Denne protokollen beskriver en ny mekanisk hakking metode som tillater utvidelse av sfæriske nevrale stamceller og progenitor-celleaggregater uten dissosiasjon til en enkelt cellesuspensjon. Opprettholde celle / celle kontakt tillater rask og stabil vekst i over 40 passasjer.
En celle utvidelse teknikk for å samle et stort antall celler fra et enkelt eksemplar for forskningseksperimenter og kliniske studier ville være til stor nytte for stamcelle samfunnet. Mange nåværende ekspansjons metoder er arbeidskrevende og kostbart, og de som involverer komplett dissosiasjon kan føre til flere stamceller og stamcelletyper å gjennomgå differensiering eller tidlig senescens. For å overvinne disse problemene, har vi utviklet en automatisert mekanisk aging fremgangsmåte referert til som "chopping" som er enkel og billig. Denne teknikken unngår kjemisk eller enzymatisk dissosiasjon til enkeltceller og i stedet gjør det mulig for den store utvidelse av suspenderte, sfæroide kulturer som opprettholder konstant celle / celle-kontakt. Den hakking metoden har først og fremst blitt brukt for fosterets hjerne-avledet nevrale stamceller eller neurospheres, og har nylig blitt publisert for bruk med nevrale stamceller hentet fra embryonale og induserte pluripotente stamceller. Prosedyren involves seeding neurospheres på en vev kultur petriskål og senere passerer en skarp, steril kniv gjennom cellene effektivt automatisere kjedelige prosessen manuelt mekanisk dissociating hver sfære. Susp celler i kultur gir et gunstig areal-til-volum-forhold; som over 500.000 celler kan dyrkes i et enkelt neurosphere på mindre enn 0,5 mm i diameter. I en T175 kolbe, kan over 50 millioner celler vokse i suspensjonskulturer sammenlignet med bare 15 millioner i heft kulturer. Viktigere, har hakking prosedyren blitt brukt i henhold til gjeldende Good Manufacturing Practice (cGMP), som tillater masse mengde produksjon av klinisk-grade celleprodukter.
Det er en lang historie med å utvide gnager nevrale stamceller i kultur som enten en monolayer 1-3 eller aggregerte neurospheres 4-7. I tillegg har humane nevrale stamceller (hNPCs) isolert fra ulike regioner i utviklingssentralnervesystemet 8-17 blitt utvidet in vitro. Disse cellene er bi-potent, i stand til å differensiere i begge astrocytter og nevroner og har vært et svært nyttig verktøy i å studere nevrale utvikling 18,19 og sykdomsmekanisme 20,21. hNPCs har også blitt transplantert inn i mange forskjellige dyremodeller av sentralnervesystemet sykdom med varierende grad av integrering, overlevelse og funksjonelle effekter 22-24.
Tradisjonelt er gnager eller humane føtale-avledet NPC utsatt for vekstfaktorer – ofte epidermal vekstfaktor (EGF) og / eller fibroblast vekstfaktor-2 (FGF-2) 25-28 – og både vedheftende 29 og tre-Dimensjonale sfæroide systemer er vanligvis passaged ved hjelp av enzymatisk dissosiasjon til en enkelt-cellesuspensjon 30-34. Standardmetoden for å utvide celler for forskning eller klinisk bruk er som en tilhenger monolayer grunnet enkel manipulasjon. Vi har imidlertid vist at aging monolayer og neurosphere hNPCs med enzymatisk eller kjemiske løsninger resulterte i tidlig senescence 35. I tillegg kan det enzymatiske dissosiasjon resultere i økte nivåer av differensiering og karyotypic abnormiteter basert på data vist med embryonale stamceller 36-38. Selv om standard metode for passering hNPCs har produsert strøm Good Manufacturing Practice (cGMP) grade produkter som har gått inn i fase 1 kliniske studier (Stem Cells Inc., Neuralstem Inc.), metoden kun tillatt et par runder celle forsterkning, noe som begrenser banktjenester potensial.
Åpenbart, kan store forskningseksperimenter og fremtidige kliniske studier dra nytte av muligheten tilforplante celler i bulk og med forsinket senescence å tillate store vekst og cellebanken. For å møte dette behovet, har vi utviklet en ny og automatisert måte mekanisk aging intakte neurospheres med "hakking" dem i små klynger for å opprettholde celle-til-celle kontakt. Denne metoden i stor grad økt deres levetid 39 og suspensjonskultur muliggjør en mer effektiv bruk av inkubator plass i forhold til monolagskulturer, som vist med en alternativ 3D bioreaktor kulturmetode 40.. Den medfølgende hakking protokollen åpner for produksjon av store banker fra en fosterprøve større enn passasje 10, en usannsynlig prestasjon ved hjelp av standard aging metoder. Selv om denne metoden for passering hNPCs er ukonvensjonell, er det vokser i popularitet og ble nylig publisert med andre celletyper som nevrale stamceller hentet fra humane embryonale og induserte pluripotente stamceller, slik at storskala ekspansjon for ulike bruksområder, inkludert i vitro sykdom modellering 41-46. Viktigere, har en cGMP-grade hNPC cellen bank allerede produsert med hogges metoden, viser at teknikken kan brukes mot fremtidige kliniske applikasjoner.
Figur 6. Skjære Skjematisk. Utvide spheroid stilk / stamceller i kultur ved hjelp av den mekaniske hakking metoden.
Kritiske Steps
En oversikt over hogges utvidelse paradigmet er vist i figur 6. HNPC sfære størrelse er en av de viktigste kriteriene for å observere før passerin…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Soshana Svendsen for kritisk gjennomgang og redigering av denne rapporten. Dette arbeidet ble bidratt til av NIH / ninds 1U24NS078370-01 og CIRM DR2A-05320.
Beaker, 50 mL | Fisherbrand | FB-100-50 | multiple manufacturers/suppliers |
Bio-Safety Cabinet, class II | Baker | SG-603A | 4 ft. or 6 ft. model. 6 ft. model recommended; multiple manufacturers/suppliers |
Blades, Double-edge Prep | Personna | 74-0002 | multiple manufacturers/suppliers. CAUTION: Sharp |
Cell Freezing Media | Sigma-Aldrich | C6295-50ML | DMSO, serum-free |
Centrifuge, swing-bucket with 15 mL inserts | Eppendorf | 5810 R | multiple manufacturers/suppliers |
Conical Tubes, 15 mL | Fisherbrand | S50712 | multiple manufacturers/suppliers |
Conical Tubes, 50 mL | BD Falcon | 352074 | multiple manufacturers/suppliers |
Controlled Rate Freezer | Planer | Kryo 750 | multiple manufacturers/suppliers |
Cryovials, 2 mL | Corning | 430488 | multiple manufacturers/suppliers |
Culture Flask, Vented, T12.5 | BD Falcon | 353107 | multiple manufacturers/suppliers |
Culture Flask, Vented, T25 | BD Falcon | 353081 | multiple manufacturers/suppliers |
Culture Flask, Vented, T175 | BD Falcon | 353045 | multiple manufacturers/suppliers |
Culture Flask, Vented, T75 | BD Falcon | 353110 | multiple manufacturers/suppliers |
Filter, 0.22 µm, attached cup, 1 L | Millipore | SCGPU11RE | multiple manufacturers/suppliers |
Filter, 0.22 µm, attached cup, 150 mL | Millipore | SCGVU01RE | multiple manufacturers/suppliers |
Filter, 0.22 µm, attached cup, 500 mL | Millipore | SCGPU05RE | multiple manufacturers/suppliers |
Filter, 0.22 µm, attached cup, 50 mL | Millipore | SCGP00525 | multiple manufacturers/suppliers |
Filter Paper, 8.5 cm circles | Whatman/GE | 1001-085 | |
Forceps, Standard Pattern – Serrated/Curved/18 cm | Fine Science Tools | 11001-18 | |
Freezing Chamber, Isopropyl Alcohol | Nalgene | 5100-0001 | "Mr. Frosty" |
Incubator, 37°C/5% CO2 | Forma | 370 series | multiple manufacturers/suppliers |
Hemacytometer, Phase | Hausser Scientific | 1475 | multiple manufacturers/suppliers |
McIlwain Tissue Chopper | Lafayette Instruments | TC752-PD | Petri dish modification required. CAUTION: Moving, sharp blade. |
Micropipettor, 1 – 10 μL | Gilson | F144562 | multiple manufacturers/suppliers |
Micropipettor, 100 – 1000 μL (starter kit) | Gilson | F167700 | multiple manufacturers/suppliers |
Micropipettor, 2 – 20 μL (starter kit) | Gilson | F167700 | multiple manufacturers/suppliers |
Micropipettor, 20 – 200 μL (starter kit) | Gilson | F167700 | multiple manufacturers/suppliers |
Nutdriver, Autoclavable, 5/16" | Steritool | 10302 | |
Pasteur Pipets, cotton-plugged | Fisherbrand | 13-678-8B | multiple manufacturers/suppliers |
Petri Dish, Glass, Autoclavable | Corning | 3160-100 | |
Pipet Aid | Drummond | 4-000-101 | multiple manufacturers/suppliers |
Shim disc | McMaster-Carr | VARIABLE | multiple manufacturers/suppliers |
Sterile barrier pipet tips, 10 μL | AvantGuard | AV10R-H | multiple manufacturers/suppliers |
Sterile barrier pipet tips, 1000 μL | AvantGuard | AV1000 | multiple manufacturers/suppliers |
Sterile barrier pipet tips, 20 μL | AvantGuard | AV20-H | multiple manufacturers/suppliers |
Sterile barrier pipet tips, 200 μL | AvantGuard | AV200-H | multiple manufacturers/suppliers |
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 10 mL | Fisherbrand | 13-676-10J | multiple manufacturers/suppliers |
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 2 mL | Fisherbrand | 13-675-3C | multiple manufacturers/suppliers |
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 25 mL | Fisherbrand | 13-676-10K | multiple manufacturers/suppliers |
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 5 mL | Fisherbrand | 13-676-10H | multiple manufacturers/suppliers |
Sterilization Pouches, 19 x 33 cm | Crosstex | SCL | multiple manufacturers/suppliers |
Strainer, 40 µm | BD Falcon | 352340 | |
Tissue Culture Dishes, 60 mm | BD Falcon | 351007 | |
Tube Racks, Interlocking Four-Way | Fisherbrand | 03-448-17 | |
Water Bath | Fisherbrand | S52602Q | multiple manufacturers/suppliers |
Neural Progenitor Cell-Specific Processing Reagents | |||
Neural Stem Cell Expansion Medium (Stemline) | Sigma-Aldrich | S3194-500ML | Important to use the Stemline brand |
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Millipore | GF316 | multiple manufacturers/suppliers |
Recombinant Human Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | Millipore | LIF1010 | multiple manufacturers/suppliers |
Trypan Blue (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | multiple manufacturers/suppliers |
TrypLE Select (1X) | Life Technologies | 12563-011 |