Time-lapse konfokal avbildning är en kraftfull teknik användbar för karakterisering av embryots utveckling. Här beskriver vi den metod och karakterisera craniofacial morfogenes i vildtyp, samt PDGFRA, smad5 och SMO mutanta embryon.
Time-lapse avbildning är en teknik som gör det möjligt att direkt observation av processen för morfogenes, eller generering av formen. På grund av deras optiska klarhet och mottaglighet för genetisk manipulation, har den zebrafisk embryot blivit en populär modell organism med för att utföra tidsförlopp analys av morfogenes i levande embryon. Konfokal avbildning av ett levande zebrafisk embryo kräver att en vävnad av intresse är ihärdigt märkt med en fluorescerande markör, såsom en transgen eller injiceras färgämnet. Processen kräver att embryot bedövas och hålls på plats på ett sådant sätt att en sund utveckling fortskrider normalt. Parametrar för avbildning måste ställas till svars för tredimensionell tillväxt och för att balansera kraven på att lösa enskilda celler samtidigt få snabba ögonblicksbilder av utveckling. Våra resultat visar att förmågan att utföra långsiktiga in vivo avbildning av fluorescensmärkta zebrafisk embryon och för att upptäcka olika vävnads beteenden ihjärn neurallisten som orsakar kraniofaciala missbildningar. Utvecklings förseningar orsakade av anestesi och montering är minimala, och embryon är oskadd genom processen. Time-lapse avbildade embryon kan returneras till flytande medium och därefter avbildas eller fast vid senare punkter i utvecklingen. Med ett ökande överflöd av transgena zebrafisk linjer och väldefinierad öde kartläggning och transplantationsteknik, bildbehandling varje önskad vävnad är möjlig. Som sådan, tidsförlopp in vivo imaging kombinerar kraftfullt med zebrafisk genetiska metoder, inklusive analyser av muterade och mikroinjicerade embryon.
Craniofacial morfogenes är en komplex process i flera steg som kräver koordinerade interaktioner mellan multipla celltyper. Majoriteten av kraniofaciala skelettet är härlett från neurallistceller måste många av som migrerar från den dorsala neuralröret i transienta strukturer som kallas pharyngeal valv 1. Som med många vävnader, är morfogenes av kraniofaciala skelett mer komplicerat än vad som kan förstås av statiska bilder av embryon vid specifika utvecklingsmässiga tidpunkter. Även om det är tidskrävande att utföra, ger in vivo-tidsförlopp mikroskopi en kontinuerlig titt på en utveckling av embryo celler och vävnader. Varje bild i en time-lapse-serien ger sammanhang till de andra, och hjälper en utredare steget mot att kunna utläsa varför ett fenomen uppstår snarare än att kunna utläsa vad som händer då.
In vivo imaging är alltså ett kraftfullt beskrivande redskap för experimentella metoder fördekonstruera de vägar som styr morfogenes. I zebrafisk Danio rerio är en populär genetisk modell av vertebrat embryonal utveckling, och är särskilt väl lämpad för in vivo-avbildning av morfogenes. Modern är praktiska metoder för genmodifiering och genomisk modifiering snabbt framåt det antal verktyg tillgängliga för zebrafisk forskare. Dessa verktyg ökar redan robusta metoder för genetisk manipulation och mikroskopi. In vivo avbildning av nästan alla vävnader i nästan alla önskade genetiska sammanhang är närmare verkligheten än fantasin.
Morfogenetiska rörelser faryngala bågar styrs genom att signalera interaktioner mellan neurallisten och den intilliggande epitel, både ektoderm och endoderm. Det finns ett stort antal signalmolekyler som uttrycks av epitel som är nödvändiga för att driva den morfogenes av kraniofaciala skelettelement. Bland dessa signalmolekyler, Sonic Hedgehog (Shh) är mycket viktigt feller craniofacial utveckling 2-8. Shh uttrycks av både den muntliga ektoderm och svalg endoderm 2,6,9,10. Uttrycket av Shh i endoderm reglerar morfogenetiska rörelser av valven 10, mönstring av neurallisten inom bågarna 10, och tillväxten av den craniofacial skelett 11.
Bmp-signalering är också av avgörande betydelse för kraniofaciala utveckling 12 och kan ändra morfogenes av svalget valv. BMP signalering reglerar rygg / ventrala mönstring av crest inom faryngala valv 13,14. Avbrott i smad5 i zebrafisk orsakar allvarliga palatinala defekter och fel på Meckels brosk att smälta lämpligt vid mittlinjen 15. Dessutom mutanterna visar också minskningar och fusion i de ventrala brosk element, med 2: a, 3: e, och ibland 4: e svalg arch element smält vid mittlinjen 15. Dessa fusioner tyder starkt på att BMP signalering styr morfogenes av dessa svalg element.
PDGF-signalering är nödvändig för kraniofaciala utveckling, men har okända roller i svalg arch morfogenes. Både mus och zebrafisk PDGFRA mutanter har djupgående midfacial clefting 16-18. Åtminstone i zebrafisk denna midfacial clefting beror på ett bristfälligt neural crest cell migration 16. Neurallistceller fortsätter att uttrycka PDGFRA efter att ha anlänt faryngala valv. Dessutom är PDGF-ligander uttrycks av ansikts epitel och inom svalg valv 16,19,20, alltså PDGF-signalering kan också spela en roll i morfogenes av svalg valv efter migrationen. Men analyser av morfogenes av pharynx valv i PDGFRA mutanter har ej utförts.
Här visar vi in vivo konfokalmikroskopi av pharyngulen-stegs transgen zebrafisk och beskriva morfogenes av pharynx valv inom denna period. Vi visar ytterligare vävnads beteenden som påverkas av mutationer som stör BMP, PDGF, och Shh signalvägar.
Time-lapse konfokalmikroskopi är ett kraftfullt verktyg för analys av utvecklingen. Här visar vi metodens användbarhet i att studera svalg båge morfogenes i zebrafisk som är mutant för viktiga signalvägar med hjälp av en transgen som märker neurallistceller. Förutom vävnadsnivå analyser, tid förfaller analyser gäller även för analyser på en cellulär skala 28. Många allmänt använda zebrafisk metoder kan också införlivas i tidsförlopp mikroskopi experiment, inklusive mikroinjektion av m…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Melissa Griffin och Jenna Rozacky för sin fisk vård expert. PDM tack EGN för att skriva bistånd, generositet, och tålamod. Detta arbete stöddes av NIH / NIDCR R01DE020884 till JKE.
6 lb. test monofilament line | Cortland Line Company | SLB16 | |
Agarose I | Amresco | 0710 | |
Argon laser | LASOS Lasertechnik GmbH | LGN 3001 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID | FHC | 30-31-0 | |
Clove oil | Hilltech Canada, Inc. | HB-102 | |
High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
Isotemp dry-bath incubator | Fisher Scientific | 2050FS | |
Laser scanning microscope | Carl Zeiss AG | LSM 710 | |
Magnesium sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
Microscope cover glass, 22×22-1 | Fisher Scientific | 12-542-B | |
Microscope cover glass, 24×60-1 | Fisher Scientific | 12-545-M | |
Potassium chloride | Fisher Scientific | M-11321 | |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | M-11624 | |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | |
TempController 2000-2 | PeCon GmbH | ||
Tricaine-S | Western Chemical, Inc. |