confocal הדמיה זמן לשגות היא טכניקה רבת עוצמה שימושית לאפיון התפתחות עוברית. כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה ולאפיין המורפוגנזה craniofacial בסוג פראי, כמו גם PDGFRA, smad5, וSMO עוברים שעברו מוטציה.
זמן לשגות הדמיה היא טכניקה המאפשרת תצפית הישירה של תהליך המורפוגנזה, או הדור של צורה. בשל הבהירות האופטית שלהם ורמת מוכנות למניפולציה גנטית, עובר דג הזברה הפך אורגניזם מודל פופולרי שבה לביצוע ניתוח הזמן לשגות של המורפוגנזה בעוברי חיים. ההדמיה confocal של עובר דג הזברה לחיות דורשת כי רקמה של עניין היא שכותרתו בהתמדה עם סמן פלואורסצנטי, כגון transgene או צבע שהוחדר. התהליך דורש כי העובר הוא הרדים ושנערך במקום בצורה כזאת, שהתפתחות בריאה ממשיכה כרגיל. פרמטרים להדמיה חייבים להיות מוגדרים חשבון לצמיחה תלת ממדים וכדי לאזן את הדרישות של פתרון תאים בודדים תוך קבלת תמונות מהירות של פיתוח. התוצאות שלנו מראות את היכולת לבצע לטווח ארוך בתחום ההדמיה vivo של עוברי דג הזברה שכותרתו הקרינה ולזהות התנהגויות רקמה מגוונות בהרכס עצבי הגולגולת שגורמים למומי craniofacial. עיכובים התפתחותיים הנגרמים על ידי הרדמה והרכבה הם מינימאליים, והם עוברים ללא פגע על ידי התהליך. ניתן להחזיר עובר זמן לשגות הדמיה למדיום נוזלי ולאחר מכן צילם או קבוע בנקודות מאוחרות יותר בהתפתחות. עם שפע הולך וגדל של קווים מהונדסים דג הזברה ומיפוי גורל מאופיין היטב וטכניקות השתלה, הדמיה כל רקמה רצויה אפשרית. ככזה, זמן לשגות בתחום ההדמיה vivo משלב עוצמה עם שיטות גנטיות דג הזברה, כוללים ניתוחים של עוברים שעברו מוטציה וmicroinjected.
המורפוגנזה Craniofacial היא תהליך רב שלבים מורכב הדורש אינטראקציות מתואמות בין סוגי תאים מרובים. רוב שלד craniofacial נגזר מתאי רכס עצביים, שרבים מהם חייבים לעבור מ הצינור העצבי הגבי למבנים ארעיים שנקראים קשתות בלוע 1. כמו ברקמות רבות, המורפוגנזה של שלד craniofacial היא יותר מסובכת ממה יכול להיות מובן על ידי תמונות סטטיות של עוברים בנקודות זמן ההתפתחותי ספציפיות. למרות שזה הוא לבצע זמן רב, in vivo מיקרוסקופיה זמן לשגות מספקת מבט מתמשך בתאים של עובר המתפתח ורקמות. כל תמונה בסדרת הזמן לשגות מעניקה הקשר לאחרים, ומסייעת למהלך חוקר לכיוון של הסקה מדוע תופעה מתרחשת ולא הסיק את מה שמתרחש באותו זמן.
בתחום ההדמיה vivo הוא אפוא כלי תיאורים רב עוצמה לגישות ניסיוניות ללפרק את המסלולים המנחים המורפוגנזה. Rerio Danio דג הזברה הוא מודל גנטי פופולרי של התפתחות עוברית של בעלי החוליות, והוא מתאים במיוחד גם בתחום ההדמיה vivo של המורפוגנזה. מודרני, שיטות נוחים לtransgenesis ושינוי גנומי הן מתקדמות במהירות מספר הכלים העומדים לרשות חוקרי דג הזברה. כלים אלה לשפר את השיטות חזקות כבר למניפולציה ומיקרוסקופיה גנטיות. בvivo הדמיה של כמעט כל רקמה בכמעט כל קשר גנטי רצוי היא קרובה יותר למציאות מאשר לדמיון.
תנועות morphogenetic של קשתות בלוע הם מודרכים על ידי איתות אינטראקציות בין הרכס העצבי והאפיטל הסמוך, שניהם האאקטודרם והאנדודרם. ישנן מולקולות רבות איתות שהביעו האפיטל כי יש צורך לנהוג המורפוגנזה של אלמנטי שלד craniofacial. בין מולקולות האיתות הללו, סוניק קיפוד (ששש) הוא f החשובה באופן קריטיאו פיתוח craniofacial 2-8. ששש מתבטאים בשני האאקטודרם הפה ובלוע האנדודרם 2,6,9,10. הביטוי של ששש בהאנדודרם מסדיר תנועות morphogenetic של הקשתות 10, דפוסים של רכס עצבי בתוך הקשתות 10, וצמיחה של שלד craniofacial 11.
איתות bmp היא גם חשובה באופן קריטי לפיתוח craniofacial 12 ועשויה לשנות המורפוגנזה של קשתות בלוע. איתות bmp מסדירה גב / הגחון דפוסים של רכס בתוך קשתות בלוע 13,14. שיבוש של smad5 בדג הזברה גורם למומי חיך קשים וכישלון של סחוסים של המקלה הפתיל כראוי על קו האמצע 15. בנוסף, מוטציות גם להציג ירידות ואיחוי באלמנטי סחוס הגחון, עם nd 2, 3 rd, ולפעמים אלמנטי קשת בלוע 4 ה התמזגו בקו האמצע 15. שילובים אלו ממליצים כי איתות Bmp מכוונת המורפוגנזה של אלמנטי בלוע אלה.
איתות PDGF היא הכרחית להתפתחות craniofacial, אבל יש לו תפקידים ידועים בהמורפוגנזה קשת בלוע. עכבר ומוטציות PDGFRA דג הזברה לשניהם יש clefting midfacial העמוק 16-18. לפחות בדג הזברה clefting midfacial זאת בשל כישלונה של נדידת תאי רכס עצביים תקינה 16. תאי רכס עצביים ממשיכים להביע PDGFRA אחרי שהם נכנסו לקשתות בלוע. בנוסף, ligands PDGF באים לידי ביטוי על ידי epithelia פנים ובתוך קשתות בלוע 16,19,20, ובכך איתות PDGF יכולה גם לשחק תפקיד בהמורפוגנזה של קשתות בלוע בעקבות הגירה. עם זאת, ניתוח של המורפוגנזה של קשתות בלוע במוטנטים PDGFRA לא בוצעו.
הנה, אנחנו מדגימים במיקרוסקופיה confocal vivo של pharyngulבשלב דג הזברה מהונדס ולתאר את המורפוגנזה של קשתות בלוע בתוך תקופה זו. בנוסף, אנו מראים התנהגויות רקמה שמושפעות על ידי מוטציות המשבשות את BMP, PDGF, ומסלולי איתות ששש.
מיקרוסקופיה confocal זמן לשגות היא כלי רב עוצמה לניתוח של התפתחות. הנה, אנחנו מדגימים את התועלת של השיטה בלימוד המורפוגנזה קשת בלוע בדג זברה שהן מוטציה למסלולי איתות חשובות באמצעות מהונדס כי תוויות בתאי רכס עצביים. בנוסף לרמת רקמת ניתוחים, ניתוחי זמן לשגות תקפים גם לניתו…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים למליסה גריפין וג'נה Rozacky לטיפול דגי המומחה שלהם. הודות PDM EGN לכתיבת סיוע, נדיבות, וסבלנות. עבודה זו נתמכה על ידי NIH / NIDCR R01DE020884 לJKE.
6 lb. test monofilament line | Cortland Line Company | SLB16 | |
Agarose I | Amresco | 0710 | |
Argon laser | LASOS Lasertechnik GmbH | LGN 3001 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID | FHC | 30-31-0 | |
Clove oil | Hilltech Canada, Inc. | HB-102 | |
High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
Isotemp dry-bath incubator | Fisher Scientific | 2050FS | |
Laser scanning microscope | Carl Zeiss AG | LSM 710 | |
Magnesium sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
Microscope cover glass, 22×22-1 | Fisher Scientific | 12-542-B | |
Microscope cover glass, 24×60-1 | Fisher Scientific | 12-545-M | |
Potassium chloride | Fisher Scientific | M-11321 | |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | M-11624 | |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | |
TempController 2000-2 | PeCon GmbH | ||
Tricaine-S | Western Chemical, Inc. |