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Biology

4D 공 초점 현미경을 사용하여 제브라 피쉬의 두개 안면 형태 형성 분석

doi: 10.3791/51190 Published: January 30, 2014

Summary

시간 경과 공 촛점 이미징은 배아 발달의 특성에 유용한 강력한 기술이다. 여기에서, 우리는 방법을 설명하고 두개 안면 야생 형에서 형태 형성뿐만 아니라 PDGFRA, smad5 및 SMO 돌연변이 배아를 특징.

Abstract

시간 경과 영상은 형태 형성의 과정을 직접 관찰 할 수있는 기술, 또는 모양의 세대입니다. 때문에 광학적 선명도와 유전자 조작에 복종 할 의무에, 제브라 피쉬 배아는 살아있는 배아에서 형태 형성의 시간 경과 분석을 수행 할 수있는 인기 모델 생물이되고있다. 라이브 제브라 피쉬 배아의 공 촛점 이미징은 그 조직이 지속적으로 같은 유전자 또는 주입 염료로, 형광 마커로 표시되어 있어야합니다. 프로세스는 배아 마취 건강한 발달이 정상적으로 진행되는 방식으로 제 위치에 유지되는 것을 요구한다. 이미징을위한 매개 변수에는 다음과 같은 세 가지 차원의 성장을 고려하여 개발의 빠른 스냅 샷을 가져 오는 동안 개별 셀 해결의 요구에 균형을 설정해야합니다. 우리의 결과는 형광 표지 된 제브라 피쉬 배아의 생체 촬상있는 장기를 수행하고있는 다양한 조직 행동을 검출하는 능력을 입증두개 안면 기형을 일으키는 원인이되는 뇌 신경 능선. 마취 및 장착으로 인한 개발 지연을 최소화하고, 배아는 프로세스에 의해 무사히입니다. 시간 경과 이미징 배아는 개발 이후 지점에서 액체 배지로 돌아 왔고, 이후 몇 군데 또는 고정 할 수 있습니다. 형질 전환 제브라 피쉬 라인과 잘 특성화 운명 매핑 및 이식 기술, 영상의 증가 풍부한 원하는 조직이 가능합니다. 따라서, 생체 내 이미징의 시간 경과가 돌연변이 및 미세 주입 배아의 분석을 포함하여 제브라 피쉬의 유전 적 방법으로 강력하게 결합한다.

Introduction

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두개 안면 형태 형성은 여러 세포 유형 간의 상호 협조를 필요로 복잡한 다단계 과정이다. 두개 안면 골격의 대부분은 신경 능선 세포에서 파생되는 많은 인두 아치 1이라는 일시적인 구조로 지느러미 신경 튜브에서 마이그레이션해야합니다. 많은 조직과 같이, 두개 안면 골격 형태 형성의 발달은 특정 시점에서 배아의 정적 이미지에 의해 이해 될 수있는 것보다 더 복잡하다. 그것은 시간이 많이 걸리는 수행 할 수 있지만, 생체 시간 경과 현미경은 배아의 세포와 조직에서 연속보기를 제공합니다. 시간 경과 시리즈의 각 이미지는 다른 사람에게 컨텍스트를 준다, 그리고 현상이 발생하는 이유를 추론보다는 그 시간에 발생하는 것을 추론을 향한 구도자 이동하는 데 도움이됩니다.

생체 내 이미징에 따라서에 실험적인 접근을위한 강력한 설명 도구입니다형태 형성을 안내 경로를 해체. 제브라 다니오의 rerio는 척추 동물의 배아 발달의 인기 유전 모델이며, 특히 형태 형성의 생체 내 이미징에 적합합니다. 현대, 형질 전환 게놈 수정을위한 편리한 방법은 빠르게 제브라 피쉬 연구원에 사용할 수있는 도구의 수를 진행하고 있습니다. 이 도구는 유전자 조작과 현미경 이미 강력한 방법을 향상시킬 수 있습니다. 거의 모든 원하는 유전 적 맥락에서 거의 모든 조직의 생체 내 이미징은 환상보다 현실에 더 가깝다.

인두 아치의 형태 형성 운동은 신경 능선과 인접한 상피, 외배엽 모두 내배엽 사이의 상호 작용을 신호에 의해 유도된다. 두개 안면 골격 요소의 형태 형성을 구동하는 데 필요한 상피 세포에 의해 표현 된 다양한 신호 분자가있다. 이러한 신호 분자 중, 소닉 더 헤지 호그 (쉬) 매우 중요 F입니다또는 두개 안면 개발 2-8. 쉿은 구강 외배엽 및 인두 내배엽 2,6,9,10 모두에 의해 표현된다. 내배엽에서 쉬의 표정은 아치 (10), 아치 (10) 내의 신경 문장의 패턴, 그리고 두개 안면 골격 (11)의 성장의 형태 형성의 움직임을 조절한다.

BMP 신호는 두개 안면 개발 (12)에 대한 매우 중요합니다 및 인두 아치의 형태 형성을 변경할 수 있습니다. BMP 신호는 인두 아치 13, 14 내 문장의 지느러미 / 복부 패턴을 조절한다. 제브라 피쉬의 smad5의 중단은 심각한 구개 결함과 중간 선 (15)에 적절하게 융합하는 메켈의 연골의 오류가 발생합니다. 또한 돌연변이는 또한 2 차, 3 차 및 중앙선에 15 융합 때때로 4 인두 아치 요소 복측 연골 성분의 감소 및 융합을 표시. 이러한 융합은 강력하게 된 BMP 신호 전달이 인두 요소의 형태 형성을 지시하는 것이 좋습니다.

PDGF 신호는 두개 안면 발전을 위해 필요하지만, 인두 아치 형태 형성에 알 수없는 역할을 가지고 있습니다. 마우스와 제브라 피쉬 PDGFRA 돌연변이는 모두 깊은 midfacial clefting 16-18있다. 적어도 제브라 피쉬이 midfacial clefting 적절한 신경 능선 세포의 이동 (16)의 실패에 기인한다. 신경 능선 세포들은 인두 아치를 입력 한 후 PDGFRA을 표현하기 위해 계속합니다. 또한, PDGF 리간드는 얼굴 상피 세포에 의해 표현되고, 인두 아치 16,19,20에서, 따라서 PDGF 신호는 마이그레이션 다음 인두 아치의 형태 형성에 중요한 역할을 할 수있다. 그러나, PDGFRA 돌연변이의 인두 아치 수행되지 않은의 형태 형성의 분석.

여기, 우리는 pharyngul의 생체 공 초점 현미경에 보여단 형질 전환 제브라 피쉬와이 기간 내에 인두 아치의 형태 형성을 설명합니다. 우리는 더 BMP, PDGF, 그리고 쉬의 신호 전달 경로를 방해 돌연변이에 의해 영향을받는 조직의 행동을 보여줍니다.

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Protocol

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1. 축산 및 돌연변이 대립 유전자

  1. (21) 기술로 제브라 피쉬를 올리고 번식.
  2. 본 연구에서 사용 된 제브라 피쉬의 돌연변이 대립 유전자는 16 b1059 smad5 B1100 (22)와, SMO의 b577 23 PDGFRA했다. 이 zebrafish의 변종에 대한 소스는 ZIRC 있습니다.

2. 솔루션 및 도구의 준비

참고 : 모든 솔루션과 구현이 사전에 향후 사용을 위해 저장 될 수있다.

  1. 이전 21 설명한 바와 같이 배아 미디어 (EM)을 확인합니다.
  2. 4g / L MS-222 (Tricaine)을 확인합니다. 450 ㎖의 멸균 물에 4g의 나트륨 인산염 (Na 2 HPO 4)을 녹입니다. 솔루션에 2g MS-222를 추가합니다. 7.0-7.2 내에서의 pH를 조정합니다. 500 ml의 총 부피에 멸균 물을 추가합니다.
  3. 선택 사항 : 4g / L 정향 오일을 확인합니다. 50 ML 원뿔 튜브에 0.2 g의 순수한 정향 오일의 무게를. 50 ㎖의 총 부피에 EM을 추가합니다. 4 ℃에서 보관
  4. 3 % methylcellulo을그 자체. 종기에 EM + 0.1 M HEPES 50 ㎖를 가져옵니다. 열에서 제거. 용액이 균질 할 때까지 1.5 g의 메틸 저어. 4 ℃에서 보관
  5. 0.2 % 아가로 오스를 확인합니다. 50 ㎖의 EM 0.1 g 아가로 오스를 추가합니다. 전자 레인지 나 핫 플레이트에 종기에 EM을 가져오고 아가로 오스가 용해되어 있는지 확인합니다. 4 ° C에서의 microcentrifuge 튜브 및 저장소에 500 μL의 볼륨으로 나누어지는 주의 : 필요에 따라 볼륨이 조절 될 수있다.
  6. 모세관 부지깽이를 확인합니다. 0.9 mm의 ID 모세관 내부의 최고 접착제 한 방울을 넣습니다. 라인 약 3 ~ 4 MM은 튜브의 끝을지나 확장되도록 모세관 내부 6파운드 테스트 모노 필라멘트 낚시 줄의 4-5 cm 길이를 삽입합니다.
  7. 표본 당 두 개의 다리를 커버 슬립을 확인합니다. 중간 자유를 떠나 24 X 60-1 커버 유리의 각 끝에 슈퍼 접착제 22 X 22-1 커버 유리. 오래된 일 미만의 배아를위한 싱글 (​​끝 당 1 작은 커버 유리를) 확인 1 ~ 4 D는 태아를 위해 (끝마다 서로의 상단에 2 개의 작은 커버 유리) 두 배배아 오일 또는 그 이상 오래 AYS, 또는 트리플 (끝마다 서로의 상단에 3 작은 커버 유리).
  8. 고진공 그리스와 10 ML의 주사기를 채우십시오. 참고 : 진공 그리스는 오랜 기간 동안 표본의 탈수를 방지하기 위해 밀봉 역할을, 그리고 더 많은 휘발성 실란트에 비해 독성에 대한 낮은 가능성이있다.

3. 공 초점 현미경에 대한 설치 제브라 피쉬 배아 (그림 1 참조)

  1. 마취 매체를 준비합니다. 완전히 액체까지 20 초 간격으로 레인지 작동으로 0.2 % 아가로 오스 나누어지는 용융. 0.2 % 아가로 오스의 195 μL에 0.2 % 아가로 오스, 4 G / L 정향 오일의 5 μL의 192 μL로 MS-222의 8 μl를 섞는다. 42 ° C에서 가열 블록에 유지합니다. 참고 : MS-222에 긴 노출이 배아 제브라 피쉬 (24)에서와 정향의 기름보다 강한 발달 지연의 원인이됩니다.
  2. 필요한 경우 수동으로 부화 형질 전환 배아 직전에 분석을 분석 할 dechorionate. 집게를 사용하여, 천천히 TE배아가 해제 될 때까지 개방 융모막 아칸소.
  3. 제브라 피쉬 배아를 마취. MS-222 배아 매체의 ML 24의 4 G / L 주식의 1 ML을 추가합니다. 또한, 물고기, 물 (24) 24 ㎖를 4 G / L 정향 오일의 390 μl를 추가합니다. 참고 : 정향 오일의 역할은 천천히 그렇게 시간 경과 현미경 전에 적어도 15 ~ 20 분을이 단계를 수행합니다.
  4. 위로 향하는 다리를 커버 슬립의 중심 공간 주위에 진공 그리스의 구슬을 놓습니다. 천천히 및 교량 및 커버 슬립의 가장자리 안쪽에 인접 부드럽고 연속 구슬 만들기, 주사기 밖으로 진공 그리스를 밀어 넣습니다.
  5. 나무 주걱을 사용하여 다리를 커버 슬립의 중간에 4 % 메틸 셀룰로오스의 원을 확산.
  6. 이미지에 표시 할 배아를 전송합니다. 배아가 마취되면 유리 피펫에를 그립니다. 배아는 펫에서 액체의 바닥에 가라 앉을 수 있도록 수직으로 펫을 잡고. 아가로 오스 용액에 피펫을 이동하고 배아 드롭 할 수아가로 오스에. 액체를 추방하지 마십시오.
  7. 표본을 놓습니다. 피펫에 약간의 아가로 오스 솔루션과 배아를 그립니다. 메틸 위에 아가로 오스 솔루션의 드롭에 배아를 추방. 메틸에 아래쪽으로 배아를 밀어 이미징 원하는대로 배아 방향을 모세관 포커를 사용합니다.
  8. 시료를 밀봉.
    1. 아래로 향하도록 장착 된 하나의 상단에 하나의 다리를 커버 슬립을 놓습니다. 다리가 모두 커버 슬립에 직접 연락 아가로 오스 드롭 씰을 만들 때까지 끼워 커버 슬립의 양쪽에 일정한 압력을 적용합니다. 배아가 제대로 지향되어 있는지 확인합니다.
    2. 진공 그리스 구슬에 균열과 틈새를 부드럽게하는 유리를 따라 나무 주걱을 문질러. 가장자리에서 여분의 기름을 닦아.

4. 형질 전환 제브라 피쉬 배아의 시간 경과 공 촛점 이미징

(이 프로토콜은 혈구 LSM 710 공 초점 현미경 우리에게 최적화되어 있습니다ZEN 이미징 소프트웨어를 보내고, 다른 시스템에 사용하기 위해 수정할 수 있습니다.)

  1. 장비를 활성화합니다. 공 초점 현미경을하고 있으며, 외부의 레이저 장치의 전원을 켭니다. 공 초점 현미경에 연결된 컴퓨터의 전원을 켜십시오. 열기 공 촛점 이미징 소프트웨어 및 이미지 수집 컨트롤을 활성화하기 위해 "시작 시스템"을 선택합니다.
  2. 가열 단계를 준비​​합니다. 공 초점 현미경의 준비 플랫폼을 낮추고 위치 밖으로 대물 렌즈를 이동합니다. 전자 가열 단계로 기본 단계를 교체합니다. 가열 단계에 대한 컨트롤러의 전원을 켜고 29.5 ° C의 온도를 설정
  3. 보기의 분야에서 시료를 배치합니다. 무대에 탑재 된 표본을 놓습니다. 위치로 20X 대물 렌즈를 이동하고 준비 플랫폼을 올립니다. 가시 광선 에미 터를 활성화하고 접안 렌즈를 통해보고. 시야에서 태아의 머리를 가운데.
  4. 실험 설정을 정의합니다.
    1. 선택하여 형광 채널을 활성화감지 할 수있는 형광 파장은 각 채널의 색상 룩업 테이블 (LUT)을 선택합니다. 필요한 경우, 필요한 레이저 (RFP에 대한 예를 들어, 561 nm의)에 설정하는 소프트웨어에서 수동 제어를 사용합니다. 각각의 형광 채널에 대해, 10.0 레이저 강도와 600 ~ 700 사이의 광전자 증 배관 전압 (HV 또는 이득)을 설정합니다. 4 평균 비트와 16 비트의 비트 심도를 설정합니다.
    2. Z-스택과 시간 시리즈 모듈을 활성화합니다. 5 ㎛ 이하 Z-해상도 핀홀을 설정하고 제안 된 최적의 거리 Z-간격을 설정합니다.
      주 : 일반적으로 5 μm의 Z-Z 해상도는 각 스택에 대한 이미지가 충분히 빠르게 수집 할 수 있도록하는 개별 세포를 확인하는 동안 특정 시점에서 배아의 "스냅 샷". 평균화를 낮추면 이미지 당 시간의 양을 감소시킨다.
    3. 이미지 사이의 원하는 시간 간격 (일반적으로 10 ~ 20 분) 및 실험의 전체 길이를 정의.
  5. 위치 설정정보.
    1. 라이브 모드로 카메라의 전원을 켜십시오. 초점을 조정하고 필요한 경우 형광을 볼 레이저 강도를 증가시킨다. 원하는 경우, 넓은보기에 대해 0.6 디지털 줌을 설정합니다.
    2. 관심의 모든 구조를 볼 수 있습니다 있도록 무대를 배치하고 전방 가지 등쪽과에 대한 시야의 여지가있다. 형광의 상한과 하한을 통해 배아 초점. 첫 번째와 마지막 Z-스택 슬라이스 위치 이러한 제한을 넘어 적어도 100 μm의 이상을 설정합니다.
  6. 형광 강도를 최적화합니다.
    1. 표시를 범위로 표시 LUT를 설정합니다. 형광 구조는 이제 흰색 표시해야하고, 시야의 나머지 (무 검출) 파란색 또는 검정색이어야한다.
    2. 단지 포화 곳 아래 수준으로 HV / 이득을 증가 (빨강) 픽셀이 나타납니다. 필요한 경우, 그래서 배경의 대부분이 (파란색) 검출되지 오프셋 조정합니다. 참고 : 작은 구멍 직경 증가 레이저 강도를 이미지 데프 모두 개선inition 있지만, 레이저의 강도는 조직 생활을 유지하기 위해 낮게 유지해야합니다. 증가 HV / 이득과 작은 구멍 직경 (<5 μm의)는 일반적으로 증가 레이저 강도에 바람직하다.
    3. 충분히 넓은 4 세트의 평균을, 적시에 이미지를 수집하기 위해 작은 구멍 직경을 유지합니다. Z-간격은 항상 핀홀 직경 제시된 최적의 거리로 설정되어야한다. 다른 설정으로 짧은 검사 (평균 = 1)을 수행하고, 원하는 해상도를 달성 최소 레이저 강도를 사용합니다.
  7. 원하는 시간에 대한 실험을 실행합니다. 그 후, 가열 단계에서 배아를 제거하고 천천히 커버 슬립을 분리합니다. 30mm 페트리 접시에 EM의 커버 슬립과 배아 잠수함. 유리 피펫을 사용하여 부드럽게 커버 슬립 떨어져 배아를 씻어 페트리 접시에서 coverslip을 제거합니다. 지속적으로 개발하는 28.5 ° C의 배양기에 배아를 놓습니다.
  8. 성장을 비교. 실험의 끝에, 개별 ZS 걸릴유사 실험의 시작 부분에 시편에 개최하지만, 한 아가로 오스 장착 형제 배아의 압정 이미지는 28.5 ° C 배양기에서 EM에 제기되었다.
  9. 필요에 따라 인두 아치를 측정한다. 측정은 일부 촛점 스위트 소프트웨어에서 수행 될 수있다. 여기에서 찾을 측정은 각각의 프레임. LSM 파일을 가져 오기 및 Z-투영하여 Fiji25를 사용하여 수행 하였다.

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Representative Results

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주동이의 방향 (동영상 1)에서 이동하는 동안 야생 형 배아에서 신경 능선 인구 다음, 인두 아치 전방 / 후방 및 지느러미 / 복부 축을 따라 연장. 30시간 포스트 수정 (HPF)에서, 제 인두 아치의 전방 / 후방의 길이는 1.8-1.9 배 지느러미 / 복부 높이 사이입니다. 지느러미 / 복부 신장 빠른 36.5 HPF까지 전방 / 후방 연장보다 꾸준히 진행된다. 여기에서, 지느러미 / 복부 높이의 고원 약 104 μm의 48 HPF를 통​​해. 전방 / 후방의 확장은 전체의 전방 / 후방의 길이가 48 HPF에서 1.95 배 지느러미 / 복부 높이 HPF 36.5에서 1.5 배 지느러미 / 복부 높이 아래에서 증가, 48 HPF를 통​​해 계속됩니다.

그 앞쪽 끝에서 첫 번째 인두 아치 상악 (등쪽)과 하악 구강 외배엽으로 구분 (복부) 도메인을 형성한다. 첫 번째 인두 아치의 상악 도메인은 F를 측정한다구강 외배엽의 후방 정점에의 말단 팁 롬. 그것은 30-48 HPF 사이에 4.6 μm의 / 시간 (R 2 = 0.9374)에서 선형 회귀에 의해 근사 속도로 성장하고 48 HPF (동영상 1)에서 약 104 μm의 길이입니다.

인두 아치 3-7 인두 내배엽 (26)을 통해 신경 능선 세포의 단일 질량의 세그먼트에서 모든 형태. 30-38 HPF 사이, 인두 아치 ~ 7 5 번째는 3 번째와 4 번째 아치가 이미 분리 한, 질량 분리. 37 HPF의 주위에, 3 차 인두 아치는 2 아치 내측으로 이동하기 시작한다. 옆으로, 7 번째 인두 아치는 2 번째와 7 번째 아치 (동영상 1)에 6 번째 아치 중간을 통해 3 차를 떠나, 48 HPF로 주동이의 운동에서 5 번째와 6 번째 아치를 따라 잡는다.

그것은 중요한 t이다O 대회는 HPF의 형태를 설명하는 것입니다 있지만, 현미경 약간 28.5 ° C 배양기에서 성장 유사 개최 배아에 비해 zebrafish의 성장을 지연 있습니다. 예를 들어, 현미경의 19 시간 후, 몇 군데 야생 형 태아의 눈과 귀 사이의 거리가 약 81.7 μm의, 그리고 그 후 즉시 군데 두 형제 배아의 평균 눈 귀 거리가 71 ㎛,. 따라서 배아는 준비 시리즈 27보다 약간 젊은 될 가능성이 있습니다.

이러한 형태 형성의 움직임이 크게 SMO 돌연변이에 중단됩니다. 전술 한 바와 같이, 제브라 피쉬 SMO 돌연변이 제 아치 상악 축합을 형성하는 데 실패하고, 제 인두 아치 HPF (48)에 의해 눈이 완전히 꼬리이다. 후방 아치의 움직임도 10을 발휘할 수있다. 3 차 인두 아치는 2 인두 아치 중간으로 이동하는 데 실패하고 영화 2 번째 인두 아치는 48 HPF 더 전방 아치와 겹쳐 rostrally 마이그레이션하는 데 실패 것을 보여줍니다.

Zebrafish의 smad5 B1100 돌연변이는 구개 골격의 거의 완전한 손실과 아치 형태 형성을 인두에 결함이있을 수 있다는 것을 제안 인두 아치 골격 요소를 15 일 2 차, 3 차, 때로는 4 사이의 복부 융합 등 다양한 두개 안면 결함을 가지고 . 사실, 정적 공 촛점 이미징은 2 차와 3아치의 복부 영역에서의 융합 (그림 2) 32 HPF에 의해 명백한 보여 주었다. 시간 경과 공 초점 현미경을 사용하여, 우리는 smad5 돌연변이의 인두 아치의 형태 형성을 분석했다. 시간 경과 분석에서, 2 층과 3 아치 사이의 융합은 정적 분석 (영화 3, 그림 3)와 일치, 32 HPF에서 먼저 나타납니다. 또한,smad5 돌연변이는 첫 번째 인두 아치 (동영상 3)의 파생물을 중단했다. 30 HPF에서, 제 인두 아치 (186.8 μM)의 전방 / 후방의 길이는 야생형에 비해 35 % 이상이며, smad5 돌연변이의 첫 번째 인두 아치의 2.5 배 지느러미 / 복부 높이입니다. 후방 가장자리 rostrally 이동 그러나, 첫 번째 인두 아치의 전방 / 후방의 길이는 약 40 μm의 30 ~ 39 사이의 HPF를 감소하고 48 HPF하여 길이를 되 찾는다. 첫 번째 인두 아치의 등 / 복부 높이가 30-48 HPF에서 62.3 ㎛, 꾸준히 감소한다. 이 시간 동안 전방 확장의 실패는 야생형에 비해 30 HPF에서 (85 ​​μm의) 매우 긴 상악 도메인에 반영됩니다. 상악의 길이는 30 ~ 36 HPF에서 4.4 μm의 / 시간 (R 2 = 0.9032)에서 선형 회귀에 의해 근사 속도로 감소하고, 그 이후 상당히 일관성이 유지됩니다. 여기에, 시간 경과 영상은 독특한 TI를 보여줍니다smad5 돌연변이 체에서 관찰 된 구개 골격의 손실을 설명 할 수 ssue 움직임.

PDGF 가족 구성원의 표현이 그것을 인두 아치 형태 형성에 광범위하게 관여 할 수 있다는 것을 제안하면서, 후방 아치의 움직임은 PDGFRA 돌연변이 정상이 나타납니다. 그것은 구체적으로 (동영상 4) 중단 나타나는 첫 번째 인두 아치의 형태 형성이다. 제 인두 아치의 전체적인 크기가 야생형에 비해 감소하고, 상악 도메인은 세포가 응축 및 시간을 통해 회수하여, 높은 플라스틱 나타나고있다. 이 56.5 μM에서 약 39 HPF 봉우리 상악 신장의 실패가 발생합니다. 48 HPF에서, 상악 도메인만을 측정 44.1 μm의. 종합적으로, 이러한 연구 결과는주의 시간 경과 분석은 잠재적 정적 분석에서 손실 형태 형성의 세부 정보를 제공 할 수있는 것을 보여줍니다.

그림 1 그림 1. 공 초점 현미경에 장착 브리지 커버 슬립의 건설 및 배아의 개략도.

그림 2
. 그림 2 두 번째와 세 번째 아치 smad5 돌연변이에 융합 (A, B) (A) fli1에서 단일 Z 조각 : EGFP와 (B) fli1 : EGFP; smad5 B1100 돌연변이 배아.. (A) smad5 대한 배아 야생형에서, 두 번째 및 세 번째 아치 신경 능선 세포는 제 인두 주머니 (화살촉)에 의해 분리된다. 세코의 복부 한계에서 (B) 신경 능선 세포차 및 제 아치 smad5 돌연변이 (화살촉)에 뒤섞다. 인두 아치 번호가 매겨집니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. 중단 인두 아치 형태 형성에 smad5 함수 결과의 손실. (A, B, 상단 패널) 계획과 (하단 패널) 영화 3 아치 융합 직교 전망. 아치 둘, 셋의 융합은 분명, 화살촉입니다. 인두 아치 번호가 매겨집니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

영화 1. 인두의 개발야생 형 아치 (fli1 : EGFP) 30-48 HPF의 배아. 전방 왼쪽에 가기 지느러미. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.

영화 2. 인두 아치의 내측 운동은 SMO의 돌연변이에 (fli1을 : EGFP; 577 smob) 실패 앞쪽을 왼쪽 상단에 등 지느러미에.. 30-48 HPF. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.

영화 3. (: EGFP; smad5 B1100을 fli1) 앞쪽을 왼쪽 상단에 등 지느러미에 2 3 차 아치 smad5 돌연변이에 융합.. (A) 전망, 30-48 HPF,와 (B)의 시리즈 단일 Z 조각, 30 ~ 40 HPF는. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.

영화 4. . 가기 왼쪽 지느러미 앞쪽에; (PDGFRA b1059 EGFP fli1) 상악 지역의 신장은 PDGFRA 돌연변이에 실패합니다. 30-48 HPF. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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시간 경과 공 초점 현미경 개발의 분석을위한 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 신경 능선 세포 레이블 유전자 변형을 사용하여 중요한 신호 전달 경로에 대한 돌연변이 있습니다 제브라 피쉬에서 인두 아치 형태 형성을 연구하는 방법의 유용성을 보여줍니다. 조직 수준뿐만 아니라 시간 경과 분석도 휴대 규모 28에서 분석에 적용, 분석한다. 대부분의 널리 사용되는 제브라 피쉬의 방법은 morpholinos와의 미세 주입, mRNA를, 또는 유전자 변형 구조뿐만 아니라 태아 사이의 이식 등의 시간 경과 현미경 실험에 통합 할 수 있습니다. 체류 현상 조직의 분석은 형광 라벨 조직에 능력에 의해 크로스 토크없이 다른 형광체의 원하는 수를 검출하는 공 초점 현미경의 능력에 의해 제한된다. 제브라 피쉬 배아의 클러치에서 영상화 할 수있는 사람의 수는 심각하게 제한되어 있지만 고급 기술동일한 시간주기에서 여러 배아의 자동 촬상을 허용한다. 쉽게 이른 시점에서 식별되는 돌연변이의 저속 분석을 수행하고자 할 때 특히 유용하다.

시간 경과 공 촛점 이미지에서 측정을 수행 할 때 약간의 발달 지연이 프로세스에 의해 발생하는 것이 고려하는 것이 중요합니다. 발달 지연뿐만 아니라 돌연변이 배아에서 드문 일이 아니다, 그래서 컨트롤 형제의 영상은 돌연변이 / 조작 배아뿐만 아니라 야생 형 컨트롤이 모두 필요합니다. 한 번이라도 준비를 위해 제어, 형광 표지 된 구조의 비교 측정이 어렵습니다. 형광 강도는 개인 사이에 동일한 구조의 분리 된 부분간에 매우 다양 할 수있다. 따라서, nondiscrete 정량적 측정 주관의 정도를 가지고, 우리는 더 이상 개인이 일관성을 유지하기 위해 측정을 수행하는 것이 좋습니다. 조사는 또한 배아를 배향에 훈련해야합니다비교 측정을 위해 지속적으로, 그렇게하지 ​​않으면 같은 것도있을 수 없다 형태 학적 차이의 모양을하게됩니다. 시편 태아의 움직임은 크게 실험을 파괴 할 수있다, 우리는 레인지 아가로 오스가 두껍게 허용 한 후 마취를 추가하는 배아를 진정 작용의 효능을 감소 것을 발견했습니다.

어려운 취득했지만, 시간 경과 현미경 데이터는 질적 형태 형성을 비교에 정적 인 이미지에 명백한 이점이있다. 정적 인 이미지가 종종 특정 시점에서 구조를 쉽게 측정 할 수 있지만,에 이르기까지 또는 그 단계 다음과 같은 조직 행동의 징후를 줄 것이다. 형태 형성을받은 두 개 이상의 분리 된 조직의 상호 작용을 연구 할 때 이러한 정보는 매우 중요하다. 형태 형성의 최고의 전반적인 특성을 얻기 위해서는, 최고의 각 방법의 장점을 활용하기 위해 모두 시간 경과 및 정적 분석을 수행하는 데 유리하다. 시간 경과 아​​나lyses, 동적 세포 및 조직 동작은 정적 분석에서, 배아 많은 수의 변동을 가장 이해하기 위해 조사 될 수 있고, 분석 할 수있다. 생체 데이터의 실시간 형태 형성 연구자들 사이 황금 표준이되고 같은 다른 기술의 제브라 피쉬의 유전자 변형 라인과 발전의 증가는 흔히 여러 조직의 시간 경과 공 초점 현미경을 만들 것입니다.

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Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgments

우리는 그들의 전문적인 물고기 케어 멜리사 그리핀과 제나 Rozacky 감사합니다. PDM 감사 EGN 지원, 관용과 인내를 작성. 이 작품은 JKE에 NIH / NIDCR R01DE020884에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 lb Test monofilament line Cortland Line Company SLB16
Agarose I Amresco 0710
Argon laser LASOS Lasertechnik GmbH LGN 3001
Calcium chloride Sigma-Aldrich C8106
Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID FHC 30-31-0
Clove oil Hilltech Canada, Inc. HB-102
High vacuum grease Dow Corning 2021846-0807
Isotemp dry-bath incubator Fisher Scientific 2050FS
Laser scanning microscope Carl Zeiss AG LSM 710
Magnesium sulfate hexahydrate Sigma-Aldrich 230391
Microscope cover glass, 22 x 22-1 Fisher Scientific 12-542-B
Microscope cover glass, 24 x 60-1 Fisher Scientific 12-545-M
Potassium chloride Fisher Scientific M-11321
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P3786
Sodium chloride Fisher Scientific M-11624
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907
TempController 2000-2 PeCon GmbH
Tricaine-S Western Chemical, Inc.

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References

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4D 공 초점 현미경을 사용하여 제브라 피쉬의 두개 안면 형태 형성 분석
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McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (83), e51190, doi:10.3791/51190 (2014).More

McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (83), e51190, doi:10.3791/51190 (2014).

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