Конфокальной микроскопии Покадровый является мощным средством полезно для характеристики эмбрионального развития. Здесь мы описываем методологию и охарактеризовать черепно-лицевой морфогенез в дикого типа, а также PDGFRA, smad5 и SMO мутантные эмбрионы.
Покадровой обработки изображений является метод, который позволяет для прямого наблюдения процесса формообразования, или генерация формы. Благодаря своей оптической прозрачности и аменабельности к генетической манипуляции, данио эмбрионов стал популярным модельным организмом, с которой для выполнения покадровой анализ формообразования в живых эмбрионов. Конфокальной визуализации живого данио эмбриона требует, чтобы ткань интерес упорно метили флуоресцентным маркером, таким как трансгена или вводили краситель. Процесс требует, чтобы эмбрион находится под наркозом и удерживается на месте таким образом, что здоровое развитие протекает нормально. Параметры для визуализации необходимо установить для учета для трехмерного роста и сбалансировать требования решении отдельных клеток при получении быстрые снимки развития. Наши результаты демонстрируют способность выполнять долгосрочный в естественных изображений флуоресцентных меченных эмбрионов данио и обнаруживать различные поведения тканей вчерепная нервного гребня, которые вызывают черепно-лицевые аномалии. Развивающие задержки, вызванные анестезией и монтажа минимальны, и эмбрионы невредимым процессом. Покадровый отображаемого эмбрионы могут быть возвращены в жидкой среде, а затем отображены или фиксированной на более поздних точек в развитии. С увеличением обилия трансгенных данио линий и хорошо характеризуется отображением судьбы и методов трансплантации, визуализации любого желаемого ткани можно. Таким образом, покадровой в естественных изображений сочетает мощно с данио генетических методов, в том числе анализа мутантных и микроинъекции эмбрионы.
Черепно-лицевой морфогенез является сложным многоэтапным процессом, который требует скоординированных взаимодействий между несколькими типами клеток. Большинство черепно-скелета происходит от клеток нервного гребня, многие из которых должен мигрировать из дорсальной части нервной трубки в переходных структурах, называемых глоточных арки 1. Как и во многих тканях, морфогенез черепно-лицевой скелет является более сложным, чем можно понять, статических изображений эмбрионов в конкретных развития времени. Хотя это занимает много времени для выполнения, в естественных условиях покадровой микроскопии обеспечивает непрерывный взгляд на клетки развивающегося эмбриона и тканей. Каждое изображение в серии покадровой придает контекст с другими, и помогает следователь движение к выведению почему явление происходит, а не выводя то, что происходит в это время.
В естественных изображений, таким образом, мощным описательный инструмент для экспериментальных подходов кдеконструировать пути, которые ведут морфогенез. Данио рерио Данио является популярным генетическая модель позвоночных эмбрионального развития, и особенно хорошо подходит для работы с изображениями в естественных морфогенеза. Современные, удобные методы трансгенеза и геномной модификации быстро развиваются количество инструментов, доступных для рыбок данио исследователей. Эти инструменты повышения уже надежные методы для генетических манипуляций и микроскопии. В естественных изображений практически любого ткани практически в любой желаемой генетической контексте ближе к реальности, чем фантазии.
Морфогенетические движения фарингеальных дуг руководствуются взаимодействия между нервного гребня и прилегающей эпителия, как эктодермы и энтодермы сигнализации. Есть множество сигнальных молекул, выраженные эпителия, которые необходимы для управления морфогенез черепно-лицевых скелетных элементов. Среди этих сигнальных молекул, Еж Соник (Тсс) является критически важным еили черепно-лицевого развития 2-8. Тсс выражается как в устной эктодермы и глотки энтодермы 2,6,9,10. Экспрессия Shh в энтодерме регулирует морфогенетические движения арок 10, структурирование нервного гребня в арках 10, и роста черепно-лицевой скелет 11.
Сигнализации Bmp также критически важно для черепно-лицевого развития 12 и может изменить морфогенез фарингеальных дуг. Сигнализации Bmp регулирует спинной / вентральной паттерна гребня внутри фарингеальных дуг 13,14. Срыв smad5 у рыбок данио вызывает серьезные дефекты небные и отказ хрящей в Меккеля на предохранитель соответствующим по срединной линии 15. Кроме того, мутанты также отображать сокращения и слияния в вентральной элементов хряща, с 2-го, 3-го, а иногда и 4-й глотки арки элементов, слитых на средней линии 15. Эти гибриды настоятельно рекомендую, что передача сигналов Bmp направляет морфогенез этих глотки элементов.
Сигнализации PDGF необходимо для черепно-лицевого развития, но имеет неизвестные роли в глотки арки формообразования. Оба мышей и рыбок данио мутанты PDGFRA имеют глубокое средней зоны лица clefting 16-18. По крайней мере, у рыбок данио это средней зоны лица clefting является из-за сбоя надлежащего миграции клеток нервного гребня 16. Клетки нервного гребня продолжают выражать PDGFRA после того как они вошли в глотки арки. Кроме того, PDGF лиганды выражаются лица эпителия и в фарингеальных дуг 16,19,20, таким образом сигнализации PDGF может также играть роль в морфогенезе фарингеальных дуг следующих миграции. Тем не менее, анализ морфогенеза фарингеальных дуг в PDGFRA мутантов не были выполнены.
Здесь мы демонстрируем в естественных условиях конфокальной микроскопии pharyngulстадии трансгенных данио и описать морфогенез фарингеальных дуг в течение этого периода. Мы также продемонстрировать, ткани поведения, которые страдают от мутаций, которые нарушают BMP, PDGF и Тсс сигнальные пути.
Покадровый конфокальной микроскопии является мощным инструментом для анализа развития. Здесь мы демонстрируем полезность метода в изучении глотки арки морфогенез у рыбок данио, которые мутант для важных сигнальных использованием трансгенных что помечает клетки нервного гребня. В д?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Мелисса Гриффин и Дженна Rozacky для их квалифицированного ухода рыбы. ДПМ благодаря EGN для написания помощь, щедрость и терпение. Эта работа была поддержана NIH / NIDCR R01DE020884 чтобы JKE.
6 lb. test monofilament line | Cortland Line Company | SLB16 | |
Agarose I | Amresco | 0710 | |
Argon laser | LASOS Lasertechnik GmbH | LGN 3001 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID | FHC | 30-31-0 | |
Clove oil | Hilltech Canada, Inc. | HB-102 | |
High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
Isotemp dry-bath incubator | Fisher Scientific | 2050FS | |
Laser scanning microscope | Carl Zeiss AG | LSM 710 | |
Magnesium sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
Microscope cover glass, 22×22-1 | Fisher Scientific | 12-542-B | |
Microscope cover glass, 24×60-1 | Fisher Scientific | 12-545-M | |
Potassium chloride | Fisher Scientific | M-11321 | |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | M-11624 | |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | |
TempController 2000-2 | PeCon GmbH | ||
Tricaine-S | Western Chemical, Inc. |