4D confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग Zebrafish में Craniofacial Morphogenesis का विश्लेषण करना
Summary
समय चूक confocal इमेजिंग भ्रूण के विकास के लिए निस्र्पक उपयोगी एक शक्तिशाली तकनीक है. यहाँ, हम पद्धति का वर्णन और craniofacial जंगली प्रकार में morphogenesis, साथ ही pdgfra, smad5, और एसएमओ उत्परिवर्ती भ्रूण की विशेषताएँ.
Abstract
समय चूक इमेजिंग morphogenesis की प्रक्रिया का प्रत्यक्ष अवलोकन के लिए अनुमति देता है एक तकनीक, या आकार की पीढ़ी है. कारण उनके ऑप्टिकल स्पष्टता और आनुवंशिक हेरफेर करने ज़िम्मा करने के लिए, zebrafish भ्रूण रहने वाले भ्रूण में morphogenesis का समय व्यतीत हो जाने के विश्लेषण करने के लिए जो के साथ एक लोकप्रिय मॉडल जीव बन गया है. एक जीवित zebrafish भ्रूण के confocal इमेजिंग ब्याज की एक ऊतक लगातार इस तरह के एक transgene या इंजेक्शन डाई के रूप में, एक फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ लेबल किया जाना जरूरी है. प्रक्रिया भ्रूण anesthetized और स्वस्थ विकास सामान्य रूप से आगे बढ़ती है कि इस तरह से जगह में आयोजित किया जाता है कि मांग. इमेजिंग के लिए पैरामीटर तीन आयामी विकास के लिए खाते में और विकास के त्वरित फोटो हो रही है जबकि व्यक्ति की कोशिकाओं को हल करने की मांगों को संतुलित करने के लिए सेट किया जाना चाहिए. हमारे परिणाम प्रतिदीप्ति लेबल zebrafish भ्रूण के vivo इमेजिंग में लंबे समय तक प्रदर्शन करने के लिए और में विभिन्न ऊतकों व्यवहार का पता लगाने के लिए क्षमता का प्रदर्शनcraniofacial असामान्यताओं का कारण है कि कपाल तंत्रिका शिखा. संज्ञाहरण और बढ़ते की वजह से विकास की देरी कम कर रहे हैं, और भ्रूण प्रक्रिया से नुकसान कर रहे हैं. समय चूक imaged भ्रूण विकास में बाद में बिंदुओं पर तरल माध्यम में लौट आए और बाद में imaged या तय किया जा सकता है. ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों और अच्छी तरह से विशेषता भाग्य मानचित्रण और प्रत्यारोपण तकनीक, इमेजिंग के एक बढ़ती हुई बहुतायत के साथ किसी भी वांछित ऊतक संभव है. जैसे, vivo इमेजिंग में समय व्यतीत उत्परिवर्ती और microinjected भ्रूण का विश्लेषण सहित zebrafish आनुवंशिक तरीकों, साथ शक्तिशाली जोड़ती है.
Introduction
Craniofacial morphogenesis अनेक प्रकार की कोशिकाओं के बीच समन्वय बातचीत की आवश्यकता है कि एक जटिल बहु कदम प्रक्रिया है. craniofacial कंकाल की बहुमत तंत्रिका शिखा कोशिकाओं से ली गई है, जिनमें से कई ग्रसनी मेहराब 1 बुलाया क्षणिक संरचनाओं में पृष्ठीय न्यूरल ट्यूब से विस्थापित करना होगा. कई ऊतकों के रूप में, craniofacial कंकाल की morphogenesis विशिष्ट विकासात्मक समय बिंदुओं पर भ्रूण की स्थिर छवियों से समझा जा सकता है की तुलना में अधिक जटिल है. यह समय लेने वाली प्रदर्शन करने के लिए है, vivo में समय व्यतीत हो माइक्रोस्कोपी एक विकासशील भ्रूण की कोशिकाओं और ऊतकों को निरंतर रूप देता है. एक समय चूक श्रृंखला में प्रत्येक छवि दूसरों के लिए संदर्भ बख्शी, और एक घटना होती है क्यों deducing के बजाय उस समय क्या हो रहा है deducing की ओर एक अन्वेषक चाल में मदद करता है.
Vivo इमेजिंग में इस प्रकार के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के लिए एक शक्तिशाली वर्णनात्मक उपकरण हैmorphogenesis गाइड कि रास्ते deconstruct. zebrafish Danio rerio हड्डीवाला भ्रूण के विकास की एक लोकप्रिय आनुवंशिक मॉडल है, और विशेष रूप से अच्छी तरह से morphogenesis के vivo इमेजिंग के लिए अनुकूल है. आधुनिक, transgenesis और जीनोमिक संशोधन के लिए सुविधाजनक तरीके तेजी से zebrafish शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध उपकरणों की संख्या बढ़ रहे हैं. ये उपकरण आनुवंशिक हेरफेर और माइक्रोस्कोपी के लिए पहले से ही मजबूत तरीकों में वृद्धि. लगभग किसी भी वांछित आनुवंशिक संदर्भ में लगभग किसी भी ऊतक के vivo इमेजिंग कल्पना से वास्तविकता के करीब है.
ग्रसनी मेहराब के morphogenetic आंदोलनों तंत्रिका शिखा और आसन्न epithelia, बाहरी झिल्ली दोनों और अन्तर्जनस्तर के बीच बातचीत के संकेत द्वारा निर्देशित कर रहे हैं. Craniofacial कंकाल तत्वों के morphogenesis ड्राइव करने के लिए आवश्यक हैं कि epithelia द्वारा व्यक्त कई संकेतन अणुओं कर रहे हैं. इन संकेतन अणुओं के बीच, ध्वनि का हाथी (श्श्श) गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है चया craniofacial विकास 2-8. श्श्श मौखिक बाहरी झिल्ली और ग्रसनी अन्तर्जनस्तर 2,6,9,10 दोनों द्वारा व्यक्त की है. अन्तर्जनस्तर में श्श्श की अभिव्यक्ति मेहराब 10, मेहराब 10 भीतर तंत्रिका शिखा की patterning, और craniofacial कंकाल 11 की वृद्धि की morphogenetic आंदोलनों को नियंत्रित करता है.
बीएमपी संकेतन भी craniofacial विकास के लिए 12 गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है और ग्रसनी मेहराब के morphogenesis बदल सकता है. बीएमपी संकेतन ग्रसनी मेहराब 13,14 भीतर शिखा के पृष्ठीय / वेंट्रल patterning को नियंत्रित करता है. Zebrafish में smad5 के विघटन गंभीर तालु दोष और midline 15 पर उचित फ्यूज करने मेकेल उपास्थि की विफलता का कारण बनता है. इसके अलावा, म्यूटेंट भी एन डी 2, 3, और midline 15 पर जुड़े हुए कभी कभी 4 वें ग्रसनी कट्टर तत्वों के साथ उदर उपास्थि तत्वों में कटौती और फ्यूजन, प्रदर्शित. इन fusions जोरदार Bmp संकेतन इन ग्रसनी तत्वों के morphogenesis कि निर्देशन का सुझाव.
PDGF संकेतन craniofacial विकास के लिए आवश्यक है, लेकिन ग्रसनी मेहराब morphogenesis में अज्ञात भूमिका है. माउस और zebrafish Pdgfra म्यूटेंट दोनों गहरा midfacial clefting 16-18 है. कम से कम zebrafish में इस midfacial clefting उचित तंत्रिका शिखा सेल प्रवास 16 की विफलता की वजह से है. तंत्रिका शिखा कोशिकाओं वे ग्रसनी मेहराब दर्ज करने के बाद pdgfra व्यक्त करने के लिए जारी है. इसके अतिरिक्त, PDGF ligands के चेहरे epithelia द्वारा व्यक्त कर रहे हैं और ग्रसनी मेहराब 16,19,20 के भीतर, इस प्रकार PDGF संकेतन भी माइग्रेशन निम्नलिखित ग्रसनी मेहराब के morphogenesis में एक भूमिका निभा सकता है. हालांकि, pdgfra म्यूटेंट में ग्रसनी मेहराब प्रदर्शन किया नहीं किया गया है की morphogenesis का विश्लेषण करती है.
यहाँ, हम pharyngul के vivo confocal माइक्रोस्कोपी में प्रदर्शितएक चरण ट्रांसजेनिक zebrafish और इस अवधि के भीतर ग्रसनी मेहराब के morphogenesis का वर्णन. हम आगे BMP, PDGF, और श्श्श संकेत दे रास्ते को बाधित कि परिवर्तन से प्रभावित कर रहे हैं कि ऊतक व्यवहार प्रदर्शित करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
समय चूक confocal माइक्रोस्कोपी विकास के विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. यहाँ, हम तंत्रिका शिखा कोशिकाओं लेबल है कि एक ट्रांसजेनिक का उपयोग महत्वपूर्ण संकेत दे रास्ते के लिए उत्परिवर्ती हैं कि zebrafish मे…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उनके विशेषज्ञ मछली की देखभाल के लिए मेलिस्सा ग्रिफिन और जेना Rozacky धन्यवाद. PDM धन्यवाद EGN सहायता, उदारता, और धैर्य लिखने के लिए. इस काम JKE लिए एनआईएच / NIDCR R01DE020884 द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| 6 lb. test monofilament line | Cortland Line Company | SLB16 | |
| Agarose I | Amresco | 0710 | |
| Argon laser | LASOS Lasertechnik GmbH | LGN 3001 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID | FHC | 30-31-0 | |
| Clove oil | Hilltech Canada, Inc. | HB-102 | |
| High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
| Isotemp dry-bath incubator | Fisher Scientific | 2050FS | |
| Laser scanning microscope | Carl Zeiss AG | LSM 710 | |
| Magnesium sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Microscope cover glass, 22×22-1 | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Microscope cover glass, 24×60-1 | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | M-11321 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | M-11624 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| TempController 2000-2 | PeCon GmbH | ||
| Tricaine-S | Western Chemical, Inc. |
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