इस प्रोटोकॉल एक एकल कक्ष निलंबन को हदबंदी के बिना गोलाकार तंत्रिका स्टेम और पूर्वपुस्र्ष सेल समुच्चय के विस्तार की अनुमति देता है कि एक उपन्यास यांत्रिक काट विधि का वर्णन करता है. सेल / सेल से संपर्क बनाए रखने पर 40 अंश के लिए तेजी से और स्थिर विकास की अनुमति देता है.
अनुसंधान प्रयोगों और नैदानिक परीक्षणों के लिए एक भी नमूना से कोशिकाओं की संख्या में एकत्र करने के लिए एक सेल विस्तार तकनीक बहुत स्टेम सेल समुदाय को लाभ होगा. कई मौजूदा विस्तार तरीकों श्रमसाध्य और महंगी हैं, और पूरा हदबंदी शामिल उन कई स्टेम और पूर्वपुस्र्ष सेल प्रकार के भेदभाव या जल्दी बुढ़ापा गुजरना करने के लिए कारण हो सकता है. इन समस्याओं को दूर करने के लिए, हम साधारण और कम खर्चीली है कि "काट" के रूप में संदर्भित एक स्वचालित यांत्रिक passaging विधि विकसित की है. इस तकनीक एकल कक्षों में रासायनिक या एंजाइमी हदबंदी से बचा जाता है और बजाय लगातार सेल / सेल से संपर्क बनाए रखने कि निलंबित, उपगोल संस्कृतियों का बड़े पैमाने पर विस्तार के लिए अनुमति देता है. काट विधि में मुख्य रूप से भ्रूण के मस्तिष्क व्युत्पन्न तंत्रिका कोशिकाओं पूर्वज या neurospheres के लिए इस्तेमाल किया गया है, और हाल ही में भ्रूण और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल से प्राप्त तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के साथ प्रयोग के लिए प्रकाशित किया गया है. प्रक्रिया involvतों एक टिशू कल्चर पेट्री डिश पर neurospheres बोने और बाद में प्रभावी ढंग से मैन्युअल रूप यंत्रवत् प्रत्येक क्षेत्र अलग कर की थकाऊ प्रक्रिया को स्वचालित कोशिकाओं के माध्यम से एक तेज, बाँझ ब्लेड गुजर रहा है. संस्कृति में कोशिकाओं निलंबित एक अनुकूल सतह क्षेत्र करने वाली मात्रा अनुपात प्रदान करता है; 500,000 से अधिक कोशिकाओं व्यास में कम से कम 0.5 मिमी की एक एकल neurosphere भीतर उगाया जा सकता है. एक T175 फ्लास्क में, 50 लाख से अधिक कोशिकाओं केवल 15 लाख अनुयायी संस्कृतियों में की तुलना में निलंबन संस्कृतियों में विकसित कर सकते हैं. महत्वपूर्ण बात है, काट प्रक्रिया नैदानिक ग्रेड सेल के उत्पादों की व्यापक मात्रा में उत्पादन की अनुमति, वर्तमान अच्छा विनिर्माण प्रैक्टिस (cGMP) के तहत इस्तेमाल किया गया है.
एक monolayer 1-3 या कुल neurospheres 4-7 या तो के रूप में संस्कृति में कृंतक तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के विस्तार का एक लंबा इतिहास है. इसके अलावा, विकासशील केंद्रीय तंत्रिका तंत्र 8-17 के विभिन्न क्षेत्रों से अलग मानव तंत्रिका कोशिकाओं पूर्वज (hNPCs) इन विट्रो में विस्तारित किया गया है. इन कोशिकाओं को द्वि शक्तिशाली, astrocytes और न्यूरॉन्स दोनों में फर्क करने में सक्षम हैं और तंत्रिका विकास 18,19 और रोग तंत्र 20,21 का अध्ययन करने में एक बहुत ही उपयोगी उपकरण किया गया है. hNPCs भी एकीकरण, अस्तित्व और कार्यात्मक प्रभाव 22-24 के स्तर पर अलग से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र रोग के कई अलग अलग पशु मॉडल में प्रत्यारोपित किया गया है.
अक्सर epidermal वृद्धि कारक (EGF) और / या fibroblast वृद्धि कारक -2 (FGF-2) 25-28 – है – और पक्षपाती 29 और तीन दोनों परंपरागत रूप से, कृंतक या मानव भ्रूण व्युत्पन्न NPCs वृद्धि कारकों के संपर्क में हैंआयामी उपगोल सिस्टम आम तौर पर एक एकल कक्ष निलंबन 30-34 में enzymatic पृथक्करण का उपयोग passaged हैं. शोध या नैदानिक इस्तेमाल के लिए कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए मानक विधि आसान हेरफेर के कारण एक पक्षपाती monolayer के रूप में है. हालांकि, हम enzymatic या रासायनिक समाधान के साथ passaging monolayer और neurosphere hNPCs जल्दी बुढ़ापा 35 में हुई दिखाई है. इसके अलावा, enzymatic पृथक्करण भ्रूण स्टेम कोशिकाओं को 36-38 के साथ प्रदर्शन डेटा के आधार पर भेदभाव और karyotypic असामान्यताओं के स्तर में वृद्धि हो सकती है. Passaging hNPCs की मानक पद्धति वर्तमान अच्छा विनिर्माण अभ्यास चरण में 1 नैदानिक परीक्षणों (कोशिकाओं इंक, Neuralstem इंक स्टेम) चले गए हैं (cGMP) ग्रेड के उत्पादों का उत्पादन किया गया है, विधि सीमित सेल प्रवर्धन की केवल कुछ राउंड की अनुमति संभावित बैंकिंग.
जाहिर है, बड़े शोध प्रयोगों और भविष्य क्लिनिकल परीक्षण करने की क्षमता से फायदा हो सकता हैबड़े पैमाने पर विकास और सेल बैंकिंग की अनुमति के लिए थोक में और देरी वार्धक्य के साथ कोशिकाओं प्रचार. इस जरूरत को संबोधित करने के लिए, हम सेल करने वाली सेल से संपर्क बनाए रखने के लिए छोटे समूहों में उन्हें "काट" द्वारा एक उपन्यास और यंत्रवत् passaging बरकरार neurospheres की स्वचालित तरीका विकसित किया. यह विधि बहुत एक वैकल्पिक 3D बायोरिएक्टर संस्कृति विधि 40 के साथ देखा के रूप में उनके जीवन काल 39 और निलंबन संस्कृति, monolayer संस्कृतियों की तुलना में इनक्यूबेटर अंतरिक्ष के एक अधिक कुशल उपयोग की अनुमति की वृद्धि हुई. प्रदान की काट प्रोटोकॉल पारित होने के 10, मानक passaging तरीकों का उपयोग कर एक अप्रत्याशित करतब से अधिक एक भ्रूण के नमूने से बड़े पैमाने पर बैंकों के उत्पादन के लिए अनुमति देता है. Passaging hNPCs के लिए इस विधि अपरंपरागत है, यह लोकप्रियता में बढ़ रहा है और हाल ही में, इस तरह के मानव भ्रूण और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल से प्राप्त तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के रूप में अन्य प्रकार की कोशिकाओं, वी में सहित विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए बड़े पैमाने पर विस्तार सक्रिय करने के साथ प्रकाशित किया गया थाitro रोग मॉडलिंग 41-46. महत्वपूर्ण बात है, एक cGMP ग्रेड hNPC सेल बैंक पहले से ही तकनीक भविष्य नैदानिक अनुप्रयोगों की दिशा में लागू किया जा सकता है कि प्रदर्शन, काट विधि के साथ उत्पादन किया गया है.
चित्रा 6. काट योजनाबद्ध. यांत्रिक काट विधि का उपयोग संस्कृति में अंडाकार आकृति स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं का विस्तार.
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The authors have nothing to disclose.
हम महत्वपूर्ण समीक्षा और इस रिपोर्ट के संपादन के लिए डॉ. Soshana Svendsen धन्यवाद. इस काम एनआईएच / NINDS 1U24NS078370-01 और सीआईआरएम DR2A-05320 से योगदान दिया था.
Beaker, 50 mL | Fisherbrand | FB-100-50 | multiple manufacturers/suppliers |
Bio-Safety Cabinet, class II | Baker | SG-603A | 4 ft. or 6 ft. model. 6 ft. model recommended; multiple manufacturers/suppliers |
Blades, Double-edge Prep | Personna | 74-0002 | multiple manufacturers/suppliers. CAUTION: Sharp |
Cell Freezing Media | Sigma-Aldrich | C6295-50ML | DMSO, serum-free |
Centrifuge, swing-bucket with 15 mL inserts | Eppendorf | 5810 R | multiple manufacturers/suppliers |
Conical Tubes, 15 mL | Fisherbrand | S50712 | multiple manufacturers/suppliers |
Conical Tubes, 50 mL | BD Falcon | 352074 | multiple manufacturers/suppliers |
Controlled Rate Freezer | Planer | Kryo 750 | multiple manufacturers/suppliers |
Cryovials, 2 mL | Corning | 430488 | multiple manufacturers/suppliers |
Culture Flask, Vented, T12.5 | BD Falcon | 353107 | multiple manufacturers/suppliers |
Culture Flask, Vented, T25 | BD Falcon | 353081 | multiple manufacturers/suppliers |
Culture Flask, Vented, T175 | BD Falcon | 353045 | multiple manufacturers/suppliers |
Culture Flask, Vented, T75 | BD Falcon | 353110 | multiple manufacturers/suppliers |
Filter, 0.22 µm, attached cup, 1 L | Millipore | SCGPU11RE | multiple manufacturers/suppliers |
Filter, 0.22 µm, attached cup, 150 mL | Millipore | SCGVU01RE | multiple manufacturers/suppliers |
Filter, 0.22 µm, attached cup, 500 mL | Millipore | SCGPU05RE | multiple manufacturers/suppliers |
Filter, 0.22 µm, attached cup, 50 mL | Millipore | SCGP00525 | multiple manufacturers/suppliers |
Filter Paper, 8.5 cm circles | Whatman/GE | 1001-085 | |
Forceps, Standard Pattern – Serrated/Curved/18 cm | Fine Science Tools | 11001-18 | |
Freezing Chamber, Isopropyl Alcohol | Nalgene | 5100-0001 | "Mr. Frosty" |
Incubator, 37°C/5% CO2 | Forma | 370 series | multiple manufacturers/suppliers |
Hemacytometer, Phase | Hausser Scientific | 1475 | multiple manufacturers/suppliers |
McIlwain Tissue Chopper | Lafayette Instruments | TC752-PD | Petri dish modification required. CAUTION: Moving, sharp blade. |
Micropipettor, 1 – 10 μL | Gilson | F144562 | multiple manufacturers/suppliers |
Micropipettor, 100 – 1000 μL (starter kit) | Gilson | F167700 | multiple manufacturers/suppliers |
Micropipettor, 2 – 20 μL (starter kit) | Gilson | F167700 | multiple manufacturers/suppliers |
Micropipettor, 20 – 200 μL (starter kit) | Gilson | F167700 | multiple manufacturers/suppliers |
Nutdriver, Autoclavable, 5/16" | Steritool | 10302 | |
Pasteur Pipets, cotton-plugged | Fisherbrand | 13-678-8B | multiple manufacturers/suppliers |
Petri Dish, Glass, Autoclavable | Corning | 3160-100 | |
Pipet Aid | Drummond | 4-000-101 | multiple manufacturers/suppliers |
Shim disc | McMaster-Carr | VARIABLE | multiple manufacturers/suppliers |
Sterile barrier pipet tips, 10 μL | AvantGuard | AV10R-H | multiple manufacturers/suppliers |
Sterile barrier pipet tips, 1000 μL | AvantGuard | AV1000 | multiple manufacturers/suppliers |
Sterile barrier pipet tips, 20 μL | AvantGuard | AV20-H | multiple manufacturers/suppliers |
Sterile barrier pipet tips, 200 μL | AvantGuard | AV200-H | multiple manufacturers/suppliers |
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 10 mL | Fisherbrand | 13-676-10J | multiple manufacturers/suppliers |
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 2 mL | Fisherbrand | 13-675-3C | multiple manufacturers/suppliers |
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 25 mL | Fisherbrand | 13-676-10K | multiple manufacturers/suppliers |
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 5 mL | Fisherbrand | 13-676-10H | multiple manufacturers/suppliers |
Sterilization Pouches, 19 x 33 cm | Crosstex | SCL | multiple manufacturers/suppliers |
Strainer, 40 µm | BD Falcon | 352340 | |
Tissue Culture Dishes, 60 mm | BD Falcon | 351007 | |
Tube Racks, Interlocking Four-Way | Fisherbrand | 03-448-17 | |
Water Bath | Fisherbrand | S52602Q | multiple manufacturers/suppliers |
Neural Progenitor Cell-Specific Processing Reagents | |||
Neural Stem Cell Expansion Medium (Stemline) | Sigma-Aldrich | S3194-500ML | Important to use the Stemline brand |
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Millipore | GF316 | multiple manufacturers/suppliers |
Recombinant Human Leukemia Inhibitory Factor (LIF) | Millipore | LIF1010 | multiple manufacturers/suppliers |
Trypan Blue (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | multiple manufacturers/suppliers |
TrypLE Select (1X) | Life Technologies | 12563-011 |