Analysere Kraniofacial Morphogenesis i sebrafisk ved hjelp av 4D konfokalmikroskopi
Summary
Time-lapse confocal bildebehandling er en kraftfull teknikk nyttig for å karakterisere embryoutvikling. Her beskriver vi metodikken og karakter kraniofaciale morphogenesis i villtype, samt PDGFRA, smad5, og SMO mutante embryoer.
Abstract
Tidsforsinkelse avbildning er en teknikk som gjør det mulig for den direkte observasjon av prosessen med morphogenesis eller generering av formen. På grunn av deres optisk klarhet og amenability til genetisk manipulasjon, har sebrafisk embryo blitt en populær modell organisme med å utføre intervall analyse av morfogenese i levende embryoer. Confocal avbildning av en levende sebrafisk embryo krever at en vev av interesse er vedvarende merket med en fluorescerende markør, som for eksempel en transgen eller injisert fargestoff. Prosessen krever at embryoet blir bedøvet og holdes på plass på en slik måte at sunn utvikling fortsetter på vanlig måte. Parametere for bildebehandling må stilles til ansvar for tredimensjonal vekst og å balansere kravene til å løse individuelle celler mens du får raske snapshots av utviklingen. Våre resultater viser evnen til å utføre langtids in vivo avbildning av fluorescens-merkede sebrafisk embryoer, og for å detektere ulike vev atferd ikranie neural crest som forårsaker kraniofaciale misdannelser. Utviklingsmessige forsinkelser forårsaket av anestesi og montering er minimal, og embryoer er uskadd etter prosessen. Time-lapse fotografert embryoer kan returneres til flytende medium og deretter avbildes eller fast på senere punkter i utvikling. Med et økende overflod av transgene sebrafisk linjer og godt karakterisert skjebne kartlegging og transplantasjon teknikker, bildebehandling enhver ønsket vev er mulig. Som sådan, time-lapse in vivo avbildning kombinerer kraftfullt med sebrafisk genetiske metoder, inkludert analyser av muterte og microinjected embryoer.
Introduction
Kraniofacial morfogenese er en kompleks multi-trinns prosess som krever koordinert samhandling mellom flere celletyper. Flertallet av kraniofaciale skjelettet er avledet fra neural crest cellene, må mange av dem forflytte seg fra rygg nevralrøret i forbigående strukturer kalt svelg buer en. Som med mange vev, er morfogenese av kraniofaciale skjelettet mer komplisert enn det som kan forstås av statiske bilder av embryoer ved spesifikke utviklings tidspunkter. Selv om det er tidkrevende å utføre, gir in vivo time-lapse mikros en kontinuerlig titt på en utvikling av embryo celler og vev. Hvert bilde i en time-lapse-serien gir kontekst til de andre, og hjelper en etterforsker trekk mot dedusere hvorfor et fenomen oppstår snarere enn dedusere hva som skjer på den tiden.
In vivo avbildning er således et kraftig verktøy for beskrivende eksperimentelle tilnærminger tildekonstruere banene som styrer morphogenesis. Sebrafisk Danio rerio er en populær genetisk modell av virveldyr embryoutvikling, og er spesielt godt egnet for in vivo avbildning av morphogenesis. Moderne, er praktiske metoder for transgenesis og genomisk modifikasjon raskt fremme antall verktøy tilgjengelig for sebrafisk forskere. Disse verktøyene forbedre allerede robuste metoder for genetisk manipulasjon og mikros. In vivo avbildning av nesten alle vev i nesten hvilken som helst ønsket genetisk sammenheng er nærmere virkeligheten enn fantasy.
Morphogenetic bevegelser av svelget buene blir guidet ved å signalisere samspillet mellom neural crest og tilstøtende epitel, både ectoderm og endoderm. Det er mange signalmolekyler uttrykt av epitel som er nødvendige for å drive morfogenese av kraniofaciale skjelettelementer. Blant disse signalmolekyler, Sonic Hedgehog (Hysj) er kritisk viktig feller kraniofaciale utvikling 2-8. Hysj er uttrykt av både muntlig ektoderm og pharyngeal endoderm 2,6,9,10. Uttrykket av Shh i endoderm regulerer morphogenetic bevegelser av buene 10, fordelingen av neural crest innenfor buene 10, og vekst av kraniofaciale skjelett 11.
Bmp signalering er også kritisk viktig for kraniofaciale utvikling 12 og kan endre morfogenese av svelg buer. Bmp signale regulerer dorsal / ventral mønster av crest innenfor svelget buer 13,14. Forstyrrelse av smad5 i sebrafisk forårsaker alvorlige palatal feil og en svikt i Meckels brusk å fusjonere hensiktsmessig ved midtlinjen 15. I tillegg mutantene også vise reduksjoner og fusjon i ventrale brusk elementene med 2 nd, 3., og noen ganger 4 th pharyngeal erke elementer smeltet på midtlinjen 15. Disse fusjoner sterkt at BMP signale dirigerer morfogenese av disse svelg elementer.
PDGF signalering er nødvendig for kraniofaciale utvikling, men har ukjente roller i faryngeal bue morphogenesis. Både mus og sebrafisk PDGFRA mutanter har dyp midfacial clefting 16-18. I hvert fall i sebrafisk dette midfacial clefting skyldes en svikt i riktig neural crest celle migrasjon 16. Neural crest cellene fortsette å uttrykke PDGFRA etter at de har kommet inn i svelget buer. I tillegg er PDGF ligander uttrykt av ansikts epitel og innenfor de svelget buer 16,19,20, dermed PDGF signale kan også spille en rolle i morfogenese av svelg buer følgende migrasjon. Men analyser av morfogenese av svelg buer i PDGFRA mutanter har ikke blitt utført.
Her viser vi in vivo konfokalmikroskopi av pharyngulen-trinns transgen sebrafisk og beskrive morfogenese av svelg buer innenfor denne perioden. Vi ytterligere demonstrere vev atferd som påvirkes av mutasjoner som forstyrrer BMP, PDGF, og Shh signalveier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Time-lapse konfokalmikroskopi er et kraftig verktøy for analyse av utvikling. Her viser vi metodens nytten i å studere pharyngeal bue morfogenese i sebrafisk som er mutant for viktige signalveier ved hjelp av en transgen som etiketter neural crest cellene. I tillegg til vev-nivå analyser, tidsforløp analyser er også gjeldende for analyser på celle skala 28. Mange brukte sebrafisk metoder kan også være innarbeidet i time-lapse mikroskopi eksperimenter, inkludert mikroinjeksjon av Morpholinos, mRNA, ell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Melissa Griffin og Jenna Rozacky for deres ekspert fisk omsorg. PDM takk EGN for å skrive hjelp, raushet og tålmodighet. Dette arbeidet ble støttet av NIH / NIDCR R01DE020884 til JKE.
Materials
| 6 lb. test monofilament line | Cortland Line Company | SLB16 | |
| Agarose I | Amresco | 0710 | |
| Argon laser | LASOS Lasertechnik GmbH | LGN 3001 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID | FHC | 30-31-0 | |
| Clove oil | Hilltech Canada, Inc. | HB-102 | |
| High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
| Isotemp dry-bath incubator | Fisher Scientific | 2050FS | |
| Laser scanning microscope | Carl Zeiss AG | LSM 710 | |
| Magnesium sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Microscope cover glass, 22×22-1 | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Microscope cover glass, 24×60-1 | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | M-11321 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | M-11624 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| TempController 2000-2 | PeCon GmbH | ||
| Tricaine-S | Western Chemical, Inc. |
References
- Trainor, P. A., Melton, K. R., Manzanares, M. Origins and plasticity of neural crest cells and their roles in jaw and craniofacial evolution. Int. J. Dev. Biol. 47, 541-553 (2003).
- Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
- Wada, N., et al. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
- Roessler, E., et al. Mutations in the human sonic hedgehog gene cause holoprosencephaly. Nat. Genet. 14, 357-360 (1996).
- Jeong, J., Mao, J., Tenzen, T., Kottmann, A. H., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in the neural crest cells regulates the patterning and growth of facial primordia. Genes Dev. 18, 937-951 (2004).
- Hu, D., Marcucio, R. S. A SHH-responsive signaling center in the forebrain regulates craniofacial morphogenesis via the facial ectoderm. Development. 136, 107-116 (2009).
- Cordero, D., et al. Temporal perturbations in sonic hedgehog signaling elicit the spectrum of holoprosencephaly phenotypes. J. Clin. Invest. 114, 485-494 (2004).
- Westphal, H., Beachyr, P. A. Cyclopia and defective axial patterning in mice lacking Sonic hedgehog gene function. Nature. 383, 3 (1996).
- Moore-Scott, B. A., Manley, N. R. Differential expression of Sonic hedgehog along the anterior-posterior axis regulates patterning of pharyngeal pouch endoderm and pharyngeal endoderm-derived organs. Dev. Biol. 278, 323-335 (2005).
- Swartz, M. E., Nguyen, V., McCarthy, N. Q., Eberhart, J. K. Hh signaling regulates patterning and morphogenesis of the pharyngeal arch-derived skeleton. Dev. Biol. 369, 65-75 (2012).
- Balczerski, B., et al. Analysis of Sphingosine-1-phosphate signaling mutants reveals endodermal requirements for the growth but not dorsoventral patterning of jaw skeletal precursors. Dev. Biol. , (2011).
- Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. Int. J. Dev. Biol. 50, 511-521 (2006).
- Alexander, C., et al. Combinatorial roles for BMPs and Endothelin 1 in patterning the dorsal-ventral axis of the craniofacial skeleton. Development. 138, 5135-5146 (2011).
- Zuniga, E., Rippen, M., Alexander, C., Schilling, T. F., Crump, J. G. Gremlin 2 regulates distinct roles of BMP and Endothelin 1 signaling in dorsoventral patterning of the facial skeleton. Development. 138, 5147-5156 (2011).
- Swartz, M. E., Sheehan-Rooney, K., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev. Dyn. 240, 2204-2220 (2011).
- Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nat. Genet. 40, 290-298 (2008).
- Soriano, P. The PDGF alpha receptor is required for neural crest cell development and for normal patterning of the somites. Development. 124, 2691-2700 (1997).
- Tallquist, M. D., Soriano, P. Cell autonomous requirement for PDGFRalpha in populations of cranial and cardiac neural crest cells. Development. 130, 507-518 (2003).
- Ho, L., Symes, K., Yordan, C., Gudas, L. J., Mercola, M. Localization of PDGF A and PDGFR alpha mRNA in Xenopus embryos suggests signalling from neural ectoderm and pharyngeal endoderm to neural crest cells. Mech. Dev. 48, 165-174 (1994).
- Liu, L., Korzh, V., Balasubramaniyan, N. V., Ekker, M., Ge, R. Platelet-derived growth factor A (pdgf-a) expression during zebrafish embryonic development. Dev. Genes Evol. 212, 298-301 (2002).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Lovely, C. B., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Bmp and Shh Signaling Mediate the Expression of satb2 in the Pharyngeal Arches. PloS one. 8, e59533 (2013).
- Varga, Z. M., et al. Zebrafish smoothened functions in ventral neural tube specification and axon tract formation. Development. 128, 3497-3509 (2001).
- Grush, J., Noakes, D. L. G., Moccia, R. D. The efficacy of clove oil as an anesthetic for the zebrafish, Danio rerio. 1, 46-53 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Crump, J. G., Maves, L., Lawson, N. D., Weinstein, B. M., Kimmel, C. B. An essential role for Fgfs in endodermal pouch formation influences later craniofacial skeletal patterning. Development. 131, 5703-5716 (2004).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat. Neurosci. 13, 673-679 (2010).
