Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Analysera Kraniofaciala Morphogenesis i Zebrafish Använda 4D konfokalmikroskopi

doi: 10.3791/51190 Published: January 30, 2014

Summary

Time-lapse konfokal avbildning är en kraftfull teknik användbar för karakterisering av embryots utveckling. Här beskriver vi den metod och karakterisera craniofacial morfogenes i vildtyp, samt PDGFRA, smad5 och SMO mutanta embryon.

Abstract

Time-lapse avbildning är en teknik som gör det möjligt att direkt observation av processen för morfogenes, eller generering av formen. På grund av deras optiska klarhet och mottaglighet för genetisk manipulation, har den zebrafisk embryot blivit en populär modell organism med för att utföra tidsförlopp analys av morfogenes i levande embryon. Konfokal avbildning av ett levande zebrafisk embryo kräver att en vävnad av intresse är ihärdigt märkt med en fluorescerande markör, såsom en transgen eller injiceras färgämnet. Processen kräver att embryot bedövas och hålls på plats på ett sådant sätt att en sund utveckling fortskrider normalt. Parametrar för avbildning måste ställas till svars för tredimensionell tillväxt och för att balansera kraven på att lösa enskilda celler samtidigt få snabba ögonblicksbilder av utveckling. Våra resultat visar att förmågan att utföra långsiktiga in vivo avbildning av fluorescensmärkta zebrafisk embryon och för att upptäcka olika vävnads beteenden ihjärn neurallisten som orsakar kraniofaciala missbildningar. Utvecklings förseningar orsakade av anestesi och montering är minimala, och embryon är oskadd genom processen. Time-lapse avbildade embryon kan returneras till flytande medium och därefter avbildas eller fast vid senare punkter i utvecklingen. Med ett ökande överflöd av transgena zebrafisk linjer och väldefinierad öde kartläggning och transplantationsteknik, bildbehandling varje önskad vävnad är möjlig. Som sådan, tidsförlopp in vivo imaging kombinerar kraftfullt med zebrafisk genetiska metoder, inklusive analyser av muterade och mikroinjicerade embryon.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Craniofacial morfogenes är en komplex process i flera steg som kräver koordinerade interaktioner mellan multipla celltyper. Majoriteten av kraniofaciala skelettet är härlett från neurallistceller måste många av som migrerar från den dorsala neuralröret i transienta strukturer som kallas pharyngeal valv 1. Som med många vävnader, är morfogenes av kraniofaciala skelett mer komplicerat än vad som kan förstås av statiska bilder av embryon vid specifika utvecklingsmässiga tidpunkter. Även om det är tidskrävande att utföra, ger in vivo-tidsförlopp mikroskopi en kontinuerlig titt på en utveckling av embryo celler och vävnader. Varje bild i en time-lapse-serien ger sammanhang till de andra, och hjälper en utredare steget mot att kunna utläsa varför ett fenomen uppstår snarare än att kunna utläsa vad som händer då.

In vivo imaging är alltså ett kraftfullt beskrivande redskap för experimentella metoder fördekonstruera de vägar som styr morfogenes. I zebrafisk Danio rerio är en populär genetisk modell av vertebrat embryonal utveckling, och är särskilt väl lämpad för in vivo-avbildning av morfogenes. Modern är praktiska metoder för genmodifiering och genomisk modifiering snabbt framåt det antal verktyg tillgängliga för zebrafisk forskare. Dessa verktyg ökar redan robusta metoder för genetisk manipulation och mikroskopi. In vivo avbildning av nästan alla vävnader i nästan alla önskade genetiska sammanhang är närmare verkligheten än fantasin.

Morfogenetiska rörelser faryngala bågar styrs genom att signalera interaktioner mellan neurallisten och den intilliggande epitel, både ektoderm och endoderm. Det finns ett stort antal signalmolekyler som uttrycks av epitel som är nödvändiga för att driva den morfogenes av kraniofaciala skelettelement. Bland dessa signalmolekyler, Sonic Hedgehog (Shh) är mycket viktigt feller craniofacial utveckling 2-8. Shh uttrycks av både den muntliga ektoderm och svalg endoderm 2,6,9,10. Uttrycket av Shh i endoderm reglerar morfogenetiska rörelser av valven 10, mönstring av neurallisten inom bågarna 10, och tillväxten av den craniofacial skelett 11.

Bmp-signalering är också av avgörande betydelse för kraniofaciala utveckling 12 och kan ändra morfogenes av svalget valv. BMP signalering reglerar rygg / ventrala mönstring av crest inom faryngala valv 13,14. Avbrott i smad5 i zebrafisk orsakar allvarliga palatinala defekter och fel på Meckels brosk att smälta lämpligt vid mittlinjen 15. Dessutom mutanterna visar också minskningar och fusion i de ventrala brosk element, med 2: a, 3: e, och ibland 4: e svalg arch element smält vid mittlinjen 15. Dessa fusioner tyder starkt på att BMP signalering styr morfogenes av dessa svalg element.

PDGF-signalering är nödvändig för kraniofaciala utveckling, men har okända roller i svalg arch morfogenes. Både mus och zebrafisk PDGFRA mutanter har djupgående midfacial clefting 16-18. Åtminstone i zebrafisk denna midfacial clefting beror på ett bristfälligt neural crest cell migration 16. Neurallistceller fortsätter att uttrycka PDGFRA efter att ha anlänt faryngala valv. Dessutom är PDGF-ligander uttrycks av ansikts epitel och inom svalg valv 16,19,20, alltså PDGF-signalering kan också spela en roll i morfogenes av svalg valv efter migrationen. Men analyser av morfogenes av pharynx valv i PDGFRA mutanter har ej utförts.

Här visar vi in vivo konfokalmikroskopi av pharyngulen-stegs transgen zebrafisk och beskriva morfogenes av pharynx valv inom denna period. Vi visar ytterligare vävnads beteenden som påverkas av mutationer som stör BMP, PDGF, och Shh signalvägar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Djurhållning och muterade alleler

  1. Höj och föda upp zebrafisk som beskrivs 21.
  2. Zebrafisk muterade alleler användes i denna studie var PDGFRA B1059 16, smad5 B1100 22 och SMO b577 23. Källor för dessa zebrafisk stammar inkluderar Zirc.

2. Beredning av lösningar och Redskap

OBS: Alla lösningar och redskap kan göras i förväg och lagras för framtida användning.

  1. Gör embryomedium (EM), såsom tidigare beskrivits 21.
  2. Gör 4 g / I MS-222 (Tricaine). Lös 4 g dinatriumfosfat (Na 2 HPO 4) i 450 ml sterilt vatten. Tillsätt 2 g MS-222 till lösningen. Justera pH till inom 7,0-7,2. Lägg sterilt vatten till en total volym av 500 ml.
  3. Tillval: Gör 4 g / L kryddnejlika olja. Väg 0,2 g ren kryddnejlika olja i en 50 ml koniska rör. Lägg EM till en total volym på 50 ml. Förvaras vid 4 ° C.
  4. Gör 3% methylcellulose. Ta 50 ml EM + 0,1 M HEPES till en koka. Ta bort från värmen. Rör i 1,5 g metylcellulosa tills lösningen är homogen. Förvaras vid 4 ° C.
  5. Se till 0,2% agaros. Lägg till 0,1 g agaros till 50 ml EM. Ta med EM till en koka i mikrovågsugn eller på en värmeplatta och verifiera att agaros har lösts upp. Fördela i 500 il volymer i mikrocentrifugrör och förvara vid 4 ° C. Anm: Volymerna kan justeras efter behov.
  6. Gör kapillär poker. Placera en droppe superlim i en 0,9 mm ID kapillärrör. Sätt i en 4-5 cm lång £ 6 provmonofilament lina inne kapillärröret så att ca 3-4 mm i linje sträcker sig längre än till slutet av röret.
  7. Gör två överbryggade täckglas per exemplar. Super-lim 22 x 22-1 täckglas på varje ände av en 24 x 60-1 täckglas lämnar mitt gratis. Gör singlar (1 liten täckglas per slutet) för embryon mindre än en dag gammal, dubbel (2 små täckglas ovanpå varandra per ände) för embryon 1-4 days gamla eller tripplar (3 små täckglas ovanpå varandra per ände) för embryon fem dagar eller äldre.
  8. Fyll en 10 ml spruta med hög fett vakuum. OBS: Vakuum fett fungerar som ett tätningsmedel för att förhindra uttorkning av prover över långa tidsperioder, och har låg potential för toxicitet jämfört med mer volatila tätningsmedel.

3. Montering Zebrafish embryon för konfokalmikroskopi (se figur 1)

  1. Förbered bedövningsmedel medium. Smält en delmängd av 0,2% agaros genom mikrovågsugnen i 20 sek mellanrum tills den är helt flytande. Blanda 8 pl av MS-222 till 192 | il av 0,2% agaros eller 5 | il av 4 g / L klöverolja i 195 | il av 0,2% agaros. Upprätthålla i ett 42 ° C värmeblock. OBS: Långvarig exponering för MS-222 orsakar starkare försenad utveckling än kryddnejlika olja gör i embryonala zebrafisk 24.
  2. Vid behov: Manuell dechorionate okläckta transgena embryon som skall analyseras strax före analys. Använd pincett, långsamt tear chorion öppen till embryot frigörs.
  3. Söva de zebrafisk embryon. Tillsätt 1 ml av en 4 g / L lager av MS-222 till 24 ml av embryomaterial. Alternativt lägga 390 pl av 4 g / L klöverolja till 24 ml av fisk vatten 24. OBS: Clove olja fungerar långsamt så utföra detta steg minst 15-20 min innan time-lapse mikroskopi.
  4. Lägg en sträng av vakuum fett runt mittutrymme för en uppåtvänd överbryggas täckglas. Tryck långsamt vakuum fett ur sprutan, gör en jämn, kontinuerlig sträng som är intill och insidan av broar och kanten på täckglas.
  5. Sprid en cirkel med 4% metylcellulosa i mitten av den bryggade täckglas med hjälp av en trä applikator.
  6. Överför embryot som skall avbildas. När embryot bedövades dra upp det i ett glas-pipett. Håll pipetten upp vertikalt för att tillåta embryot att sjunka till botten av vätskan i pipetten. Flytta pipett till agaroslösningen och tillåta embryot att släppai agarosen. Inte driva ut vätskan.
  7. Placera provet. Rita några agaroslösningen och embryot in i pipetten. Spruta embryot i en droppe av agaroslösningen på toppen av metylcellulosa. Använd en kapillär poker att driva embryot nedåt på metylcellulosa och orientera embryot som önskas för avbildning.
  8. Förslut provexemplaret.
    1. Placera en överbryggad täckglas ovanpå monterad en, nedåt. Applicera jämnt tryck på båda sidor om de mellanliggande täck förrän bryggorna komma i direkt kontakt och agarosen droppe tätningar på båda täckglasen. Verifiera att embryot är rätt orienterad.
    2. Gnid en trä applikator längs glaset för att jämna ut sprickor och luckor i vakuum fett pärla. Torka bort överflödigt fett från kanterna.

4. Time-lapse Confocal avbildning av Transgena Zebrafish embryon

(Detta protokoll har optimerats för en Zeiss LSM 710 konfokalmikroskop ossing ZEN bildbehandlingsprogram, och kan modifieras för att användas med andra system.)

  1. Aktivera utrustning. Slå på konfokalmikroskop och eventuella externa laseranordningar. Starta datorn ansluten till konfokalmikroskop. Öppna konfokala bildbehandlingsprogram och välj "Start System" för att aktivera bildförvärvskontroller.
  2. Förbered uppvärmd skede. Sänk iscensättning plattform konfokalmikroskop och flytta objektiv ur position. Ersätt standard scenen med ett elektroniskt uppvärmd scen. Sätt på kontrollenheten för den uppvärmda scenen och ställa in temperaturen för 29,5 ° C.
  3. Placera provet i synfältet. Placera de monterade exemplar på scenen. Flytta 20X objektiv på plats och höja iscensättning plattform. Aktivera det synliga ljussändare och titta igenom okularen. Centrera embryo huvud i synfältet.
  4. Definiera experimentinställningar.
    1. Aktivera fluorescens kanaler genom att väljaden fluorescerande våglängden som skall detekteras och väljer färguppslagstabeller (LUT) för varje kanal. Använd vid behov manuella kontroller i programvaran för att aktivera de nödvändiga lasrar (t.ex. 561 nm för RFP). För varje fluorescens kanal, ställ in laserintensiteten till 10,0 och fotomultiplikatorn spänningen (HV eller vinst) mellan 600-700. Ställ in medelvärdes till 4 och bitdjupet till 16 bitar.
    2. Aktivera Z-stack och tidsseriemoduler. Ställ in pinhole till 5 pm eller mindre Z-upplösning, och ställa in Z-intervallet till den föreslagna optimala avståndet.
      Notera: I allmänhet tillåter 5 ìm Z-upplösning varje Z-stack bild som ska samlas in tillräckligt snabbt för en "ögonblicksbild" av embryot vid en viss tidpunkt och samtidigt lösa enskilda celler. Sänkning medelvärdes minskar också den tid per bild.
    3. Definiera det önskade tidsintervallet mellan bilderna (vanligen 10-20 min) och den totala längden av experimentet.
  5. Ställ positionellinformation.
    1. Vrid kameran till liveläge. Justera fokus och öka laserintensiteten vid behov för att se fluorescens. Ställ in den digitala zoomen på 0,6 för en bredare syn, om så önskas.
    2. Placera scenen så att alla strukturer av intresse är synliga och det finns plats i synfältet för utväxt dorsalt och anteriort. Fokus genom embryot till de övre och undre gräns för fluorescens. Ställ in den första och sista Z-stack slice positioner minst 100 nm eller mer utanför dessa gränser.
  6. Optimera fluorescensintensitet.
    1. Ställ in visnings LUT att variera indikator. Fluorescerande strukturer ska nu visas vitt, och resten av synfältet bör vara blå (ingen detektering) eller svart.
    2. Öka HV / vinst till en nivå strax under där mättad (röd) bildpunkter visas. Vid behov, justera offset så en majoritet av bakgrunden inte upptäcks (blå). OBS: Mindre hål diameter och ökad laserintensiteten både förbättra bild definition, men laser intensitet måste hållas låg för att bevara levande vävnader. Ökad HV / förstärkning och hål diameter (<5 mikrometer) är i allmänhet att föredra framför ökad laserintensiteten.
    3. Håll hål diameter tillräckligt bred för att samla in bilder i tid, i genomsnitt set till 4. Z-intervall bör alltid sättas till den föreslagna optimala avståndet för hål diameter. Utför kortare genomsökningar (medelvärdes = 1) med olika inställningar, och använda minsta laserintensiteten som uppnår önskad upplösning.
  7. Kör experimentet efter önskad tidslängd. Efteråt, ta bort embryot från den uppvärmda scenen och sakta separera täckglas. Sänk täckglas och embryot i EM i en 30 mm petriskål. Med hjälp av ett glas pipett försiktigt tvätta embryot bort av täckglas och ta bort täckglaset från petriskål. Placera embryot till en 28,5 ° C inkubator för att fortsätta utvecklas.
  8. Jämför tillväxt. Vid slutet av försöket, ta enskilda Zsplease bilder av agaros monterade syskon embryon som på liknande iscensatta med förlagan i början av experimentet, men togs upp i EM i en 28,5 ° C inkubator.
  9. Mät svalg valv, efter behov. Mätningar kan utföras i vissa konfokala programvara sviter. Mätningar finns här utfördes med Fiji25 genom att importera och Z-projicering. LSM filer av enskilda bildrutor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I embryon vildtyp, efter neurallist befolkning, faryngala valv avlånga längs främre / bakre och rygg / ventrala axlar när du flyttar i en rostral riktning (film 1). Vid 30 timmar efter fertilisering (HPF), är den främre / bakre längden av den första svalg båge mellan 1,8 till 1,9 gånger dess dorsal / ventral höjd. Rygg / ventrala förlängningen fortsätter stadigt, snabbare än främre / bakre förlängning till 36,5 HPF. Härifrån, rygg / ventrala höjdplatåer omkring 104 nm till 48 HPF. Främre / bakre förlängning fortsätter genom 48 HPF, med total anterior / posterior längd ökar från under 1,5 gånger den dorsala / ventrala höjd på 36,5 HPF till 1,95 gånger den dorsala / ventrala höjd vid 48 HPF.

Vid sin främre ände, bildar den första svalgbågen maxillary (rygg) och underkäke (ventrala) domäner separerade av den muntliga ektoderm. Den maxillary domänen för den första svalg bågen mäts from dess distala spets till den bakre spetsen på den orala ektoderm. Den växer i en takt approximeras med linjär regression på 4,6 ìm / tim (r 2 = 0,9374) mellan 30-48 HPF och är ca 104 nm lång vid 48 HPF (film 1).

Pharyngeal valv 3-7 all form från segmentering av en enda massa av neurallistceller via svalg endoderm 26. Mellan 30-38 HPF, den 5: e till 7: e svalg valv separerar från massan, den 3: e och 4: e valv redan har separerat. Omkring 37 HPF, börjar den 3: e svalg valv för att flytta medialt till den 2: a båge. I sidled, förbi den 7: e svalg arch de 5: e och 6: e valv i rostral rörelse med 48 HPF, som lämnar den 3: e till 6: e valv mediala till 2: a och 7: e valv (Film 1).

Det är viktigt to Observera att även om konventionen är att beskriva morfologi i HPF, mikroskopi enar zebrafisk tillväxten något jämfört med motsvarande sätt iscensatta embryon odlas i en 28,5 ° C inkubator. Till exempel, efter 19 timmar av mikroskopi, avståndet mellan öga och öra av ett avbildat vildtyp embryo var cirka 81,7 nm, och den genomsnittliga ögonöron avstånd för två syskon embryon avbildas omedelbart efteråt var 71 um. Därför embryon kommer sannolikt att vara något yngre än iscensättningen serien 27.

Dessa morfogenetiska rörelser är kraftigt störd i SMO mutanter. Såsom tidigare beskrivits, zebrafisk mutanter SMO misslyckas med att bilda ett maxillary kondensation av den första bågen, och vid 48 HPF första svalg bågen är helt kaudalt ögat 2. Posterior arch rörelser också störs 10. Den 3: e svalg valv inte flytta mediala till den 2: a svalg valv, och Movie 2 7: e svalg valv inte migrera rostrally för att överlappa med flera främre bågar med 48 HPF.

Zebrafisk smad5 mutanter B1100 har många kraniofaciala defekter, inklusive en nästan fullständig förlust av palatal skelett-och ventral-fusioner mellan 2: a, 3: e, och ibland fyra th pharyngeal arch skelettelement 15, vilket tyder på att det kan finnas fel till svalg arch morfogenes . Indeed, statisk konfokal avbildning visat fusionerna i de ventrala områden av den 2: a och 3: e valv är uppenbara genom 32 HPF (Figur 2). Använda tidsförlopp konfokalmikroskopi, analyserade vi morfogenes av svalg valv i smad5 mutanter. I tidsförlopp analyser, fusioner mellan den 2: a och 3: e valv visas först vid 32 HPF, i linje med den statiska analys (Movie 3, figur 3). Dessutomsmad5 mutanter har stört utväxt av den första svalgbågen (film 3). Vid 30 HPF, är den främre / bakre längden av den första svalgbågen (186,8 | im) över 35% längre än i vildtypen, och är 2,5 gånger den dorsala / ventrala höjden av den första svalg båge i en smad5 mutanten. Men eftersom den bakre kanten rör sig rostrally, den främre / bakre längden av den första svalg bågen minskar nästan 40 um mellan 30-39 HPF och därefter återfår denna längd av 48 HPF. Den dorsala / ventrala höjd första svalgbågen minskar stadigt till 62,3 um 30-48 HPF. Misslyckande av anterior förlängning under denna tid återspeglas i maxillary domän, som är exceptionellt lång (85 ^ m) vid 30 HPF jämfört med vildtypen. Maxillary längd minskar med en hastighet approximeras med linjär regression på 4,4 ìm / tim (r 2 = 0,9032) 30-36 HPF, och håller sig ganska konsekvent därefter. Här visar tidsförlopp imaging unik tissue rörelser som får stå för förlusten av den palatal skelett observerats i smad5 mutanter.

Medan uttrycket av PDGF familjemedlemmar föreslår att den kan vara i stort sett involverad i svalg arch morfogenes, förflyttning av de bakre bågarna förefaller normala i PDGFRA mutanter. Det är morfogenes av den första svalgbågen som verkar specifikt stört (film 4). Den totala storleken på den första svalg bågen minskas i förhållande till vildtypen, och maxillary domän synes högst plast, med celler kondensera och återkallande av över tiden. Detta resulterar i ett misslyckande för maxillary töjning, som toppar runt 39 HPF på 56,5 um. Vid 48 HPF, de maxillary åtgärder domän endast 44,1 nm. Tillsammans står dessa resultat visar att noggrann time lapse analyser kan lämna uppgifter om morphogenesis potentiellt förlorade i statiska analyser.

Figur 1 Figur 1. Schematisk bild av bryggtäck konstruktion och embryo montering för konfokalmikroskopi.

Figur 2
. Figur 2 Den andra och tredje bågar fusera i smad5 mutanter (A, B) Enkel Z-segment från en (A) FLI1: EGFP och en (B) FLI1: EGFP; smad5 B1100 mutant embryo.. (A) i embryon av vildtyp för smad5 är neurallistceller i den andra och tredje båge åtskilda av den andra pharyngeal påsen (pilspets). (B) neurallistceller på den ventrala gränsen hos sekond och tredje valv blandas i smad5 mutanter (pilspets). Pharyngeal valv är numrerade. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 3
Figur 3. Förlust av smad5 funktionen ger störd svalg arch morfogenes. (A, B, övre paneler) Prognoser och (lägre paneler) ortogonala vyer av båge fusion i Movie 3. Fusion av valv två och tre är uppenbar, pilspets. Pharyngeal valv är numrerade. Klicka här för att visa en större bild.

Film 1. Utveckling av svalgvalv i en vild-typ (FLI1: EGFP) embryo 30-48 HPF. Anterior till vänster, rygg till toppen. Klicka här för att se filmen.

Movie 2. Medial rörelser pharyngeal valv misslyckas i SMO mutanter (FLI1: EGFP; smob 577) Anterior åt vänster dorsal till toppen.. 30-48 HPF. Klicka här för att se filmen.

Movie 3. Den 2: a och 3: e valv fusera i smad5 mutanter (FLI1: EGFP; smad5 B1100) Anterior åt vänster dorsal till toppen.. Serie av (A) prognoser, 30-48 HPF, och (B) enstaka Z skivor, 30-40 HPF. Klicka här för att se filmen.

Movie 4. Töjning av maxillary regionen misslyckas i PDGFRA mutanter (FLI1: EGFP; PDGFRA B1059) Anterior åt vänster dorsal till toppen.. 30-48 HPF. Klicka här för att se filmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Time-lapse konfokalmikroskopi är ett kraftfullt verktyg för analys av utvecklingen. Här visar vi metodens användbarhet i att studera svalg båge morfogenes i zebrafisk som är mutant för viktiga signalvägar med hjälp av en transgen som märker neurallistceller. Förutom vävnadsnivå analyser, tid förfaller analyser gäller även för analyser på en cellulär skala 28. Många allmänt använda zebrafisk metoder kan också införlivas i tidsförlopp mikroskopi experiment, inklusive mikroinjektion av morpholinos, mRNA: n, eller transgena konstruktioner, liksom transplantat mellan embryon. Analys av multipla utvecklings vävnader begränsas enbart av förmågan att fluorescent label vävnader och av ett konfokalmikroskop förmåga att detektera det önskade antalet olika fluoroforer utan överhörning. Antalet individer som kan avbildas från en koppling av zebrafisk embryon är strängt begränsad, men avancerade teknikermöjliggöra automatiserad avbildning av flera embryon i samma tidsperiod. Detta är särskilt användbart när man försöker utföra tidsförlopp analys av en mutant som inte är lätta att identifiera vid tidiga tidpunkter.

När mätningar från tidsförlopp konfokala bilder, är det viktigt att tänka på att en del utvecklingsförsening orsakas av processen. Försenad utveckling är inte ovanliga i muterade embryon också, så avbildning av syskon kontroller är nödvändig för både mutant / manipulerade embryon samt vildtyp kontroller. Även en gång kontrolleras för iscensättning, är svårt jämförande mätning av fluorescensmärkta strukturer. Fluorescensintensiteten kan vara mycket varierande mellan individer och mellan olika delar av samma struktur. Således nondiscrete kvantitativa mätningar har en viss grad av subjektivitet, och vi rekommenderar att fler än en person utför mätningar för att säkerställa enhetlighet. Utredarna ska också vara disciplinerad i orientera embryonför jämförande mätning konsekvent, eftersom underlåtenhet att göra detta kommer att leda till uppkomsten av morfologiska skillnader där det kan finnas ingen. Förflyttning av prov embryon kan regel förstöra ett experiment, och vi upptäcker att lägga bedövningsmedel efter att microwaved agaros har tillåtits att tjockna minskar dess effektivitet i seder embryon.

Även svårt att få, tidsförlopp mikroskopi uppgifter har uppenbara fördelar jämfört med statiska bilder att jämföra morfogenes kvalitativt. Statiska bilder kommer ofta möjliggöra enkel mätning av strukturer vid en viss tidpunkt, men ger ingen indikation på vävnads beteenden som leder fram till eller efter det stadiet. Sådan information är viktig när man studerar samspelet mellan två eller flera separata vävnad som genomgår morfogenes. För att få den bästa totala karakterisering av morfogenes, är det fördelaktigt att utföra både tids preskriberad och statiska analyser för att bäst utnyttja fördelarna med varje metod. I det tidsbortfallit analyses, kan de dynamiska cell-och vävnads beteenden analyseras och, i statiska analyser, kan ett stort antal embryon undersökas för att få den bästa förståelsen av variabilitet. Det ökande antalet zebrafisk transgena linjerna och befordran av andra tekniker kommer att göra tidsförlopp konfokalmikroskopi av flera vävnader alldagliga, som i realtid in vivo-data blir guldmyntfoten bland morphogenesis forskare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Vi tackar Melissa Griffin och Jenna Rozacky för sin fisk vård expert. PDM tack EGN för att skriva bistånd, generositet, och tålamod. Detta arbete stöddes av NIH / NIDCR R01DE020884 till JKE.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 lb Test monofilament line Cortland Line Company SLB16
Agarose I Amresco 0710
Argon laser LASOS Lasertechnik GmbH LGN 3001
Calcium chloride Sigma-Aldrich C8106
Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID FHC 30-31-0
Clove oil Hilltech Canada, Inc. HB-102
High vacuum grease Dow Corning 2021846-0807
Isotemp dry-bath incubator Fisher Scientific 2050FS
Laser scanning microscope Carl Zeiss AG LSM 710
Magnesium sulfate hexahydrate Sigma-Aldrich 230391
Microscope cover glass, 22 x 22-1 Fisher Scientific 12-542-B
Microscope cover glass, 24 x 60-1 Fisher Scientific 12-545-M
Potassium chloride Fisher Scientific M-11321
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich P3786
Sodium chloride Fisher Scientific M-11624
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S7907
TempController 2000-2 PeCon GmbH
Tricaine-S Western Chemical, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trainor, P. A., Melton, K. R., Manzanares, M. Origins and plasticity of neural crest cells and their roles in jaw and craniofacial evolution. Int. J. Dev. Biol. 47, 541-553 (2003).
  2. Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
  3. Wada, N., et al. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
  4. Roessler, E., et al. Mutations in the human sonic hedgehog gene cause holoprosencephaly. Nat. Genet. 14, 357-360 (1996).
  5. Jeong, J., Mao, J., Tenzen, T., Kottmann, A. H., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in the neural crest cells regulates the patterning and growth of facial primordia. Genes Dev. 18, 937-951 (2004).
  6. Hu, D., Marcucio, R. S. A SHH-responsive signaling center in the forebrain regulates craniofacial morphogenesis via the facial ectoderm. Development. 136, 107-116 (2009).
  7. Cordero, D., et al. Temporal perturbations in sonic hedgehog signaling elicit the spectrum of holoprosencephaly phenotypes. J. Clin. Invest. 114, 485-494 (2004).
  8. Westphal, H., Beachyr, P. A. Cyclopia and defective axial patterning in mice lacking Sonic hedgehog gene function. Nature. 383, 3 (1996).
  9. Moore-Scott, B. A., Manley, N. R. Differential expression of Sonic hedgehog along the anterior-posterior axis regulates patterning of pharyngeal pouch endoderm and pharyngeal endoderm-derived organs. Dev. Biol. 278, 323-335 (2005).
  10. Swartz, M. E., Nguyen, V., McCarthy, N. Q., Eberhart, J. K. Hh signaling regulates patterning and morphogenesis of the pharyngeal arch-derived skeleton. Dev. Biol. 369, 65-75 (2012).
  11. Balczerski, B., et al. Analysis of Sphingosine-1-phosphate signaling mutants reveals endodermal requirements for the growth but not dorsoventral patterning of jaw skeletal precursors. Dev. Biol. (2011).
  12. Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. Int. J. Dev. Biol. 50, 511-521 (2006).
  13. Alexander, C., et al. Combinatorial roles for BMPs and Endothelin 1 in patterning the dorsal-ventral axis of the craniofacial skeleton. Development. 138, 5135-5146 (2011).
  14. Zuniga, E., Rippen, M., Alexander, C., Schilling, T. F., Crump, J. G. Gremlin 2 regulates distinct roles of BMP and Endothelin 1 signaling in dorsoventral patterning of the facial skeleton. Development. 138, 5147-5156 (2011).
  15. Swartz, M. E., Sheehan-Rooney, K., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev. Dyn. 240, 2204-2220 (2011).
  16. Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nat. Genet. 40, 290-298 (2008).
  17. Soriano, P. The PDGF alpha receptor is required for neural crest cell development and for normal patterning of the somites. Development. 124, 2691-2700 (1997).
  18. Tallquist, M. D., Soriano, P. Cell autonomous requirement for PDGFRalpha in populations of cranial and cardiac neural crest cells. Development. 130, 507-518 (2003).
  19. Ho, L., Symes, K., Yordan, C., Gudas, L. J., Mercola, M. Localization of PDGF A and PDGFR alpha mRNA in Xenopus embryos suggests signalling from neural ectoderm and pharyngeal endoderm to neural crest cells. Mech. Dev. 48, 165-174 (1994).
  20. Liu, L., Korzh, V., Balasubramaniyan, N. V., Ekker, M., Ge, R. Platelet-derived growth factor A (pdgf-a) expression during zebrafish embryonic development. Dev. Genes Evol. 212, 298-301 (2002).
  21. Westerfield, M. The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). (1993).
  22. Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Lovely, C. B., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Bmp and Shh Signaling Mediate the Expression of satb2 in the Pharyngeal Arches. PloS one. 8, e59533 (2013).
  23. Varga, Z. M., et al. Zebrafish smoothened functions in ventral neural tube specification and axon tract formation. Development. 128, 3497-3509 (2001).
  24. Grush, J., Noakes, D. L. G., Moccia, R. D. The efficacy of clove oil as an anesthetic for the zebrafish, Danio rerio. 1, 46-53 (2004).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
  26. Crump, J. G., Maves, L., Lawson, N. D., Weinstein, B. M., Kimmel, C. B. An essential role for Fgfs in endodermal pouch formation influences later craniofacial skeletal patterning. Development. 131, 5703-5716 (2004).
  27. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  28. Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat. Neurosci. 13, 673-679 (2010).
Analysera Kraniofaciala Morphogenesis i Zebrafish Använda 4D konfokalmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (83), e51190, doi:10.3791/51190 (2014).More

McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (83), e51190, doi:10.3791/51190 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter