Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Een cGMP-toepassing Uitbreiding Methode voor Aggregaten van menselijke neurale stamcellen en stamcellen afgeleid uit pluripotente stamcellen of foetaal hersenweefsel

doi: 10.3791/51219 Published: June 15, 2014

ERRATUM NOTICE

Summary

Dit protocol beschrijft een nieuwe mechanische snij methode die de sferische expansie van neurale stamcellen en voorlopercellen aggregaten zonder dissociatie een enkele celsuspensie maakt. Handhaving van cel / cel contact maakt een snelle en stabiele groei voor meer dan 40 passages.

Abstract

Een cel expansie techniek om grote aantallen cellen vergaren van een enkel exemplaar voor onderzoek experimenten en klinische studies zouden veel baat hebben de stamcel gemeenschap. Veel van de huidige methoden expansie zijn bewerkelijk en kostbaar, en die waarbij volledige dissociatie kan leiden tot verschillende stam-en voorlopercellen celtypen tot differentiatie of vroegtijdige veroudering ondergaan. Om deze problemen te overwinnen, hebben we een geautomatiseerde mechanische passage aangeduid als "hakken" dat eenvoudige en goedkope methode ontwikkeld. Deze techniek vermijdt chemische of enzymatische dissociatie in enkele cellen en in plaats daarvan maakt de grootschalige uitbreiding van opgeschort, bolvormige culturen die constant cel / cel contact te onderhouden. De snij methode voornamelijk gebruikt voor foetale hersenen afgeleide neurale progenitorcellen of neurosferen en onlangs verschenen voor gebruik met neurale stamcellen uit embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen. De procedure INVOLVes zaaien neurospheres op een weefselkweek petrischaaltje en vervolgens slaagt voor een scherpe, steriel mes door de cellen effectief automatiseren van het moeizame proces van het handmatig mechanisch dissociëren elke bol. Schorsing van cellen in cultuur zorgt voor een gunstig oppervlakte-volume verhouding; en meer dan 500.000 cellen kunnen worden gegroeid in een enkele neurosfeer van minder dan 0,5 mm in diameter. In een T175 kolf, kunnen meer dan 50 miljoen cellen groeien in suspensie kweken vergeleken met slechts 15 miljoen adherente culturen. Belangrijk is dat de hakken procedure werd gebruikt onder de huidige good manufacturing practice (cGMP), waardoor massaproductie hoeveelheid van klinische kwaliteit cel producten.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Er is een lange geschiedenis van het uitbreiden van knaagdieren neurale stamcellen in een kweek als ofwel een monolaag 1-3 of geaggregeerde neurosferen 4-7. Bovendien zijn humane neurale stamcellen (hNPCs) geïsoleerd uit verschillende regio's van de ontwikkeling van centrale zenuwstelsel 8-17 uitgebreid in vitro. Deze cellen zijn bi-potente, kunnen differentiëren in zowel astrocyten en neuronen en een zeer nuttig hulpmiddel bestuderen neurale ontwikkeling en ziektemechanisme 18,19 20,21 hebben. hNPCs zijn ook getransplanteerd in vele verschillende diermodellen van het centrale zenuwstelsel ziekte met verschillende niveaus van integratie, overleving en functionele effecten 22-24.

Traditioneel, knaagdier of foetale-afgeleide NPC blootgesteld aan groeifactoren - vaak epidermale groeifactor (EGF) en / of fibroblastgroeifactor-2 (FGF-2) 25-28 - en beide hechtende 29 en drie-Dimensionale bolvormige systemen zijn meestal gepasseerd met behulp van enzymatische dissociatie in een single-cell suspensie 30-34. De standaard methode om cellen voor onderzoek of klinisch gebruik uit te breiden is als een aanhanger monolaag dankzij eenvoudige manipulatie. Wij hebben echter aangetoond dat de passage monolaag en neurosphere hNPCs met enzymatische of chemische oplossingen resulteerde begin senescentie 35. Bovendien kan enzymatische dissociatie resulteren in verhoogde niveaus van differentiatie en karyotypische afwijkingen gebaseerd op gegevens toonden embryonale stamcellen 36-38. Hoewel de standaard methode van passage hNPCs huidige good manufacturing practice (cGMP) grade producten die 1 klinische studies (Stem Cells Inc, Neuralstem Inc) in fase zijn gegaan heeft geproduceerd, de methode is alleen toegestaan ​​met een paar rondes van cel versterking, het beperken van de bancaire potentieel.

Het spreekt vanzelf dat grote onderzoeksexperimenten en toekomstige klinische proeven profiteren van de mogelijkheid ompropageren cellen in bulk en vertraagde veroudering grootschalige groei en celbankwezen mogelijk. Om aan deze behoefte, ontwikkelden we een nieuwe en geautomatiseerde manier van mechanisch passage intact neurosferen door "hakken" ze in kleine clusters naar cel-naar-cel contact onderhouden. Deze werkwijze aanzienlijk verhoogden hun levensduur 39 en suspensiekweek maakt een efficiënter incubatorruimte opzichte monolaagkweken, gezien een alternatieve 3D bioreactor kweekmethode 40. De hakken protocol voorziet in de productie van grote banken ve foetale monster groter dan doorgang 10, een onwaarschijnlijke prestatie met behulp van standaard werkwijzen passage. Hoewel deze methode voor passage hNPCs is onconventioneel, het groeit in populariteit en werd onlangs gepubliceerd met andere celtypen, zoals neurale stamcellen uit menselijke embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen, waardoor grootschalige expansie voor diverse toepassingen, waaronder in vitro ziektemodel 41-46. Belangrijk is een cGMP-gehalte hNPC cellenbank reeds geproduceerd met hakken methode, waaruit blijkt dat de techniek kan worden toegepast op toekomstige klinische toepassingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Ethische verklaring en Veiligheid

  1. Deze procedure omvat het gebruik van celkweek producten van mens of dier. Alle afgeleide weefsels moet worden goedgekeurd voor gebruik door de bevoegde Institutional Review Board (s) en / of de Institutional Animal Care en gebruik Comite (s).
  2. Alle bio-gevaarlijk afval moet worden afgevoerd volgens de veiligheidsvoorschriften door de desbetreffende instelling besloten. Kennen en volg alle toepasselijk: veiligheid en milieu richtlijnen tijdens de gehele procedure.

2. Voorbereiding van uitrusting, benodigdheden, reagentia, en waarnemingen

  1. Voorbereiding
    1. Verkrijgen van een glazen petrischaal, 8,5 cm filterpapier cirkels en double-edge prep messen.
    2. Leg een stuk filtreerpapier in de petrischaal en breng meerdere unsheathed messen op het filterpapier in de petrischaal.
    3. Herhaaldelijk laag filterpapier en bladen tot de petrischaal is ongeveer 75% vol, deksel with petrischaaldeksel en autoclaaf. Slaan in een steriele of gesloten omgeving om de steriliteit te behouden.
    4. Autoclaaf 18 cm pincet en een autoclaaf moer-chauffeur in een sterilisatie zakje. Voor cGMP productie, autoclaaf diverse RVS shim schijven in sterilisatie zakjes. Voor meer informatie over de shim schijf, zie stap 3.5.
    5. Sanitize de bioveiligheid kast (BSC) met 70% isopropylalcohol (IPA).
    6. Alle procedures moeten een BSC worden uitgevoerd om steriliteit te handhaven. Aseptisch overdracht van de volgende in de BSC:
      1. McIlwain Tissue Chopper (chopper). Veeg alle oppervlakken met 70% IPA, vooral de chopper arm (Figuur 1B). De gehele chopper kan worden ontsmet met ethyleenoxide indien nodig.
      2. Een autoclaaf moer-driver of moer-sleutel (meegeleverd met de helikopter, figuur 1I), een 18 cm pincet, een set van standaard formaat micropipettors (20 pl-1, 000 pi), een pipetaid en reageerbuisrekken.
      3. Steriele serologische pipetten, barrière pipet tips, 15 ml conische buizen, 60 mm petrischaaltjes, double-edge prep bladen en juiste maat T kolven. LET OP: Alleen omgaan met de scherpe messen met een pincet.
  2. Reagentia
    1. Expand hNPCs in Maintenance Media (MM) bestaande uit neurale stamcellen Expansion Medium, EGF bij 100 ng / ml en Leukemie Remmende Factor (LIF) en 10 ng / ml. Breng de reagentia en filtratie apparaat (s) nodig om media te bereiden in de BSC.
    2. Re-schorten de gevriesdroogde EFG behulp neurale stamcellen Uitbreiding Medium en monsters te bereiden op 100 ug / ml op te slaan bij -80 ° C gedurende maximaal 1 jaar. LIF wordt opgeslagen als gekocht bij 4 ° C tot 6 maanden of de vervaldatum van de fabrikant.
    3. Transfer MM reagentia in de BSC. Combineer alle reagentia in een juiste maat filtratie apparaat en filter met een stofzuiger apparaat. Bewaren bij 4 ° C gedurende maximaal 3 weken.
    4. hNPC Waarnemingen
      1. De twee belangrijkste factoren aan te pakken voordat het hakken is bol met een diameter en media conditionering of kleur. Geconditioneerde media (CM) wordt gedefinieerd als middel dat wordt gemetaboliseerd door de hNPCs in kweek incubator onder omstandigheden (37 ° C, 5% CO2, 95% vochtigheid). Als de cellen metaboliseren de media de fenol rode component zal verschuiven van een roze tot gele kleur betekent een meer zure omgeving (Figuur 5D).
      2. Houd de flacon (s) van hNPCs tegen het licht om de media kleur te pakken (zie bespreking voor details).
      3. Scan door de kolf met een microscoop om de cellen te observeren. Gebruik een dradenkruis om sfeer omvang te onderzoeken. Als veel gebieden een diameter van 300 urn of meer, verder met het snij proces. Hak de cellen om de 7-10 dagen.
      4. Als een karbonade niet gerechtvaardigd is, uitwisseling 25-75% van de CM met vers medium om de 3-4 dagen, afhankelijk van hoe snel de cellen worden metaboliseren de media. Continue om media uit te wisselen totdat de bollen zijn de groot genoeg om doorgang.
      5. hNPCs worden typisch gesneden in een verhouding van 01:02, kleinere kolven grotere kolven. Gebruik tabel 1 als een naslagwerk voor kolf grootte en het volume aanbevelingen.
    2 T175s
    Flacon Volume van de totale media Pre-Chop Post-Chop
    1 T12.5 5 ml 1 T12.5 1 T25
    1 T25 10 ml 1 T25 1 T75
    1 T75 20 ml 1 T75 1 T175
    1 T175 40 ml 1 T175 2 T175s
    80 ml 2 T175s * 4 T175s
    * 2 T175s is het maximum aantal kolven die kan worden gehakt tegelijk. Hak in sets van 2 T175s en verwijzen naar stap 7.

    Tabel 1. HNPC expansie paradigma. Beschrijving van een typische uitbreiding regeling voor hNPCs. Het is standaard om uit te breiden van twee-voudig volumetrisch om de 7-10 dagen.

    3. Chopper Setup

    Figuur 1
    Figuur 1. McIlwain Tissue Chopper. A) Hak dikteaanpassing micrometer, B) Chopper arm base en de bijgevoegde arm, C) Haak op plaat houder voor petrischaal, D) tabel laat u de knop en de lade, E) Snijdruk regelknop, F) Reset schakelaar, G) Plate houder, H) Bout bevestiging voor blade, sluiting en moer, ik) Moer sleutel meegeleverd met chopper, J) Blade / slotje moer, K) Blade gesp, L ) Geautomatiseerde hakken rijregelaar, M) Manuele hakken arm bedieningsknop, N)-schakelaar.

    1. Steek de helikopter in een stopcontact in de BSC en zet de schakelaar (figuur 1 N). Stel de hakken afstand tot 200 micrometer (Figuur 1A). Zet het mes kracht tot 270 ° of 9:00 indien de knop was een klok (figuur 1E). Controleer of de automatische snelheid knop zo ver linksom mogelijk wordt gedraaid. (Figuur 1L).
    2. Verplaats de tafel vrijlating alle van de weg naar rechts bevestigen de plaathouder is stabiel (figuur 1D).
    3. Draai de fabrikantal arm manipulator naar rechts om de arm te verhogen tot het maximale niveau (Figuur 1 M). De handleiding arm manipulator mag alleen rechtsom gedraaid worden.
    4. Aseptisch de overdracht van een steriele, tweesnijdend hakmes op de chopper arm los met een pincet (Figuur 1H).
    5. Voltooi deze stap alleen voor cGMP passage, als de petrischaal alleen voldoende is voor onderzoek-grade verwerking. Zoals opgemerkt in stap 2.1.4, worden shim schijven geplaatst binnenkant van de petrischaal basis die nodig is voor cGMP. De shim disc voorkomt plastic scherven van het opnemen in de sferen tijdens de hakken procedure. Voor elke geplande chop, transfer een shim schijf in de basis van elke petrischaal en deksel.
    6. Aseptisch plaats de gesp (figuur 1K) over het blad met behulp van de tang. Het gebogen gedeelte van de sluiting moet worden over de bovenrand van de arm. De sluiting blijft niet op de arm totdat de moer goed werd gevormd. Gebruik de tang om de clas houdenp op de arm en zet de moer (fig. 1J) op de bout met de steriele moer-driver. Laat de moer een kwartslag los.

    4. Pre-chop Procedure

    1. Breng de voorgestelde omvang van MM in de nieuwe fles (s) volgens tabel 2, kolom C.
    2. Aseptisch overbrengen van de cellen uit de incubator naar de BSC. Lean de kolf (s) op een buis rek (Figuur 2A) en laat de bollen om zich te vestigen in de kolf (s).
    3. Eenmaal geïnstalleerd, zuigen tot 12 ml supernatant met 5 ml of 10 ml serologische pipet en spoel het losjes hechtende gebieden van het oppervlak van de kolf (s). Herhaal indien nodig en vestigen de sferen tussen spoelingen.
    4. Breng de voorgestelde volume van CM in de nieuwe fles (s) volgens tabel 2, kolom D. Als passage van twee of meer T175 kolven, zie stap 7.1.
    5. Breng alle resterende CM en bollen in een nieuwe 15 ml conische buis. Laat de bollen te settle en de gebruikte kolf (s) te verwijderen.
    6. Kritische stap: Langzaam overdracht van de bollen uit de 15 ml conische buis op de 60 mm petrischaal of shim schijf in de laagst haalbare volume; 0,1-0,5 ml aanbevolen (figuur 2B). Houd de resterende hoeveelheid CM zoals deze wordt gebruikt om de cellen te spoelen uit de schotel na chop. Probeer de oppervlakte behandeld door de media en bollen op de schotel (figuur 2C) te minimaliseren.

    Figuur 2
    Figuur 2. Sphere voorbereiding voor het hakken. A) Lean de kolf (s) tegen een buis rek of iets dergelijks naar de sferen vestigen in de hoek van de kolf. B) Breng de bollen zo dicht mogelijk van de conische buis om de Petri gerecht. C) Zwembad de sferen van de conische buis in thij midden van de petrischaal. D) Verwijder zoveel supernatant mogelijk vanaf de bovenkant van de gepoolde sferen. E) Verdeel de bolletjes met behulp van de zijkant van een plastic micropipettor tip. F) Beweeg de sferen aan een kant van het zwembad . G) Voorbeeld van bollen die zijn verplaatst naar een kant van het zwembad om media verwijdering te vergemakkelijken. H) Condensed bollen verspreid op de petrischaal, klaar voor het hakken. Klik hier voor grotere afbeelding.

    1. Vervolgens moeten de bollen te condenseren door verwijdering van de overgedragen in stap 4.6 supernatant. Breng de bovenstaande terug in de 15 ml conische buis met een spuitbus-barrière getipt micropipettor (figuur 2D), voorkomen dat de verwijdering van bollen. Verwijder eerst zoveel media vanaf de bovenkant van de media / celpool. Wanneer het niet mogelijk isom media te verwijderen zonder bollen, gaat u verder met de volgende stap.
    <td> 0 ml
    Kolom A Kolom B Kolom C Kolom D Kolom E Kolom F
    Pre-Chop Flask Maat Post-Chop Kolf (s) Grootte Stelde volume van MM over te dragen aan nieuwe fles (s) pre-chop Stelde volume van CM over te dragen aan nieuwe fles (s) pre-chop Stelde volume van bollen / media om te zetten in nieuwe fles (s) post-chop Final Volume Seeded / Kolf
    T12.5 T25 5 ml 0 ml 5 ml 10 ml
    T25 T75 10 ml 10 ml 20 ml
    T75 T175 20 ml 10 ml 10 ml 40 ml
    1 T175 2 T175s 20 ml per fles 15 ml per fles 5 ml per fles 40 ml
    2 T75s 4 T175s 20 ml per fles 17.5 ml per fles 2,5 ml per fles 40 ml

    Tabel 2. Mediaoverdr gids pre / post-chop. Stelde volumes te gebruiken tijdens het hakken proces.

    1. Spreid het zwembad met behulp van de zijkant van de pipet tip om oppervlakte (figuur 2E) te verhogen.
    2. Kritische stap: Tip de petrischaal iets naar u toe en gebruik de kant van de pipet tip om voorzichtig slide alle sferen aan een kant van het zwembad (figuur 2F, G).
    3. Kritische stap: Als alle cellen zijn verplaatst, langzaam kantelen de petrischaal tegengestelde richting. Tijdens het proces wordt het medium alleen vanaf de sferen stromen. Breng de media terug in de 15 ml conische buis. Minimal bol verwijdering is aanvaardbaar.
    4. Gebruik de zijkant van de pipet tip om schuif alle sferen terug naar het midden van de petrischaal, zodat het zwembad heeft een diameter van 0,5-2,4 cm (figuur 2H). Het is belangrijk om de diepte van het gebied pool ondiepe houden. Als het zwembad is te diep, de bollen worden gewoon opzij geschoven tijdens het hakken. OPMERKING: De diameter van bol collectief mag niet groter zijn dan 2,5 cm en het mes contact de randen van de petrischaal, ontbreekt de cellen.

    5. Chop Procedure

    1. Breng de petrischaal op de plaat houder (figuur 1G) en zorgen voor het gerechtis bevestigd onder de plaat houder haken (figuur 1C).
    2. De tabel ontgrendelingsgreep zich uitsparingen waar het past in de versnelling. Gebruik de tabel ontgrendelknop aan de plaat houder naar links te schuiven, zodat het blad is duidelijk van de bollen en opgesloten in de versnelling (figuur 1D).
    3. Kritische stap: Laat de chopper arm door het draaien van de handleiding manipulator knop (figuur 1 M) met de klok mee totdat het mes springt naar beneden plat op de petrischaal. Gebruik een hand naar beneden drukken op de arm mount (Figuur 1B), terwijl de moer met de nutdriver.
    4. Druk de reset-knop (Figuur 1F). Steady de petrischaal met een hand terwijl u de automatische arm manipulator knop (figuur 1L) rechtsom naar de 90 ° positie of 0:00 indien de knop was een klok. LET OP: Houd uw vingers uit de buurt van de bewegende mes te allen tijde.
    5. Passeer het blad volledig door het zwembad van bollen. Draai de plaat houder90 °.
    6. Draai de bout en herhaal stap 5,3-5,5.
    7. Aseptisch overdracht van de petrischaal van de plaat houder op een werkruimte in de BSC.

    6. Post-chop Procedure

    1. Prime een 10 ml serologische pipet met de CM in de conische buis uit stap 4.6 en breng 1 ml op de gehakte sferen. Zachtjes opnieuw te schorten en over te dragen naar een nieuwe 15 ml conische buis. Vermijd bubbels en herhalen zo vaak als nodig om de gehakte sferen verzamelen.
      TIP: Minimaliseer schrapen het gerecht als plastic fragmenten kunnen tillen. Dit is geen probleem als u de RVS Shim schijven. Pas cellen verbonden aan de binnenzijde van de plastic serologische pipet. Als dit gebeurt, aspireren bellen met tussenpozen via de media in de pipet om de cellen los.
    2. Meet het volume van CM en gehakte sferen. Voeg de juiste hoeveelheid MM om het volume in tabel 2, kolom E bereiken.
    3. Vermaal debollen 2-3x te breken elke losjes gesmolten bollen.
    4. Kritische stap: Aliquot de sfeer schorsing in elke nieuwe fles. Pas over de bol schorsing in een kolf in een tijd, en opnieuw te schorten de sferen tussen transfers. Aliquoting meerdere kolven tegelijk leidt tot een onevenredig aantal bollen in elke kolf. Het uiteindelijke volume in elke kolf moet de volumes gelijk zijn in tabel 2, kolom F. Zie stap 7.2 als het zaaien van meer dan twee T175 kolven.
    5. Verwijder de moer met de moer-driver en vervolgens de sluiting met de steriele pincet. Ontsmet de juiste wijze met 70% IPA of gelijkwaardig. LET OP: Verwijder de gebruikte hakmes alleen met een tang en gooi in een bio-gevaar naaldcontainer.
    6. Ontsmet alle oppervlakken van de helikopter met 70% IPA.

    . 7 Proces Variations - meerdere kolven

    Er zijn een aantal verschillen wanneer passage van meer dan twee T175s. De staps hieronder zijn veranderingen van het gerefereerde stap.

    1. Verwijzingen naar stap 4.4:
      1. Bij passage van twee T175s, een combinatie van alle van de media en bollen in een T175 kolven. Laat de bollen om het juiste volume van CM vestigen en vervolgens aliquot in elk van de nieuwe flessen zoals vermeld in tabel 2, kolom D. Ga verder met stap 4.5.
      2. Bij passage van meer dan twee T175s, het verkrijgen van een nieuwe T175 kolf en label als de CM kolf. Compleet stap 7.1.1, maar de overdracht van de CM in de CM kolf. Bewaar de kolf aan de zijde van de BSC wordt gebruikt om de CM te verzamelen van alle kolven tot alle kolven werden gehakt. Dan is de CM worden gelijkelijk verdeeld in elk van de nieuwe flessen.
    2. Referentie stap 6.4 - Wanneer hakken dezelfde cellijn meerdere keren, dragen de gehakte sfeer suspensie in een nieuwe T75 fles gelabelde bollen post-chop en noteer de overgedragen volume. Blijf de cellen combineren in ditkolf na elke Chop en bewaar de kolf in de incubator bij 37 ° C, 5% CO2, 95% vochtigheid. Immers karbonades zijn voltooid, aliquot de sfeer suspensie in volume in elke nieuwe fles. Ga verder naar stap 6.5.

    8. Cryopreservation

    Het volgende protocol is voor cryogeen bewaren hNPCs.

    1. Ontdooi cellen invriesmedium in een schone waterbad bij 37 ° C en bewaar op ijs. Cell invriesmedium worden hoeveelheden verdeeld en opgeslagen bij -80 ˚ C tot 6 maanden.
    2. Brand polish glas Pasteur pipetten door het draaien van de opening van de pipet in een vlam. Maak minstens twee grote en twee kleine boring brand gepolijst pipetten (figuur 3). De bolletjes uiteen zal vallen door het bewegen van groot naar klein boring pipetten.
    3. Plaats TrypLE Selecteer in het waterbad bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Verwijder laten kamertemperatuur tot aan gebruik.


    Figuur 3. Open hard glas Pasteur pipetten. A) Houd de pipet in het bovenste deel van de vlam en draaien om gelijkmatig rond de randen van de glazen pipet. B) Voorbeeld van een grote diameter brand-gepolijst glas pipet. C) Voorbeeld van een klein kaliber brand gepolijst glazen pipet.

    1. Aseptisch overdracht van de neurosferen in de BSC. Laat de bollen om zich te vestigen door te leunen de kolf (s) tegen een buis rek en spoel de bodem van de kolf aan een losjes aanhangend bollen verwijderen. Laat de bollen opnieuw te vestigen.
    2. Breng alle maar 5-10 ml van CM in een steriele fles en het totale volume te meten. Leg de resterende bollen en media in een conische buis.
    3. Nadat alle cellen hebben gevestigd, dragen allemaal maar een klein meniscus van CM in de fles en summate de volume.
    4. Aseptisch overdracht 5-10 ml opgewarmd TrypLE Selecteer in de conische buis en resuspendeer de cel pellet. Breng de conische buis in de 37 ° C waterbad gedurende 15-20 minuten. Na 7,5-10 min, schud de conische buis te mengen.
    5. Gebruik gemeten CM volume uit stap 8.5 en een gelijk volume MM bereiden. Combineer en filteren de 50% CM en 50% MM-oplossing (CM / MM oplossing).
    6. Aseptisch overbrengen van een 40 urn zeef in een 50 ml conische buis.
    7. Wanneer de incubatie is voltooid, draai de 15 ml conische buizen gedurende 15 seconden bij 100 x g.
    8. Zorgvuldig aspireren en gooi de TrypLE Select en eventuele vezelig substraat. Laat een klein meniscus. Voeg zachtjes 2-4 ml CM / MM te verdunnen de resterende TrypLE Select terwijl niet de pellet te verstoren. Laten verdreven cellen opnieuw te wikkelen voordat het teruggooien van de was.
    9. Voeg 2,5 ml CM / MM oplossing aan de buis bollen. Distantiëren de bollen met een pipet 5 ml door fijnwrijven maximaal 10x. Laat de ungedissocieerde sferen regelen voor 1-2 minuten. Breng de gedissocieerde celsuspensie op de 40 urn zeef volledig ongedissocieerde clusters verwijderen.
    10. Herhaal stap 8.12 met een brand-gepolijste grote diameter glazen pipet en vervolgens een klein kaliber glazen pipet.
    11. Spoel de zeef met 2-5 ml CM / MM oplossing.
    12. Meng de celsuspensie en monsters nemen voor levensvatbaarheid.
    13. Verdun de monsters met trypaanblauw op een passend verdunningsfactor en tellen. Gebruik hieronder de standaard vergelijking met de gemiddelde levensvatbare cel concentratie berekenen en bereken de totale levensvatbare cellen.
      Vergelijking 1
    14. Bereken de totale cel bevriezing media moeten resuspendeer de cellen bij 5,0 x 10 6 cellen / ml. 1 ml cellen worden gezaaid in elke cryovial. Breng de cryovials in de BSC.
    15. Centrifugeer de celsuspensie bij 200 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C in 15 ml conische buizen voor de beste opbrengst. Als 50 ml conische buizen worden gebruikt voor een grootschalige bevriezing beneden verhogen en de tijd tot 400 g gedurende 10 minuten.
    16. Resuspendeer de celpellet met de cel invriesmedium op 5,0 x 10 6 cellen / ml. Aliquot 1 ml celsuspensie in elk cryovial. Voor een gelijkmatige verdeling, aspireren 6 ml suspensie en monster 5 cryovials x 1 ml. Breng de resterende 1 ml suspensie terug in de pool van cellen. Herhaal dit tot alle flesjes zijn gevuld.
    17. Aseptisch verzegelen alle zaadjes cryovials en breng ze op ijs gedurende 5-10 minuten.
    18. Gebruik een van de volgende voor cryopreservatie strategieën om de hNPCs behouden: Isopropyl Alcohol Chamber
      1. Vul het gewenste aantal kamer (s) met 100% IPA bij kamertemperatuur.
      2. Breng de geplaatste cryovials van ijs in de kamer (s) en breng de kamer (s) in een -80 ° C vriezer gedurende de nacht. De cellen zijn stabiel gedurende maximaal een week bij -80 ° C, maarwordt voorgesteld om de flesjes dragen aan langdurige stikstof bewaarvloeistof de volgende dag.

      Gecontroleerde Rate Vriezer

      1. Upload een geschikte bevriezing programma om de software van de gecontroleerde snelheid vriezer's. Een voorbeeld programma vermeld in tabel 3. Figuur 4 toont een typische bevriezing curve voor hNPCs. Toch zal de exacte programma variëren voor elke vriezer model. De standaard algemene bemonsteringsfrequentie moet dicht bij -1 ° C / min tot het bereiken van -40 ° C, waarbij de snelheid van bevriezing kan aanzienlijk verhoogd tot ten minste -80 ° C.
    Stap Rate (° C) Einde Temperatuur (° C) Hold (min sec) Trekker
    1 </ Td> - - 5 min 0 sec Kamer
    2 - 1.3 - 5 - Monster
    3 - - 1 min 0 sec Kamer
    4 - 45 - 58 - Kamer
    5 + 10 - 26 - Kamer
    6 + 3 - 23 - Kamer
    7 - 0,8 - 40 - Monster
    8 - 10 - 100 - Kamer
    9 - 35 - 160 - Kamer

    Tabel 3. Stappen voor het invriezen hNPCs in een gecontroleerde raten vriezer. Voorgestelde programma voor hNPC cryopreservatie op een gecontroleerde snelheid vriezer.

    Figuur 4
    Figuur 4. Voorbeeld bevriezing curve. Typische bevriezing curve voor hNPCs op een gecontroleerde snelheid vriezer.

      1. Breng de cryovials van ijs in de korven in verband met de controle tarief vriezer. Zorg ervoor dat u een cryovial laden met slechts cel bevriezing media te gebruiken voor de steekproef temperatuursensor. Breng de manden in het ijskoude kamer en plaats het monster sonde in de sonde flacon. Start het programma.
      2. Wanneer het protocol is voltooid, de overdracht van de injectieflacons in de langdurige opslag van vloeibare stikstof.

    9. Ontdooien

    Het volgende protocol is voor het ontdooien cryogeen pgereserveerd hNPCs.

    1. Breng de cryovials van vloeibare stikstof opslag onmiddellijk op droogijs. LET OP: Flesjes kunnen scheuren of losse deksels waardoor vloeibare stikstof aan de flacon betreden. Bij het verwijderen van diepvries omstandigheden, kan de vloeistof koken, onmiddellijk exploderen de flacon. Gebruik de juiste beschermingsmiddelen bij het verwijderen van de flesjes.
    2. Bereid alle van de reagentia en leveringen onder van tevoren. Wanneer het ontdooien is begonnen, is het essentieel efficiënt door te volgen.
      1. Transfer neurale stamcellen Expansion Medium, MM, een 15 ml conische buis, een 2 ml en een 10 ml serologische pipet voor elke cryovial in de BSC.
      2. Een minimum van 9 ml neurale stamcellen Uitbreiding Medium en 5 ml MM is vereist voor elke flacon. Bereid meer van elke media indien nodig.
    3. Alleen ontdooien een flacon van hNPCs tegelijk. Breng de bevroren cellen van droog ijs in een schone 37 ° C waterbad en roer de flacon in het waterbad continu. Controleer het volumeijs dat gesmolten. Wanneer er een stuk ijs ongeveer 0,5 cm in de injectieflacon, spray en veeg met 70% isopropylalcohol en overbrengen naar het BSC.
    4. De inhoud van de cryovial een 15 ml conische buis met 2 ml serologische pipet. Voeg 1 ml van neurale stamcellen Uitbreiding Medium om de lege cryovial en vervolgens overbrengen 8 ml van neurale stamcellen Uitbreiding Medium op de ontdooide cellen in een langzaam, druppelsgewijs wijze onder zachtjes schudden van de buis. Dit wordt gedaan om het risico van osmotische shock verminderen.
    5. Breng het spoelen van de cryovial de 9 ml celsuspensie. Breng de conische buis op ijs en herhaal de stappen 9,4-9,5 voor alle resterende flesjes.
    6. Centrifugeer de conische buizen bij 200 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Tijdens het centrifugeren Bereid het juiste aantal kolven zaaien basis van Tabel 4.
    # Van flacons Totaal Seeding Volume (ml) Flacon
    1 5 T12.5
    2 10 T25
    3 15 T75
    4 20 T75
    5 25 T75
    6 30 T175
    7 35 T175
    8 40 T175
    8 + - Combinatie van Kolven

    Tabel 4. Kolf weergegeven gebaseerd op het aantal cryovials ontdooid. Stelde volume en kolf grootte om hNPCs post-dooi zaad.

    1. Re-schorten en combineren alle buizen op de juiste volume van MM op basis van tabel 4. Meng goed en reverplaatsen van een monster voor levensvatbaarheid tellen. Zie stappen 8,15-8,16 voor het tellen van details. De standaard zaaien ligt tussen 160,000-320,000 cellen / cm 2.
    2. Meng de cellen goed en aliquot de cellen in kolven. Breng de kolven een 5% CO 2/37 ° C/95% luchtvochtigheid incubator. Meng de kolf door voorzichtig schudden heen en weer om de cellen gelijkmatig te verdelen.
    3. De cellen zullen bolletjes vormen binnen 24-48 uur. Af en toe zullen de cellen zich aan het plastic oppervlak en vormen een honingraat-achtige kolonie distributie. Als dit gebeurt, laat de cellen gedurende 3 dagen voor het spoelen van de cellen los, hulp in de bol vorming. Spoel om de 1-3 dagen totdat er geen hechtende cellen. Eventueel overbrengen van de cellen naar een nieuwe kolf.
    4. Uitwisseling 25-75% van de media met MM elke 3-4 dagen tot de cellen zijn klaar om te hakken, meestal 7-14 dagen na de dooi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figuur 5
Figuur 5. Representatieve gegevens. A) Verwachte cel aantallen hNPCs op p19 bevroren, vervolgens ontdooid en uitgebreid als een aanhanger monolaag met behulp van enzymatische dissociatie vergelijking met neurosferen gepasseerd via de hakken methode. Dag 0 vertegenwoordigt wanneer de cellen werden ontdooid bij p20. B) Vertegenwoordiger beelden van bollen pre-chop, 10X. C) Vertegenwoordiger beelden van bollen post-chop, 10X. D) monster van de kleur gebruikt om de mate van media-conditioning beschrijven in cGMP- vergelijkbare protocollen. E) Immunocytochemie van ontdooid p29 hNPCs die werden uitgezet voor 1 dag en gekleurd voor nestin (rood) expressie. Hoechst nucleaire teller vlek (blauw). F) Immunocytochemie van ontdooide p29 hNPCs die werden uitgezet voor 7 dagen en vleked voor GFAP (rood) en β-III tubuline (Groen). Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 5A vertegenwoordigt hNPCs ontdooid bij p20 (dag 0) en onderhouden aanhanger-laminine beklede weefselkweekflessen of als niet-hechtende neurosferen gepasseerd via de hakken methode. De hechtende cellen werden enzymatisch gedissocieerd met behulp TrypLE Selecteer wekelijkse en senesced na 70 dagen (7-10 passages) in de cultuur. In tegenstelling, de neurosferen ontdooid bij passage 20 en uitgebreid via de snij techniek gegroeid gedurende meer dan 40 passages voor senescentie. Typische hNPCs voordat hakken (Figuur 5B) moet vooral worden ≥ 300 micrometer in doorsnede. Zodra gehakt, worden de bollen in het algemeen in vieren in variabel gedimensioneerd secties, meestal ongeveer 200 micrometer in doorsnede (figuur 5C). Het is belangrijk op te merken dat hNPCs uitgebreid via de chopping methode handhaven van de expressie van hNPC markers en kan zowel astrocyten en neuronen na differentiatie produceren. Na passage hNPCs werden gedissocieerd uitgeplaat op laminine beklede dekglaasjes gedurende een of zeven dagen en daarna gefixeerd met 4% paraformaldehyde. De hNPCs drukken de progenitor cel marker nestine (Millipore, 1:1000) op dag 1 uitgeplaat hNPCs (figuur 5E) en de gedifferentieerde neurale markers glia fibrillair zuur eiwit (GFAP, 1:500) en β-III tubuline (1: 2000) op de zeven dag vergulde hNPCs (figuur 5F), markers voor respectievelijk astrocyten en onvolwassen neuronen,.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figuur 6
Figuur 6. Hakken Schematische. Uitbreidende spheroïde stam / voorlopercellen cellen in kweek met behulp van de mechanische hakken methode.

Kritische stappen

Een overzicht van de hakken expansie paradigma wordt getoond in figuur 6. HNPC bol grootte is een van de belangrijke criteria te observeren voor passage van de neurosferen. Hoewel er een grote variatie in omvang gebied, ten minste 30% van de bolletjes hebben een diameter groter dan 300 urn. Indien de bollen te klein om doorgang eenvoudig wisselen CM verse MM (25% -50%) en opnieuw te beoordelen na 1-4 dagen. Matig tarieven expansie optreden wanneer de sferen zijn gepasseerd op te klein diameter.

hNPC expansie tarieven zijn ook afhankelijk van de sfeer dichtheid en media conditioning vanwege uitgescheiden factoren 47. Echter, als de media overdreven wordt gemetaboliseerd en belangrijke groeifactoren worden verminderd, kunnen de cellen een karyotypisch abnormale populatie van cellen 48 te verwerven. Daarom moeten vervangen voedingsstoffen en groeifactoren worden afgewogen tegen afgescheiden trofische factoren. Wanneer zaaien hNPCs na chop of na ontdooien, het aantal neurosferen per cm3 media is variabel. Echter, de algemene regel is hoe groter de dichtheid, hoe sneller de media zal conditioneren en hoe hoger de uitbreiding tarief, mits de media wordt uitgewisseld wanneer dat nodig is. Gebruik de media-conditioning kleurenspectrum (Figuur 5D), die varieert van roze als niet-gemetaboliseerd, geel wanneer de media volledig is gemetaboliseerd. De ideale medium kleur voor logaritmische groei is een rood-oranje kleur, # 3 op de kleurstaal. Dit geeft aan dat de media bevat voldoende voedingsstoffen en groeifactoren met behoud van een voldoende concentratie van uitgescheiden trophic factoren. De media moeten niet voorwaarde verleden # 4 op de kleurstaal. Als alternatief, wanneer de cellen niet snel metaboliseren media (# 1 op de kleurstaal), de hNPCs zal trager groeien en vereisen een chop elke 10-20 dagen in plaats van om de 7-10 dagen. Het is belangrijk om de cultuur dichtheid verhogen conditionering, waardoor verbeteren expansiesnelheid verhogen.

Tijdens het hakken procedure op de volgende kritische stappen. Controleer of de schijf is geïnstalleerd parallel aan de chopper arm. Als het mes niet vlak op het oppervlak van de petrischaal of trim disc, kunnen veel gebieden niet worden gehakt. Let op de verspreiding van cellen behandeld in stap 4.11. De bollen moeten in het midden van de petrischaal of het blad blijven zal contact met de muur voordat alles sferen zijn gehakt. Tenslotte is het belangrijk te voorkomen drogen van de hNPCs langere tijd gedurende het hakken proces. Na het plaatsen van bollen in de schotel, hakken en overspoelen ze met verse media zo snelmogelijk.

Omdat deze techniek vereist een aantal onderdelen van de uitrusting kunnen er risico's voor de steriliteit van de kweek. Gezien deze risico, moet de juiste steriele techniek worden gebruikt in de procedure. Voor fundamenteel onderzoek niveau productie, vegen beneden alle apparatuur met 70% IPA of gelijkwaardig is voldoende, samen met optionele ultraviolet incubatie voor een minimum van 15 minuten. Voer alle stappen binnen in een steriele BSC. Voor cGMP niveau productie, moet de helikopter worden gesteriliseerd met ethyleenoxide, zoals voorgesteld door de fabrikant. Alle andere benodigdheden kunnen steriel worden gekocht of geautoclaveerd.

Toekomstige toepassingen

De overgang van een fundamenteel onderzoek therapie van de bank aan het bed kan een uitdaging zijn. De hakken procedure is ontworpen met deze overgang in het achterhoofd. De procedure is al gebruikt om een ​​cGMP-compliant hNPC bank te produceren aan de Universiteit van Wisconsin Waisman Center Bio-fabriek. Thoed hNPC bank werd aangekocht voor de uitbreiding van een farmaceutische kwaliteit hNPC cel veel dat zal worden gebruikt voor nieuwe pre-experimentele geneesmiddel studies en een fase 1 klinische studie volgende Federal Drug Administration goedkeuring. Er zijn andere celtypen die deze procedure voor uitbreiding. Een voorbeeld zijn EZ bollen, neurale stamcellen gegenereerd uit pluripotente stamcellen 41. Deze techniek heeft een groot potentieel voor gebruik met andere soorten weefsel die constante cel-cel-contact vereisen tijdens expansie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken dr. Soshana Svendsen voor kritisch en bewerken van dit rapport. Dit werk werd bijgedragen door de NIH / NINDS 1U24NS078370-01 en CIRM DR2a-05320.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker, 50 ml Fisherbrand FB-100-50 multiple manufacturers/suppliers
Bio-Safety Cabinet, class II Baker SG-603A 4 ft. or 6 ft. model.  6 ft. model recommended; multiple manufacturers/suppliers
Blades, Double-edge Prep Personna 74-0002 multiple manufacturers/suppliers.  CAUTION: Sharp
Cell Freezing Media Sigma-Aldrich C6295-50ML DMSO, serum-free
Centrifuge, swing-bucket with 15 ml inserts Eppendorf 5810 R multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 15 ml Fisherbrand S50712 multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 50 ml BD Falcon 352074 multiple manufacturers/suppliers
Controlled Rate Freezer Planer Kryo 750 multiple manufacturers/suppliers
Cryovials, 2 ml Corning 430488 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T12.5 BD Falcon 353107 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T25 BD Falcon 353081 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T175 BD Falcon 353045 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T75  BD Falcon 353110 multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 1 L Millipore SCGPU11RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 150 ml Millipore SCGVU01RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 500 ml Millipore SCGPU05RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 50 ml Millipore SCGP00525 multiple manufacturers/suppliers
Filter Paper, 8.5 cm circles Whatman/GE 1001-085
Forceps, Standard Pattern - Serrated/Curved/18 cm Fine Science Tools 11001-18
Freezing Chamber, Isopropyl Alcohol Nalgene 5100-0001 "Mr. Frosty"
Incubator, 37 °C/5% CO2 Forma 370 series multiple manufacturers/suppliers
Hemacytometer, Phase Hausser Scientific 1475 multiple manufacturers/suppliers
McIlwain Tissue Chopper Lafayette Instruments TC752-PD  Petri dish modification required.   CAUTION:  Moving, sharp blade.
Micropipettor, 1-10 μl Gilson F144562 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 100-1,000 μl (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 2-20 μl (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 20-200 μl (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Nutdriver, Autoclavable, 5/16" Steritool 10302
Pasteur Pipets, cotton-plugged Fisherbrand 13-678-8B multiple manufacturers/suppliers
Petri Dish, Glass, Autoclavable Corning 3160-100
Pipet Aid Drummond 4-000-101 multiple manufacturers/suppliers
Shim disc McMaster-Carr VARIABLE multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 10 μl AvantGuard AV10R-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 1,000 μl AvantGuard AV1000 multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 20 μl AvantGuard AV20-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 200 μl AvantGuard AV200-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 10 ml Fisherbrand 13-676-10J multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 2 ml Fisherbrand 13-675-3C multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 25 ml Fisherbrand 13-676-10K multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 5 ml Fisherbrand 13-676-10H multiple manufacturers/suppliers
Sterilization Pouches, 19 x 33 cm Crosstex SCL multiple manufacturers/suppliers
Strainer, 40 µm BD Falcon 352340
Tissue Culture Dishes, 60 mm BD Falcon 351007
Tube Racks, Interlocking Four-Way Fisherbrand 03-448-17
Water Bath Fisherbrand S52602Q multiple manufacturers/suppliers
Neural Progenitor Cell-Specific Processing Reagents
Neural Stem Cell Expansion Medium (Stemline) Sigma-Aldrich S3194-500ML Important to use the Stemline brand
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Millipore GF316 multiple manufacturers/suppliers
Recombinant Human Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Millipore LIF1010 multiple manufacturers/suppliers
Trypan Blue (0.4%) Sigma-Aldrich T8154-100ML multiple manufacturers/suppliers
TrypLE Select (1x) Life Technologies 12563-011

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cattaneo, E., McKay, R. Proliferation and differentiation of neuronal stem cells regulated by nerve growth factor. Nature. 347, 762-765 (1990).
  2. Palmer, T. D., Takahashi, J., Gage, F. H. The adult rat hippocampus contains primordial neural stem cells. Molecular and cellular neurosciences. 8, 389-404 (1997).
  3. Wu, Y., Liu, Y., Chesnut, J. D., Rao, M. S. Isolation of neural stem and precursor cells from rodent tissue. Methods in molecular biology. 438-4339 (2008).
  4. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  5. Svendsen, C. N., Fawcett, J. W., Bentlage, C., Dunnett, S. B. Increased survival of rat EGF-generated CNS precursor cells using B27 supplemented medium. Experimental brain research. Experimentelle Hirnforschung. Experimentation cerebrale. 102-407 (1995).
  6. Laywell, E. D., Kukekov, V. G., Steindler, D. A. Multipotent neurospheres can be derived from forebrain subependymal zone and spinal cord of adult mice after protracted postmortem intervals. Experimental neurology. 156-430 (1999).
  7. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. 45, (45), (2010).
  8. Temple, S. Division and differentiation of isolated CNS blast cells in microculture. Nature. 340, 471-473 (1989).
  9. Chalmers-Redman, R. M., Priestley, T., Kemp, J. A., Fine, A. In vitro propagation and inducible differentiation of multipotential progenitor cells from human fetal brain. Neuroscience. 76, 1121-1128 (1997).
  10. Ostenfeld, T., et al. Regional specification of rodent and human neurospheres. Brain research. Developmental brain research. 134, 43-55 (2002).
  11. Carpenter, M. K., et al. et al. In vitro expansion of a multipotent population of human neural progenitor cells. Experimental neurology. 158, 265-278 (1999).
  12. Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nature. 9, 439-447 (2003).
  13. Piao, J. H., et al. Cellular composition of long-term human spinal cord- and forebrain-derived neurosphere cultures. Journal of neuroscience research. 84, 471-482 (2006).
  14. Barami, K., Zhao, J., Diaz, F. G., Lyman, W. D. Comparison of neural precursor cell fate in second trimester human brain and spinal cord. Neurological research. 23, 260-266 (2001).
  15. Walder, S., Ferretti, P. Distinct neural precursors in the developing human spinal cord. The International journal of developmental biology. 48, 671-674 (2004).
  16. Buc-Caron, M. H. Neuroepithelial progenitor cells explanted from human fetal brain proliferate and differentiate in vitro. Neurobiology of. 2, 37-47 (1995).
  17. Becq, H., Jorquera, I., Ben-Ari, Y., Weiss, S., Represa, A. Differential properties of dentate gyrus and CA1 neural precursors. Journal of. 62, 243-261 (2005).
  18. Keenan, T. M., Nelson, A. D., Grinager, J. R., Thelen, J. C., Svendsen, C. N. Real time imaging of human progenitor neurogenesis. PloS one. 5, (2010).
  19. Kim, H. J., McMillan, E., Han, F., Svendsen, C. N. Regionally specified human neural progenitor cells derived from the mesencephalon and forebrain undergo increased neurogenesis following overexpression of ASCL1. Stem cells. 27, 390-398 (2009).
  20. Windrem, M. S., et al. Neonatal chimerization with human glial progenitor cells can both remyelinate and rescue the otherwise lethally hypomyelinated shiverer mouse. Cell stem cell. 2, 553-565 (2008).
  21. Kitiyanant, N., Kitiyanant, Y., Svendsen, C. N., Thangnipon, W. B. D. N. F. - IGF-1- and GDNF-secreting human neural progenitor cells rescue amyloid beta-induced toxicity in cultured rat septal neurons. Neurochemical research. 37, 143-152 (2012).
  22. Dutta, S., et al. Cell therapy: the final frontier for treatment of neurological diseases. CNS neuroscience & therapeutics. 19, 5-11 (2013).
  23. Lindvall, O., Barker, R. A., Brustle, O., Isacson, O., Svendsen, C. N. Clinical translation of stem cells in neurodegenerative disorders. Cell stem cell. 10, 151-155 (2012).
  24. Wang, S., et al. Long-term vision rescue by human neural progenitors in a rat model of photoreceptor degeneration. Investigative ophthalmology & visual science. 49, 3201-3206 (2008).
  25. Kitchens, D. L., Snyder, E. Y., Gottlieb, D. I. FGF and EGF are mitogens for immortalized neural progenitors. Journal of. 25, 797-807 (1994).
  26. Craig, C. G., et al. In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 2649-2658 (1996).
  27. Ciccolini, F., Svendsen, C. N. Fibroblast growth factor 2 (FGF-2) promotes acquisition of epidermal growth factor (EGF) responsiveness in mouse striatal precursor cells: identification of neural precursors responding to both EGF and FGF-2. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 7869-7880 (1998).
  28. Kelly, C. M., et al. EGF and FGF-2 responsiveness of rat and mouse neural precursors derived from the embryonic CNS. Brain research bulletin. 68, 83-94 (2005).
  29. Sun, Y., et al. Long-term tripotent differentiation capacity of human neural stem (NS) cells in adherent culture. Molecular and cellular neurosciences. 38, 245-258 (2008).
  30. Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells. Neuron. 11, 951-966 (1993).
  31. Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 1091-1100 (1996).
  32. Chojnacki, A., Weiss, S. Production of neurons, astrocytes and oligodendrocytes from mammalian CNS stem cells. Nature. 3, 935-940 (2008).
  33. Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique. Current protocols in stem cell biology. Chapter. 2, 10-1002 (2010).
  34. Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells. Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, Unit 2D 2, doi:10.1002/9780470151808.sc02d02s6. (2008).
  35. Svendsen, C. N., et al. Long-term survival of human central nervous system progenitor cells transplanted into a rat model of Parkinson's disease. Experimental neurology. 148, 135-146 (1997).
  36. Draper, J. S., et al. Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells. Nature. 22, 53-54 (2004).
  37. Buzzard, J. J., Gough, N. M., Crook, J. M., Colman, A. Karyotype of human ES cells during extended culture. Nature biotechnology. 22, 381-382; author reply 382. 10-1038 (2004).
  38. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nature. 23, 10-1038 Forthcoming.
  39. Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. Journal of neuroscience. 85, 141-152 (1998).
  40. Baghbaderani, B. A., Mukhida, K., Hong, M., Mendez, I., Behie, L. A. A review of bioreactor protocols for human neural precursor cell expansion in preparation for clinical trials. Current stem cell research & therapy. 6, 229-254 (2011).
  41. Ebert, A. D., et al. EZ spheres: A stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs. Stem cell research. 10, 417-427 (2013).
  42. Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
  43. Consortium, H. D. iP. S. C. Induced pluripotent stem cells from patients with Huntington's disease show CAG-repeat-expansion-associated phenotypes. Cell stem cell. 11, 264-278 (2012).
  44. Gamm, D. M., Nelson, A. D., Svendsen, C. N. Human retinal progenitor cells grown as neurospheres demonstrate time-dependent changes in neuronal and glial cell fate potential. Annals of the New York Academy of Sciences. 1049-10107 (2005).
  45. Hosoyama, T., Meyer, M. G., Krakora, D., Suzuki, M. Isolation and in vitro propagation of human skeletal muscle progenitor cells from fetal muscle. Cell biology international. 37, 191-196 (2013).
  46. Sareen, D., et al. Inhibition of apoptosis blocks human motor neuron cell death in a stem cell model of spinal muscular atrophy. PloS one. 7, (2012).
  47. Chang, M. Y., Park, C. H., Lee, S. H. Embryonic cortical stem cells secrete diffusible factors to enhance their survival. Neuroreport. 14, 1191-1195 (2003).
  48. Sareen, D., et al. Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells. PloS one. 4, (2009).

Erratum

Formal Correction: Erratum: A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue
Posted by JoVE Editors on 09/01/2014. Citeable Link.

A correction was made to A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. The corresponding author was changed from:

Brandon C. Shelley

to:

Clive Svendsen

Een cGMP-toepassing Uitbreiding Methode voor Aggregaten van menselijke neurale stamcellen en stamcellen afgeleid uit pluripotente stamcellen of foetaal hersenweefsel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. J. Vis. Exp. (88), e51219, doi:10.3791/51219 (2014).More

Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. J. Vis. Exp. (88), e51219, doi:10.3791/51219 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter