Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Effektiv produksjon og rensing av rekombinant mus Kindlin-3 fra insektceller for biofysiske studier

Published: March 19, 2014 doi: 10.3791/51206
Automatic Translation
1, 1
1Division of Structural Biology, Wellcome Trust Centre for Human Genetics, University of Oxford

Summary

Kindlins er grunnleggende for celle adhesjon gjennom inte men studier av dem har vært hemmet av vanskelighet med å uttrykke dem rekombinant i bakterie verter. Vi beskriver her metoder for deres effektiv produksjon i baculovirus-infiserte insektceller.

Abstract

Kindlins er essensielle coactivators, og Talin, av celleoverflatereseptorer integriner og deltar også i integrin ute-i signalering og styring av gentranskripsjon i cellekjernen. De kindlins er ~ 75 kDa multidomain proteiner og binder seg til et NPxY motiv og oppstrøms T / S klynge av integrinet β-subenheten cytoplasmatisk hale. Den hematopoietically viktige kindlin isoform, kindlin-3, er kritisk for blodplateaggregering under trombedannelse, leukocytt rulle som reaksjon på infeksjon og inflammasjon og osteoclast podocyte dannelse i benresorpsjon. Kindlin-tre rolle i disse prosessene har resultert i omfattende cellulære og fysiologiske studier. Det er imidlertid et behov for en effektiv metode for å skaffe høy kvalitet milligram mengder av proteinet for videre studier. Vi har utviklet en protokoll, som er beskrevet her, for effektiv ekspresjon og rensing av rekombinant murint kindlin-3 ved bruk av en baculovirus-driven ekspresjonssystem i Sf9-celler, hvorved tilstrekkelige mengder av høy renhet full-lengde protein for å tillate dens biofysiske karakterisering. Den samme tilnærmingen kan bli tatt i studiet av de andre pattedyr kindlin isoformer.

Introduction

Proteiner av kindlin-familien er en viktig del av fokal adhesjon sammenstillingen, og derfor essensielt for kompleks levetid. Kindlins, hvorav det er tre isoformer hos pattedyr (kindlin-en, kindlin-2, og kindlin-3), anses coactivators av de ekstracellulære reseptorer inte sammen Talin en. Integrin-mediert celle adhesjon forbinder celleoverflaten til den ekstracellulære matriks (ECM) i høyere eukaryoter. Det er en viktig og vanlig prosess i en mengde av fysiologiske fenomener, inkludert vev integritet, embryogenese, beinmetabolismen, hemostase og immunforsvar. Integrin-mediert celle adhesjon aktiveres gjennom innsiden ut signaltransduksjon via bindingen av Talin og kindlin til integrin β-subenheten cytoplasmatiske haler (CTS) på sine bevart NPxY motiver. Den biomedisinske betydning kindlin proteiner strekker seg imidlertid så langt som til kjernen, hvor kindlin-2 har blitt vist i flere nylige rapporter å være involvert i transkripsjonal kontrollere 2,3.

Kindlins er multidomain proteiner på omtrent 75 kDa, hall ved at den besitter en todelt C-terminal FERM (4,1 band, ezrin, radixin, moesin) domene, som er avbrutt av en pleckstrin homologi (PH)-domene om midten av sin F2 underdomene 4,5. Studier av kindlin-2 og kindlin-3 PH domener viste at det binder seg til det andre lipid messengers fosfatidylinositol-(3,4,5)-Trisphosphate og fosfatidylinositol-(4,5)-bisfosfat 6-8. Men studier av kindlin-1 PH domenet viser at det binder seg til ptdins (3,4,5) P 3 med en mye lavere affinitet, som kan forklares på kindlin-en av en isoform-spesifikke saltbroen hindre lipider fra binding 9. I tillegg er det et ~ 100 aminosyre-sløyfe inn i F1 domenet av kindlins som er forutsagt til å foldes ut, men binder seg til fosfatidylserin i den indre paknings av plasmamembranen 10,11. Den kindlin FERMDomenet anses homolog med Talin FERM domene, selv om Talin FERM domene ikke har en pleckstrin homologi-domene. Begge kindlins og Talin samhandle med NPxY motiver på integrin β-haler via F3-regionen i sin FERM domene, men kindlin binder seg til membranen distal motiv, mens Talin mål membranen proksimale en 12-16. Kindlins og Talin både i tillegg har en N-terminal F0 domene med et ubiquitin-lignende fold som ikke er funnet i andre Ferm proteiner 11,17. Studier på F0 domenet av kindlin-2 har vist at det uavhengig binder til fosfatidylinositol-(4,5)-bisfosfat anriket membraner 17.

De kindlins utviser paralogue-spesifikke vev uttrykk mønstre og nonredundant fysiologiske funksjoner. Kindlin-en er hovedsakelig uttrykt i overhuden, men også i mindre grad i kolon, mage, og nyrer; kindlin-2 er ubikvitært uttrykt, men konsentreres i tverrstripet og glattmuskel og er den eneste kindlin uttrykt i embryoutvikling 4, og kindlin-3 blir uttrykt i de hematopoietiske vev med den høyeste konsentrasjon av kindlin-3 finnes i megakaryocytter 18. Imidlertid har nyere studier antydet at funksjonelt protein blir uttrykt i endoteliale vev, så vel 19.

Kindlin-3 er akutt medisinsk interesse på grunn av sin viktige fysiologiske rolle i blod. Det er kritisk for blodplateaggregering og sprer seg ved trombedannelse 20, leukocytt rulle som reaksjon på infeksjon og inflammasjon 21,22 og osteoclast podocyte dannelse i benresorpsjon 23.. Videre uttømming av kindlin-3 hos mennesker fører til leukosyttadhesjon mangel type III - en sykdom karakterisert ved livstruende blødningsforstyrrelser og tilbakevendende bakterieinfeksjoner 20,24,25. Kindlin-3-knock-out studier i mus viste den avgjørende funksjon av proteinet icelle adhesjon KIND3 -. / - mus vise tydelige fenotyper, som alvorlig blødning på grunn av inaktive blodplateinte, alvorlig osteopetrose og nedsatt leukosyttadhesjon 20,22, ligner symptomer hos mennesker mangler kindlin-3.

Høyoppløselige strukturelle data om kindlins, til dags dato har vært begrenset til enkelte underdomener som pleckstrin homologi (PH) domene kindlin-en 9 og kindlin-2 26,27 og F0 domenet kindlin-1 11 og kindlin -2 17. De fleste av de underdomener for hver kindlin polypeptid har imidlertid motstått kloning og strukturell analyse (Yates and Gilbert, upubliserte observasjoner) og studier av full-lengde proteiner har blitt hindret av vanskeligheten med å uttrykke og rensing av tilstrekkelige mengder ved å bruke E. coli (upubliserte observasjoner og Harburger et al. 14). Det er en betydelig medisinsk interesse i kindlin-3 og dens fufunksjons, sammen med de to andre familiemedlemmer, og nylig genererte vi milligram mengder av det ved rekombinant uttrykk i Spodoptera frugiperda celler drevet av baculovirus infeksjon 12. Vi har derfor her beskriver fremgangsmåter for fremstilling av milligram mengder av rekombinant mus kindlin-3 i insektcellekultur, egnet for omfattende strukturelle studier og biokjemisk analyse.

I denne protokollen gjør vi bruk av en konstruert knockout bacmid (BAC10 KO: 1629) som er, selv ikke i stand til å produsere levedyktige virions 28. Den virale DNA er således reddet av rekombinasjon med en overføringsvektor som i dette tilfelle også omfatter kindlin-3-genet (FERMT3) og resulterer i FERMT3 gen erstatter viruset meget sent-genet, som er sterkt uttrykt, men overflødige, noe som resulterer i et rekombinant virus som uttrykker mus kindlin-3 som en del av virus livssyklus 28.. Vi identifiserte dettemetode for produksjon av kindlin-tre etter at forsøk på å uttrykke og rense den i andre ekspresjonsverter bevist uoverkommelig vanskelig (upubliserte observasjoner), men også på grunn av allsidigheten av Popin vektor suite, som vi brukte for kloning og som kan distribueres i mange uttrykk vert 29.

Protocol

Denne protokollen antar at musen kindlin-3-genet (FERMT3) har blitt klonet inn i en vektor nedstrøms for svært sent p10 promoter, og at vektoren besitter flankerende baculovirus-sekvenser for å muliggjøre rekombinasjon med bacmid BAC10 KO: 1629 utviklet av IM Jones kolleger 28. For denne protokollen, ble kindlin-3-genet klonet inn pOPINE 29 og primere og kloning strategi som brukes kan finnes beskrevet andre steder 12. Plasmidet konstruert slik at FERMT3 genet (kindlin-3) er under kontroll av p10 baculoviral promoter og vektoren inneholder 5 'UTR/ORF603 og ORF 1629 og koder for en C-terminal His 6-tag for nedstrøms rensing 29.

En. Insect Cell Kultur og vedlikehold

  1. Før rekombinant baculovirus forsterkning, Spodoptera frugiperda celler tilpasset suspensjon kultur (Sf9 celler) børdyrkes og vedlikeholdes. Insektceller bør alltid behandles med aseptiske teknikker i en dedikert vev kultur avtrekkshette.
  2. Opphengs kulturer av insektceller blir inkubert i Sf-900 II (SFM) serumfritt flytende medium supplert med 100 pg / ml penicillin og 100 pg / ml streptomycin i kolber ved 27 ° C med risting ved 100 rpm.
  3. Oppretthold insektcellekulturtettheten varierer mellom 1 x 10 6 - 1 x 10 7 celler / ml ved å splitte og fortynning av cellekulturen med friske Sf-900 II media.
    Merk: sunn celler skal se ut ensartet i størrelse, og bør være sfærisk i form.
  4. Tell cellene i et prøvevolum ved hjelp av et hemocytometer og lys-mikroskopi for å beregne kulturcelletetthet.

2. Generering av rekombinant Baculovirus

  1. Kultur og vedlikeholde Sf9 celler i suspensjon ved hjelp av SF-900 II media supplert med 100 mikrogram / ml penicillin og 100 pg / ml streptomycin. For baculovirus generasjon, bør insektceller dyrkes til en tetthet området på 5 x 10 5 - 1 x 10 6 celler / ml.
  2. Seed omtrent 1 x 10 6. Sf9-celler per brønn i en steril 6-brønns vevkultur-plate i 2 ml Sf-900 II media supplert med 100 pg / ml penicillin og 100 pg / ml streptomycin. Forlat Sf9 cellene ved RT i avtrekksskap å følge bunnen av plastbrønner og dermed danne en monolayer.
  3. Utfør rekombinant baculovirus generasjon ved kotransfektering bacmid DNA og plasmid DNA på monolayer kultur.
    1. For hver transfeksjon, blanding 1-2 ug av renset pOPINE-mFERMT3, som besitter de ORF1629 baculovirus-elementene, med 0,5 pg av renset BAC10 KO: 1629 i 100 mL av Sf-900 II SFM uten antibiotika (Løsning A).
    2. I et eget rør, fortynne 6 mL av Cellfectin II Reagens med 100 mL av Sf-900 II SFM uten antibiotika for hver transfeksjon reaksjon (Løsning B). En "master mix 'kan opprettes her, for redusert væskehåndtering, hvis mange transfections er påkrevd.
    3. Bland de to løsninger (A og B, om lag 200 pl) og inkuberes ved RT i 20 min for å danne en lipid-DNA kompleks.
    4. Fortynne lipid-DNA komplekser med 800 mL Sf-900 II SFM uten antibiotika. Aspirer forsiktig Sf9 cellemonolag media og nøye pipette løsningen A / B og media på toppen av Sf9 monolayer.
    5. Inkuber de transfekterte celler i en fuktet inkubator ved 27 ° CO / N og tilsett ytterligere 1 ml Sf-900 II SFM uten antibiotika til hver monosjikt kultur følgende dag. Inkuber cellene ved 27 ° C i ytterligere 5 dager.
  4. Høste det rekombinante baculovirus direkte fra kulturmediet (ca. 2 ml totalt) og overført til et rent sentrifugerør (for eksempel et 15 ml Falcon rør).
    1. Avklare eventuelle Sf9 celle Debrer ved sentrifugering ved 1000 xg i 5 min ved RT. Overfør den virus, som er i den resulterende supernatanten og betegnet P1, til et rent rør og oppbevares ved 4 ° C i mørke inntil bruk. På dette stadium gjenværende Sf9 monolag kan brukes til å vurdere rekombinant virusproduksjon ved å vurdere nærværet av rekombinant kindlin-3 i insektceller.
  5. Resuspender monolaget med 0,5 ml PBS, og fortynne en 10 ul prøve med like volumer av 2 x SDS-PAGE loading buffer. Varm prøven ved> 95 ° C i minst 10 min.
    1. Sonicate prøven i 1 sekund ved 10% amplitude ved hjelp av en mikro-sonicator spiss hvis den er for viskøs for riktig gel lasting.

Tre. Forsterkning av rekombinant Baculovirus

  1. For forsterkning av virus i suspensjon, å bruke en celletetthet på 1,4 x 10 6 celler / ml, og dette skal okkupere 1/20 av det totale kolbe volum (dvs. 50 ml kultur ien 2 liters kolbe).
  2. Oppnå forsterkningen av det rekombinante virus ved å infisere insektcellekultur med P1 viral lager ved en multiplisitet for infeksjon (MOI) på 0,1 ved hjelp av følgende formel;

    Merk: P1 virus generering kan antas å ha en forventet viral titer på 1 x 10 7 pfu / ml. Imidlertid kan en plakett analysen utføres før dette stadiet.
  3. Inkuber P1-infiserte insekt kultur ved 27 ° C med rysting ved 100 rpm i 3 dager (72 timer).
  4. Høst viruset ved å separere cellene fra mediet ved sentrifugering ved 1000 xg i 5 min ved RT. Lagre resulterende cellepelleten på dette stadiet for bekreftelse av rekombinant virusproduksjon ved å vurdere kindlin-3 protein-ekspresjon ved SDS-PAGE og western-blotting.
  5. Overfør den klarede virus-anriket mediet til et rent rør og oppbevares ved 4 ° C imørket inntil bruk. Dette viral lager betegnes som P2.
    Merk: En viral titer av 2 x 10 8 PFU / ml (eller en forsterkning hastighet på 100 PFU / celle) kan forventes.

4. Uttrykk for kindlin-3 i Baculovirus-infisert Sf9

  1. Dyrk et tilstrekkelig volum av Sf9 celler kulturer i suspensjon i Sf-900 II SFM supplert med 100 pg / ml penicillin og 100 pg / ml streptomycin, forut for storskala rekombinant kindlin-3 ekspresjon for rensing. Inkuber suspensjonskulturer ved 27 ° C med risting ved 100 rpm, og med et totalt volum kultur: Flaske volumforhold på 01:05.
  2. Infect suspensjonskulturer av Sf9 ved en densitet på 2 x 10 til 6 celler / ml.
  3. Supplement Sf9 kulturer med en sluttkonsentrasjon på 1% (v / v) føtalt bovint serum (FBS), etterfulgt med forsterket rekombinant virus (P2-viruslager) for å gi en MOI på en. Inkuber de infiserte kulturer ved 27 ° C med risting ved 100 rpm.
  4. Innhøsting rekombinasjonnt kindlin-3-CHIS 6-uttrykke Sf9 celler 72 timer etter infeksjon ved sentrifugering ved 1000 xg   og den resulterende cellepelleten lagret ved -20 ° C inntil bruk, eller -80 ° C for langtidslagring.

5. Rensing av rekombinant Kindlin-3

  1. Tine frosne baculovirus-infisert insektcelle (Sf9) pellets uttrykker rekombinant kindlin-3 på is.
  2. Resuspender cellepelleten tint med lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 1% (v / v) Tween-20), supplert med EDTA-fri protease inhibitor cocktail og 1000-2000 U of DNase1.
    Merk: Alternativt kan modifisert fosfatbufret saltvann (PBS) også anvendes, hvor NaCl konsentrasjonen reguleres til 500 mM for å unngå ikke-spesifikke interaksjoner mellom endogene Sf9 celle-proteiner og den immobiliserte metall affinitetskolonne brukes til nedstrøms-rensing (se nedenfor).
  3. Lysere cellene ved inkubering av de resuspenderte celler med vaskemiddel og vortexing. Sonicate (40% amplitude, 10 sykluser med 10 sek puls etterfulgt av 10 sek avkjøling) prøven for ytterligere celle-nedbrytning i et is-bad, eller alternativt bruke en Douce-homogenisator.
  4. Klargjøre lysatet ved sentrifugering ved 48,000 xg i 1 time ved 4 ° C. Legg den resulterende supernatanten på en HisTrap-kolonne (5 ml kolonnevolum), pre-ekvilibrert med lyseringsbuffer ved 4 ° C med en hastighet på 1 ml / min.
    Merk: Alternativt kan den klarede lysatet blir inkubert med en 1-5 ml lagvolum av pre-ekvilibrert nikkel Sepharose-kuler (for eksempel Ni Sepharose 6 fast flow) ved 4 ° C i 1-2 timer. En kolonne av Ni sepharose kan dannes etter at bindingstrinn ved hjelp av en tyngdekraftstrøm kolonne.
  5. Vask kolonnen med 10 kolonnevolumer av vaskebufferen (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 10 mM imidazol) for å fjerne ubundne proteiner.
  6. Bruk av en lineær imidazol gradient 10 til 500 mM med en hastighet på 10 mm / ml (eller i 10 kolonnevolumer) ved bruk av en Äkta FPLC å eluereden bundne rekombinante kindlin-3-CHIS seks.
  7. Fraksjonerer elueringen i 0,5-1 ml fraksjoner ved bruk av Äkta FPLC, med disse fraksjoner inne kindlin-3-CHIS 6 vanligvis eluering med en imidazol-konsentrasjon på 300 mM.
  8. Evaluere proteinsammensetning elueringsmiddel ved SDS-PAGE og for første gang purifications bekrefte ved western blotting ved å bruke et anti-His 6 antistoff eller anti-mus kindlin-3 antistoff.
  9. Pool fraksjonene innehold kindlin-3 og bufferutveksling i 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl via en serie av fortynninger i buffer og prøvekonsentrasjon ved hjelp av en sentrifugal protein konsentrator med en 50 kDa molekylvekt cut-off (MWCO) ved 4 ° C.
    Merk: Alternativt, dialyser proteinoppløsningen ved hjelp av Slide-A-lyzer Dialyse kassett med en MWCO på 30 kDa ved 4 ° C i 4 timer til O / N i 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl.
    NB: For ionebytter (se nedenfor) en lavere konsentrasjon av NaCl,
  10. Påfør buffer-byttet proteinoppløsning på en pre-ekvilibrert (5 ml kolonnevolum) HiTrap heparin HP-kolonnen ved hjelp av en Äkta FPLC med en hastighet på 0,5 ml / min.
    Merk: Det bundne kindlin-3 eluert ved anvendelse av en lineær NaCl-gradient (0,2 M NaCl til 1 M NaCl) i den samme buffer, og øker med en hastighet på 10 mm / ml. Kindlin-3-CHIS6 forventes å elueres ved ~ 0.6 M NaCl.
  11. Fraksjonerer elueringen i 0,5-1 ml fraksjoner og vurdere proteinsammensetningen ved hjelp av SDS-PAGE og western-blotting, hvis det er hensiktsmessig.
    Merk: man kan forvente et protein renhet nær 95%, bedømt ved SDS-PAGE.
  12. Pool fraksjoner inne kindlin-3 og ved hjelp av en sentrifuge konsentrere protein konsentrator med en 50 kDa MWCO til et endelig volum på 0,5 til 2 ml.
  13. I et siste trinn, polere den konsentrerte protein og buffer utveksle proteinet ved hjelp av gelfiltrerings-kromatografi (SEC).
    1. Påfør renset protein på en Superdex S200 (16/60) eller (10/30) pre-ekvilibrert i 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl, 1 mM DTT ved en hastighet på 1 ml / min eller 0,5 ml / min, avhengig av kolonnestørrelse anvendes.
      Merk: Størrelse uttrekk-kromatografi kan også utføres i fosfat-bufret saltvann (PBS) ved behov.
    2. Rens proteinene i henhold til størrelse ved å anvende buffer på kolonnen ved en hastighet på 1 ml / min eller 0,5 ml / min, avhengig av kolonnestørrelse anvendes.
      Merk: protein eluert fra kolonnen er fraksjonert og overvåket ved hjelp av absorbans ved 280 nm.
    3. En enkelt topp absorbans bør forventes fra SEC, som er fraksjonert og vurdert ved SDS-PAGE for å bestemme homogeniteten, og er vanligvis> 95% ren etter dette trinnet.
  14. Konsentrer den rensede kindlin-3-CHIS 6 ved hjelp av en sentrifuge protein konsentrator med en 50 kDa MWCO til ca 15 mg / ml, som målt spektrofotometrisk ved å bruke en beregnet ekstinksjonskoeffisient (ε) av 109320 M -1 cm -1 </ Sup> (forutsatt at alle cysteinrester reduseres).
  15. For lagring ved -20 ° C og langtidslagring ved -80 ° C, alikvoter av proteinet inn i PCR-rør og flash-fryse prøvene i flytende nitrogen. Alternativt kan proteinet anvendes direkte for undersøkelse ved hjelp av en rekke biokjemiske og biofysiske teknikker.

Representative Results

Den storskala ekspresjon av rekombinant mus kindlin-3 ved hjelp av baculovirus-infiserte Sf9-celler kan ta mindre enn to uker for å oppnå milligram mengder, som vist i den skjematiske figur 1A og krever bare en liten mengde av plasmid DNA fra en QIAprep Miniprep kit, for eksempel. Produksjonen av rekombinant baculovirus oppnås ved kotransfektering Sf9-celler med mus kindlin-3 (FERMT3)-inneholdende plasmid, sammen med en konstruert linearisert bacmid (BAC10: KO 1629), og høsting av nydannede virioner etter 5-7 dager, som vist i figur 1A. Denne metoden for baculovirus genererings resulterer i 100% rekombinante virus og i vesentlig grad avgir behovet for plakkrensing 28,30. Et representativt liten skala (2 ml monolayer) kultur vil generere en rekombinant virus-inneholdende oppløsning med en forventet viral titer på 1 x 10 7 plakkdannende enheter (pfu) per mlkultur. Man kan utføre en plaque-analysen for å bestemme den faktiske viral titer, men dette er kanskje for arbeidskrevende når et stort antall konstruksjoner er testet for strukturelle studier. Suksessen av viruset generering trinnet kan vurderes ved hjelp av en eGFP-holdig plasmid i parallell, eller i, for kindlin-3-konstrukt, kan Sf9 monolag blir resuspendert i PBS og vurdert ved SDS-PAGE og western-blotting, som typisk viser et klart bånd som svarer til en 75 kDa His-merket protein, som vist i figur 1B. Viruset blir deretter forsterkes til å generere tilstrekkelige mengder for storskala (liters volum) insektcelleinfeksjon og rekombinant protein isolert. Den andre passasje virus (P2) blir generert ved å infisere suspensjonskulturer med en beregnet MOI på 0,1 (se protokoll). Det er viktig at forsterkningen Sf9 suspensjon kultur opptar bare en tyvendedel av den totale kolbe volum. Denne ekstra lufting sikrer at den resulterende virus-inneholdende media, høstet etter 3 dager (72 timer) etter infeksjon, vil generere tilstrekkelige mengder av kindlin-3 i det etterfølgende uttrykk kulturen. Den forsterkede viruslager (P2) er antatt å ha en forventet viral titer på 2 x 10 8 pfu / ml basert på et konservativt estimat på 100 pfu / celle ved hjelp av en celletetthet på 2 x 10 6 celler / ml i løpet av forsterkningen 31.. Vanligvis, for å oppnå optimal baculovirus forsterkning og proteinproduksjon, bør Sf9-celler være ensartet i størrelse og sfæriske, som vist i figur 1C. I tillegg er viral forsterkning og protein ekspresjon maksimal ved 72 timer etter infeksjon, og begge er betydelig redusert i 96 timer etter infeksjon.

Når viruset er blitt forsterket og benyttet for å infisere Sf9-celler i storskalaforsøk rekombinant kindlin-3 er delvis renset i kraft av sin konstruert C-terminal His-tag 6 ved hjelp av immobiliserte metall affinitet kromatokromatografi, slik som vist i figur 2.. Det er viktig å utføre rensing ved 4 ° C, og at tilstrekkelige proteaseinhibitorer er blitt tilsatt for å forhindre proteolyse. Den delvis renset kindlin-3 er ytterligere renset til nær homogenitet ved ionebytterkromatografi (IEC) under anvendelse av en heparin-kolonnen, som vist i figur 3.. Vi benyttet ved bruk av en heparin-kolonnen i stedet for et konvensjonelt ionisk bytterkolonne, som vi spådd at det store antallet av grunnleggende rester, inkludert et poly-lysin strekning innenfor kindlin-3-F1-domene, vil interagere sterkt med de negativt ladede sulfatgrupper av kolonnen. Denne strategien er spesielt nyttig for DNA-og RNA-bindende proteiner med vanlige nukleinsyre-bindende plaster, for eksempel RNA-bindende terminal uridylyltransferase Cid1 32.. Endelig kindlin-3 renhet er "polert" ved gelfiltrerings-kromatografi for å fjerne aggregater og oppnå homogenitet, som vist iFigur 4. Bufferne er angitt i protokollene er standardbuffere som brukes ofte i proteinrensing for strukturell analyse. Vanligvis er fosfatbaserte buffere unngås for rensing av proteiner for strukturelle studier, spesielt krystallisering screening på grunn av dannelsen av fosfatkrystaller i krystallisa-dråper (særlig for eksperimenter ved 4 ° C). Imidlertid, utførte vi en Thermofluor basert termisk shift assay for å bestemme hvilke buffere ble stabiliserende for kindlin-3, slik som vist i figur 5.. I korte trekk blir et renset proteinløsning fortynnet i buffere som dekker et område av pH-og natriumklorid-konsentrasjoner, og derfor danner en to-dimensjonale skjerm. Smelting av proteinet blir målt ved å observere fluorescensen fra Sypro oransje fargestoff (molekylære prober), som binder seg til hydrofobe rester i den foldede protein kjerne, over temperaturområdet 20 til 95 ° C (293 til 368 K). Temperaturen mid-punkt hvor the protein utfolder (overgang temperatur, T m) ble beregnet ved hjelp av Opticon Monitor programvare og er beskrevet andre steder 33. Kindlin-3 ble observert å være stabil ved høye natrium-klorid-konsentrasjon (500 mM) i pH-området 7,0 til 9,0, med en jevn overgangstemperatur (T m) på 55 ° C. Det ble også observert at T m av Kindlin-3 var ca 55 ° C i pH-området 7,0-7,5, uavhengig av natrium-klorid-konsentrasjon.

Vi fant at det var begrenset proteolyse av kindlin-3 i løpet av rensingen, men SDS-PAGE-analyse av høykonsentrert protein (~ 15 mg / ml) viste liten forurensning med ytterligere to polypeptider med lik intensitet. Merkelig nok, men det er ingen indikasjon på flere arter ved gelfiltrerings-kromatografi, som vist i figur 4. Det er derfor antatt at proteinet bretter av proteaser men forblir foldet og hydrodynamically utvisket fra full-lengde protein. Interessant er Calpain et kjent protease som spalter kindlin-3 ved Tyrosine373, som er i β1-β2 løkke av pleckstrin homologi (PH) domene 34 og kan forklare våre observasjoner. Videre åpenbarer western blotting for at en av de polypeptid-dubletter besitter en C-terminal His-tag, og den tilsynelatende molekylvekt av dublett, da summeres, tilsvarer 75 kDa, med samme molekylvekt som det opprinnelige protein. Utbyttet av renset rekombinant kindlin-3 per liter av Sf9-celler (~ 2 g cellevekt) er, i beste fall, 5 mg.

Figur 1
Figur 1. Oversikt over baculovirus-infiserte insektceller heterolog proteinekspresjon. (A) En skjematisk oversikt over baculovirus genen og ekspresjon av kindlin-3 i Sf9-celler. I DNA vektor skjematisk, er 5'UTR / ORF603 farget i rødt, ORF1629 er farget i grønt og, genet av protein av interesse (POI) er farget blå. (B) Western blot ved å bruke et anti-His 6 antistoff, av seks små-skala (2 ml monolayer) kulturer (kolonnene merket i henhold til kultur) av Sf9-celler som produserer rekombinant baculovirus og rekombinant murin kindlin-3. (C) Lysmikroskopi bilde av friske Sf9-celler dyrket i suspensjon i Sf-900 II SFM supplert med antibiotika, og overført til en 35 mm vel vevskultur fatet (se protokoll). Bildet er 20X forstørrelse.

Fig. 2
Figur 2. Representative rensing av kindlin-3 av immobiliserte metall affinitetskromatografi (IMAC). SDS-PAGE av nikkel affinitetsrenset rekombinant murin kindlin-3 uttrykt i baculovirus-infiserte Sf9-celler (~ 2 g cellevekt). Adsorberte protein ble eluert ved hjelp av en imidazol gradient (vist ovenfor i gelen). Lanes er merket som følger; MW, molekylvekt markør, Lys, hele cellelysat; FT, strømme gjennom (ubundet), WI, vaske en, WII, vaske to. Western blot analyse (under) ble også utført ved hjelp av elueringsfraksjonene å bekrefte tilstedeværelse av konstruert Hans-tag på rekombinant protein. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Represensentativt rensing av kindlin-3 av heparin-affinitetskromatografi. (A) elueringsprofil følges ved 280 nm (blått) viser en enkelt symmetrisk topp ved eluering under et lineært natrium-klorid-gradient (grønn) ved hjelp av NaCl-konsentrasjonsområde av 0,05 til 1,0 M ( B) SDS-PAGE analyse av fraksjonert elueringen demonstrere tilstedeværelse av 75 kDa protein, kindlin-3 (merket K3). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4 Representative. Gelfiltrering-kromatografi og konsentrert kindlin-3. (A) Gel filtrering elueringsprofilen av renset kindlin-3 ved å brukeen Superdex S200 (16/60) i Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl og 1 mM DTT ved 20 ° C. Basert på elueringsvolumet, kindlin-3 vandrer som forventet for et 75 kDa protein, noe som tyder på at det er overveiende monomere. (B) SDS-PAGE av høykonsentrert renset rekombinant kindlin-3 på 14,5 mg / ml. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Thermofluor basert termisk skift Assay Buffer for Screening. Kindlin-3 ble fortynnet inn i forskjellige buffere som omfatter en todimensjonal skjerm av pH versus natriumkloridkonsentrasjon. Overgangstemperaturer (temperaturmidtpunkter) ble observert ved fluorescens ihydrofobisk bundet fargestoff, Sypro orange (molekylære prober) og beregnes ved hjelp av Opticon Monitor programvare. (A) En 3D histogram av overgangstemperaturer er plottet sammen med (B) endringen i overgangstemperatur fra det beregnet gjennomsnitt på 50,4 ° C. For klarhet stolpene er farget i henhold til omfanget av temperaturer som de svarer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Baculovirus uttrykk systemer blir stadig mer populært og et viktig verktøy for produksjon av milligram mengder av rekombinant protein for protein karakterisering ved hjelp av biofysiske studier, inkludert røntgenkrystallografi. Til tross for at mer eksperimentelt krevende baculovirus ekspresjonssystemer tilbyr flere fordeler fremfor E. coli hvorav den ene er en tilnærmet opprinnelig miljø for proteiner av eukaryot opprinnelse f.eks nærvær av passende anstand og mulighet for post-translasjonell modifikasjon. I vår egen innsats for å uttrykke kindlin-3, ble alternative ekspresjonsverter brukt blant annet pattedyrcellelinjer og bakterie uttrykk stammer (upubliserte observasjoner). Generelt er mange E. coli stammer testet produsert svært små mengder av rekombinant kindlin-3 (~ 0,5 mg / L av kultur, upubliserte observasjoner). Imidlertid baculovirus-drevet ekspresjon i insektceller var særlig effektiv, og i comparison til transient ekspresjon i pattedyrceller, mer mottagelig for å generere den stor biomasse som kreves for å isolere et milligram av rekombinante cytoplasmatiske proteiner (upubliserte observasjoner). Vi spekulerer i at tilstedeværelsen eukaryote anstand kan tillate en effektiv produksjon av kindlin-3.

De baculoviridae infisere insektceller, og for rekombinant protein ekspresjon i baculovirus som brukes i dette arbeidet er basert på den Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV). I naturen AcNPV, som infiserer Autographa californica (alfalfa lopper) insektlarver, krever polyhedrin protein for å danne occlusions hvorved virons er innkapslet i en krystallinsk protein matrise og dermed gi den nødvendige beskyttelse for sin utgivelse. I dyrkede celler dannelse av okklusjonslegemer ikke er nødvendig for replikasjon, og er derfor unnværlig. Ved å uttrykke fremmede proteiner polyhedrin-protein-genet kan være replaced i en rekombinant AcNPV med genet for proteinet av interesse. AcNPV kan infisere andre Lepidopteron arter og i forbindelse med rekombinant protein uttrykk hær orm Spodoptera frugiperda pupal ovarieceller brukes. I metode er beskrevet her, er det AcNPV bacmid (BAC10) konstruert slik at en vesentlig virale gen, ORF1629, blir inaktivert ved innsetting av kloramfenikol-acetyl-transferase som resulterer i et knock-out bacmid (BAC10: KO 1629), slik at den er ute av stand til å danne infeksjons baculovirions 28. Cotransfection av Sf9-celler med linearisert BAC10: KO 1629 og FERMT3-inneholdende overføringsvektor reparerer den inaktive ORF1629, ved transponering, som resulterer i en levedyktig genom som også har inkorporert den FERMT3-genet under kontroll av polyhedrin-promoteren 28..

Vi beskriver en renseprotokoll for isolering av meget rent rekombinant mus kindlin-3 via et trelage skritt kromatografisk tilnærming. Metodene som brukes her kan lett brukes på andre Hans-merkede proteiner. Vi har anvendt en ionebytter-trinn for ytterligere å rense kindlin-3, men vi tror at dette er en ytterligere pseudo affinitet trinn som kindlin-3 besitter en rekke grunnleggende rester, inkludert et poly-lysin strekning innenfor sin F1 domene. I tillegg er kindlin-3 anses å binde seg til og kommuniserer med det cytoplasmiske flate av plasma membran, hvor den fungerer, og derfor forutsi vi at gruppering av basis rester vil tillate proteinet å motvirke den negativt ladet membran.

Bufferne er beskrevet i renseprotokoller betraktes som standard, og blir ofte brukt i konstruksjons biologi. Den thermofluor analysen (Figur 5) viser at kindlin-3 er stabile i de fleste bufferbetingelser over pH 6,0. Dette var spesielt nyttig og viktig for å informere våre eksperimenter når studere kinldin-3: β1En tail interaksjon ved NMR som ga utmerket spektra ved pH 6,1 med lave konsentrasjoner av NaCl 12..

Før noen biofysiske undersøkelse kan utføres, er det viktig å demonstrere at det rensede proteinet av interesse er faktisk fullstendig brettet og er funksjonelt aktive. I en tidligere publikasjon demonstrerte vi at det rekombinante kindlin-3 uttrykt og renset ved hjelp av denne metode ble en monomer og monodispersed i løsning, vurdert ved størrelsesutelukkelses-kromatografi, dynamisk lysspredning, analytisk ultrasentrifugering og liten vinkel røntgen-spredning, og var også i stand til å binde og erkjenner membranen-distal NPxY og oppstrøms Serine / Threonine klynge av β 1A cytoplasmatiske haler 14, noe som bekrefter at det oppfører seg som de innfødte protein, noe som er i tråd med tidligere cellulære og fysiologiske studier 14,20,22. Anvendelse av en termisk stabilitet analysen er en ytterligere måte å foreslå the korrekt folding av et protein av interesse, som feilaktig foldet protein vil resultere i en høy fluorescens bakgrunnen på grunn av eksponerte hydrofobe rester.

Den kindlin familie av proteiner har vært fokus for mye oppmerksomhet siden deres uventet rolle som viktige coactivators av inte in vivo ble oppdaget. Dette har utløst mye krefter på å uttrykke dem rekombinant og løse sine strukturer. Hittil begrenset suksess er blitt rapportert å uttrykke milligram mengder av full lengde rekombinant protein, men vi har her beskrevne bruk av en baculovirus-system som tillater ekspresjon i stor skala på nivåer hvor strukturelle studier blitt mulig. Ved å generere store mengder av rekombinant kindlin-3 forventer vi at dette vil bidra til videre studier av dette protein. The baculovirus-drevet fremgangsmåte og rensing arbeidsflyten beskrevet her for rekombinant murint kindlin-3 kan også bli brukt til å uttrykke og rense den andre kindlin isoformer, Som også er vanskelig å uttrykke, og også ha poly-lysin strekker seg, og kan videre tilpasses for andre cytoplasmiske proteiner, slik som nukleinsyre-bindende proteiner, som ikke klarer å uttrykke i bakteriestammer.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Weixan Lu for teknisk assistanse i kulturen og vedlikehold av Sf9 celle bestandene. LAY ble støttet av en Medical Research Council (MRC) graduate studieplass. RJCG var en Royal Society University Research Fellow. The Oxford Divisjon for strukturbiologi er en del av Wellcome Trust Centre for Human Genetics, Wellcome Trust Kjerne Award Grant Antall 090532/Z/09/Z.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sf-900 II serum free media (SFM) 1x liquid Life Technologies 10902-096 store at 4 °C and warm to RT before use
Cellfectin II Reagent Invitrogen 10362-100 Alternatively, GeneJuice transfection (EMD) reagent can be used
Streptomycin sulphate (solid) Melford S0148 Sterilize filter (0.22 μm filter) before use
Penicillin G, potassium salt (solid) Melford P0580 Sterilize filter (0.22 μm filter) before use
CELLSTAR Sterile 6-well Culture Plate Greiner Bio-One 657160
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 10100-147
Protease Inhibitor Cocktail Sigma P8849 Caution: Protease inhibitors are dissolved in DMSO
Bovine pancrease deoxyribonuclease (Dnase) I  Sigma D5025
HisTrap FF (5 ml) GE Heathcare 17-5286-01 Requires an Äkta FPLC machine
HiTrap Heparin (5 ml) GE Heathcare 17-0407-01 Requires an Äkta FPLC machine
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units (with Ultracel-50 membrane) Millipore UFC905024 15 ml capacity and a MWCO of 50 kDa protein concentrator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moser, M., Legate, K. R., Zent, R., Fassler, R. The tail of integrins, talin, and kindlins. Science. 895, 899- (2009).
  2. Yu, Y., et al. Kindlin 2 forms a transcriptional complex with β-catenin and TCF4 to enhance Wnt signalling. EMBO Rep. 13, 750-758 (2012).
  3. Yu, Y., et al. Kindlin 2 promotes breast cancer invasion via epigenetic silencing of the microRNA200 gene family. Int J Cancer. , (2013).
  4. Meves, A., Stremmel, C., Gottschalk, K., Fassler, R. The Kindlin protein family: new members to the club of focal adhesion proteins. Trends Cell Biol. 19, 504-513 (2009).
  5. Siegel, D. H., et al. Loss of kindlin-1, a human homolog of the Caenorhabditis elegans actin-extracellular-matrix linker protein UNC-112, causes Kindler syndrome. Am. J. Hum. Genet. 73, 174-187 (2003).
  6. Hart, R., Stanley, P., Chakravarty, P., Hogg, N. The kindlin 3 PH domain has an essential role in integrin LFA-1-mediated B cell adhesion and migration. J. Biol. Chem. , (2013).
  7. Liu, J., et al. Structural basis of phosphoinositide binding to Kindlin-2 pleckstrin homology domain in regulating integrin activation. J. Biol. Chem. 286, 43334-43342 (2011).
  8. Qu, H., et al. Kindlin-2 regulates podocyte adhesion and fibronectin matrix deposition through interactions with phosphoinositides and integrins. J. Cell Sci. 124, 879-891 (2011).
  9. Yates, L. A., et al. Structural and Functional Characterisation of the Kindlin-1 Pleckstrin Homology Domain. J. Biol. Chem. 287, 43246-43261 (2012).
  10. Bouaouina, M., et al. A conserved lipid-binding loop in the kindlin FERM F1 domain is required for kindlin-mediated αIIbβ3 integrin coactivation. J. Biol. Chem. 287, 6979-6990 (2012).
  11. Goult, B. T., et al. The structure of the N-terminus of kindlin-1: a domain important for AlphaIIbBeta3 integrin activation. J. Mol. Biol. 394, 944-956 (2009).
  12. Yates, L. A., Fuzery, A. K., Bonet, R., Campbell, I. D., Gilbert, R. J. Biophysical Analysis of Kindlin-3 Reveals an Elongated Conformation and Maps Integrin Binding to the Membrane-Distal β-Subunit NPXY motif. J. Biol. Chem. 287, 37715-37731 (2012).
  13. Anthis, N. J., Campbell, I. D. The tail of integrin activation. Trends Biochem. Sci. 36, 191-198 (2011).
  14. Harburger, D. S., Bouaouina, M., Calderwood, D. A. Kindlin-1 and -2 directly bind the C-terminal region of beta integrin cytoplasmic tails and exert integrin-specific activation effects. J. Biol. Chem. 284, 11485-11497 (2009).
  15. Tadokoro, S., et al. Talin binding to integrin beta tails: a final common step in integrin activation. Science. 302, 103-106 (2003).
  16. Garcia-Alvarez,, et al. Structural determinants of integrin recognition by talin. Mol. Cell. 11, 49-58 (2003).
  17. Perera, H. D., Ma, Y. Q., Yang, J., Hirbawi, J., Plow, E. F., Qin, J. Membrane binding of the N-terminal ubiquitin-like domain of kindlin-2 is crucial for its regulation of integrin activation. Structure. 19, 1664-1671 (2011).
  18. Ussar, S., Wang, H. V., Linder, S., Fassler, R., Moser, M. The Kindlins: subcellular localization and expression during murine development. Exp. Cell Res. 312, 3142-3151 (2006).
  19. Bialkowska, K., et al. The integrin co-activator Kindlin-3 is expressed and functional in a non-hematopoietic cell, the endothelial cell. J. Biol. Chem. 285, 18640-18649 (2010).
  20. Moser, M., Nieswandt, B., Ussar, S., Pozgajova, M., Fassler, R. Kindlin-3 is essential for integrin activation and platelet aggregation. Nat. Med. 14, 325-330 (2008).
  21. Lefort, C. T., et al. Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation. Blood. 119, 4275-4282 (2012).
  22. Moser, M., et al. Kindlin-3 is required for beta2 integrin-mediated leukocyte adhesion to endothelial cells. Nat. Med. 15, 300-305 (2009).
  23. Schmidt, S., Nakchbandi, I., Ruppert, R., Kawelke, N., Hess, M. W., Pfaller, K., Jurdic, P., Fassler, R., Moser, M. Kindlin-3-mediated signaling from multiple integrin classes is required for osteoclast-mediated bone resorption. J. Cell Biol. 192, 883-897 (2011).
  24. Malinin, N. L., et al. A point mutation in KINDLIN3 ablates activation of three integrin subfamilies in humans. Nat. Med. 15, 313-318 (2009).
  25. Svensson, L., et al. Leukocyte adhesion deficiency-III is caused by mutations in KINDLIN3 affecting integrin activation. Nat. Med. 15, 306-312 (2009).
  26. Liu, Y., Zhu, Y., Ye, S., Zhang, R. Crystal structure of kindlin-2 PH domain reveals a conformational transition for its membrane anchoring and regulation of integrin activation. Protein Cell. 3, 434-440 (2013).
  27. Liu, J., et al. Structural basis of phosphoinositide binding to kindlin-2 protein pleckstrin homology domain in regulating integrin activation. J. Biol. Chem. 286, 43334-43342 (2011).
  28. Zhao, Y., Chapman, D. A., Jones, I. M. Improving baculovirus recombination. Nucleic Acids Res. 31, (2003).
  29. Berrow, N. S., et al. A versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications. Nucleic Acids Res. 35, 45 (2007).
  30. Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology. J Struct. Biol. 172, 55-65 Forthcoming.
  31. Wasilko, D. J., et al. The titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus. Protein Expr. Purif. 65, 122-132 (2009).
  32. Yates, L. A., Fleurdépine, S., Rissland, O. S., De Colibus, L., Harlos, K., Norbury, C. J., Gilbert, R. J. Structural Basis for the activity of a cytoplasmic RNA terminal uridylyl transferase. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 782-787 (2012).
  33. Sainsbury, S., Ren, J., Saunders, N. J., Stuart, D. I., Owens, R. J. Crystallization and preliminary X-ray analysis of CrgA, a LysR-type transcriptional regulator from pathogenic Neisseria meningitidis MC58. Acta Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 797-801 (2008).
  34. Zhao, Y., et al. Regulation of cell adhesion and migration by Kindlin-3 cleavage by calpain. J. Biol. Chem. 287, 40012-40020 Forthcoming.

Tags

Virologi Heterolog protein uttrykk insektceller, Baculovirus protein rensing kindlin celle adhesjon
Effektiv produksjon og rensing av rekombinant mus Kindlin-3 fra insektceller for biofysiske studier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yates, L. A., Gilbert, R. J. C.… More

Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J. Vis. Exp. (85), e51206, doi:10.3791/51206 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter