Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Analyserer kraniofacial Morfogenese i zebrafisk Brug 4D konfokal mikroskopi

doi: 10.3791/51190 Published: January 30, 2014

Summary

Time-lapse konfokal billeddannelse er en kraftfuld teknik nyttig til karakterisering af fosterudviklingen. Her beskriver vi den metode og karakterisere kraniofaciale morfogenese i vildtype, samt PDGFRA, smad5, og SMO mutant embryoner.

Abstract

Time-lapse-billeddannelse er en teknik, der giver mulighed for direkte observation af processen morfogenese eller generering af form. På grund af deres optiske klarhed og modtagelighed for genetisk manipulation, er zebrafisk embryo blevet en populær model organisme med at udføre time-lapse-analyse af morfogenese i levende fostre. Konfokal afbildning af en levende zebrafisk embryo kræver, at et væv af interesse vedvarende er mærket med en fluorescerende markør, såsom et transgen eller injiceres farvestof. Processen kræver, at fosteret er bedøvet, og holdes på plads på en sådan måde, at en sund udvikling forløber normalt. Parametre for billeddannelse skal indstilles til at redegøre for tre-dimensionelle vækst og at skabe balance mellem krav redde individuelle celler, mens få hurtige snapshots af udvikling. Vores resultater viser evnen til at udføre langsigtede in vivo billeddannelse af fluorescens-mærket zebrafisk embryoner og opdage varierede væv adfærd ikranie neurale våbenskjold, der forårsager kraniofaciale abnormiteter. Udviklingsmæssige forsinkelser forårsaget af anæstesi og montering er minimal, og embryoner er uskadt ved processen. Time-lapse filmede embryoner kan returneres til flydende medium og efterfølgende filmede eller fast på senere punkter i udvikling. Med en stigende overflod af transgene zebrafisk linjer og velkarakteriseret skæbne kortlægning og transplantationscentre teknikker, billedbehandling enhver ønsket væv er mulig. Som sådan time-lapse in vivo imaging kombinerer kraftigt med zebrafisk genetiske metoder, herunder analyser af mutant og mikroinjicerede embryoner.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Craniofacial morfogenese er en kompleks multi-trins proces, der kræver en koordineret interaktioner mellem flere celletyper. Størstedelen af kraniofaciale skelet er afledt fra neurale kamceller skal hvoraf mange migrerer fra den dorsale neuralrøret i forbigående strukturer kaldet svælg buer 1. Som med mange væv, morfogenese af kraniofaciale skelet er mere kompliceret, end der kan forstås af statiske billeder af fostre på bestemte udviklingsmæssige tidspunkter. Selv om det er tidskrævende at udføre in vivo time-lapse mikroskopi giver en kontinuerlig kig på en fosterets udvikling celler og væv. Hvert billede i en time-lapse-serie giver sammenhæng til de andre, og hjælper en investigator bevægelse mod at udlede, hvorfor et fænomen snarere end at udlede, hvad der sker på det tidspunkt.

In vivo billeddannelse er således en kraftfuld beskrivende værktøj til eksperimentelle tilgange tildekonstruere de veje, der styrer morfogenese. Zebrafisk Danio rerio er en populær genetisk model af hvirveldyr embryonale udvikling, og er særdeles velegnet til in vivo billeddannelse af morfogenese. Moderne, er bekvemme metoder til gensplejsning og genomisk modifikation hurtigt fremme antallet af tilgængelige værktøjer til zebrafisk forskere. Disse værktøjer forbedre allerede robuste metoder til genetisk manipulation og mikroskopi. In vivo billeddannelse af næsten enhver væv i næsten enhver ønsket genetisk sammenhæng er tættere på virkeligheden end fantasien.

Morfogenetiske bevægelser af svælg buer er styret af signalering interaktioner mellem neurale våbenskjold og den tilstødende epithel, både ectoderm og endoderm. Der er talrige signalmolekyler udtrykkes af epitelet, der er nødvendige for at drive morfogenese kraniofaciale skelet elementer. Blandt disse signalmolekyler, Sonic Hedgehog (Shh) er kritisk vigtigt feller kraniofaciale udvikling 2-8. Shh udtrykkes ved både den mundtlige ectoderm og svælg endoderm 2,6,9,10. Udtrykket af Shh i endodermen regulerer morfogenetiske bevægelser af buer 10, mønstret af neural crest inden buer 10, og væksten i den kraniofaciale skelet 11.

BMP signalering er også kritisk vigtigt for kraniofacial udvikling 12 og kan ændre morfogenese af svælg buer. BMP signalering regulerer dorsale / ventrale mønstret af våbenskjold i svælg buer 13,14. Forstyrrelser i smad5 i zebrafisk forårsager alvorlige palatinalt fejl og en fejl i Meckel s brusk til at smelte ordentligt på midterlinjen 15. Desuden mutanterne også vise reduktioner og fusion i ventrale brusk elementer, med 2., 3., og undertiden 4. buen elementer fusioneret på midterlinjen 15. Disse fusioner tyder stærkt på, at BMP signalering dirigerer morfogenese af disse svælg elementer.

PDGF signalering er nødvendig for kraniofaciale udvikling, men har ukendte roller i buen morfogenese. Både mus og zebrafisk PDGFRA mutanter har dyb midfacial clefting 16-18. I hvert fald i zebrafisk denne midfacial clefting skyldes en fejl i ordentlig neural crest cellemigration 16. Neuralkam celler fortsætter med at udtrykke PDGFRA efter at de har indtastet svælg buer. Derudover er PDGF-ligander udtrykt ved ansigts epiteler og inden svælg buer 16,19,20, således PDGF signalering kunne også spille en rolle i morfogenese af svælg buer efter migration. Men analyser af morfogenese af svælg buer i PDGFRA mutanter er ikke blevet udført.

Her viser vi in vivo konfokal mikroskopi af pharyngulet-trins transgene zebrafisk og beskrive morfogenese af svælg buer inden for denne periode. Vi yderligere at demonstrere væv adfærd, der er påvirket af mutationer, der forstyrrer BMP, PDGF og Shh signalveje.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1.. Husdyrhold og mutantallelerne

  1. Hæv og avle zebrafisk som beskrevet 21.
  2. Zebrafisk mutantalleler anvendt i denne undersøgelse var PDGFRA B1059 16 smad5 B1100 22 og smo B577 23. Kilderne til disse zebrafisk stammer indbefatter Zirc.

2. Fremstilling af opløsninger og Redskaber

Bemærk: Der kan gøres Alle løsninger og redskaber i forvejen og gemt til senere brug.

  1. Gør embryo medier (EM) som tidligere beskrevet 21.
  2. Lav 4 g / L MS-222 (tricaine). Opløs 4 g Dinatriumfosfat (Na 2 HPO 4) i 450 ml sterilt vand. Tilsæt 2 g MS-222 til opløsningen. PH justeres inden for 7,0-7,2. Tilføj sterilt vand til et totalt volumen på 500 ml.
  3. Valgfrit: Lav 4 g / L fed olie. 0,2 g ren fed olie afvejes i en 50 ml konisk rør. Tilføj EM til et samlet volumen på 50 ml. Opbevares ved 4 ° C.
  4. Lav 3% methylcellulose. Medbring 50 ml EM + 0,1 M HEPES til en byld. Fjern fra varmen. Rør 1,5 g methylcellulose, indtil opløsningen er homogen. Opbevares ved 4 ° C.
  5. Lav 0,2% agarose. Tilføj 0,1 g agarose til 50 ml EM. Bring EM i kog i mikrobølgeovn eller på en varmeplade, og kontroller, at agarose er opløst. Alikvot i gl volumener i mikrocentrifugerør og butik 500 ved 4 ° C. Bemærk: Mængder kan justeres efter behov.
  6. Foretag kapillar pokers. Placer en dråbe superlim inde i en 0,9 mm ID kapillarrør. Sæt en længde på 6 £ test monofilamenter fiskesnøre 4-5 cm ind i kapillarrøret, således at ca 3-4 mm linje strækker sig ud over enden af ​​røret.
  7. Lav to broholdige dækglas per eksemplar. Super-lim 22 x 22-1 dækglas på hver ende af en 24 x 60-1 dækglas forlader den midterste gratis. Foretag singler (1 lille dækglas pr ende) for embryoner mindre end en dag gammel, fordobler (2 små dækglasset oven på hinanden per ende) for embryoner 03:59 days gamle eller tredobler (3 små dækglasset oven på hinanden per ende) for embryoner fem dage eller ældre.
  8. Fyld en 10 ml sprøjte med højt vakuum fedt. Bemærk: Vacuum fedt fungerer som en fugemasse for at undgå dehydrering af eksemplarer over lange perioder, og har lavt potentiale for toksicitet i forhold til mere volatile fugemasse.

3. Montering zebrafisk Embryoner til konfokal mikroskopi (se figur 1)

  1. Forbered anæstetisk medium. Smelt en portion på 0,2% agarose ved microwaving i 20 sek intervaller indtil den er helt flydende. Bland 8 pi MS-222 ind i 192 pi 0,2% agarose eller 5 pi af 4 g / L fed olie i 195 pi 0,2% agarose. Vedligehold i en 42 ° C varme blok. Bemærk: Lang eksponering til MS-222 forårsager stærkere udviklingsmæssige forsinkelser end fed olie gør i embryonale zebrafisk 24.
  2. Hvis det er nødvendigt: dechorionate manuelt uklækkede transgene embryoner, der skal analyseres lige før analysen. Ved hjælp af en pincet, langsomt tear chorion åben indtil fosteret er befriet.
  3. Bedøve zebrafisk embryoner. Tilsæt 1 ml af en 4 g / L bestand af MS-222 til 24 ml embryonbeholdere medier. Alternativt tilsættes 390 pi 4 g / L fed olie til 24 ml af fisk vand 24. Bemærk: Fed olie virker langsomt, så udføre dette trin mindst 15-20 min før time-lapse mikroskopi.
  4. Placer en perle af vakuum fedt omkring midten rummet af en opadvendte bro dækglas. Skub langsomt vakuum fedt ud af sprøjten, hvilket gør en glat, ubrudt stribe, der støder op til og indersiden af ​​broerne og kanten af ​​dækglasset.
  5. Spred en cirkel på 4% methylcellulose i midten af ​​den broforbundne dækglasset ved hjælp af en træ applikator.
  6. Overfør embryo, der skal afbildes. Når fosteret er bedøvet trække det op i et glas pipette. Hold pipetten lodret op for at tillade embryonet at synke til bunden af ​​væsken i pipetten. Flyt pipetten ind agaroseopløsningen og tillade embryonet at faldei agarose. Må ikke uddrive væsken.
  7. Anbring prøven. Drage nogle agaroseopløsning og embryoet ind i pipetten. Udvise embryo i en dråbe agaroseopløsning på toppen af ​​methylcellulose. Brug en kapillær poker at skubbe embryo nedad på methylcellulose og orientere foster som ønsket for billeddannelse.
  8. Seal prøven.
    1. Placer en bro dækglas på toppen af ​​den monteret en, vendt nedad. Påfør jævnt tryk på begge sider af klemt dækglas indtil broerne gøre direkte kontakt og agarose drop tætninger på begge dækglas. Kontroller, at fosteret er korrekt orienteret.
    2. Gnid et træ applikator langs glasset til at udjævne revner og huller i vakuum fedt perlen. Tør overskydende fedt fra kanterne væk.

4.. Time-lapse konfokal Imaging af transgene zebrafisk embryoer

(Denne protokol er blevet optimeret til et Zeiss LSM 710 konfokal mikroskop osning ZEN imaging software, og kan ændres til brug med andre systemer.)

  1. Aktiver udstyr. Tænd for konfokal mikroskop og eventuelle eksterne laser enheder. Tænd computer forbundet til konfokal mikroskop. Åbent konfokal imaging software, og vælg "Start System" for at aktivere kontrollen billede erhvervelse.
  2. Forbered opvarmet fase. Sænk iscenesættelse platform konfokal mikroskop og flytte de objektive linser ud af position. Udskift standard scenen med en elektronisk opvarmet scene. Tænd controller til den opvarmede scene og indstille temperaturen for 29,5 ° C.
  3. Placer modellen i synsfeltet. Placer de monterede prøve på scenen. Flyt 20X objektiv i position og hæve iscenesættelse platform. Aktiver synligt lys emitter og se gennem okularerne. Centrere fosterets hoved i synsfeltet.
  4. Definer indstillinger for eksperiment.
    1. Aktiver fluorescens-kanaler ved at vælgeden fluorescerende bølgelængde at blive opdaget og vælger farve opslagstabeller (LUT) for hver kanal. Hvis det er nødvendigt, bruge manuelle kontroller i softwaren for at tænde de nødvendige lasere (fx 561 nm for RFP). For hver fluorescens kanal, skal du indstille laseren intensitet til 10,0 og fotomultiplikatorrørets spænding (HV eller gevinst) mellem 600-700. Indstil gennemsnitsberegning til 4 og bit dybde til 16 bit.
    2. Aktiver serie moduler Z-stack og klokkeslæt. Indstil pinhole til 5 um eller mindre Z-opløsning og indstille Z-interval til den foreslåede optimale afstand.
      Bemærk: Generelt 5 um Z opløsning tillader hver Z-stack billede, der skal opsamles hurtigt nok til en "snapshot" af embryo på et bestemt tidspunkt og samtidig at løse de enkelte celler. Sænkning af gennemsnitsberegning reducerer også mængden af ​​tid pr billede.
    3. Definer det ønskede tidsinterval mellem billeder (normalt 10-20 min) og den samlede længde af forsøget.
  5. Set positionelleinformation.
    1. Tænd kameraet til live-mode. Juster fokus og øge laser intensitet hvis det er nødvendigt at se fluorescens. Indstil den digitale zoom til 0,6 for et bredere udsyn, hvis det ønskes.
    2. Placer den fase, således at alle strukturer af interesse er synlige, og der er plads i synsfeltet for udvækst dorsalt og anteriort. Fokus gennem embryonet til de øvre og nedre grænser for fluorescens. Indstil første og sidste Z-stack udsnitspositioner mindst 100 m eller mere over disse grænser.
  6. Optimer fluorescensintensitet.
    1. Indstil displayet LUT at ligge indikator. Fluorescerende strukturer vises nu hvide, og resten af ​​synsfeltet skal være blå (ingen registrering) eller sort.
    2. Forøg HV / gevinst på et niveau lige under hvor mættet (rød) pixler. Juster om nødvendigt offset så et flertal af baggrunden er ikke påvist (blå). Bemærk: Mindre pinhole diameter og øget laser intensitet både forbedre billedkvaliteten definition, men laser intensitet skal holdes lav for at bevare levende væv. Øget HV / gevinst og pinhole diameter (<5 m) er generelt at foretrække frem for en øget laser intensitet.
    3. Hold pinhole diameter bred nok til at indsamle billeder i tide, i gennemsnit sæt til 4.. Z-interval bør altid være sat til den foreslåede optimale afstand for pinhole diameter. Udfør korte scanninger (i gennemsnit = 1) med forskellige indstillinger, og bruge den mindste laser intensitet, der opnår den ønskede opløsning.
  7. Køre eksperimentet for det ønskede tidsrum. Bagefter fjerne embryo fra den opvarmede scenen og langsomt adskille dækglas. Sænk dækglasset og embryo i EM i en 30 mm petriskål. Ved hjælp af en glaspipette forsigtigt vaske embryonet væk fra dækglasset og fjerne dækglasset fra petriskålen. Placer foster til en 28,5 ° C inkubator at fortsætte med at udvikle sig.
  8. Sammenlign væksten. Ved afslutningen af ​​forsøget, tage individuelle Zstack billeder af agarose monteret søskende embryoner, blev ligeledes iscenesat til modellen i starten af ​​forsøget, men er blevet rejst under EM i en 28,5 ° C inkubator.
  9. Mål svælg buer efter behov. Målinger kan udføres i nogle konfokale softwarepakker. Målinger findes her blev udført ved hjælp af Fiji25 ved at importere og Z-projektering. LSM filer af de enkelte frames.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I vildtype embryoner efter neuralkam befolkning, svælg buer langstrakt langs forreste / bageste og dorsale / ventrale akser, mens du flytter i en rostral retning (Movie 1). Ved 30 timer efter befrugtning (HPF), den anteriore / posteriore længden af ​​den første buen er mellem 1,8 til 1,9 gange dens dorsale / ventrale højde. Dorsal / ventral forlængelse fortsætter støt, hurtigere end anterior / posterior forlængelse indtil 36,5 HPF. Herfra dorsale / ventrale højde plateauer omkring 104 um gennem 48 HPF. Anterior / posterior udvidelse fortsætter gennem 48 HPF, med overordnet anterior / posterior stigende længde fra under 1,5 gange den dorsale / ventrale højde på 36,5 HPF til 1,95 gange den dorsale / ventrale højde ved 48 HPF.

På sit forreste ende, den første buen danner maxillary (dorsale) og mandibular (ventrale) domæner adskilt af den mundtlige ectoderm. Maxillary domæne af den første buen måles from sin distale spids til den bageste spids af den mundtlige ectoderm. Den vokser med en hastighed estimeres ved lineær regression på 4,6 um / time (r 2 = 0,9374) mellem 30-48 HPF og er omkring 104 um lang ved 48 HPF (Movie 1).

Svælg buer 3-7 al form fra segmentering af en enkelt masse af neurale crest celler via svælg endoderm 26. Mellem 30-38 HPF, 5 th gennem 7 th svælg buer adskilt fra massen, den 3. og 4. th buer allerede have adskilt. Omkring 37 HPF, den 3. buen begynder at bevæge sig medialt til den 2. bue. Lateralt, 7 th buen overhaler de 5 og 6. buer i rostrale bevægelse med 48 HPF, forlader 3. gennem 6 th buer medialt til den 2. og 7. buer (Film 1).

Det er vigtigt, to Bemærk, at selv om konventionen er at beskrive morfologi i HPF, mikroskopi forsinker zebrafisk vækst i forhold til tilsvarende iscenesatte embryoner dyrket i et 28,5 ° C inkubator. For eksempel, efter 19 hr af mikroskopi, afstanden mellem øjet og øret af en afbildet vildtype foster var ca 81,7 um, og den gennemsnitlige øje-ear afstand til to søskende fostre afbildet straks bagefter var 71 um. Derfor er det sandsynligt, at være lidt yngre end iscenesættelsen serie 27 embryoner.

Disse morfogenetiske bevægelser er stærkt forstyrret i SMO mutanter. Som tidligere beskrevet, zebrafisk SMO mutanter ikke at danne en maxillary kondensation af den første bue, og med 48 HPF første buen er helt caudale til øjet 2. Posteriore arch bevægelser er også forstyrret 10. Den 3. buen ikke flytte medialt til den 2. buen, og Movie 2 7. buen undlader at migrere rostrally at overlappe med flere forreste buer med 48 HPF.

Zebrafisk smad5 B1100 mutanter har adskillige kraniofaciale defekter, herunder en næsten komplet tab af palatal skelet og ventrale fusioner mellem den 2., 3. og undertiden 4. buen skeletelementer 15, antyder, at der kan være fejl at buen morfogenese . Faktisk statisk konfokal billeddannelse påvist fusioner i ventrale områder af 2. og 3. buer er synlige ved 32 HPF (figur 2). Brug time-lapse konfokal mikroskopi, analyserede vi morfogenese af svælg buer i smad5 mutanter. I analyser time-lapse, fusioner mellem 2. og 3. buer vises først ved 32 HPF, i overensstemmelse med den statiske analyse (Movie 3, figur 3). Derudoversmad5 mutanter har forstyrret udvækst af den første buen (Film 3). Ved 30 HPF, den anteriore / posteriore længden af den første buen (186,8 um) er over 35% længere end i vild-type og er 2,5 gange den dorsale / ventrale højden af det første buen i en smad5 mutanten. Men som den bageste kant bevæger rostrally, den forreste / bageste længden af ​​den første buen aftager næsten 40 um mellem 30-39 HPF og derefter genvinder denne længde med 48 HPF. Den dorsale / ventrale højden af ​​det første buen falder støt til 62,3 um 30-48 HPF. Svigt i anterior forlængelse løbet af denne tid er afspejlet i maxillary domæne, som er usædvanlig lang (85 um) ved 30 HPF forhold til vild type. Maxillær længde aftager med en hastighed estimeres ved lineær regression på 4,4 um / time (r 2 = 0,9032) 30-36 HPF, og forbliver derefter ret konsekvent. Her time-lapse imaging demonstrerer unik tissue bevægelser, der eventuelt tegner sig for tabet af palatal skelet observeret i smad5 mutanter.

Mens ekspressionen af PDGF familiemedlemmer tyder på, at det kan være bredt involveret i buen morfogenese bevægelse af den bageste buer forekommer normalt i PDGFRA mutanter. Det er morfogenese af den første buen, der vises specifikt forstyrret (Movie 4). Den samlede størrelse af den første buen er reduceret i forhold til vild-type og maxillary domæne forekommer yderst plast, med celler kondenserende og tilbagetrækning over tid. Dette resulterer i et svigt af maxillary forlængelse, som topper omkring 39 HPF på 56,5 um. Ved 48 HPF kun 44,1 um maxillary domæne foranstaltninger. Kollektivt, disse fund viser, at omhyggelig tid bortfalder analyser kan give nærmere oplysninger om morfogenese potentielt tabt i statiske analyser.

Figur 1 Figur 1.. Skematisk af brokoblet dækglas konstruktion og embryo montering for konfokal mikroskopi.

Figur 2
Den anden og tredje buer sammensmelte i smad5 mutanter Figur 2 (A, B) Single Z skiver fra et (A) fli1: EGFP og en (B) fli1: EGFP; smad5 B1100 mutant foster... (A) I embryoner vildtype for smad5 neurale kamceller i den anden og tredje bue adskilt af den anden svælg posen (pilespids). (B) neuralkam celler i den ventrale grænse second og tredje buer blande sig i smad5 mutanter (pilespids). Svælg buer er nummererede. Klik her for at se større billede.

Figur 3
Figur 3. Tab af smad5 funktion resulterer i forstyrret buen morfogenese. (A, B, øvre paneler) Fremskrivninger og (lavere paneler) retvinklede synspunkter bue fusion i Movie 3. Fusion af buer to og tre er indlysende, pilespids. Svælg buer er nummererede. Klik her for at se større billede.

Movie 1. Udvikling af svælgbuer i en vild-type (fli1: EGFP) embryo 30-48 HPF. Anterior til venstre, bryst til toppen. Klik her for at se filmen.

Movie 2. Mediale bevægelser af svælg buer mislykkes i SMO mutanter (fli1: EGFP; SMOB 577) Anterior til venstre, bryst til toppen.. 30-48 HPF. Klik her for at se filmen.

Movie 3. 2. og 3. buer smelte i smad5 mutanter (fli1: EGFP; smad5 B1100) Anterior til venstre, bryst til toppen.. Serie af (A) fremskrivninger, 30-48 HPF, og (B) enk skiver, 30-40 HPF. Klik her for at se filmen.

Movie 4. Forlængelse af overkæben region fejler i PDGFRA mutanter (fli1: EGFP; PDGFRA B1059) Anterior til venstre, bryst til toppen.. 30-48 HPF. Klik her for at se filmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Time-lapse konfokal mikroskopi er et kraftfuldt værktøj til analyse af udviklingen. Her vil vi vise metodens anvendelighed i at studere buen morfogenese i zebrafisk, der er mutant for vigtige signalveje ved hjælp af et transgen, som mærker neurale crest celler. Ud til tissue-niveau analyser, tid bortfalder analyser gælder også for analyser på et cellulært skala 28. Mange udbredte zebrafisk metoder kan også indarbejdes i time-lapse mikroskopi eksperimenter, herunder mikroinjektion af morpholinos, mRNAs eller transgene konstruktioner, samt transplantationer mellem embryoner. Analyse af flere udviklingslande væv er kun begrænset af evnen til at fluorescens label væv og et konfokalt mikroskop evne til at detektere det ønskede antal forskellige fluoroforer uden krydstale. Antallet af personer, der kan filmede fra en kobling af zebrafisk embryoner er stærkt begrænset, men avancerede teknikkertillade automatiseret billeddannelse af flere fostre i samme periode. Dette er især nyttigt, når de søger at udføre time-lapse-analyse af en mutant, der ikke let identificeres på tidlige tidspunkter.

Når der foretages målinger fra time-lapse konfokal billeder, er det vigtigt at overveje, at nogle udviklingsmæssige forsinkelse forårsaget af processen. Udviklingsmæssige forsinkelser er ikke ualmindelige i mutant embryoner så godt, så billeddannelse af søskende kontrol er nødvendig for både mutant / genmanipulerede embryoner samt vildtype kontrol. Selv en gang kontrolleret for iscenesættelse, er vanskelig sammenlignende måling af fluorescens-mærkede strukturer. Fluorescensintensitet kan være meget variabel mellem individer og mellem forskellige dele af den samme struktur. Således nondiscrete kvantitative målinger har en vis grad af subjektivitet, og vi anbefaler, at mere end én person udføre målinger for at sikre sammenhæng. Efterforskere skal også disciplineret i orientere embryonerfor sammenlignende målinger konsekvent, som i modsat fald vil få indtryk af morfologiske forskelle, hvor der kan være ingen. Bevægelser prøve embryoner kan ligefrem ødelægge et eksperiment, og vi finder, at tilsætning af bedøvelsesmiddel efter microwaved agarose har fået lov til at blive tykkere reducerer dets effekt i sedating embryoner.

Skønt det er vanskeligt at erhverve, time-lapse mikroskopi data har indlysende fordele i forhold til statiske billeder at sammenligne morfogenese kvalitativt. Statiske billeder vil ofte gøre det let måling af strukturer på et bestemt tidspunkt, men giver ingen indikation af væv adfærd, der fører op til eller efter denne fase. Sådanne oplysninger er afgørende, når undersøgelse af interaktion mellem to eller flere separate væv undergår morfogenese. For at opnå den bedste samlede karakterisering af morfogenese, er det gavnligt at foretage både tidsforkortet og statisk analyser bedst udnytter fordelene ved hver metode. I tidsforkortet analyserer, kan de dynamiske celler og væv adfærd blive analyseret, og i statiske analyser, kan et stort antal fostre undersøges for at opnå den bedste forståelse af variabilitet. Det stigende antal zebrafisk transgene linjer og avancement fra andre teknikker vil gøre time-lapse konfokal mikroskopi af flere væv hverdagskost, som real-time in vivo data bliver guldstandarden blandt morfogenese forskere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker Melissa Griffin og Jenna Rozacky for deres ekspert fisk pleje. PDM tak EGN til at skrive hjælp, generøsitet og tålmodighed. Dette arbejde blev støttet af NIH / NIDCR R01DE020884 til JKE.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 lb Test monofilament line Cortland Line Company SLB16
Agarose I Amresco 0710
Argon laser LASOS Lasertechnik GmbH LGN 3001
Calcium chloride Sigma-Aldrich C8106
Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID FHC 30-31-0
Clove oil Hilltech Canada, Inc. HB-102
High vacuum grease Dow Corning 2021846-0807
Isotemp dry-bath incubator Fisher Scientific 2050FS
Laser scanning microscope Carl Zeiss AG LSM 710
Magnesium sulfate hexahydrate Sigma-Aldrich 230391
Microscope cover glass, 22 x 22-1 Fisher Scientific 12-542-B
Microscope cover glass, 24 x 60-1 Fisher Scientific 12-545-M
Potassium chloride Fisher Scientific M-11321
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P3786
Sodium chloride Fisher Scientific M-11624
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907
TempController 2000-2 PeCon GmbH
Tricaine-S Western Chemical, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trainor, P. A., Melton, K. R., Manzanares, M. Origins and plasticity of neural crest cells and their roles in jaw and craniofacial evolution. Int. J. Dev. Biol. 47, 541-553 (2003).
  2. Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
  3. Wada, N., et al. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
  4. Roessler, E., et al. Mutations in the human sonic hedgehog gene cause holoprosencephaly. Nat. Genet. 14, 357-360 (1996).
  5. Jeong, J., Mao, J., Tenzen, T., Kottmann, A. H., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in the neural crest cells regulates the patterning and growth of facial primordia. Genes Dev. 18, 937-951 (2004).
  6. Hu, D., Marcucio, R. S. A SHH-responsive signaling center in the forebrain regulates craniofacial morphogenesis via the facial ectoderm. Development. 136, 107-116 (2009).
  7. Cordero, D., et al. Temporal perturbations in sonic hedgehog signaling elicit the spectrum of holoprosencephaly phenotypes. J. Clin. Invest. 114, 485-494 (2004).
  8. Westphal, H., Beachyr, P. A. Cyclopia and defective axial patterning in mice lacking Sonic hedgehog gene function. Nature. 383, 3 (1996).
  9. Moore-Scott, B. A., Manley, N. R. Differential expression of Sonic hedgehog along the anterior-posterior axis regulates patterning of pharyngeal pouch endoderm and pharyngeal endoderm-derived organs. Dev. Biol. 278, 323-335 (2005).
  10. Swartz, M. E., Nguyen, V., McCarthy, N. Q., Eberhart, J. K. Hh signaling regulates patterning and morphogenesis of the pharyngeal arch-derived skeleton. Dev. Biol. 369, 65-75 (2012).
  11. Balczerski, B., et al. Analysis of Sphingosine-1-phosphate signaling mutants reveals endodermal requirements for the growth but not dorsoventral patterning of jaw skeletal precursors. Dev. Biol. (2011).
  12. Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. Int. J. Dev. Biol. 50, 511-521 (2006).
  13. Alexander, C., et al. Combinatorial roles for BMPs and Endothelin 1 in patterning the dorsal-ventral axis of the craniofacial skeleton. Development. 138, 5135-5146 (2011).
  14. Zuniga, E., Rippen, M., Alexander, C., Schilling, T. F., Crump, J. G. Gremlin 2 regulates distinct roles of BMP and Endothelin 1 signaling in dorsoventral patterning of the facial skeleton. Development. 138, 5147-5156 (2011).
  15. Swartz, M. E., Sheehan-Rooney, K., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev. Dyn. 240, 2204-2220 (2011).
  16. Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nat. Genet. 40, 290-298 (2008).
  17. Soriano, P. The PDGF alpha receptor is required for neural crest cell development and for normal patterning of the somites. Development. 124, 2691-2700 (1997).
  18. Tallquist, M. D., Soriano, P. Cell autonomous requirement for PDGFRalpha in populations of cranial and cardiac neural crest cells. Development. 130, 507-518 (2003).
  19. Ho, L., Symes, K., Yordan, C., Gudas, L. J., Mercola, M. Localization of PDGF A and PDGFR alpha mRNA in Xenopus embryos suggests signalling from neural ectoderm and pharyngeal endoderm to neural crest cells. Mech. Dev. 48, 165-174 (1994).
  20. Liu, L., Korzh, V., Balasubramaniyan, N. V., Ekker, M., Ge, R. Platelet-derived growth factor A (pdgf-a) expression during zebrafish embryonic development. Dev. Genes Evol. 212, 298-301 (2002).
  21. Westerfield, M. The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). (1993).
  22. Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Lovely, C. B., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Bmp and Shh Signaling Mediate the Expression of satb2 in the Pharyngeal Arches. PloS one. 8, e59533 (2013).
  23. Varga, Z. M., et al. Zebrafish smoothened functions in ventral neural tube specification and axon tract formation. Development. 128, 3497-3509 (2001).
  24. Grush, J., Noakes, D. L. G., Moccia, R. D. The efficacy of clove oil as an anesthetic for the zebrafish, Danio rerio. 1, 46-53 (2004).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
  26. Crump, J. G., Maves, L., Lawson, N. D., Weinstein, B. M., Kimmel, C. B. An essential role for Fgfs in endodermal pouch formation influences later craniofacial skeletal patterning. Development. 131, 5703-5716 (2004).
  27. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  28. Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat. Neurosci. 13, 673-679 (2010).
Analyserer kraniofacial Morfogenese i zebrafisk Brug 4D konfokal mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (83), e51190, doi:10.3791/51190 (2014).More

McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (83), e51190, doi:10.3791/51190 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter