 4 г / л запаса MS-222 в 24 мл эмбриона СМИ. Кроме того, добавить 390 мкл 4 г / л гвоздичного масла на 24 мл рыбного воды 24. Примечание: гвоздичное масло действует медленно, так выполнить этот шаг, по крайней мере 15-20 минут до покадровой микроскопии.
  4. Поместите шарик вакуумной смазки вокруг центрального пространства обращенной кверху мостовом покровное. Медленно вставьте вакуумную смазку из шприца, что делает плавный, непрерывный шарик, который примыкает к и внутри мостов и краю покровного стекла.
  5. Распространение круг 4% метилцеллюлозы в середине мостикового покровное с помощью деревянного аппликатора.
  6. Трансфер эмбрион перед созданием образа. Когда эмбрион находится под наркозом сделать его в стеклянную пипетку. Удерживая пипетку вертикально, чтобы позволить эмбрион опускаться на дно жидкости в пипетку. Перемещение пипетки в раствор агарозы и позволяют эмбрион падатьв агарозы. Не выдавить жидкость.
  7. Поместите образец. Нарисуйте какое-то решение агарозном и эмбрион в пипетку. Извергните эмбриона в капле раствор агарозы в верхней части метилцеллюлозы. Используйте капилляров в покер, чтобы подтолкнуть эмбрион вниз на метилцеллюлозы и ориентировать эмбрион как нужный для работы с изображениями.
  8. Печать образца.
    1. Поместите один мостовой покровное на вершине смонтированном один, лицом вниз. Прикладывая усилия к обеим сторонам, зажатых покровные пока мосты не прямой контакт и агарозные падение уплотнения к обеим покровные. Убедитесь, что эмбрион в правильной ориентации.
    2. Натрите деревянный аппликатор вдоль стекла, чтобы сгладить трещины и зазоры в вакуумной смазки шарик. Вытрите лишний жир от краев.

4. Покадровый конфокальной микроскопии трансгенных эмбрионов рыбок данио

(Этот протокол был оптимизирован для Zeiss LSM 710 конфокальной микроскопии насING обработки изображений ZEN, и может быть модифицирована для использования с другими системами.)

  1. Активируйте оборудования. Включите конфокальной микроскопии и любых внешних лазерных устройств. Включите компьютер, подключенный к конфокальной микроскопии. ПО для обработки изображений Открыть конфокальной и выберите "Start System" активизации параметров захвата изображений.
  2. Подготовка подогревом этап. Опустите промежуточной платформы конфокальной микроскопии и двигаться объективные линзы из положения. Заменить этап по умолчанию с электронным подогревом этапе. Включите контроллер для нагретого сцену и установить температуру для 29,5 ° С.
  3. Расположите образец в поле зрения. Поместите установленные образца на сцене. Перемещение объектива 20X в положение и поднять промежуточную платформу. Активируйте видимого света излучатель и смотреть через окуляры. Глава центра эмбриона в поле зрения.
  4. Определение настроек эксперимента.
    1. Активируйте флуоресценции каналов, выбравдлина волны флуоресценции для обнаружения и выбрать цвет таблицы поиска (LUT) для каждого канала. Если необходимо, используйте ручное управление в программном обеспечении, чтобы включить необходимых лазеров (например, 561 нм для RFP). Для каждого флуоресценции канала, нужно задать интенсивность лазера на 10,0 и ФЭУ напряжения (HV или усиления) между 600-700. Установите усреднение до 4 и битовую глубину до 16 бит.
    2. Активируйте модулей серии Z-Stack и времени. Установите крошечное отверстие для Z-разрешением 5 мкм или меньше, и установить Z-интервал до предложенного оптимальном расстоянии.
      Примечание: Как правило, 5 Z-разрешение мкм позволяет каждому Z-Stack изображения должны быть собраны достаточно быстро для «моментальный снимок» эмбриона в определенный момент времени в то же время решения отдельных клеток. Понижение усреднение также уменьшает количество времени на изображении.
    3. Определите желаемый временной интервал между изображениями (обычно 10-20 мин) и общую длину эксперимента.
  5. Установите позиционныйинформация.
    1. Включите камеру, чтобы режиме реального времени. Отрегулируйте фокус и увеличить интенсивность лазера при необходимости, чтобы увидеть флуоресценцию. Установите цифровой зум до 0,6 для более широкого зрения, если это необходимо.
    2. Расположите этап таким образом, чтобы все структуры интереса видны и есть место в поле зрения для вырост спинной и кпереди. Фокус через эмбриона к верхним и нижним пределами флуоресценции. Установите первую и последнюю позиции Z-Stack ломтик не менее 100 мкм или более за эти пределы.
  6. Оптимизация интенсивности флуоресценции.
    1. Установите дисплей LUT в диапазоне индикатор. Сейчас Люминесцентные структуры должны появиться белые, а остальные поля зрения должен быть синего цвета (нет обнаружения) или черный.
    2. Увеличение HV / прибыль до уровня чуть ниже, где насыщенный появляются (красный) пикселей. Если необходимо, отрегулируйте смещение так большинство фоне не обнаруживается (синий). Примечание: Меньше диаметр микроотверстий и повышенную интенсивность лазера и улучшить изображения ЗащитуInition, но интенсивность лазерного должна быть низкой, чтобы сохранить живые ткани. Увеличение ВН / усиления и отверстие диаметром (<5 мкм), как правило, предпочтительнее повышенной интенсивности лазерного.
    3. Держите диаметр микроотверстий достаточно широким, чтобы собирать изображения своевременно, в среднем наборы до 4. Z-интервал всегда должен быть установлен в предложенной оптимального расстояния для диаметр микроотверстий. Выполните короткие сканирования (в среднем = 1) с различными настройками, и использовать минимальную интенсивность лазерного который достигает нужного разрешения.
  7. Запуск эксперимент для желаемого периода времени. После этого удалить эмбрион от нагретого стадии и медленно отделить покровные. Погрузите покровное и зародыш в EM в 30 мм чашки Петри. Используя стеклянную пипетку осторожно мыть эмбрион прочь покровного стекла и снимите покровное от чашки Петри. Поместите эмбрион в 28.5 ° C инкубатора продолжать развивать.
  8. Сравнение роста. В конце эксперимента, принимать индивидуальную Zsгалс изображения агарозных монтажа эмбрионов, которые были родственных аналогичным образом, организованных в образце в начале эксперимента, но были подняты в EM в инкубаторе 28,5 ° C.
  9. Измерьте глотки арки, по мере необходимости. Измерения можно проводить в некоторых конфокальной программные комплексы. Измерения, найденные здесь, были выполнены с использованием Fiji25 путем импорта и Z-проектирования. LSM файлы отдельных кадров.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

В эмбрионов дикого типа, после нервной населения гребня, глоточные арки удлиненные вдоль передней / задней и спинной / вентральной осей при движении в ростральном направлении (Movie 1). В 30 часов после оплодотворения (ФВЧ), длина передней / задней первого глотки арки между 1,8-1,9 раза по сравнению спинной / вентральной высоте. Спинной / вентральной удлинение протекает стабильно, быстрее, чем расширение передней / задней до 36,5 после оплодотворения. Отсюда, спинные / брюшные плато высотой около 104 мкм с помощью 48 часов после оплодотворения. Расширение Передняя / задняя продолжается 48 часов после оплодотворения, с общая длина передней / задней увеличения из-под 1,5 раза спинной / вентральной высоты в 36,5 ФВЧ в 1,95 раза спинной / вентральной высоты в 48 часов после оплодотворения.

На своем переднем конце, первый глотки арки формирует верхнечелюстной (спинной) и нижней челюсти (брюшные) доменов, разделенных ротовой эктодермы. Верхнечелюстной домен первого глотки арки измеряется еПЗУ ее дистальный конец к задней вершины полости эктодермы. Он растет со скоростью аппроксимируется линейной регрессии на уровне 4,6 мкм / ч (R 2 = 0,9374) между 30-48 часов после оплодотворения и составляет около 104 мкм длиной в 48 часов после оплодотворения (Movie 1).

Глоточные арки 3-7 все формы от сегментации единую массу клеток нервного гребня через глоточной энтодермы 26. Между 30-38 часов после оплодотворения, 5-й по 7-й фарингеальных дуг отделить от массы, 3-й и 4-й арки уже отделившись. Вокруг 37 часов после оплодотворения, 3-й глотки арки начинает двигаться медиально к-й арки 2. Сбоку, 7-й глотки арки обгоняет 5-й и 6-й арки в ростральной движения от 48 часов после оплодотворения, в результате чего 3-е по 6-й арки медиальной к 2-м и 7-м арок (ВИДЕО 1).

Важно, то Отметим, что хотя Конвенция является описание морфологии в оплодотворения, микроскопия немного задерживает рост данио по сравнению с аналогичным ЦВК эмбрионов, выращенных в инкубаторе 28,5 ° C. Например, после 19 часов микроскопии, расстояние между глазом и ухом виде изображения дикого типа эмбриона составляла примерно 81,7 мкм, а среднее расстояние глаз-ухо в течение двух-двойников эмбрионов отображаемого сразу же после этого был 71 мкм. Таким образом, эмбрионы, вероятно, будут немного моложе промежуточной серии 27.

Эти морфогенетические движения значительно нарушается в SMO мутантов. Как описано выше, данио SMO мутанты не способны образовывать верхнечелюстной конденсацию первой дуге, и на 48 HPF первой глоточной дуги полностью хвостовой для глаз 2. Задние движения арки также нарушается 10. 3-я глотки арки не в состоянии двигаться медиальнее 2-й глотки арки и кино 2 7-й глотки арки не в состоянии перенести рострально перекрываться с более передних арок на 48 часов после оплодотворения.

Данио рерио smad5 B1100 мутанты имеют многочисленные черепно-лицевые дефекты, в том числе почти полной потере небной скелета и брюшной слияний между 2-й, 3-й, а иногда и 4-й глотки арки скелетных элементов 15, предполагая, что там может быть дефекты в глоточной арки морфогенез . Действительно, статические изображения конфокальной продемонстрировали слияния в вентральной доменов 2-го и 3-го арок очевидны на 32 часов после оплодотворения (рис. 2). Использование покадровой конфокальной микроскопии, мы проанализировали морфогенез фарингеальных дуг в smad5 мутантов. В покадровой анализ, слияния между 2-й и 3-й арки появляются сначала на 32 часов после оплодотворения, в соответствии с статического анализа (Movie 3, рисунок 3). Кроме того,smad5 мутанты нарушили вырост первой глоточной дуги (Видео 3). На 30 часов после оплодотворения, длина переднего / заднего первой глоточной дуги (186,8 мкм) составляет более 35% больше, чем в дикого типа, и в 2,5 раза спинной / брюшной высота первой глоточной дуги в smad5 мутанта. Однако, как задний край перемещается рострально, длина переднего / заднего первой глоточной дуги уменьшается почти 40 мкм между 30-39 HPF и затем восстанавливает эту длину на 48 часов после оплодотворения. Спинной / вентральной Высота первой глоточной дуги неуклонно снижается до 62,3 мкм от 30-48 часов после оплодотворения. Отказ расширение переднего течение этого времени находит свое отражение в верхнечелюстной области, которая является исключительно долго (85 мкм) при 30 часов после оплодотворения по сравнению с диким типом. Челюстные длина уменьшается в размере аппроксимируется линейной регрессии на 4,4 мкм / ч (R 2 = 0,9032) от 30-36 часов после оплодотворения, и остается достаточно последовательно после этого. Здесь, покадровой обработки изображений демонстрирует уникальный тиСГУП движения, которые могут составлять потери небной скелета наблюдается в smad5 мутантов.

Хотя экспрессия членов семьи PDGF предполагает, что оно может быть широко вовлечен в глотки арки морфогенеза, движение задних арок кажется нормальным в PDGFRA мутантов. Это морфогенез первой глоточной дуги, которая появляется специально нарушается (Видео 4). Общий размер первого глотки арки снижается относительно дикого типа, и появится верхнечелюстной домена высоко пластик, с клетки конденсации и снятия с течением времени. Это приводит к неспособности верхнечелюстной удлинения, пик которого около 39 ФВЧ на 56,5 мкм. В 48 часов после оплодотворения, верхней челюсти меры домена только 44,1 мкм. В совокупности эти результаты показывают, что анализы градиенты осторожны времени могут представить подробную информацию о морфогенезе потенциально потерянных в статических анализов.

Рисунок 1 Рисунок 1. Схема мостовом строительстве покровного и эмбриона монтажа для конфокальной микроскопии.

Рисунок 2
. Рисунок 2 Второй и третий арки сливаются в smad5 мутантов (А, В) Одноместный Z ломтики от (А) FLI1: EGFP и (В) FLI1: EGFP; smad5 B1100 мутант эмбрион.. (А) В эмбрионов дикого типа для smad5, клетки нервного гребня во втором и третьем арки разделены второй глоточного кармана (стрелки). (B) Клетки нервного гребня в брюшной предела СЕКОй и третий арки смешиваются в smad5 мутантов (стрелки). Глоточные арки сочтены. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 3
Рисунок 3. Потеря smad5 функции приводит нарушается глотки арки формообразования. (A, B, верхние панели) Прогнозы и (нижние панели) ортогональные проекции арки синтеза в Movie 3. Fusion арок двух и трех очевидно, наконечник стрелы. Глоточные арки сочтены. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Фильм 1. Развитие глоткиарки в дикого типа (FLI1: EGFP) эмбрион от 30-48 часов после оплодотворения. Впереди слева, спинной к вершине. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм.

Фильм 2. Срединные движения фарингеальных дуг неудачу в SMO мутантов (FLI1: EGFP; SMOB 577) впереди слева, спинной к вершине.. 30-48 оплодотворения. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм.

Фильм 3. 2-й и 3-й арки сливаются в smad5 мутантов (FLI1: EGFP; smad5 B1100) впереди слева, спинной к вершине.. Серия (А) прогнозы, 30-48 часов после оплодотворения, и (б) одиночные ломтики Z, 30-40 оплодотворения. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм.

Фильм 4. Удлинение верхнечелюстной области терпит неудачу в PDGFRA мутантов (FLI1: EGFP; PDGFRA b1059) впереди левой, спинной к вершине.. 30-48 оплодотворения. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Покадровый конфокальной микроскопии является мощным инструментом для анализа развития. Здесь мы демонстрируем полезность метода в изучении глотки арки морфогенез у рыбок данио, которые мутант для важных сигнальных использованием трансгенных что помечает клетки нервного гребня. В дополнение к ткани уровне анализов, анализов промежутка времени, также применимы к анализу на клеточном уровне 28. Многие широко используемые методы данио также могут быть включены в покадровой микроскопии экспериментов, в том числе микроинъекции Morpholinos, мРНК, или трансгенных конструкций, а также трансплантации между эмбрионов. Анализ нескольких развивающихся тканей ограничивается только способностью к флуоресцентно тканей этикеток и по возможности конфокальной микроскопии для обнаружения желаемое количество различных флуорофоров без перекрестных помех. Количество лиц, которые могут быть отображены с муфтой эмбрионов данио строго ограничивается, но передовые технологиипозволяют автоматизированную визуализацию нескольких эмбрионов в тот же период времени. Это особенно полезно при поиске для выполнения покадровой анализ мутанта, который не легко определить на ранних временных точках.

При выполнении измерений из покадровой конфокальных изображений, важно учитывать, что некоторые задержки в развитии обусловлена ​​процесса. Развивающие задержки не являются редкостью в мутантных эмбрионов, так что визуализация двойников управления необходимо для обеих мутантных / манипулировать эмбрионов, а также контроля дикого типа. Даже находясь под контролем для постановки, сравнительное измерение флуоресценции меченных структур трудно. Интенсивность флуоресценции может быть сильно варьируется между людьми и между отдельными частями той же структуры. Таким образом, недискретные количественные измерения имеют определенную степень субъективности, и мы рекомендуем более одного индивидуального выполнения измерений для обеспечения согласованности. Исследователи также должны быть дисциплинированным в ориентировании эмбрионовдля сравнительного измерения последовательно, как неспособность сделать это может привести к появлению морфологических различий, где не может быть ни одного. Движения эмбрионов образца может напрямую разрушить эксперимент, и мы находим, что добавление анестетик после мироволновой печи агарозы было разрешено сгущаться снижает его эффективность в седативные эмбрионов.

Хотя трудно приобрести, данные микроскопии покадровой имеют очевидные преимущества перед статических изображений в сравнении морфогенез качественно. Статические изображения часто позволяют легко определить структур в определенный момент времени, но не подают никаких признаков тканей поведения, ведущих к или следующих этой стадии. Такая информация имеет решающее значение при изучении взаимодействия двух или более отдельных тканей, проходящих морфогенез. Для того чтобы получить лучшую общую характеристику морфогенеза, это выгодно, чтобы выполнять обе во времени истек, и статический анализ, чтобы наилучшим образом использовать преимущества каждого метода. В времени истек анализирует, динамические поведения клеток и тканей могут быть проанализированы и, в статических анализов, большое количество эмбрионов может быть рассмотрено, чтобы получить лучшее понимание изменчивости. Растущее число рыбок данио трансгенных линий и продвижения других методов сделает покадровую конфокальной микроскопии из нескольких тканей банальных, как в режиме реального времени в естественных данных становится золотым стандартом среди морфогенеза исследователей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgments

Мы благодарим Мелисса Гриффин и Дженна Rozacky для их квалифицированного ухода рыбы. ДПМ благодаря EGN для написания помощь, щедрость и терпение. Эта работа была поддержана NIH / NIDCR R01DE020884 чтобы JKE.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 lb Test monofilament line Cortland Line Company SLB16
Agarose I Amresco 0710
Argon laser LASOS Lasertechnik GmbH LGN 3001
Calcium chloride Sigma-Aldrich C8106
Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID FHC 30-31-0
Clove oil Hilltech Canada, Inc. HB-102
High vacuum grease Dow Corning 2021846-0807
Isotemp dry-bath incubator Fisher Scientific 2050FS
Laser scanning microscope Carl Zeiss AG LSM 710
Magnesium sulfate hexahydrate Sigma-Aldrich 230391
Microscope cover glass, 22 x 22-1 Fisher Scientific 12-542-B
Microscope cover glass, 24 x 60-1 Fisher Scientific 12-545-M
Potassium chloride Fisher Scientific M-11321
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P3786
Sodium chloride Fisher Scientific M-11624
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907
TempController 2000-2 PeCon GmbH
Tricaine-S Western Chemical, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trainor, P. A., Melton, K. R., Manzanares, M. Origins and plasticity of neural crest cells and their roles in jaw and craniofacial evolution. Int. J. Dev. Biol. 47, 541-553 (2003).
  2. Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
  3. Wada, N., et al. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
  4. Roessler, E., et al. Mutations in the human sonic hedgehog gene cause holoprosencephaly. Nat. Genet. 14, 357-360 (1996).
  5. Jeong, J., Mao, J., Tenzen, T., Kottmann, A. H., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in the neural crest cells regulates the patterning and growth of facial primordia. Genes Dev. 18, 937-951 (2004).
  6. Hu, D., Marcucio, R. S. A SHH-responsive signaling center in the forebrain regulates craniofacial morphogenesis via the facial ectoderm. Development. 136, 107-116 (2009).
  7. Cordero, D., et al. Temporal perturbations in sonic hedgehog signaling elicit the spectrum of holoprosencephaly phenotypes. J. Clin. Invest. 114, 485-494 (2004).
  8. Westphal, H., Beachyr, P. A. Cyclopia and defective axial patterning in mice lacking Sonic hedgehog gene function. Nature. 383, 3 (1996).
  9. Moore-Scott, B. A., Manley, N. R. Differential expression of Sonic hedgehog along the anterior-posterior axis regulates patterning of pharyngeal pouch endoderm and pharyngeal endoderm-derived organs. Dev. Biol. 278, 323-335 (2005).
  10. Swartz, M. E., Nguyen, V., McCarthy, N. Q., Eberhart, J. K. Hh signaling regulates patterning and morphogenesis of the pharyngeal arch-derived skeleton. Dev. Biol. 369, 65-75 (2012).
  11. Balczerski, B., et al. Analysis of Sphingosine-1-phosphate signaling mutants reveals endodermal requirements for the growth but not dorsoventral patterning of jaw skeletal precursors. Dev. Biol. (2011).
  12. Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. Int. J. Dev. Biol. 50, 511-521 (2006).
  13. Alexander, C., et al. Combinatorial roles for BMPs and Endothelin 1 in patterning the dorsal-ventral axis of the craniofacial skeleton. Development. 138, 5135-5146 (2011).
  14. Zuniga, E., Rippen, M., Alexander, C., Schilling, T. F., Crump, J. G. Gremlin 2 regulates distinct roles of BMP and Endothelin 1 signaling in dorsoventral patterning of the facial skeleton. Development. 138, 5147-5156 (2011).
  15. Swartz, M. E., Sheehan-Rooney, K., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev. Dyn. 240, 2204-2220 (2011).
  16. Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nat. Genet. 40, 290-298 (2008).
  17. Soriano, P. The PDGF alpha receptor is required for neural crest cell development and for normal patterning of the somites. Development. 124, 2691-2700 (1997).
  18. Tallquist, M. D., Soriano, P. Cell autonomous requirement for PDGFRalpha in populations of cranial and cardiac neural crest cells. Development. 130, 507-518 (2003).
  19. Ho, L., Symes, K., Yordan, C., Gudas, L. J., Mercola, M. Localization of PDGF A and PDGFR alpha mRNA in Xenopus embryos suggests signalling from neural ectoderm and pharyngeal endoderm to neural crest cells. Mech. Dev. 48, 165-174 (1994).
  20. Liu, L., Korzh, V., Balasubramaniyan, N. V., Ekker, M., Ge, R. Platelet-derived growth factor A (pdgf-a) expression during zebrafish embryonic development. Dev. Genes Evol. 212, 298-301 (2002).
  21. Westerfield, M. The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). (1993).
  22. Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Lovely, C. B., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Bmp and Shh Signaling Mediate the Expression of satb2 in the Pharyngeal Arches. PloS one. 8, e59533 (2013).
  23. Varga, Z. M., et al. Zebrafish smoothened functions in ventral neural tube specification and axon tract formation. Development. 128, 3497-3509 (2001).
  24. Grush, J., Noakes, D. L. G., Moccia, R. D. The efficacy of clove oil as an anesthetic for the zebrafish, Danio rerio. 1, 46-53 (2004).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
  26. Crump, J. G., Maves, L., Lawson, N. D., Weinstein, B. M., Kimmel, C. B. An essential role for Fgfs in endodermal pouch formation influences later craniofacial skeletal patterning. Development. 131, 5703-5716 (2004).
  27. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  28. Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat. Neurosci. 13, 673-679 (2010).
Анализируя черепно-лицевой морфогенеза у рыбок данио Использование 4D конфокальной микроскопии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (83), e51190, doi:10.3791/51190 (2014).More

McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (83), e51190, doi:10.3791/51190 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter