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Neuroscience

मानव तंत्रिका के समुच्चय के लिए एक cGMP-लागू विस्तार विधि स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं pluripotent स्टेम सेल या भ्रूण के मस्तिष्क के ऊतकों से निकाली

doi: 10.3791/51219 Published: June 15, 2014

ERRATUM NOTICE

Summary

इस प्रोटोकॉल एक एकल कक्ष निलंबन को हदबंदी के बिना गोलाकार तंत्रिका स्टेम और पूर्वपुस्र्ष सेल समुच्चय के विस्तार की अनुमति देता है कि एक उपन्यास यांत्रिक काट विधि का वर्णन करता है. सेल / सेल से संपर्क बनाए रखने पर 40 अंश के लिए तेजी से और स्थिर विकास की अनुमति देता है.

Abstract

अनुसंधान प्रयोगों और नैदानिक ​​परीक्षणों के लिए एक भी नमूना से कोशिकाओं की संख्या में एकत्र करने के लिए एक सेल विस्तार तकनीक बहुत स्टेम सेल समुदाय को लाभ होगा. कई मौजूदा विस्तार तरीकों श्रमसाध्य और महंगी हैं, और पूरा हदबंदी शामिल उन कई स्टेम और पूर्वपुस्र्ष सेल प्रकार के भेदभाव या जल्दी बुढ़ापा गुजरना करने के लिए कारण हो सकता है. इन समस्याओं को दूर करने के लिए, हम साधारण और कम खर्चीली है कि "काट" के रूप में संदर्भित एक स्वचालित यांत्रिक passaging विधि विकसित की है. इस तकनीक एकल कक्षों में रासायनिक या एंजाइमी हदबंदी से बचा जाता है और बजाय लगातार सेल / सेल से संपर्क बनाए रखने कि निलंबित, उपगोल संस्कृतियों का बड़े पैमाने पर विस्तार के लिए अनुमति देता है. काट विधि में मुख्य रूप से भ्रूण के मस्तिष्क व्युत्पन्न तंत्रिका कोशिकाओं पूर्वज या neurospheres के लिए इस्तेमाल किया गया है, और हाल ही में भ्रूण और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल से प्राप्त तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के साथ प्रयोग के लिए प्रकाशित किया गया है. प्रक्रिया involvतों एक टिशू कल्चर पेट्री डिश पर neurospheres बोने और बाद में प्रभावी ढंग से मैन्युअल रूप यंत्रवत् प्रत्येक क्षेत्र अलग कर की थकाऊ प्रक्रिया को स्वचालित कोशिकाओं के माध्यम से एक तेज, बाँझ ब्लेड गुजर रहा है. संस्कृति में कोशिकाओं निलंबित एक अनुकूल सतह क्षेत्र करने वाली मात्रा अनुपात प्रदान करता है; 500,000 से अधिक कोशिकाओं व्यास में कम से कम 0.5 मिमी की एक एकल neurosphere भीतर उगाया जा सकता है. एक T175 फ्लास्क में, 50 लाख से अधिक कोशिकाओं केवल 15 लाख अनुयायी संस्कृतियों में की तुलना में निलंबन संस्कृतियों में विकसित कर सकते हैं. महत्वपूर्ण बात है, काट प्रक्रिया नैदानिक ​​ग्रेड सेल के उत्पादों की व्यापक मात्रा में उत्पादन की अनुमति, वर्तमान अच्छा विनिर्माण प्रैक्टिस (cGMP) के तहत इस्तेमाल किया गया है.

Introduction

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एक monolayer 1-3 या कुल neurospheres 4-7 या तो के रूप में संस्कृति में कृंतक तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के विस्तार का एक लंबा इतिहास है. इसके अलावा, विकासशील केंद्रीय तंत्रिका तंत्र 8-17 के विभिन्न क्षेत्रों से अलग मानव तंत्रिका कोशिकाओं पूर्वज (hNPCs) इन विट्रो में विस्तारित किया गया है. इन कोशिकाओं को द्वि शक्तिशाली, astrocytes और न्यूरॉन्स दोनों में फर्क करने में सक्षम हैं और तंत्रिका विकास 18,19 और रोग तंत्र 20,21 का अध्ययन करने में एक बहुत ही उपयोगी उपकरण किया गया है. hNPCs भी एकीकरण, अस्तित्व और कार्यात्मक प्रभाव 22-24 के स्तर पर अलग से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र रोग के कई अलग अलग पशु मॉडल में प्रत्यारोपित किया गया है.

अक्सर epidermal वृद्धि कारक (EGF) और / या fibroblast वृद्धि कारक -2 (FGF-2) 25-28 - है - और पक्षपाती 29 और तीन दोनों परंपरागत रूप से, कृंतक या मानव भ्रूण व्युत्पन्न NPCs वृद्धि कारकों के संपर्क में हैंआयामी उपगोल सिस्टम आम तौर पर एक एकल कक्ष निलंबन 30-34 में enzymatic पृथक्करण का उपयोग passaged हैं. शोध या नैदानिक ​​इस्तेमाल के लिए कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए मानक विधि आसान हेरफेर के कारण एक पक्षपाती monolayer के रूप में है. हालांकि, हम enzymatic या रासायनिक समाधान के साथ passaging monolayer और neurosphere hNPCs जल्दी बुढ़ापा 35 में हुई दिखाई है. इसके अलावा, enzymatic पृथक्करण भ्रूण स्टेम कोशिकाओं को 36-38 के साथ प्रदर्शन डेटा के आधार पर भेदभाव और karyotypic असामान्यताओं के स्तर में वृद्धि हो सकती है. Passaging hNPCs की मानक पद्धति वर्तमान अच्छा विनिर्माण अभ्यास चरण में 1 नैदानिक ​​परीक्षणों (कोशिकाओं इंक, Neuralstem इंक स्टेम) चले गए हैं (cGMP) ग्रेड के उत्पादों का उत्पादन किया गया है, विधि सीमित सेल प्रवर्धन की केवल कुछ राउंड की अनुमति संभावित बैंकिंग.

जाहिर है, बड़े शोध प्रयोगों और भविष्य क्लिनिकल परीक्षण करने की क्षमता से फायदा हो सकता हैबड़े पैमाने पर विकास और सेल बैंकिंग की अनुमति के लिए थोक में और देरी वार्धक्य के साथ कोशिकाओं प्रचार. इस जरूरत को संबोधित करने के लिए, हम सेल करने वाली सेल से संपर्क बनाए रखने के लिए छोटे समूहों में उन्हें "काट" द्वारा एक उपन्यास और यंत्रवत् passaging बरकरार neurospheres की स्वचालित तरीका विकसित किया. यह विधि बहुत एक वैकल्पिक 3D बायोरिएक्टर संस्कृति विधि 40 के साथ देखा के रूप में उनके जीवन काल 39 और निलंबन संस्कृति, monolayer संस्कृतियों की तुलना में इनक्यूबेटर अंतरिक्ष के एक अधिक कुशल उपयोग की अनुमति की वृद्धि हुई. प्रदान की काट प्रोटोकॉल पारित होने के 10, मानक passaging तरीकों का उपयोग कर एक अप्रत्याशित करतब से अधिक एक भ्रूण के नमूने से बड़े पैमाने पर बैंकों के उत्पादन के लिए अनुमति देता है. Passaging hNPCs के लिए इस विधि अपरंपरागत है, यह लोकप्रियता में बढ़ रहा है और हाल ही में, इस तरह के मानव भ्रूण और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल से प्राप्त तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के रूप में अन्य प्रकार की कोशिकाओं, वी में सहित विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए बड़े पैमाने पर विस्तार सक्रिय करने के साथ प्रकाशित किया गया थाitro रोग मॉडलिंग 41-46. महत्वपूर्ण बात है, एक cGMP ग्रेड hNPC सेल बैंक पहले से ही तकनीक भविष्य नैदानिक ​​अनुप्रयोगों की दिशा में लागू किया जा सकता है कि प्रदर्शन, काट विधि के साथ उत्पादन किया गया है.

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Protocol

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1. एथिकल वक्तव्य और सुरक्षा

  1. यह प्रक्रिया मनुष्य या पशुओं से व्युत्पन्न सेल संस्कृति उत्पादों का इस्तेमाल शामिल है. सभी व्युत्पन्न ऊतकों उपयुक्त संस्थागत समीक्षा बोर्ड (एस) और / या संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (एस) द्वारा उपयोग करने से पहले अनुमोदित किया जाना चाहिए.
  2. सभी जैव खतरनाक अपशिष्ट संबंधित संस्था द्वारा पर निर्णय लिया सुरक्षा नियमों के अनुसार से निपटाया जाना चाहिए. पता है और इस प्रक्रिया के दौरान उचित सुरक्षा और निपटान दिशानिर्देशों का अनुपालन करें.

उपकरण के 2. तैयार करना, आपूर्ति, अभिकर्मकों, और प्रेक्षणों

  1. तैयारी
    1. एक गिलास पेट्री डिश, 8.5 सेमी फिल्टर पेपर हलकों और डबल बढ़त प्रस्तुत करने का ब्लेड प्राप्त करते हैं.
    2. पेट्री डिश में फिल्टर कागज का एक टुकड़ा प्लेस और पेट्री डिश में फिल्टर पेपर पर कई unsheathed ब्लेड हस्तांतरण.
    3. पेट्री डिश बार बार जब तक परत फिल्टर पेपर और ब्लेड लगभग 75% पूर्ण है, कवर बुद्धिज पेट्री डिश ढक्कन और आटोक्लेव. बाँझपन बनाए रखने के लिए एक बाँझ या संलग्न वातावरण में स्टोर.
    4. आटोक्लेव 18 सेमी संदंश और एक नसबंदी थैली में एक autoclavable अखरोट के चालक. CGMP उत्पादन के लिए, बंध्याकरण पाउच में कई स्टेनलेस स्टील शिम डिस्क आटोक्लेव. शिम डिस्क के बारे में अधिक जानकारी के लिए, 3.5 कदम देखें.
    5. 70% isopropyl शराब (आईपीए) के साथ जैव सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) sanitize.
    6. सभी प्रक्रियाओं बाँझपन बनाए रखने के लिए एक बीएससी में प्रदर्शन किया जाना चाहिए. Aseptically बीएससी में निम्नलिखित स्थानांतरण:
      1. McIlwain ऊतक हेलिकॉप्टर (हेलिकॉप्टर). 70% आईपीए, विशेष रूप से हेलिकॉप्टर हाथ (चित्रा 1 बी) के साथ सभी सतहों के नीचे साफ कर लें. पूरे हेलिकॉप्टर यदि आवश्यक ethylene ऑक्साइड का उपयोग decontaminated जा सकता है.
      2. एक autoclaved अखरोट के ड्राइवर या अखरोट रिंच (हेलिकॉप्टर, चित्रा 1 मैं साथ शामिल है), एक 18 सेमी संदंश, मानक आकार micropipettors (20 μl-1, 000 μl), एक pipetaid और ट्यूब रैक का एक सेट.
      3. बाँझ डिस्पोजेबल सीरम वैज्ञानिक pipettes, बाधा pipet सुझावों, 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों, 60 मिमी पेट्री डिश, डबल बढ़त प्रस्तुत करने का ब्लेड और उचित आकार टी बोतल. चेतावनी: केवल एक संदंश के साथ तेज ब्लेड संभाल.
  2. अभिकर्मकों
    1. 100 10 एनजी / एमएल एनजी / एमएल और लेकिमिया निरोधात्मक कारक (lif) में सेल विस्तार मध्यम, EGF स्टेम तंत्रिका से मिलकर रखरखाव मीडिया (एम एम) में hNPCs का विस्तार करें. बीएससी में मीडिया को तैयार करने के लिए आवश्यक अभिकर्मकों और निस्पंदन डिवाइस (ओं) स्थानांतरण.
    2. तंत्रिका कोशिका विस्तार मध्यम स्टेम और अप करने के लिए 1 वर्ष के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने के लिए 100 माइक्रोग्राम / एमएल aliquots तैयार उपयोग कर lyophilized EGF फिर से निलंबित. अप करने के लिए 6 महीने या निर्माता द्वारा दिए गए समय समाप्ति तिथि के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर खरीदा रूप LIF संग्रहीत किया जाता है.
    3. बीएससी में एम एम अभिकर्मकों स्थानांतरण. एक निर्वात उपकरण का उपयोग कर एक उचित आकार निस्पंदन डिवाइस और फिल्टर में सभी अभिकर्मकों मिश्रण. अप करने के लिए 3 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
    4. hNPC टिप्पणियों
      1. काट से पहले पता करने के लिए दो सबसे महत्वपूर्ण कारक क्षेत्र व्यास और मीडिया कंडीशनिंग या रंग है. वातानुकूलित मीडिया (मुख्यमंत्री) इनक्यूबेटर शर्तों (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 95% आर्द्रता) के तहत संस्कृति में hNPCs द्वारा metabolized किया गया है कि माध्यम के रूप में परिभाषित किया गया है. कोशिकाओं मीडिया metabolize के रूप में फिनोल लाल घटक एक अधिक अम्लीय वातावरण (चित्रा 5D) वाचक पीले रंग के लिए एक गुलाबी से बदलाव होगा.
      2. (विवरण के लिए चर्चा देखें) मीडिया रंग संबोधित करने के लिए प्रकाश के लिए ऊपर hNPCs की कुप्पी (ओं) पकड़ो.
      3. कोशिकाओं का पालन करने के लिए एक खुर्दबीन के साथ कुप्पी के माध्यम से स्कैन करें. क्षेत्र आकार की जांच के लिए एक लजीला व्यक्ति का प्रयोग करें. कई क्षेत्रों में 300 मीटर या अधिक की एक व्यास है, तो काट प्रक्रिया के साथ आगे बढ़ना. हर 7-10 दिनों कोशिकाओं जल्द.
      4. एक काट warranted नहीं है, ताजा मीडिया हर 3-4 दिनों कोशिकाओं मीडिया metabolizing कर रहे हैं कि कैसे जल्दी पर निर्भर करता है के साथ मुख्यमंत्री के आदान प्रदान के 25-75%. चोरक्षेत्रों के पारित होने के लिए काफी बड़े हैं जब तक मीडिया का आदान प्रदान करने tinue.
      5. hNPCs आम तौर पर छोटे बोतल से बड़ा बोतल के लिए, 1:2 के अनुपात में काट रहे हैं. कुप्पी आकार और मात्रा की सिफारिशों के लिए एक संदर्भ गाइड के रूप में 1 टेबल का प्रयोग करें.
    2 T175s
    कुप्पी कुल मीडिया की मात्रा पूर्व जल्द पोस्ट जल्द
    1 T12.5 5 मिलीलीटर 1 T12.5 1 T25
    1 T25 10 मिलीलीटर 1 T25 1 T75
    1 T75 20 मिलीलीटर 1 T75 1 T175
    1 T175 40 मिलीलीटर 1 T175 2 T175s
    80 मिलीलीटर 2 T175s * 4 T175s
    * 2 T175s एक समय में कटा हुआ जा सकता है कि बोतल की अधिकतम संख्या है. 2 T175s के सेट में जल्द और चरण 7 को देखें.

    तालिका 1. HNPC विस्तार प्रतिमान. HNPCs के लिए एक विशिष्ट विस्तार योजना का विवरण. यह हर 7-10 दिनों volumetrically दो गुना विस्तार करने के लिए मानक है.

    3. हेलिकॉप्टर सेटअप

    चित्रा 1
    चित्रा 1. McIlwain ऊतक हेलिकॉप्टर. ए)) पेट्री डिश, विकास के लिए थाली धारक पर हुक मोटाई समायोजन सुक्ष्ममापी, बी) हेलिकॉप्टर हाथ का आधार है और संलग्न हाथ, सी) जल्द टेबल रिहाई दस्ता और ट्रेहेलिकॉप्टर, जे) ब्लेड / अकवार अखरोट, कश्मीर) ब्लेड लगाना, एल के साथ शामिल, ई) ब्लेड बल नियंत्रण घुंडी, एफ) स्विच रीसेट, जी) प्लेट धारक, ब्लेड, आलिंगन और अखरोट के लिए एच) बोल्ट लगाव, मैं) अखरोट रिंच ) स्वचालित काट गति नियंत्रण घुंडी, एम) मैनुअल काट हाथ परिचालन दस्ता, एन) पावर स्विच.

    1. बीएससी में एक दुकान में हेलिकॉप्टर प्लग और सत्ता परिवर्तन (चित्रा 1N) पर बारी. 200 माइक्रोन (चित्रा 1 ए) को काट दूरी निर्धारित करें. घुंडी एक घड़ी (चित्रा 1E) था अगर 270 डिग्री या 9:00 ब्लेड बल सेट करें. स्वत: गति दस्ता के रूप में दूर वामावर्त संभव के रूप में घुमाया जा रहा है कि पुष्टि करें. (चित्रा 1L).
    2. सही तरीके से करने के लिए सभी तालिका रिहाई हटो थाली धारक (चित्रा -1) स्थिर है की पुष्टि करें.
    3. मनु घुमाएँअल हाथ जोड़तोड़ अपने अधिकतम स्तर (चित्रा 1M) के लिए हाथ बढ़ाने के लिए दक्षिणावर्त. पुस्तिका हाथ जोड़तोड़ ही घुमाया दक्षिणावर्त होना चाहिए.
    4. Aseptically संदंश की एक जोड़ी (चित्रा 1H) का उपयोग हेलिकॉप्टर हाथ बोल्ट पर एक बाँझ, दोधारी काट ब्लेड हस्तांतरण.
    5. अकेले पेट्री डिश शोध ग्रेड के प्रसंस्करण के लिए पर्याप्त है, के रूप में केवल cGMP passaging के लिए इस चरण को पूरा. कदम 2.1.4 में वर्णित है, पेट्री डिश बेस के अंदर रखा शिम डिस्क cGMP के लिए आवश्यक हैं. शिम डिस्क काट प्रक्रिया के दौरान क्षेत्रों में शामिल करने से प्लास्टिक shards से बचाता है. प्रत्येक योजना बनाई काट के लिए, प्रत्येक पेट्री डिश और कवर के आधार में एक परत डिस्क हस्तांतरण.
    6. Aseptically संदंश का उपयोग ब्लेड से अधिक अकवार (चित्रा 1K) रखें. आलिंगन की घुमावदार भाग बांह के ऊपरी किनारे से अधिक होना चाहिए. अखरोट सुरक्षित रूप से गढ़ी गई है जब तक पकड़ बांह पर नहीं रहेगी. Clas पकड़ संदंश का प्रयोग करेंपी बांह पर और बाँझ अखरोट के ड्राइवर के साथ बोल्ट पर अखरोट (चित्रा 1J) सुरक्षित. ढीला बारी ¼ अखरोट एक छोड़ दें.

    4. पूर्व काट प्रक्रिया

    1. तालिका 2, स्तंभ C के अनुसार नई कुप्पी (ओं) में एम.एम. का सुझाव दिया मात्रा स्थानांतरण.
    2. Aseptically बीएससी में इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को हस्तांतरण. एक ट्यूब रैक (2A चित्रा) पर कुप्पी (ओं) झुक और क्षेत्रों कुप्पी (ओं) में व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं.
    3. एक बार बसे, एक 5 मिलीलीटर या 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला के 12 एमएल के लिए ऊपर aspirate और कुप्पी (ओं) की सतह से सब शिथिल पक्षपाती क्षेत्रों कुल्ला. आवश्यक के रूप में दोहराएँ और rinses के बीच क्षेत्रों बसा.
    4. दो या दो से अधिक T175 बोतल passaging हैं,. तालिका 2, स्तंभ D के अनुसार नई कुप्पी (ओं) में सीएम का सुझाव दिया मात्रा स्थानांतरण कदम 7.1 देखें.
    5. एक नया 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में शेष सभी मुख्यमंत्री और क्षेत्रों स्थानांतरण. क्षेत्रों के लिए एसई अनुमति देंttle और खेतों में कुप्पी (ओं) को त्यागें.
    6. महत्वपूर्ण कदम: धीरे धीरे 60 मिमी पेट्री डिश या सबसे कम संभव मात्रा में शिम डिस्क पर 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब से क्षेत्रों हस्तांतरण; 0.1-0.5 मिलीग्राम (चित्रा 2 बी) की सिफारिश की है. यह पकवान पद जल्द से कोशिकाओं कुल्ला करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा के रूप में मुख्यमंत्री की शेष मात्रा रखें. पकवान (चित्रा -2) पर मीडिया और क्षेत्रों द्वारा कवर सतह क्षेत्र को कम करने की कोशिश करें.

    चित्रा 2
    चित्रा 2.) कुप्पी. बी के कोने में क्षेत्रों बसा पेट्री को शंक्वाकार ट्यूब से घनी यथासंभव क्षेत्रों स्थानांतरण करने के लिए एक ट्यूब रैक या इसी तरह के आइटम के खिलाफ कुप्पी (ओं) झुक. ए) काट के लिए क्षेत्र तैयारी पकवान. सी) टी में शंक्वाकार ट्यूब से क्षेत्रों पूलवह पेट्री डिश. डी के बीच) जमा क्षेत्रों के ऊपर से जितना संभव हो पर तैरनेवाला निकालें. ई)) एक प्लास्टिक micropipettor टिप. एफ की ओर का उपयोग कर बाहर क्षेत्रों बिखरा धीरे पूल के एक तरफ करने के लिए क्षेत्रों के लिए कदम . मीडिया हटाने की सुविधा के लिए पूल के एक तरफ करने के लिए स्थानांतरित कर दिया गया है कि क्षेत्रों के जी) उदाहरण. एच) संघनित क्षेत्रों काट के लिए तैयार पेट्री डिश, पर बाहर फैल गया. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    1. अगला, क्षेत्रों कदम 4.6 में स्थानांतरित सतह पर तैरनेवाला हटाने से संघनित होने की जरूरत है. एक एयरोसोल बाधा इत्तला दे दी micropipettor (चित्रा 2 डी) के साथ वापस 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण, क्षेत्रों के हटाने से बचें. मीडिया / सेल पूल के ऊपर से जितना संभव हो उतना मीडिया को हटाने के द्वारा शुरू करो. यह संभव नहीं है जबक्षेत्रों के बिना मीडिया को दूर करने के लिए, निम्नलिखित कदम के लिए आगे बढ़ें.
    <टीडी> 0 मिलीलीटर
    स्तंभ A कॉलम बी स्तंभ C स्तंभ D कॉलम E स्तंभ F
    पूर्व जल्द फ्लास्क आकार पोस्ट जल्द फ्लास्क (ओं) का आकार नई कुप्पी (ओं) पूर्व काट करने के लिए स्थानांतरित करने के लिए एमएम का सुझाव मात्रा नई कुप्पी (ओं) पूर्व काट करने के लिए स्थानांतरित करने के लिए मुख्यमंत्री का सुझाव मात्रा नई कुप्पी (ओं) के बाद काट में स्थानांतरित करने के लिए क्षेत्रों / मीडिया का सुझाव मात्रा अंतिम मात्रा वरीयता प्राप्त / फ्लास्क
    T12.5 T25 5 मिलीलीटर 0 मिलीलीटर 5 मिलीलीटर 10 मिलीलीटर
    T25 T75 10 मिलीलीटर 10 मिलीलीटर 20 मिलीलीटर
    T75 T175 20 मिलीलीटर 10 मिलीलीटर 10 मिलीलीटर 40 मिलीलीटर
    1 T175 2 T175s फ्लास्क प्रति 20 मिलीलीटर फ्लास्क प्रति 15 मिलीलीटर फ्लास्क प्रति 5 एमएल 40 मिलीलीटर
    2 T75s 4 T175s फ्लास्क प्रति 20 मिलीलीटर फ्लास्क प्रति 17.5 मिलीलीटर फ्लास्क प्रति 2.5 मिलीग्राम 40 मिलीलीटर

    तालिका 2. मीडिया स्थानांतरण पुस्तिका पूर्व / पोस्ट जल्द. सुझाव संस्करणों काट प्रक्रिया के दौरान उपयोग करने के लिए.

    1. सतह क्षेत्र (चित्रा 2 ई) को बढ़ाने के लिए pipet टिप की ओर का उपयोग कर बाहर पूल बिखरा हुआ है.
    2. महत्वपूर्ण कदम: आप के प्रति थोड़ा पेट्री डिश युक्ति और धीरे SL pipet टिप की ओर का उपयोगपूल (चित्रा 2 एफ, जी) के एक तरफ करने के लिए क्षेत्रों की सभी आईडीई.
    3. महत्वपूर्ण कदम: सभी कक्षों को स्थानांतरित किया गया है जब, धीरे धीरे पेट्री डिश विपरीत दिशा टिप. प्रक्रिया के दौरान, अकेले मीडिया को दूर क्षेत्रों से बहेगा. वापस 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में मीडिया स्थानांतरण. मिनिमल क्षेत्र हटाने स्वीकार्य है.
    4. धीरे इतना पूल 0.5-2.4 सेमी (चित्रा 2H) की एक व्यास है वापस पेट्री डिश के केंद्र के क्षेत्रों के सभी स्लाइड करने pipet टिप की ओर का प्रयोग करें. आईटी क्षेत्र पूल उथले की गहराई रखने के लिए महत्वपूर्ण है. पूल भी गहरा है, क्षेत्रों बस काट दौरान तरफ धकेल दिया जाएगा. नोट: क्षेत्र पूल के व्यास से अधिक 2.5 सेमी नहीं किया जा सकता या ब्लेड कोशिकाओं लापता, पेट्री डिश के किनारों से संपर्क करेंगे.

    5. जल्द प्रक्रिया

    1. थाली धारक (चित्रा 1G) पर पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण और पकवान सुनिश्चितथाली धारक हुक (चित्रा 1C) के तहत सुरक्षित है.
    2. तालिका रिहाई घुंडी यह गियर में फिट होगा जहां डिग्री अधिक है. इसलिए ब्लेड क्षेत्रों की स्पष्ट है और गियर (चित्रा -1) में बंद बाईं ओर प्लेट धारक स्लाइड करने के लिए तालिका रिहाई घुंडी का प्रयोग करें.
    3. महत्वपूर्ण कदम: ब्लेड पेट्री डिश पर फ्लैट नीचे तस्वीरें जब तक दक्षिणावर्त पुस्तिका जोड़तोड़ दस्ता (चित्रा 1M) घूर्णन द्वारा हेलिकॉप्टर हाथ कम करें. Nutdriver साथ नट कस जबकि हाथ माउंट (चित्रा 1 बी) पर नीचे प्रेस करने के लिए एक हाथ का प्रयोग करें.
    4. (चित्रा 1F) एक बार रीसेट बटन पुश. घुंडी एक घड़ी थी अगर 90 ° स्थिति या 12:00 स्वत: हाथ जोड़तोड़ दस्ता (चित्रा 1L) दक्षिणावर्त मोड़ जबकि एक हाथ से पेट्री डिश स्थिर. चेतावनी: दूर हर समय आगे बढ़ ब्लेड से उंगलियों रखें.
    5. क्षेत्रों के पूल के माध्यम से पूरी तरह से ब्लेड से गुजरती हैं. थाली धारक घुमाएँ90 °.
    6. बोल्ट ढीला और कदम 5.3-5.5 दोहराएँ.
    7. Aseptically बीएससी में एक काम की जगह पर थाली धारक से पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण.

    6. पोस्ट जल्द प्रक्रिया

    1. प्रधानमंत्री तो एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक कदम 4.6 से शंक्वाकार ट्यूब में मुख्यमंत्री के साथ विंदुक और कटा क्षेत्रों पर 1 मिलीलीटर हस्तांतरण. धीरे फिर से निलंबित और एक नया 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में हस्तांतरण. बुलबुले से बचें और कटा क्षेत्रों इकट्ठा करने के लिए आवश्यक के रूप में कई बार दोहराएँ.
      सुझाव: प्लास्टिक के टुकड़े लिफ्ट बंद हो सकता है के रूप में पकवान scraping न्यूनतम. यह स्टेनलेस स्टील शिम डिस्क का उपयोग कर यदि एक चिंता का विषय नहीं है. प्लास्टिक सीरम वैज्ञानिक विंदुक के अंदर करने के लिए संलग्न कोशिकाओं से सावधान रहें. यदि ऐसा होता है, महाप्राण बुलबुले रहकर पिपेट में मीडिया के माध्यम से कोशिकाओं को अलग करने के लिए.
    2. मुख्यमंत्री की मात्रा और कटा क्षेत्रों उपाय. 2 तालिका में सूचीबद्ध मात्रा कॉलम ई प्राप्त करने के लिए एम एम की उचित मात्रा में जोड़ें.
    3. Triturateकिसी भी शिथिल जुड़े हुए क्षेत्रों को तोड़ने के लिए 2-3X क्षेत्रों है.
    4. महत्वपूर्ण कदम: प्रत्येक नई कुप्पी में क्षेत्र निलंबन विभाज्य. केवल एक बार में एक कुप्पी में क्षेत्र निलंबन हस्तांतरण, और तबादलों के बीच क्षेत्रों फिर से निलंबित. एक समय में एक से अधिक बोतल aliquoting प्रत्येक कुप्पी में क्षेत्रों की आय से अधिक संख्या में यह परिणाम है. प्रत्येक फ्लास्क में अंतिम मात्रा तालिका 2, स्तंभ एफ में मात्रा के बराबर होना चाहिए. अधिक से अधिक से अधिक दो T175 बोतल बोने जब ​​कदम 7.2 देखें.
    5. अखरोट के ड्राइवर और बाँझ संदंश के साथ फिर अकवार के साथ अखरोट निकालें. 70% आइपीए या समकक्ष के साथ उचित रूप से शुद्ध करना. चेतावनी: केवल एक संदंश के साथ प्रयोग किया जाता काट ब्लेड निकालें और एक जैव खतरा sharps कंटेनर में त्यागें.
    6. 70% आईपीए के साथ हेलिकॉप्टर की सभी सतहों शुद्ध करना.

    7. प्रक्रिया परिवर्तनों - एकाधिक बोतल

    दो से अधिक T175s passaging जब कई मतभेद हैं. कदमनीचे है संदर्भित कदम का परिवर्तन कर रहे हैं.

    1. 4.4 कदम के सन्दर्भ:
      1. दो T175s passaging है, एक T175 बोतल में मीडिया और क्षेत्रों के सभी गठबंधन. तालिका 2 में कहा गया है क्षेत्रों नई बोतल में से प्रत्येक में मुख्यमंत्री की उचित मात्रा व्यवस्थित करने और फिर विभाज्य करने की अनुमति दें, कॉलम डी. 4.5 कदम के लिए आगे बढ़ें.
      2. अधिक से अधिक से अधिक दो T175s passaging, जब मुख्यमंत्री कुप्पी के रूप में एक नया T175 कुप्पी और लेबल प्राप्त करते हैं. पूर्ण कदम 7.1.1 लेकिन मुख्यमंत्री कुप्पी में मुख्यमंत्री हस्तांतरण. सभी बोतल कटा कर दिया गया है जब तक सभी बोतल से मुख्यमंत्री को इकट्ठा करने के लिए प्रयोग की जाने वाली बीएससी की तरफ कुप्पी स्टोर. तब मुख्यमंत्री समान रूप से नई बोतल में से प्रत्येक में aliquoted किया जाएगा.
    2. संदर्भ कदम 6.4 - एक ही सेल लाइन को कई बार काट रही हैं, तो एक नया T75 फ्लास्क लेबल क्षेत्रों के बाद काट में कटा क्षेत्र निलंबन हस्तांतरण और तबादला मात्रा रिकॉर्ड. इस में कोशिकाओं गठबंधन करने के लिए जारीहर काट के बाद फ्लास्क और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 95% आर्द्रता में इनक्यूबेटर में कुप्पी की दुकान. सभी चोप्स पूरा हो चुका है, के बाद हर नई कुप्पी में मात्रा में गोला निलंबन विभाज्य. 6.5 कदम आगे बढ़ना.

    8. Cryopreservation

    निम्नलिखित प्रोटोकॉल cryogenically hNPCs के संरक्षण के लिए है.

    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक साफ पानी के स्नान में सेल ठंड मध्यम पिघलना और फिर बर्फ पर दुकान. सेल ठंड मध्यम अप करने के लिए 6 महीने के लिए aliquoted और -80 ˚ सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
    2. एक लौ में pipet का उद्घाटन घूर्णन पॉलिश कांच पाश्चर pipets आग. तैयार करें बड़े और दो ​​छोटे बोर आग पॉलिश pipets (चित्रा 3) के कम से कम दो. क्षेत्रों के बड़े से छोटे बोर pipets के लिए आगे बढ़ द्वारा अलग किया जाएगा.
    3. 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में TrypLE स्थान का चयन. निकालें और उपयोग के लिए तैयार है जब तक कमरे के तापमान पर रखना.


    चित्रा 3. आग चमकाने कांच पाश्चर pipets. ए) के आदेश के एक बड़े बोर आग पॉलिश कांच pipet के लिए समान रूप से कांच pipet के किनारों दौर. बी) उदाहरण में ज्वाला और स्पिन के शीर्ष भाग में pipet पकड़ो. एक छोटे से बोर आग पॉलिश कांच pipet की सी) उदाहरण.

    1. Aseptically बीएससी में neurospheres हस्तांतरण. क्षेत्रों के एक ट्यूब रैक के खिलाफ कुप्पी (ओं) झुकाव द्वारा व्यवस्थित करने और किसी भी शिथिल पक्षपाती क्षेत्रों को हटाने के लिए कुप्पी के नीचे कुल्ला करने की अनुमति दें. क्षेत्रों को फिर से व्यवस्थित करने की अनुमति दें.
    2. एक बाँझ बोतल में मुख्यमंत्री के सभी लेकिन 5-10 मिलीलीटर हस्तांतरण और कुल मात्रा को मापने. एक शंक्वाकार ट्यूब में शेष क्षेत्रों और मीडिया रखें.
    3. सभी कोशिकाओं तय हो चुका है, के बाद बोतल में मुख्यमंत्री की एक छोटी meniscus लेकिन सभी हस्तांतरण और वॉल summateUme.
    4. Aseptically हस्तांतरण शंक्वाकार ट्यूब में गर्म TrypLE चयन 5-10 मिलीग्राम और फिर से निलंबित सेल गोली. 15-20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में शंक्वाकार ट्यूब स्थानांतरण. 7.5-10 मिनट के बाद, धीरे शंक्वाकार ट्यूब मिश्रण को हिला.
    5. कदम 8.5 से मापा मुख्यमंत्री मात्रा का प्रयोग करें और एम एम के एक बराबर मात्रा तैयार करते हैं. 50% मुख्यमंत्री और 50% मिमी समाधान (मुख्यमंत्री / मिमी समाधान) गठबंधन और फिल्टर.
    6. Aseptically एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एक 40 माइक्रोन झरनी हस्तांतरण.
    7. ऊष्मायन के पूरा होने पर, 100 x जी पर 15 सेकंड के लिए 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब स्पिन.
    8. ध्यान aspirate और TrypLE का चयन करें और किसी भी चिपचिपा सब्सट्रेट त्यागें. एक छोटे meniscus छोड़ दें. गोली परेशान नहीं है, जबकि शेष TrypLE चयन को कमजोर करने के लिए मुख्यमंत्री / एम एम के 4 एमएल - धीरे 2 जोड़ें. किसी भी उखाड़ फेंकना कोशिकाओं को धो discarding से पहले फिर से व्यवस्थित करते हैं.
    9. 2-5 मिलीलीटर मुख्यमंत्री / ट्यूब क्षेत्रों मिमी समाधान जोड़ें. 10x की अधिकतम triturating द्वारा एक 5 मिलीलीटर विंदुक के साथ क्षेत्रों को अलग कर देना. संयुक्त राष्ट्र चलोअलग क्षेत्रों में 1-2 मिनट के लिए व्यवस्थित. पूरी तरह से undissociated समूहों को दूर करने के लिए 40 माइक्रोन झरनी पर अलग सेल निलंबन स्थानांतरण.
    10. एक आग पॉलिश बड़े बोर कांच pipet और फिर एक छोटे से बोर कांच pipet के साथ कदम 8.12 दोहराएँ.
    11. मुख्यमंत्री / मिमी समाधान के 2-5 मिलीलीटर के साथ झरनी कुल्ला.
    12. सेल निलंबन मिक्स और व्यवहार्यता विश्लेषण के लिए नमूने निकालें.
    13. एक उपयुक्त कमजोर पड़ने कारक पर trypan नीले रंग के साथ नमूने पतला और गिनती. औसत व्यवहार्य सेल एकाग्रता की गणना और कुल व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करने के लिए नीचे दिए गए मानक समीकरण का प्रयोग करें.
      1 समीकरण
    14. 5.0 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल पर फिर से निलंबित कोशिकाओं के लिए आवश्यक सेल ठंड मीडिया की कुल मात्रा की गणना. कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर प्रत्येक cryovial में वरीयता प्राप्त किया जाएगा. बीएससी में cryovials स्थानांतरण.
    15. 15 मीटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्रउत्तम उपज के लिए एल शंक्वाकार ट्यूबों. 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब नीचे एक बड़े पैमाने पर रोक के लिए उपयोग किया जाता है, तो 10 मिनट के लिए 400 XG के लिए दर और समय में वृद्धि.
    16. 5.0 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल सेल ठंड माध्यम का उपयोग सेल गोली निलंबित पुनः. प्रत्येक cryovial में सेल निलंबन की अशेष 1 मिलीलीटर. निलंबन और विभाज्य 5 cryovials एक्स 1 मिलीलीटर की एक भी वितरण, महाप्राण 6 मिलीलीटर के लिए. वापस कोशिकाओं के पूल में निलंबन की शेष 1 मिलीलीटर स्थानांतरण. सभी शीशियों भर दिया गया है जब तक दोहराएँ.
    17. Aseptically सभी वरीयता प्राप्त cryovials सील और 5-10 मिनट के लिए बर्फ पर उन्हें स्थानांतरण.
    18. Isopropyl शराब चैंबर: hNPCs संरक्षित करने के लिए cryopreservation रणनीतियों के लिए निम्न में से एक का प्रयोग करें
      1. कमरे के तापमान पर 100% आईपीए के साथ कक्ष के लिए आवश्यक संख्या (ओं) भरें.
      2. कक्ष (ओं) में बर्फ से वरीयता प्राप्त cryovials स्थानांतरण और रातोंरात एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में कक्ष (ओं) हस्तांतरण. कोशिकाओं हालांकि, -80 डिग्री सेल्सियस पर एक सप्ताह के लिए स्थिर रहेयह अगले दिन लंबी अवधि तरल नाइट्रोजन भंडारण के लिए शीशियों हस्तांतरण करने के लिए सुझाव दिया है.

      नियंत्रित दर फ्रीजर

      1. नियंत्रित दर फ्रीजर के सॉफ्टवेयर के लिए एक उपयुक्त ठंड कार्यक्रम अपलोड करें. एक उदाहरण कार्यक्रम 3 तालिका में सूचीबद्ध है. चित्रा 4 hNPCs के लिए एक ठेठ ठंड की अवस्था को दर्शाता है. हालांकि, सटीक कार्यक्रम प्रत्येक फ्रीजर मॉडल के लिए अलग अलग होंगे. ठंड की दर हो सकता है, जहां -40 डिग्री सेल्सियस तक पहुँचने तक काफी हद तक कम से कम -80 डिग्री की वृद्धि हुई मानक समग्र नमूना दर -1 डिग्री सेल्सियस / मिनट के करीब होना चाहिए सी.
    चरण दर (डिग्री सेल्सियस) अंत में तापमान (डिग्री सेल्सियस) पकड़ो (न्यूनतम सेकंड) ट्रिगर
    1 </ P> - - 5 मिनट 0 सेकंड कक्ष
    2 - 1.3 - 5 - नमूना
    3 - - 1 मिनट 0 सेकंड कक्ष
    4 - 45 - 58 - कक्ष
    5 10 + - 26 - कक्ष
    6 + 3 - 23 - कक्ष
    7 - 0.8 - 40 - नमूना
    8 - 10 - 100 - कक्ष
    9 - 35 - 160 - कक्ष

    तालिका 3. एक नियंत्रित आर में hNPCs ठंड के लिए कदमफ्रीजर खा लिया. एक नियंत्रित दर फ्रीजर पर hNPC cryopreservation के लिए सुझाव कार्यक्रम.

    चित्रा 4
    चित्रा 4. नमूना ठंड वक्र. एक नियंत्रित दर फ्रीजर पर hNPCs के लिए विशिष्ट ठंड वक्र.

      1. नियंत्रण दर फ्रीजर के साथ जुड़े टोकरी में बर्फ से cryovials स्थानांतरण. केवल सेल मीडिया नमूना तापमान जांच के लिए उपयोग करने के लिए ठंड के साथ एक cryovial लोड करने के लिए सुनिश्चित करें. ठंड के चेंबर में बास्केट स्थानांतरण और जांच शीशी में नमूना जांच जगह. कार्यक्रम की शुरुआत करें.
      2. प्रोटोकॉल पूरा कर लिया है, लंबी अवधि के तरल नाइट्रोजन भंडारण में शीशियों हस्तांतरण.

    9. विगलन प्रक्रिया

    निम्नलिखित प्रोटोकॉल विगलन cryogenically पी के लिए हैआरक्षित hNPCs.

    1. तुरंत सूखी बर्फ पर तरल नाइट्रोजन भंडारण से cryovials स्थानांतरण. चेतावनी: शीशियों दरारें या तरल नाइट्रोजन शीशी में प्रवेश करने की अनुमति ढीला पलकों हो सकता है. गहरी फ्रीज स्थितियों से हटा दिया, तरल तुरंत शीशी विस्फोट, उबाल कर सकते हैं. शीशियों को हटाने जब उचित पीपीई का प्रयोग करें.
    2. समय से आगे नीचे अभिकर्मकों और आपूर्ति के सभी तैयार करें. विगलन प्रक्रिया शुरू हो जाने के बाद, यह कुशलतापूर्वक के माध्यम से पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है.
      1. तंत्रिका कोशिका विस्तार मध्यम, एम.एम., एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब, एक 2 मिलीलीटर और एक 10 मिलीलीटर बीएससी में प्रत्येक cryovial के लिए सीरम वैज्ञानिक पिपेट स्टेम स्थानांतरण.
      2. तंत्रिका के 9 मिलीलीटर की एक न्यूनतम सेल विस्तार मध्यम स्टेम और एम एम के 5 एमएल प्रत्येक शीशी के लिए आवश्यक है. यदि आवश्यक हो तो हर मीडिया के अधिक तैयार करें.
    3. केवल एक बार में hNPCs की एक शीशी पिघलना. एक साफ 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सूखी बर्फ से जमी कोशिकाओं स्थानांतरण और लगातार पानी के स्नान में शीशी हलचल. की मात्रा मॉनिटरपिघल गया है कि बर्फ. शीशी में छोड़ा बर्फ के बारे में 0.5 सेमी का एक टुकड़ा नहीं है, स्प्रे और 70% isopropyl शराब के साथ पोंछे और बीएससी में स्थानांतरण.
    4. एक 2 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक विंदुक के साथ एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब cryovial की सामग्री को स्थानांतरित. खाली cryovial के लिए सेल विस्तार मध्यम स्टेम तंत्रिका के 1 मिलीलीटर जोड़ें और फिर एक धीमी गति में thawed कोशिकाओं पर सेल विस्तार मध्यम स्टेम तंत्रिका के 8 एमएल हस्तांतरण, धीरे ट्यूब मिलाते हुए, जबकि बुद्धिमान तरीके से ड्रॉप. इस आसमाटिक सदमे के जोखिम को कम करने के लिए किया जाता है.
    5. सेल निलंबन के 9 मिलीलीटर cryovial से कुल्ला स्थानांतरण. बर्फ पर शंक्वाकार ट्यूब स्थानांतरण और दोहराने शेष सभी शीशियों के लिए 9.4-9.5 कदम.
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 XG पर शंक्वाकार ट्यूबों अपकेंद्रित्र Centrifugation के दौरान, 4 तालिका के आधार पर बोने के लिए बोतल की उपयुक्त संख्या में तैयार करते हैं.
    शीशियों की # कुल सीडिंग वॉल्यूम (एमएल) कुप्पी
    1 5 T12.5
    2 10 T25
    3 15 T75
    4 20 T75
    5 25 T75
    6 30 T175
    7 35 T175
    8 40 T175
    8 + - बोतल के युग्म

    तालिका 4. Thawed cryovials की संख्या के आधार पर फ्लास्क आकार. HNPCs के बाद पिघलना बीज के लिए सुझाव मात्रा और कुप्पी आकार.

    1. पुनः निलंबित और तालिका 4 पर आधारित एम एम की उचित मात्रा में सभी ट्यूबों गठबंधन. अच्छी तरह से मिलाएं और फिर सेव्यवहार्यता गणना के लिए एक नमूना चाल है. विवरण गिनती के लिए कदम 8.15-8.16 देखें. मानक बोने रेंज / 2 सेमी 160,000-320,000 कोशिकाओं के बीच है.
    2. अच्छी तरह से कोशिकाओं मिश्रण और बोतल में कोशिकाओं विभाज्य. एक 5% सीओ 2/37 ° C/95% नमी इनक्यूबेटर बोतल स्थानांतरण. धीरे समान रूप से कोशिकाओं को वितरित करने के लिए आगे और पीछे झटकों से कुप्पी मिलाएं.
    3. कोशिकाओं 24-48 घंटे के भीतर क्षेत्रों बनेगी. कभी कभी कोशिकाओं प्लास्टिक की सतह का पालन करना और हनीकांब की तरह कॉलोनी वितरण बनेगी. यदि ऐसा होता है, क्षेत्र के गठन में सहायता, ढीला कोशिकाओं rinsing से पहले 3 दिनों के लिए कोशिकाओं को छोड़ दें. कोई पक्षपाती कोशिकाओं रहे हैं जब तक हर 1-3 दिनों कुल्ला. एक नई कुप्पी के लिए आवश्यक कोशिकाओं स्थानांतरण हैं.
    4. विनिमय एम एम के साथ मीडिया हर 3-4 दिनों के 25-75% कोशिकाओं, आमतौर पर 7-14 दिनों के बाद पिघलना काट करने के लिए तैयार हैं जब तक.

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Representative Results

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चित्रा 5
P19 पर जमे हुए hNPCs की चित्रा 5. प्रतिनिधि डेटा. ए) अनुमानित सेल नंबर, फिर thawed और काट विधि के माध्यम से passaged neurospheres की तुलना में enzymatic पृथक्करण का उपयोग कर एक पक्षपाती monolayer के रूप में विस्तार किया. कोशिकाओं P20 पर thawed थे जब दिन 0 प्रतिनिधित्व करता है. बी) क्षेत्रों के प्रतिनिधि छवियों पूर्व काटना, क्षेत्रों के बाद जल्द, 10X. डी) रंग स्वाच में मीडिया कंडीशनिंग की हद तक का वर्णन किया cGMP के 10X. सी) प्रतिनिधि छवियाँ तुलनीय प्रोटोकॉल. ई) 1 दिन के लिए चढ़ाया और nestin (लाल) अभिव्यक्ति के लिए दाग रहे थे कि thawed P29 hNPCs की Immunocytochemistry. 7 दिन और दाग के लिए चढ़ाया गया कि thawed P29 hNPCs की Hoechst परमाणु काउंटर दाग (नीला). एफ) ImmunocytochemistryGFAP के लिए एड (लाल) और β-III ट्यूबिलिन (हरा). बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5A P20 (0 दिन) पर thawed और laminin लेपित टिशू कल्चर बोतल के लिए या काट विधि के माध्यम से passaged गैर पक्षपाती neurospheres के रूप में पक्षपाती बनाए रखा hNPCs का प्रतिनिधित्व करता है. पक्षपाती कोशिकाओं enzymatically साप्ताहिक चयन करें TrypLE का उपयोग अलग और संस्कृति में 70 दिनों (7-10 मार्ग) के बाद senesced गया. इसके विपरीत, पारित होने के 20 में thawed और काट तकनीक के माध्यम से विस्तार neurospheres वार्धक्य से पहले अधिक से अधिक से अधिक 40 अंश के लिए बढ़ी. (चित्रा 5 ब) काट से पहले विशिष्ट hNPCs ज्यादातर व्यास में ≥ 300 माइक्रोन होना चाहिए. एक बार कटा, क्षेत्रों आम तौर पर ज्यादातर 200 व्यास (चित्रा 5C) में माइक्रोन के आसपास, variably आकार वर्गों में quartered रहे हैं. यह hNPCs Choppin के माध्यम से विस्तार किया है कि नोट करना महत्वपूर्ण हैजी विधि hNPC मार्करों की अभिव्यक्ति को बनाए रखने और दोनों astrocytes और न्यूरॉन्स के बाद भेदभाव का उत्पादन कर सकते हैं. देर बीतने hNPCs, अलग laminin लेपित coverslips पर चढ़ाया एक या एक से सात दिन की अवधि के लिए और बाद में 4% paraformaldehyde के साथ तय किया गया. hNPCs 1 दिन चढ़ाया hNPCs (चित्रा 5E) पर पूर्वज सेल मार्कर nestin (Millipore, 1:1,000) के रूप में अच्छी तरह से विभेदित तंत्रिका मार्कर glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP, 1:500) और β-III ट्यूबिलिन (1 एक्सप्रेस: 2,000) सात दिन चढ़ाया hNPCs (चित्रा 5F) पर क्रमश: astrocytes और अपरिपक्व न्यूरॉन्स के लिए मार्कर.

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Discussion

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चित्रा 6
चित्रा 6. काट योजनाबद्ध. यांत्रिक काट विधि का उपयोग संस्कृति में अंडाकार आकृति स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं का विस्तार.

गंभीर कदम

काट विस्तार प्रतिमान का अवलोकन. HNPC क्षेत्र आकार neurospheres passaging से पहले निरीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण मानदंडों में से एक है 6 चित्र में दिखाया गया है. क्षेत्र के आकार में एक बड़े विचरण हालांकि वहाँ, क्षेत्रों के कम से कम 30% एक से अधिक व्यास 300 मीटर होनी चाहिए. क्षेत्रों के पारित होने के लिए बहुत छोटे हैं, तो बस ताजा एम.एम. (25% -50%) के साथ मुख्यमंत्री के आदान प्रदान और फिर से आकलन 1-4 दिनों के बाद. क्षेत्रों के एक व्यास का बहुत छोटा पर passaged हैं जब गरीब विस्तार दरों होते हैं.

hNPC विस्तार दरों में भी क्षेत्र के घनत्व और मीडिया ग पर निर्भर कर रहे हैंकारण स्रावित कारकों 47 onditioning. मीडिया पीढ़ी metabolized है और महत्वपूर्ण वृद्धि कारकों कम कर रहे हैं हालांकि, अगर कोशिकाओं कोशिकाओं 48 की एक karyotypically असामान्य आबादी का अधिग्रहण कर सकते हैं. इसलिए, जगह पोषक तत्वों और वृद्धि कारकों secreted पौष्टिकता संबंधी कारकों के साथ संतुलित किया जाना चाहिए. HNPCs के बाद काट या बाद पिघलना बोने करते हैं, मीडिया के 3 सेमी प्रति neurospheres की संख्या परिवर्तनशील है. हालांकि, सामान्य नियम घनत्व अधिक है, तेजी से मीडिया हालत होगी और उच्चतर विस्तार दर, जब जरूरत मीडिया विमर्श किया है प्रदान की. मीडिया पूरी तरह से metabolized किया गया है जब पीले करने के लिए, संयुक्त राष्ट्र metabolized जब गुलाबी से लेकर जो मीडिया कंडीशनिंग रंग स्पेक्ट्रम (चित्रा 5D), का प्रयोग करें. लघुगणक विकास के लिए आदर्श मीडिया रंग एक लाल, नारंगी रंग, रंग आदर्श पर # 3 है. इस स्रावित troph की पर्याप्त एकाग्रता को बनाए रखते हुए मीडिया पर्याप्त पोषक तत्वों और वृद्धि कारकों शामिल इंगित करता हैआईसी कारकों. मीडिया रंग आदर्श पर पिछले # 4 हालत नहीं होना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं (रंग आदर्श पर # 1) जल्दी से मीडिया metabolizing नहीं कर रहे हैं, hNPCs धीमी हो जाना होगा और हर 7-10 दिनों के लिए विरोध के रूप में हर 10-20 दिनों एक काट आवश्यकता होती है. यह बदले में विस्तार की दर में सुधार होगा जो कंडीशनिंग, को बढ़ावा देने के लिए संस्कृति घनत्व को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है.

काट प्रक्रिया के दौरान निम्नलिखित महत्वपूर्ण कदम ध्यान दें. सुनिश्चित ब्लेड हेलिकॉप्टर हाथ के समानांतर स्थापित किया गया है. ब्लेड पेट्री डिश या शिम डिस्क की सतह पर फ्लैट नहीं है, तो कई क्षेत्रों कटा हुआ न हो. कदम 4.11 में चर्चा की कोशिकाओं के प्रसार को ध्यान दें. क्षेत्रों के सभी क्षेत्रों कटा किया गया है से पहले दीवार संपर्क करेंगे पेट्री डिश या ब्लेड के केंद्र में रहना चाहिए. अंत में, यह काट प्रक्रिया के दौरान समय की एक विस्तारित अवधि के लिए hNPCs सूखने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है. डिश क्षेत्रों में रखने के बाद, काटना और जैसे ही ताजा मीडिया के साथ उन्हें बाढ़संभव.

इस तकनीक के उपकरणों के कई टुकड़े की आवश्यकता है, संस्कृति का बाँझपन के लिए जोखिम भी हो सकता है. इस खतरे को देखते हुए उचित बाँझ तकनीक प्रक्रिया के दौरान इस्तेमाल किया जाना चाहिए. बुनियादी अनुसंधान स्तर पर उत्पादन के लिए, 70% आइपीए या समकक्ष के साथ सभी उपकरण नीचे पोंछते 15 मिनट की एक न्यूनतम के लिए वैकल्पिक पराबैंगनी ऊष्मायन के साथ पर्याप्त है. एक बाँझ बीएससी के अंदर सभी चरणों को पूरा करें. निर्माता ने सुझाव दिया है cGMP स्तर पर उत्पादन के लिए, हेलिकॉप्टर ethylene ऑक्साइड के साथ निष्फल होना चाहिए. अन्य सभी आपूर्ति बाँझ खरीदी या autoclaved किया जा सकता है.

भविष्य अनुप्रयोगों

बिस्तर बेंच से किसी भी बुनियादी अनुसंधान चिकित्सा के संक्रमण एक चुनौती हो सकती है. काट प्रक्रिया मन में इस संक्रमण के साथ डिजाइन किया गया था. प्रक्रिया पहले ही विश्वविद्यालय के विस्कॉन्सिन Waisman केंद्र जैव निर्माण की सुविधा में एक cGMP अनुरूप hNPC बैंक के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया गया है. टीटोपी hNPC बैंक फेडरल ड्रग एडमिनिस्ट्रेशन अनुमोदन के बाद नई पूर्व अनुसंधानात्मक दवा के अध्ययन और एक चरण 1 चिकित्सीय परीक्षण के लिए उपयोग किया जाएगा जो एक दवा ग्रेड hNPC सेल बहुत कुछ के विस्तार के लिए sourced किया गया था. विस्तार के लिए इस प्रक्रिया का उपयोग करने वाले अन्य कोशिकाओं प्रकार के होते हैं. एक उदाहरण ईज़ी क्षेत्रों, pluripotent स्टेम सेल 41 से उत्पन्न तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं रहे हैं. इस तकनीक के विस्तार के दौरान लगातार सेल करने वाली सेल संपर्क की आवश्यकता है कि ऊतक के अन्य प्रकारों के साथ प्रयोग के लिए काफी संभावना है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम महत्वपूर्ण समीक्षा और इस रिपोर्ट के संपादन के लिए डॉ. Soshana Svendsen धन्यवाद. इस काम एनआईएच / NINDS 1U24NS078370-01 और सीआईआरएम DR2A-05320 से योगदान दिया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker, 50 ml Fisherbrand FB-100-50 multiple manufacturers/suppliers
Bio-Safety Cabinet, class II Baker SG-603A 4 ft. or 6 ft. model.  6 ft. model recommended; multiple manufacturers/suppliers
Blades, Double-edge Prep Personna 74-0002 multiple manufacturers/suppliers.  CAUTION: Sharp
Cell Freezing Media Sigma-Aldrich C6295-50ML DMSO, serum-free
Centrifuge, swing-bucket with 15 ml inserts Eppendorf 5810 R multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 15 ml Fisherbrand S50712 multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 50 ml BD Falcon 352074 multiple manufacturers/suppliers
Controlled Rate Freezer Planer Kryo 750 multiple manufacturers/suppliers
Cryovials, 2 ml Corning 430488 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T12.5 BD Falcon 353107 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T25 BD Falcon 353081 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T175 BD Falcon 353045 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T75  BD Falcon 353110 multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 1 L Millipore SCGPU11RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 150 ml Millipore SCGVU01RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 500 ml Millipore SCGPU05RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 50 ml Millipore SCGP00525 multiple manufacturers/suppliers
Filter Paper, 8.5 cm circles Whatman/GE 1001-085
Forceps, Standard Pattern - Serrated/Curved/18 cm Fine Science Tools 11001-18
Freezing Chamber, Isopropyl Alcohol Nalgene 5100-0001 "Mr. Frosty"
Incubator, 37 °C/5% CO2 Forma 370 series multiple manufacturers/suppliers
Hemacytometer, Phase Hausser Scientific 1475 multiple manufacturers/suppliers
McIlwain Tissue Chopper Lafayette Instruments TC752-PD  Petri dish modification required.   CAUTION:  Moving, sharp blade.
Micropipettor, 1-10 μl Gilson F144562 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 100-1,000 μl (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 2-20 μl (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 20-200 μl (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Nutdriver, Autoclavable, 5/16" Steritool 10302
Pasteur Pipets, cotton-plugged Fisherbrand 13-678-8B multiple manufacturers/suppliers
Petri Dish, Glass, Autoclavable Corning 3160-100
Pipet Aid Drummond 4-000-101 multiple manufacturers/suppliers
Shim disc McMaster-Carr VARIABLE multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 10 μl AvantGuard AV10R-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 1,000 μl AvantGuard AV1000 multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 20 μl AvantGuard AV20-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 200 μl AvantGuard AV200-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 10 ml Fisherbrand 13-676-10J multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 2 ml Fisherbrand 13-675-3C multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 25 ml Fisherbrand 13-676-10K multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 5 ml Fisherbrand 13-676-10H multiple manufacturers/suppliers
Sterilization Pouches, 19 x 33 cm Crosstex SCL multiple manufacturers/suppliers
Strainer, 40 µm BD Falcon 352340
Tissue Culture Dishes, 60 mm BD Falcon 351007
Tube Racks, Interlocking Four-Way Fisherbrand 03-448-17
Water Bath Fisherbrand S52602Q multiple manufacturers/suppliers
Neural Progenitor Cell-Specific Processing Reagents
Neural Stem Cell Expansion Medium (Stemline) Sigma-Aldrich S3194-500ML Important to use the Stemline brand
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Millipore GF316 multiple manufacturers/suppliers
Recombinant Human Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Millipore LIF1010 multiple manufacturers/suppliers
Trypan Blue (0.4%) Sigma-Aldrich T8154-100ML multiple manufacturers/suppliers
TrypLE Select (1x) Life Technologies 12563-011

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue
Posted by JoVE Editors on 09/01/2014. Citeable Link.

A correction was made to A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. The corresponding author was changed from:

Brandon C. Shelley

to:

Clive Svendsen

मानव तंत्रिका के समुच्चय के लिए एक cGMP-लागू विस्तार विधि स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं pluripotent स्टेम सेल या भ्रूण के मस्तिष्क के ऊतकों से निकाली
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Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. J. Vis. Exp. (88), e51219, doi:10.3791/51219 (2014).More

Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. J. Vis. Exp. (88), e51219, doi:10.3791/51219 (2014).

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