Summary
Kindlins är grundläggande för celladhesion via integriner men studier av dem har hämmats av svårigheterna i att uttrycka dem rekombinant i bakterievärdar. Vi beskriver här metoder för effektiv produktion i baculovirus-infekterade insektsceller.
Abstract
Kindlins är viktiga samaktivatorer, med Talin, av cellytereceptorer integriner och även delta i grin utanför-i signalering och kontroll av genen transkription i cellkärnan. De kindlins är ~ 75 kDa multidomain proteiner och binder till en NPxY motiv och uppströms T / S kluster av integrin β-subenheten cytoplasmatisk svans. Den hematopoietically viktiga kindlin isoform, kindlin-3, är kritisk för trombocytaggregationen vid trombbildning, leukocyt-rullning som svar på infektion och inflammation och osteoklast podocyte bildning i benresorption. Kindlin-3: s roll i dessa processer har resulterat i omfattande cellulära och fysiologiska studier. Det finns emellertid ett behov av en effektiv metod för att förvärva högkvalitativa milligrammängder av proteinet för vidare studier. Vi har utvecklat ett protokoll, här beskrivs till effektiv expression och rening av rekombinant murint kindlin-3 genom användning av ett baculovirus-dkluven expressionssystem i Sf9-celler som ger tillräckliga mängder av högren fullängdsproteinet för att tillåta dess biofysiska karakterisering. Samma tillvägagångssätt kan utnyttjas i studiet av de andra däggdjurs kindlin isoformer.
Introduction
Proteiner i kindlin familjen är en viktig del av fokal adhesion församling, och därför viktigt för komplext liv. Kindlins, av vilka det finns tre isoformer hos däggdjur (kindlin-1, kindlin-2, och kindlin-3), anses samaktivatorer av de extracellulära receptorer integriner tillsammans Talin 1. Integrin-medierad celladhesion ansluter cellytan till den extracellulära matrisen (ECM) i högre eukaryoter. Det är en kritisk och gemensam process i en plethora av fysiologiska fenomen, som inkluderar vävnadsintegritet, embryogenes, benmetabolism, hemostas, och immunitet. Grin-medierad celladhesion aktiveras via inifrån och ut signalöverföring via bindning av Talin och kindlin till grin β-subenhet cytoplasmiska svansar (CTS) vid deras konserverade NPxY motiv. Den biomedicinska betydelse kindlin proteiner sträcker sig dock så långt som till kärnan, där kindlin-2 har visats i flera färska rapporter att vara involverade i transkriptional styra 2,3.
Kindlins är multidomain proteiner av ungefär 75 kDa, stämplad av innehav av en tvådelad C-terminal FERM (4,1 band, ezrin, radixin, moesin) domän, som avbryts av en pleckstrin homologi (PH) domän i centrum för sin F2 domän 4,5. Studier av kindlin-2 och kindlin-3 PH-domäner har visat att det binder till lipid second messengers fosfatidylinositol-(3,4,5)-trisfosfat och fosfatidylinositol-(4,5)-bisfosfat 6-8. Men studier av kindlin-1 PH-området visar att den binder till Ptdlns (3,4,5) P3 med en mycket lägre affinitet, som kan förklaras i kindlin-1 med en isoform-specifika saltbrygga förhindrar lipider från bindande 9. Dessutom finns det ett ~ 100 aminosyra slinga införs i F1-domänen i de kindlins som förutsägs vara ovikt men binder till fosfatidylserin i innerblad av plasmamembranet 10,11. Den kindlin FERMdomän anses homolog till Talin FERM domänen, även om Talin FERM domänen inte har en pleckstrin homologi domän. Både kindlins och Talin interagera med NPxY motiv på grin β-svansar via F3 regionen i deras FERM domän, men kindlin binder till membranet distala motiv, medan Talin riktar membran proximala en 12-16. Kindlins och talin både utöver besitter en N-terminal F0 domän med ett ubiquitin-liknande veck som inte finns i andra FERM proteiner 11,17. Studier av den F0 domänen av kindlin-2 har visat att det oberoende binder till fosfatidylinositol-(4,5)-bisfosfat anrikade membranen 17.
De kindlins uppvisar paralog specifik vävnadsuttrycksmönster och nonredundant fysiologiska funktioner. Kindlin-1 är primärt uttrycks i epidermis, men också i mindre utsträckning kolon, mage och njurar; kindlin-2 ubiquitously uttrycks men koncentreras i tvärstrimmig och slätmuskler och är den enda kindlin uttryckt i fosterutvecklingen 4, och kindlin-3 uttrycks i de hematopoetiska vävnader med den högsta koncentrationen av kindlin-3 som finns i megakaryocyter 18. Dock har senare studier antytt att funktionellt protein uttrycks i endotel vävnader samt 19.
Kindlin-3 är av akut medicinskt intresse på grund av sin viktiga fysiologiska roll i blodet. Det är viktigt för trombocytaggregation och sprida under trombbildning 20, leukocytrullning som svar på infektion och inflammation 21,22 och osteoclast podocyte bildning i benresorption 23. Dessutom utarmning av kindlin-3 hos människor leder till leukocytvidhäftning brist typ-III - en sjukdom som karakteriseras av livshotande blödningsstörningar och återkommande bakteriella infektioner 20,24,25. Kindlin-3 knock-out-studier på möss visade den avgörande funktionen hos proteinet icelladhesion KIND3 -. / - möss visar distinkta fenotyper, såsom allvarlig blödning på grund av inaktiva trombocyter integriner, svår osteopetros och nedsatt leukocytadhesion 20,22, som liknar symtomen hos människor som saknar kindlin-3.
Högupplösta strukturella uppgifter om kindlins, hittills har begränsats till enskilda underdomäner såsom pleckstrin homologi (PH) domän av kindlin-1 9 och kindlin-2 26,27 och F0 domän kindlin-1 11 och kindlin -2 17. De flesta av de underdomäner för varje kindlin polypeptid har dock motstått kloning och strukturanalys (Yates och Gilbert, opublicerade observationer) samt studier av fullängds proteiner har hindrats av att det är svårt att uttrycka och rening av tillräckliga mängder med hjälp av E. coli (opublicerade observationer och Harburger et al. 14). Det finns ett stort medicinskt intresse kindlin-3 och dess funktion, tillsammans med de två andra familjemedlemmar, och nyligen har vi genererat milligrammängder genom rekombinant uttryck i Spodoptera frugiperda-celler som drivs av baculovirus infektion 12. Vi därför här beskriver metoder för framställning av milligrammängder rekombinant mus kindlin-3 i insektscellodling, lämpliga för omfattande strukturella studier och biokemisk analys.
I detta protokoll använder vi oss av en konstruerad knockout bacmid (BAC10 KO: 1629) som är ensam, inte kan producera livskraftiga virioner 28. Det virala DNA: t är således räddas av rekombination med en överföringsvektor som i detta fall ingår även kindlin-3-genen (FERMT3) och resulterar i den FERMT3 genen ersätter viruset mycket sen gen, som uttrycks i hög utsträckning utan överflödig, vilket resulterar i en rekombinant virus som uttrycker mus kindlin-3 som en del av virusets livscykel 28. Vi identifierade dettaFörfarande för framställning av kindlin-3 efter försök att uttrycka och rena det i andra expressionsvärdar visat oöverkomligt svår (opublicerade observationer), utan även på grund av mångsidigheten hos popin vector suite, som vi använde för kloning och som kan utnyttjas i många uttryck är värd 29.
Protocol
Detta protokoll förutsätter att mus kindlin-3-genen (FERMT3) har med framgång klonats in i en vektor nedströms om mycket sent p10 promotor och att vektorn besitter flankerande baculovirus-sekvenser för att tillåta rekombination med bacmid BAC10 KO: 1629 utvecklats av IM Jones och kollegor 28. För detta protokoll, var kindlin-3-genen klonades in pOPINE 29 och primers och kloningsstrategi som används finns beskrivet på annat håll 12. Den plasmid som är konstruerad så att den FERMT3 genen (kindlin-3) är under kontroll av den p10 baculovirus promotor och vektorn innehåller 5 'UTR/ORF603 och ORF 1629 och kodar för ett C-terminalt His 6-tagg för nedströms rening 29.
1. Insektscellodling och underhåll
- Före rekombinant baculovirus-amplifiering, Spodoptera frugiperda-celler anpassade till suspensionsodling (Sf9-celler) böratt odlas och upprätthålls. Insektsceller bör alltid hanteras med aseptisk teknik i en särskild vävnadskultur dragskåp.
- Suspensionskulturer av insektsceller inkuberas i Sf-900 II (SFM) serumfritt flytande medium kompletterat med 100 | ig / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin i kolvar vid 27 ° C med skakning vid 100 rpm.
- Bibehåll insektscellkultur densitetsintervall mellan 1 x 6-1 Oktober x 10 7 celler / ml genom delning och spädning av cellkultur med färska Sf-900 II media.
Notera: frisk celler ska se enhetlig i storlek och bör vara klotformig. - Räkna celler i en provvolym med användning av en hemocytometer och Ijusmikroskopi för att beräkna odlingscelldensitet.
2. Generering av rekombinant baculovirus
- Kultur och bibehålla Sf9-celler i suspension med användning av Sf-900 II-medium kompletterat med 100 | ig / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin. För bakulovirus generationen bör insektsceller odlas i ett densitetsområde av 5 x Oktober 05-01 x 10 6 celler / ml.
- Seed cirka 1 x 10 6 Sf9-celler per brunn av en steril 6-brunnars vävnadsodlingsplatta i 2 ml Sf-900 II-medium kompletterat med 100 | ig / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin. Lämna de Sf9-celler vid RT i dragskåp för att vidhäfta till botten av plastbrunnarna och sålunda bilda ett monoskikt.
- Utför rekombinant baculovirus generation genom samtransfektering bacmid DNA och plasmid-DNA på monolager kultur.
- För varje transfektion, blanda 1-2 pg av renat pOPINE-mFERMT3, som besitter de ORF1629 baculovirus element, med 0,5 | ig av renad BAC10 KO: 1629 i 100 pl av Sf-900 II SFM utan antibiotika (lösning A).
- I ett separat rör, späd 6 l av Cellfectin II reagens med 100 ^ Sf-900 II SFM utan antibiotics för varje transfektion reaktion (lösning B). En "master mix" kan skapas här, för minskad hantering vätska, om många transfektionerna krävs.
- Blanda de två lösningarna (A och B, ungefär 200 | il) och inkubera vid RT i 20 min för att bilda ett lipid-DNA-komplex.
- Späd lipid-DNA-komplex med 800 pl Sf-900 II SFM utan antibiotikummar. Försiktigt aspirera Sf9 cellmonolager media och försiktigt pipettera lösningen A / B och media ovanpå Sf9 monolager.
- Inkubera de transfekterade cellerna i en fuktad inkubator vid 27 ° CO / N och tillsätt ytterligare 1 ml Sf-900 II SFM utan antibiotika till varje monolagerkultur följande dag. Inkubera cellerna vid 27 C under ytterligare 5 dagar.
- Skörda det rekombinanta baculoviruset direkt från odlingsmediet (ca 2 ml totalt) och överför till ett rent centrifugrör (t ex en 15 ml Falcon-rör).
- Klargöra alla Sf9 cell DEBRär genom centrifugering vid 1000 x g under 5 min vid rumstemperatur. Överför det virus, som är i den resulterande supernatanten och betecknas P1, till ett rent rör och förvara vid 4 ° C i mörkret fram till användning. I detta skede kan användas resterande Sf9 cellslager att bedöma rekombinant virus generation genom att bedöma närvaro av rekombinant kindlin-3 i insektsceller.
- Resuspendera monoskikt med 0,5 ml PBS och späddes ett prov 10 | il med lika volymer av 2x SDS-PAGE-laddningsbuffert. Värm proverna vid> 95 ° C under minst 10 min.
- Sonikera provet i 1 sek vid 10% amplitud med hjälp av en mikro-sonikator tips om det är för trögflytande för korrekt gel lastning.
3. Amplifiering av rekombinant baculovirus
- För amplifiering av virus i suspension, använda en celldensitet av 1,4 x 10 6 celler / ml, och detta bör uppta 1/20 av den totala flaskvolymen (dvs. 50 ml kultur ien 2 L kolv).
- Uppnå amplifieringen av det rekombinanta viruset genom att infektera insektscellodling med P1 viralt lager vid en multiplicitet av infektion (MOI) av 0,1 med användning av följande formel;
Obs: P1 virus generation kan antas ha en förväntad viral titer av 1 x 10 7 pfu / ml. Däremot kan en plackanalys utföras före detta stadium. - Inkubera P1-infekterade insektsodlings vid 27 ° C med skakning vid 100 rpm under 3 dagar (72 h).
- Skörda viruset genom separation av cellerna från mediet genom centrifugering vid 1000 x g under 5 min vid rumstemperatur. Spara den resulterande cellpelleten i detta skede för att bekräfta rekombinanta virusproduktion genom att bedöma kindlin-3-proteinuttryck med hjälp av SDS-PAGE och Western blotting.
- Överför den klarnade virus berikad media, till ett rent rör och förvara vid 4 ° C imörkret fram till användning. Detta virus lager betecknas som P2.
Anmärkning: En viral titer av 2 x 10 8 pfu / ml (eller en förstärkningsgrad på 100 pfu / cell) kan förutses.
4. Uttryck av kindlin-3 i Baculovirus-infekterade Sf9
- Odla en tillräcklig volym av Sf9-celler kulturer i suspension i Sf-900 II SFM kompletterad med 100 | ig / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin, före storskalig rekombinant kindlin-3 uttryck för rening. Inkubera suspensionskulturer vid 27 ° C med skakning vid 100 rpm och med en total odlingsvolym: volymförhållande av 01:05 kolv.
- Infektera suspensionsodlingar av Sf9 vid en densitet av 2 x 10 6 celler / ml.
- Supplement Sf9-kulturerna med en slutlig koncentration av 1% (volym / volym) fetalt bovint serum (FBS), följt med förstärkt rekombinanta viruset (P2 viral lager) för att ge en MOI på 1. Inkubera de infekterade kulturer vid 27 ° C med skakning vid 100 rpm.
- Harvest rekombinationnt kindlin-3-CHIS 6-uttryckande Sf9-celler 72 h efter infektion genom centrifugering vid 1000 x g och den erhållna cellpelleten förvarades vid -20 ° C fram till användning, eller -80 ° C för långtidsförvaring.
5. Rening av Rekombinant Kindlin-3
- Tina frysta baculovirus-infekterade insektscell (Sf9) pellets som uttrycker rekombinant kindlin-3 på is.
- Resuspendera den tinade cellpelleten med lyseringsbuffert (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 1% (v / v) Tween-20), kompletterad med EDTA-fri proteasinhibitorcocktail och 1000-2000 U av DNase1.
Anmärkning: Alternativt kan modifierad fosfatbuffrad saltlösning (PBS) också användas, där NaCl-koncentrationen justeras till 500 mM för att förhindra icke-specifika interaktioner mellan endogena Sf9 cellproteiner och den immobiliserade metallaffinitetskolonn används för nedströms rening (se nedan). - Lysera cellerna genom inkubering av resuspenderade cellerna med detergent och vortexing. Ultraljudsbehandla (40% amplitud, 10 cykler av 10 sek puls följt av 10 sek kylnings) provet i ytterligare cellsönderdelning i ett isbad eller alternativt använda en Dounce-homogenisator.
- Clarify lysatet genom centrifugering vid 48.000 x g under 1 timme vid 4 ° C. Fyll den resulterande supernatanten på en HisTrap kolonn (5 ml kolonnvolym), för-jämviktad med lyseringsbuffert, vid 4 ° C vid en hastighet av 1 ml / min.
Anmärkning: Alternativt kan den klarnade lysatet inkuberas med ett 1-5 ml bäddvolym av förekvilibrerad nickel Sepharose-pärlor (t ex Ni-Sepharose 6 Fast Flow) vid 4 ° C under 1-2 timmar. En kolonn av Ni-Sepharose kan formas efter bindningssteget genom användning av en kolonn tyngdkraftsflöde. - Tvätta kolonnen med 10 kolonnvolymer av tvättbuffert (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 10 mM imidazol) för att avlägsna obundna proteiner.
- Använd en linjär imidazol-gradient 10 till 500 mM med en hastighet av 10 mm / ml (eller i 10 kolonnvolymer) med användning av en Äkta FPLC för att elueraden bundna rekombinanta kindlin-3-CHIS 6.
- Fraktionera eluering i 0,5 till 1 ml fraktioner med användning av Äkta FPLC, med de fraktioner som innehöll kindlin-3-CHIS 6 vanligtvis som eluerade vid en imidazol-koncentration av 300 mM.
- Bedöm proteinkompositionen av elueringsmedlet genom SDS-PAGE och för förstagångs reningar bekräfta genom western blotting med användning av en anti-His-6-antikropp eller anti-mus kindlin-3-antikropp.
- Slå samman fraktionerna innehållande kindlin-3 och buffertutbyte i 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl via en serie spädningar i buffert-och provkoncentrationer med användning av en centrifugal-protein-koncentrator med ett 50 kDa molekylvikt cut-off (MWCO) vid 4 ° C.
Anmärkning: Alternativt dialysera proteinlösningen med användning av Slide-A-lyzer Dialys kassett med en MWCO på 30 kDa vid 4 ° C under 4 h till O / N i 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl.
Anmärkning: för jonbyte (se nedan) en lägre koncentration av NaCl,- Applicera buffertutbyte proteinlösningen på en pre-ekvilibrerad HiTrap heparin HP-kolonn (5 ml kolonnvolym) under användning av en Äkta FPLC med en hastighet av 0,5 ml / min.
Anmärkning: Den bundna kindlin-3 elueras med användning av en linjär NaCl-gradient (0,2 M NaCl till 1 M NaCl) i samma buffert, ökad med en hastighet av 10 mM / ml. Kindlin-3-CHIS6 förväntas eluera vid ~ 0,6 M NaCl.- Fraktionera eluering i 0,5 till 1 ml fraktioner och bedöma proteinkompositionen genom SDS-PAGE och Western blotting, om så är lämpligt.
Anmärkning: en kan förvänta sig en proteinrenhet på nära 95%, såsom bestämdes genom SDS-PAGE.- Pool av fraktioner innehållande kindlin-3 och koncentrera genom att använda en centrifug protein koncentrator med ett 50 kDa MWCO till en slutvolym av 0,5 till 2 ml.
- I ett sista steg, polera den koncentrerade protein och buffertutbyte proteinet med användning av storlekssorterande kromatografi (SEC).
- Applicera det renade proteinet på en Superdex S200 (16/60) eller (10/30) för-jämviktad i 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl, 1 mM DTT med en hastighet av 1 ml / min eller 0,5 ml / min beroende på kolonnstorlek användas.
Anm: Storleksuteslutningskromatografi kan även utföras i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid behov. - Man renade proteinerna efter storlek genom att applicera buffert på kolonnen med en hastighet av 1 ml / min eller 0,5 ml / min, beroende på kolonnstorlek användas.
Anm: Proteinet eluerar från kolonnen fraktioneras och övervakas med användning av absorbansen vid 280 nm. - En enda absorbanstopp bör förväntas från SEC, som fraktioneras och utvärderas med hjälp av SDS-PAGE för att bestämma homogenitet, och är typiskt> 95% rena efter detta steg.
- Koncentrera renades kindlin-3-CHIS 6 användning av en centrifug-protein-koncentrator med ett kDa MWCO 50 till ~ 15 mg / ml, enligt bedömning spektrofotometriskt genom att använda en beräknad extinktionskoefficient (ε) av 109.320 M -1 cm -1 </ Sup> (förutsatt att alla cysteinrester reduceras).
- För lagring vid -20 ° C och långtidslagring vid -80 ° C, alikvot proteinet till PCR-rör och flash-frysa proverna i flytande kväve. Alternativt kan proteinet användas direkt för utredning med hjälp av ett antal biokemiska och biofysiska tekniker.
- Applicera buffertutbyte proteinlösningen på en pre-ekvilibrerad HiTrap heparin HP-kolonn (5 ml kolonnvolym) under användning av en Äkta FPLC med en hastighet av 0,5 ml / min.
Representative Results
Den storskaliga uttryckning av rekombinant mus kindlin-3 med användning av baculovirus-infekterade Sf9-celler kan ta mindre än två veckor för att uppnå milligram-mängder, såsom visas i den schematiska figur 1A och kräver endast en liten kvantitet av plasmid-DNA från en QIAprep Miniprep-kit, för exempel. Generering av rekombinant baculovirus uppnås genom samtransfektion Sf9-celler med mus kindlin-3 (FERMT3)-innehållande plasmid tillsammans med en konstruerad linjäriserad bacmid (BAC10: KO 1629) och skördande av nybildade virioner efter 5-7 dagar, såsom visas i fig. 1A. Denna metod för baculovirus generationen ger 100% rekombinanta virus och i huvudsak doserar behovet av plackrening 28,30. Ett representativt småskalig (2 ml monoskikt) kultur kommer att generera ett rekombinant virus-innehållande lösningen med en förväntad viral titer av 1 x 10 7 plackbildande enheter (pfu) per mlkultur. Man kan utföra en plackanalys för att bestämma den faktiska virustiter men detta är kanske alltför arbetskrävande när ett stort antal konstruktioner som testas för strukturstudier. Framgången av viruset genereringssteg kan bedömas genom användning av en EGFP-innehållande plasmid i parallella eller, för det här kindlin-3-konstruktionen kan Sf9 enkelskikt återsuspenderas i PBS och analyserades medelst SDS-PAGE och western blotting, som typiskt visar ett tydligt band motsvarande en 75 kDa-His-märkt protein, såsom visas i figur 1B. Viruset förstärks därefter för att alstra tillräckliga mängder för storskalig (volymer i liter) insektscell-infektion och rekombinant proteinisolering. Den andra passagen virus (P2) genereras genom att infektera suspensionskulturer uppskattad MOI på 0,1 (se protokoll). Det är viktigt att förstärkningen Sf9 suspensionsodling upptar endast en tjugondel av den totala kolven volymen. Denna extra luftning gör att den resulte viross-haltiga medier, skördades efter 3 dagar (72 h) efter infektion, kommer att generera tillräckliga mängder kindlin-3 i det efterföljande uttrycket kultur. Den amplifierade virusförråd (P2) antas ha en förväntad viral titer av 2 x 10 8 pfu / ml baserat på en försiktig uppskattning av 100 pfu / cell med användning av en celldensitet på 2 x 10 6 celler / ml under förstärkningen 31. Generellt för optimal baculovirus förstärkning och proteinproduktion bör Sf9 celler vara enhetliga i storlek och sfäriska, som visas i figur 1C. Dessutom är virala amplifiering och proteinuttryck maximal vid 72 timmar efter infektion, och båda är signifikant reducerad vid 96 h efter infektion.
När viruset har förstärks och användes för att infektera Sf9-celler i storskaliga experiment rekombinant kindlin-3 renas partiellt genom sin manipulerade C-terminalt His 6-tagg med immobiliserad metall-affinitets chromatography, såsom visas i fig. 2. Det är viktigt att utföra reningen vid 4 ° C, och att tillräckliga proteasinhibitorer har tillsatts för att förhindra proteolys. Den partiellt renade kindlin-3 renas ytterligare till nära homogenitet genom jonbyteskromatografi (IEC) med hjälp av en heparinkolonn, såsom visas i fig 3. Vi utnyttjas användningen av en heparin-kolonn i stället för en konventionell jonisk jonbytarkolonn, som vi förutsagt att det stora antalet av basiska rester som inbegriper en poly-lysin sträcka inom kindlin-3 F1 domän, skulle samverka starkt med de negativt laddade sulfatgrupper av kolonnen. Denna strategi är särskilt användbara för DNA-och RNA-bindande proteiner med basiska nukleinsyrabindande fläckar, t ex RNA-bindande terminal uridylyltransferase Cid1 32. Slutligen kindlin-3 renhet är "polerad" genom storleksuteslutningskromatografi att avlägsna aggregat och uppnå homogenitet, som visas iFigur 4. De buffertar som anges i protokollen är standardbuffertar som ofta används vid proteinrening för strukturanalys. Generellt är fosfatbaserade buffertar undviks för reningen av proteiner för strukturella studier, i synnerhet kristallisa screening på grund av bildning av fosfatkristaller i kristallisations droppar (särskilt för experiment vid 4 ° C). Emellertid genomförde vi en Thermofluor baserad termisk shift assay för att bestämma vilka buffertar stabiliserande för kindlin-3, såsom visas i fig. 5. Kortfattat är ett renat proteinlösningen späddes i buffertar som täcker ett område av pH-och natriumkloridkoncentrationer, således bildande en 2-dimensionell skärm. Smältningen av det protein som skall mätas genom att man observerar fluorescensen från Sypro apelsin-färgämne (Molecular Probes), som binder till hydrofoba rester inom den vikta proteinkärnan, över temperaturområdet 20-95 ° C (293-368 K). Temperatur mittpunkt där the protein utspelar (övergångstemperatur, T m) beräknades med hjälp av Opticon Monitor och beskrivs på annan plats 33. Kindlin-3 observerades vara stabil vid höga natriumkloridkoncentrationer (500 mM) inom pH-området 7,0 till 9,0, med en konsekvent övergångstemperatur (Tm) av 55 ° C. Det observerades också att Tm för Kindlin-3 var cirka 55 ° C inom pH-området 7,0 till 7,5, oberoende av natriumkloridkoncentration.
Vi fann att det var begränsad proteolys av kindlin-3 under reningen, men SDS-PAGE-analys av högkoncentrerad protein (~ 15 mg / ml) visade begränsad förorening med ytterligare två polypeptider med lika intensitet. Märkligt, men det finns ingen indikation på ytterligare arter genom storleksuteslutande kromatografi, såsom visas i fig 4. Det är sålunda tänkt att proteinet nicked av proteaser men förblir vikta och hydrodynamically omöjlig att skilja från fullängdsproteinet. Intressant nog är kalpain ett känt proteas som klyver kindlin-3 vid Tyrosine373, vilken är i β1-β2 slinga av pleckstrin homologi (PH)-domän 34 och kan förklara våra observationer. Vidare avslöjar western blotting som en av polypeptiden dubletter besitter en C-terminal His-tag, och den skenbara molekylvikten för dublett, när de summeras, lika med 75 kDa, med samma molekylvikt som det nativa proteinet. Utbytet av renad rekombinant kindlin-3 per liter Sf9 celler (~ 2 g cellvikt) är, i bästa fall, 5 mg.
Figur 1. Översikt av baculovirus-infekterade insektscell heterologt proteinuttryck. (A) En schematiserad översikt av baculovirus genen och uttryck av kindlin-3 i Sf9 celler. I DNA-vektor scheman, är 5'UTR / ORF603 färgat i rött, den ORF1629 är färgad i grönt och, genen för proteinet av intresse (POI) är blåfärgad. (B) Western blöt, med användning av en anti-His-6-antikropp, av sex småskaliga (2 ml monoskikt) kulturer (banorna märkta enligt kultur) av Sf9-celler som producerar rekombinanta baculoviruset och rekombinant murint kindlin-3. (C) Ljusmikroskopi bild av friska Sf9 celler som odlas i suspension i Sf-900 II SFM kompletterad med antibiotika och överförs till en 35 mm och vävnadsodlingsskål (se protokollet). Bilden är 20X förstoring.
Figur 2. Representative rening av kindlin-3 genom immobiliserad metall affinitetskromatografi (IMAC). SDS-PAGE av nickel affinitetsrenat rekombinant murint kindlin-3 uttrycktes i bakulovirus-infekterade Sf9-celler (~ 2 g cellvikt). Adsorberade proteinet eluerades med användning av en imidazol-gradient (visas ovan gelén). Lanes är märkta enligt följande, MW, molekylviktsmarkör, Lys, helcellslysat, FT, flödet genom (obunden), WI, tvätta 1, WII, tvätta 2. Western blot-analys (nedan) utfördes också med användning av elueringsfraktionerna för att bekräfta närvaron av den manipulerade His-tag på det rekombinanta proteinet. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3. Representativ rening av kindlin-3 genom heparinaffinitetskromatografi. (A) Eluering profil observerades vid 280 nm (blå) som visar en enda symmetrisk topp med eluering enligt en linjär natriumklorid-gradient (grön) med hjälp av koncentrationsområde av 0,05 till 1,0 M NaCl ( B) SDS-PAGE analys av fraktione eluering visar förekomsten av protein 75 kDa, kindlin-3 (märkt K3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Representant gelfiltreringskromatografi och koncentrerades kindlin-3. (A) Gelfiltrering elueringsprofilen för renat kindlin-3 med användning aven Superdex S200 (16/60) i Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl och 1 mM DTT vid 20 ° C. Utifrån elueringsvolymen, kindlin-3 migrerar som förväntat för ett protein 75 kDa, vilket tyder på att det främst är mono. (B) SDS-PAGE av högkoncentrerad renat rekombinant kindlin-3 vid 14,5 mg / ml. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Thermofluor baserade Termisk Shift Assay för Buffert Screening. Kindlin-3 utspäddes till olika buffertar som innefattar en tvådimensionell skärm med pH kontra natriumkloridkoncentration. Övergångs temperaturer (temperatur mitten poäng) observerades av fluorescens avhydrofobt bunden färgämne, Sypro orange (molekylära sonder) och beräknas med hjälp av Opticon Monitor. (A) En 3D-histogram av övergångstemperaturer plottas tillsammans med (B) förändringen i övergångstemperaturen från det beräknade genomsnittet av 50,4 ° C. För tydlighetens skull staplarna är färgade i enlighet med olika temperaturer som de motsvarar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Baculovirus expressionssystem blir allt populärare och ett viktigt verktyg för produktion av milligram mängder av rekombinant protein för proteinkarakterisering använder biofysikaliska studier, inklusive röntgenkristallografi. Trots att mer experimentellt krävande de baculovirus expressionssystem erbjuder flera fördelar jämfört med E. coli en av vilken är en nära-nativa miljö för proteiner av eukaryot ursprung, t.ex. närvaro av lämpliga chaperoner och möjlighet för posttranslationell modifiering. I våra egna ansträngningar att uttrycka kindlin-3, har alternativa uttrycksvärdar används bland däggdjurscelllinjer och bakteriella expressionsstammar (opublicerade observationer). Generellt gäller att många E. coli-stammar som testades gav mycket små kvantiteter av rekombinant kindlin-3 (~ 0,5 mg / l av kulturen; opublicerade observationer). Emellertid baculovirus-driven expression i insektsceller var särskilt effektivt och, i samverkanmparison till transient expression i däggdjursceller, mer mottagliga för att alstra det stora biomassa som erfordras för isolering av ett milligram av rekombinanta cytoplasmatiska proteiner (opublicerade observationer). Vi spekulerar att närvaron eukaryota chaperoner kan möjliggöra en effektiv produktion av kindlin-3.
De baculoviridae infektera insektsceller och för rekombinant proteinexpression baculovirus används i detta arbete är baserat på Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV). I naturen AcNPV, som infekterar Autographa californica (alfalfa grensaxen) insektslarver kräver polyhedrinprotein att bilda ocklusioner varvid vironer är inkapslade i en kristallin proteinmatris vilket ger nödvändigt skydd för deras frigivning. I odlade celler erfordras inte bildning av ocklusionskroppar för replikering och är därför onödigt. I fallet med att uttrycka främmande proteiner polyhedrin proteingenen kan vara replaced i en rekombinant AcNPV med genen för proteinet av intresse. AcNPV kan infektera andra lepidopteron arter och i syfte att rekombinant proteinuttryck armé masken Spodoptera frugiperda PUPP äggstock celler används. I den strategi som beskrivs här, är det AcNPV bacmid (BAC10) konstruerad så att en väsentlig viral gen, ORF1629, inaktiveras genom insättning av kloramfenikolacetyltransferas vilket resulterar i en knock-out bacmid (BAC10: KO 1629), så att den är oförmögen att bilda infektiösa baculovirions 28. Samtransfektion av Sf9-celler med linjäriserade BAC10: KO 1629 och FERMT3-innehållande överföringsvektor reparerar det inaktiva ORF1629, genom införlivande, vilket resulterar i en livskraftig genomet som också har införlivat FERMT3-genen under kontroll av polyhedrinpromotorn 28.
Vi beskriver ett reningsprotokoll för isolering av i hög grad ren rekombinant mus kindlin-3 via en three steg kromatografisk metod. De metoder som används här kan lätt tillämpas på andra His-märkta proteiner. Vi har anställt en jonbytessteg att ytterligare rena kindlin-3, men vi anser att detta är ytterligare ett pseudo-affinitetssteg som kindlin-3 har ett stort antal grundläggande rester, däribland en poly-lysin sträcka inom sin F1-domän. Dessutom är kindlin-3 anses binda till och interagera med den cytoplasmatiska ytan av plasmamembranet, där den fungerar, och därför förutsäger vi att kluster av basiska rester kommer att tillåta proteinet att motverka det negativt laddade membranet.
Buffertarna som beskrivs i de reningsprotokoll anses standard och används ofta i strukturell biologi. Den thermofluor analysen (Figur 5) visar att kindlin-3 är stabil på de flesta buffertförhållanden över pH 6,0. Detta var särskilt användbart och viktigt för att informera våra experiment när man studerar kinldin-3: β1En svans interaktion med NMR, vilket gav utmärkt spektra vid pH 6,1 med låga koncentrationer av NaCl 12.
Innan någon biofysiska studie kan utföras, är det viktigt att visa att det renade proteinet av intresse faktiskt korrekt veckad och är funktionellt aktiv. I en tidigare publikation visade vi att den rekombinanta kindlin-3 uttrycks och renas med hjälp av denna metod var en monomer och monodispergerad i lösning, enligt bedömning av storleken-kromatografi, dynamisk ljusspridning, analytisk ultracentrifugering och liten vinkel röntgenspridning, och var även kan binda och erkänna membran-distala NPxY och uppströms serin / treonin kluster av β 1A cytoplasmiska svansar 14, vilket bekräftar att den beter sig som det naturliga proteinet, vilket är i linje med tidigare cellulära och fysiologiska undersökningar 14,20,22. Användningen av en termisk stabilitet analys är ytterligare ett sätt att föreslå the korrekt veckning av ett protein av intresse, som felaktigt vikt protein kommer att resultera i en hög fluorescensbakgrund till följd av exponerade hydrofoba rester.
Den kindlin familj av proteiner har varit i fokus för mycket uppmärksamhet eftersom deras oväntad roll som viktiga samaktivatorer av integriner in vivo upptäcktes. Detta har utlöst mycket ansträngning för att uttrycka dem rekombinant och lösa sina strukturer. Hittills begränsad framgång har rapporterats uttrycka milligrammängder av fullängd rekombinanta proteinet men vi har här beskrivit användning av ett baculovirus-system som tillåter storskalig expression vid nivåer där strukturstudier blivit genomförbart. Genom att generera stora mängder rekombinant kindlin-3 räknar vi med att det kommer att hjälpa ytterligare studier av detta protein. The baculovirus-driven metod och rening arbetsflöde som beskrivs här för rekombinant murint kindlin-3 kan också användas för att uttrycka och rena de andra kindlin isoformer, Vilka också är svåra att uttrycka och också besitter polylysin sträckor och kan ytterligare anpassas för andra cytoplasmiska proteiner, såsom nukleinsyra-bindande proteiner, som misslyckas med att uttrycka i bakteriestammar.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar Weixan Lu för tekniskt bistånd i kulturen och underhåll av celllager Sf9. LAY fick stöd av ett Medical Research Council (MRC) graduate studentship. RJCG var en Royal Society University Research Fellow. The Oxford Avdelningen för strukturbiologi är en del av Wellcome Trust Center for Human Genetics, Wellcome Trust Kärna Award Grant Number 090532/Z/09/Z.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sf-900 II serum free media (SFM) 1x liquid | Life Technologies | 10902-096 | store at 4 °C and warm to RT before use |
| Cellfectin II Reagent | Invitrogen | 10362-100 | Alternatively, GeneJuice transfection (EMD) reagent can be used |
| Streptomycin sulphate (solid) | Melford | S0148 | Sterilize filter (0.22 μm filter) before use |
| Penicillin G, potassium salt (solid) | Melford | P0580 | Sterilize filter (0.22 μm filter) before use |
| CELLSTAR Sterile 6-well Culture Plate | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10100-147 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8849 | Caution: Protease inhibitors are dissolved in DMSO |
| Bovine pancrease deoxyribonuclease (Dnase) I | Sigma | D5025 | |
| HisTrap FF (5 ml) | GE Heathcare | 17-5286-01 | Requires an Äkta FPLC machine |
| HiTrap Heparin (5 ml) | GE Heathcare | 17-0407-01 | Requires an Äkta FPLC machine |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units (with Ultracel-50 membrane) | Millipore | UFC905024 | 15 ml capacity and a MWCO of 50 kDa protein concentrator |
References
- Moser, M., Legate, K. R., Zent, R., Fassler, R. The tail of integrins, talin, and kindlins. Science. 895, 899- (2009).
- Yu, Y., et al. Kindlin 2 forms a transcriptional complex with β-catenin and TCF4 to enhance Wnt signalling. EMBO Rep. 13, 750-758 (2012).
- Yu, Y., et al. Kindlin 2 promotes breast cancer invasion via epigenetic silencing of the microRNA200 gene family. Int J Cancer. , (2013).
- Meves, A., Stremmel, C., Gottschalk, K., Fassler, R. The Kindlin protein family: new members to the club of focal adhesion proteins. Trends Cell Biol. 19, 504-513 (2009).
- Siegel, D. H., et al. Loss of kindlin-1, a human homolog of the Caenorhabditis elegans actin-extracellular-matrix linker protein UNC-112, causes Kindler syndrome. Am. J. Hum. Genet. 73, 174-187 (2003).
- Hart, R., Stanley, P., Chakravarty, P., Hogg, N. The kindlin 3 PH domain has an essential role in integrin LFA-1-mediated B cell adhesion and migration. J. Biol. Chem. , (2013).
- Liu, J., et al. Structural basis of phosphoinositide binding to Kindlin-2 pleckstrin homology domain in regulating integrin activation. J. Biol. Chem. 286, 43334-43342 (2011).
- Qu, H., et al. Kindlin-2 regulates podocyte adhesion and fibronectin matrix deposition through interactions with phosphoinositides and integrins. J. Cell Sci. 124, 879-891 (2011).
- Yates, L. A., et al. Structural and Functional Characterisation of the Kindlin-1 Pleckstrin Homology Domain. J. Biol. Chem. 287, 43246-43261 (2012).
- Bouaouina, M., et al. A conserved lipid-binding loop in the kindlin FERM F1 domain is required for kindlin-mediated αIIbβ3 integrin coactivation. J. Biol. Chem. 287, 6979-6990 (2012).
- Goult, B. T., et al. The structure of the N-terminus of kindlin-1: a domain important for AlphaIIbBeta3 integrin activation. J. Mol. Biol. 394, 944-956 (2009).
- Yates, L. A., Fuzery, A. K., Bonet, R., Campbell, I. D., Gilbert, R. J. Biophysical Analysis of Kindlin-3 Reveals an Elongated Conformation and Maps Integrin Binding to the Membrane-Distal β-Subunit NPXY motif. J. Biol. Chem. 287, 37715-37731 (2012).
- Anthis, N. J., Campbell, I. D. The tail of integrin activation. Trends Biochem. Sci. 36, 191-198 (2011).
- Harburger, D. S., Bouaouina, M., Calderwood, D. A. Kindlin-1 and -2 directly bind the C-terminal region of beta integrin cytoplasmic tails and exert integrin-specific activation effects. J. Biol. Chem. 284, 11485-11497 (2009).
- Tadokoro, S., et al. Talin binding to integrin beta tails: a final common step in integrin activation. Science. 302, 103-106 (2003).
- Garcia-Alvarez,, et al. Structural determinants of integrin recognition by talin. Mol. Cell. 11, 49-58 (2003).
- Perera, H. D., Ma, Y. Q., Yang, J., Hirbawi, J., Plow, E. F., Qin, J. Membrane binding of the N-terminal ubiquitin-like domain of kindlin-2 is crucial for its regulation of integrin activation. Structure. 19, 1664-1671 (2011).
- Ussar, S., Wang, H. V., Linder, S., Fassler, R., Moser, M. The Kindlins: subcellular localization and expression during murine development. Exp. Cell Res. 312, 3142-3151 (2006).
- Bialkowska, K., et al. The integrin co-activator Kindlin-3 is expressed and functional in a non-hematopoietic cell, the endothelial cell. J. Biol. Chem. 285, 18640-18649 (2010).
- Moser, M., Nieswandt, B., Ussar, S., Pozgajova, M., Fassler, R. Kindlin-3 is essential for integrin activation and platelet aggregation. Nat. Med. 14, 325-330 (2008).
- Lefort, C. T., et al. Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation. Blood. 119, 4275-4282 (2012).
- Moser, M., et al. Kindlin-3 is required for beta2 integrin-mediated leukocyte adhesion to endothelial cells. Nat. Med. 15, 300-305 (2009).
- Schmidt, S., Nakchbandi, I., Ruppert, R., Kawelke, N., Hess, M. W., Pfaller, K., Jurdic, P., Fassler, R., Moser, M. Kindlin-3-mediated signaling from multiple integrin classes is required for osteoclast-mediated bone resorption. J. Cell Biol. 192, 883-897 (2011).
- Malinin, N. L., et al. A point mutation in KINDLIN3 ablates activation of three integrin subfamilies in humans. Nat. Med. 15, 313-318 (2009).
- Svensson, L., et al. Leukocyte adhesion deficiency-III is caused by mutations in KINDLIN3 affecting integrin activation. Nat. Med. 15, 306-312 (2009).
- Liu, Y., Zhu, Y., Ye, S., Zhang, R. Crystal structure of kindlin-2 PH domain reveals a conformational transition for its membrane anchoring and regulation of integrin activation. Protein Cell. 3, 434-440 (2013).
- Liu, J., et al. Structural basis of phosphoinositide binding to kindlin-2 protein pleckstrin homology domain in regulating integrin activation. J. Biol. Chem. 286, 43334-43342 (2011).
- Zhao, Y., Chapman, D. A., Jones, I. M. Improving baculovirus recombination. Nucleic Acids Res. 31, (2003).
- Berrow, N. S., et al. A versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications. Nucleic Acids Res. 35, 45 (2007).
- Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology. J Struct. Biol. 172, 55-65 Forthcoming.
- Wasilko, D. J., et al. The titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus. Protein Expr. Purif. 65, 122-132 (2009).
- Yates, L. A., Fleurdépine, S., Rissland, O. S., De Colibus, L., Harlos, K., Norbury, C. J., Gilbert, R. J. Structural Basis for the activity of a cytoplasmic RNA terminal uridylyl transferase. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 782-787 (2012).
- Sainsbury, S., Ren, J., Saunders, N. J., Stuart, D. I., Owens, R. J. Crystallization and preliminary X-ray analysis of CrgA, a LysR-type transcriptional regulator from pathogenic Neisseria meningitidis MC58. Acta Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 797-801 (2008).
- Zhao, Y., et al. Regulation of cell adhesion and migration by Kindlin-3 cleavage by calpain. J. Biol. Chem. 287, 40012-40020 Forthcoming.
