Summary
במבחני חוץ גופית כדי למדוד שכפול נגיף כבר השתפר מאוד על ידי הפיתוח של וירוסי RNA רקומביננטי להביע לוציפראז או אנזימים אחרים מסוגלים פליטת אור. כאן אנו פירוט צינור הקרנת תפוקה גבוהה המשלב זני רקומביננטי כגון חצבת והווירוסים chikungunya לבודד antivirals ספקטרום רחב מספריות כימיות.
Abstract
וירוסי RNA אחראים למחלות עיקריות אדם כגון שפעת, ברונכיטיס, דנגה, הפטיטיס C או חצבת. הם גם מייצגים איום מתעורר בגלל חילופים מוגברים ברחבי העולם ואוכלוסיות אנושיות החודרים מערכות אקולוגיות טבעיות יותר ויותר. דוגמא טובה למצב כזה מתעורר היא מגיפות וירוסים chikungunya של 2005-2006 באוקיינוס ההודי. התקדמות של אחרונות בהבנה של מסלולים הסלולר שליטה שכפול נגיפי שלנו מראה כי תרכובות מיקוד פונקציות תא מארחות, ולא את הנגיף עצמו, יכולים לעכב פנל גדול של וירוסי RNA. תרכובות אנטי כמה ספקטרום רחב זוהו עם מבחני מוכוון יעד מארח. עם זאת, מדידת העיכוב בשכפול נגיף בתרביות תאים באמצעות הפחתת השפעות cytopathic כקריאת נתונים עדיין מייצגת אסטרטגית הקרנה בעל חשיבות עליונה. מסכי פונקציונליים כגון שופרו באופן משמעותי על ידי הפיתוח של וירוסי רקומביננטי להביע כתב אנזימי capable של פליטת אור כגון לוציפראז. בדו"ח הנוכחי, אנחנו פירוט צינור הקרנת תפוקה גבוהה, המשלב חצבת רקומביננטי ווירוסים chikungunya עם מבחני כדאיות סלולרית, כדי לזהות תרכובות עם פרופיל אנטי ספקטרום רחב.
Introduction
וירוסי RNA אחראים למגוון רחב של זיהומי אדם, ויש לה השפעה עצומה על אוכלוסייה ברחבי העולם, הוא במונחים של בריאות ציבור ומחיר חסכוני. חיסונים יעילים פותחו נגד מספר וירוסי RNA האנושי, ונמצאים בשימוש נרחב כטיפול מניעתי. עם זאת, עדיין קיים מחסור קריטי של תרופות טיפוליות נגד נגיף RNA. ואכן, חיסונים יעילים אינם זמינים מפני פתוגנים אנושיים גדולים כגון וירוס דנגה, וירוס הצהבת מסוג C או וירוס סינסיציאלי נשימה אנושי (hRSV). חוץ מזה, וירוסי RNA אחראים למרבית מחלות מתפתחות, שגדלו בתדירות בגלל חילופים הגלובליים והשפעת אדם על מערכות אקולוגיות. נגד האיום הזה שמייצגים וירוסי RNA, הארסנל הטיפולי שלנו הוא מאוד מוגבל ולא יעיל יחסית 1-3. טיפולים קיימים למעשה מבוססים על סוג רקומביננטי אני האינטרפרונים (IFN-α / β) כדי לעורר חסינות מולדת,או הממשל של ribavirin. למרות שאופן פעולה של אנלוגי ribonucleoside זה שנוי במחלוקת וכנראה מסתמך על מנגנונים שונים, העיכוב של IMPDH הסלולרית (דהידרוגנז monophosphate inosine), אשר מכלה את בריכות GTP תאיים, הוא באופן ברור חיוני 4. Ribavirin, בשילוב עם IFN-α pegylated, הוא הטיפול העיקרי נגד וירוס הצהבת מסוג C. עם זאת, טיפולי IFN-α / β ו ribavirin הם יעילות נמוכה יחסית בvivo מול מרבית וירוסי RNA כפי שהם IFN-α / β ביעילות הבוטה איתות דרך ביטוי של ארסיות גורמים 5 ולעתים קרובות לברוח ribavirin 3. זה הוסיף לעובדה שטיפול ribavirin הוא העלאת בעיות רעילות חשובות, למרות שזה אושר לאחרונה נגד המחלה hRSV חמורה עם הטבות שנויות במחלוקת 6. לאחרונה, כמה טיפולים ספציפי וירוס כבר משווקים, בפרט כנגד נגיף שפעת עם o הפיתוחמעכבי neuraminidase ו 3. עם זאת, המגוון הגדול והופעתה הקבועה של וירוסי RNA מונע את פיתוח טיפולים ספציפיים נגד כל אחד מהם בעתיד קרוב יחסית. בסך הכל, זה מדגיש את הצורך באסטרטגיות יעילה כדי לזהות ולפתח מולקולות אנטי חזקות בעתיד הקרוב.
זה טריוויאלי לומר כי מעכב ספקטרום רחב פעיל נגד פנל גדול של וירוסי RNA הייתי לפתור את הבעיה הזו. למרות שמולקולה כזו היא עדיין החלום של ירולוג, ההבנה טובה יותר שלנו מנגנוני הגנה תאיים ומערכת חיסון מולדת מראה כי כמה אפשרויות קיימות 7,8. מספר מעבדות אקדמיות ותעשייתיות עכשיו מחפשות מולקולות המעוררות היבטים ספציפיים של מנגנוני הגנה תאית או מסלולים מטבוליים כדי להקהות שכפול נגיפי. למרות תרכובות כגון כנראה להראות תופעות לוואי משמעותיים, טיפולים נגד זיהומים נגיפיים אקוטיים יהיו לנהלed לזמן קצר יחסית, מה שהופך אותם מקובלים למרות כמה רעילות פוטנציאלית בטווח הארוך. אסטרטגיות שונות פותחו כדי לזהות מולקולות אנטי ספקטרום רחב כזה. תוכניות מחקר כמה לכוון במציאת מולקולות שיעד מסלולי הגנה או חילוף חומרים ספציפיים. זה כולל, למשל, קולטנים הכרת הפתוגן לעורר ביטוי גנים אנטי 9 ולהפעיל גורמים אנטי כגון 10 RNaseL, מכונות autophagy לקדם השפלה וירוס 11, סינתזת נוקלאוזידים מסלולי 12,13, או מפלים אפופטוטיים כדי לזרז מוות של תאים נגועים בנגיף 14. קבוצות אחרות פיתחו מסכי פנוטיפי שאינם היעד מבוסס 13,15-17. במקרה זה, מולקולות אנטי פשוט זוהו על ידי היכולת שלהם לחסום את השכפול נגיפי במערכת סלולרית נתון. ההנחה הכללית היא שמתחם עיכוב 2-3 וירוסי RNA שאינם קשורים הייתי לו פרופיל מתאים לרחב spectrum מולקולה אנטי. אופן פעולה של תרכובות להיט שנבחרו עם גישה כזו אמפירית נקבע רק בפעם שנייה וסופו של דבר, עלול להוביל לזיהוי של יעדים סלולריים חדשניים לתרופות אנטי. מעניין לציין, כי ניתוח רטרוספקטיבי של תרופות חדשות שאושרו על ידי הרשות האמריקנית למזון והתרופות אמריקניות בין 1999 ו 2008 הראה כי באופן כללי, הקרנות פנוטיפי כאלה נוטים לבצע טובים יותר מאשר גישות המבוסס על יעד כדי לגלות תרופות מולקולה הקטנה הראשון ב-class 18 .
שכפול נגיפי במבחנים מבוססי תאי תפוקה גבוהה נקבע בדרך כלל מהשפעות cytopathic וירוס. תאים נגועים ותרבותי ב96 - או צלחות 384 גם בנוכחות של תרכובות שנבדקו. לאחר כמה ימים, שכבות הסלולריות קבועות ומוכתם בצבעים כגון סגול קריסטל. לבסוף, הספיגה נקבעה עם קורא צלחת ותרכובות עיכוב שכפול נגיפי מזוהים על ידי היכולת שלהם לשמר את השכבות סלולריות לכאן ולכאןהשפעת cytopathic מושרה וירוס מ '. לחלופין, השפעות cytopathic באופן ויראלי בתיווכם הוערכו באמצעות מבחני כדאיות סטנדרטיים כגון הפחתת MTS. מבחני כאלה הם צייתנים וחסכוניים מאוד, אך סובלים משלוש מגבלות עיקריות. ראשית, הם דורשים שילוב תאי וירוס שבו שכפול נגיפי הוא cytopathic רק כמה ימים, אבל זה לא תמיד אפשרי, ובכך קורא לאלטרנטיבה גישות 19. שנית, הם גרועים כמותיים משום שהם מבוססים על אמצעי עקיף של שכפול נגיפי. ולבסוף, ניתן הבקיע תרכובות רעילות כלהיטים חיוביים, ולכן יש לבטל עם מסך דלפק מדידת כדאיות סלולרית. כדי להתגבר על חלק ממכשולים אלה, וירוסים או replicons רקומביננטי כבר מהונדסים על ידי גנטיקה הפוכה לבטא חלבוני כתב, כגון EGFP או לוציפראז, מיחידת שעתוק נוספת או במסגרת עם גנים חלבון נגיפיים (כמה דוגמאות הן 20-23). כאשר וירוסים אלה לשכפל, יחסי ציבור כתבoteins מיוצר יחד עם חלבונים נגיפיים עצמם. זה מספק assay מאוד כמותית למדוד שכפול נגיפי ולהעריך את הפעילות המעכבת של מולקולות מועמד. זה נכון במיוחד לוירוסי רקומביננטי להביע לוציפראז (או אנזימים אחרים מסוגלים פליטת אור) שכן מערכת הכתב הזה מציגה טווח דינמי רחב עם רגישות גבוהה וכמעט ללא רקע. יתר על כן, אין מקור אור העירור, ובכך למנוע הפרעה לקרינת מתחם 24.
הנה, אנחנו פירוט פרוטוקול תפוקה גבוהה מסך ספריות כימיות למעכבי ספקטרום רחב של וירוסי RNA. תרכובות נבדקו תחילה על תאים אנושיים נגועים בוירוס חצבת רקומביננטי (MV) להביע גחלילית לוציפראז 25 (rMV2/Luc, איור 1, מסך ראשי). MV שייך לMononegavirales סדר, והוא נחשב לעתים קרובות כחבר טיפוסי של נגיף RNA שלילי גדילes. ככזה, הגנום MV משמש כתבנית על ידי פולימראז הנגיפי לסנתז מולקולות mRNA קידוד לחלבונים נגיפיים. בזן MV רקומביננטי הנקרא rMV2/Luc, ביטוי לוציפראז בא לידי ביטוי מיחידת שעתוק נוסף מוכנסת בין P וגני M (איור 2 א). במקביל, תרכובות נבדקו לרעילות שלהם על תאים אנושיים באמצעות מגיב מבוסס לוציפראז מסחרי שמעריך, על ידי כימות ATP, מספר התאים הפעילים מטבולית בתרבות (איור 1, מסך ראשי). ספריות כימיות כולו יכולות להיות מוקרנת בקלות עם שני מבחני הללו על מנת לבחור תרכובות שאינן רעילים וביעילות לחסום שכפול MV. ואז, להיטים נבדקים מחדש לעיכוב מנת תגובה של שכפול MV, חוסר הרעילות, כמו גם ליכולת שלהם לפגוע בשכפול נגיף Chikungunya (CHIKV) (איור 1, מסך משני). CHIKV הוא חבר של משפחה של Togaviridae והגנום שלו הוא apמולקולת RNA חד גדיל ositive. ככזה, זה לגמרי לא קשורים לחצבת ותרכובות מעכבות גם MV וCHIKV סיכוי גדול לעכב פנל גדול של וירוסי RNA. חלבוני nonstructural CHIKV מתורגמים ישירות מהגנום הנגיפי, ואילו חלבונים מבניים מקודדים על ידי שעתוק ותרגום של מולקולת mRNA subgenomic. assay השכפול שלנו במבחנה לCHIKV מבוסס על זן רקומביננטי הנקרא CHIKV / רן, המבטא אנזים לוציפראז Renilla כחלק ביקע של polyprotein nonstructural באמצעות החדרת גן הכתב בין nsP3 ורצפי nsP4 26 (איור 2). המדד לפעילות לוציפראז Renilla מאפשר הניטור של שכפול נגיפי בשלב המוקדם של מחזור החיים CHIKV.
פרוטוקול תפוקה גבוהה זה שימש כדי לזהות במהירות תרכובות עם פרופיל מתאים לantivirals ספקטרום רחב בספרייה מסחרית של 10,000 Molecules מועשר לגיוון כימי. תרכובות בעצם עקבו אחרי השלטון של חמש של יפינסקי, עם משקולות מולקולריות הנעות 250-600 daltons, והיכנסו ערכי D מתחת ל -5. רוב המולקולות אלה היו גופים כימיים חדשים אינו זמינים בספריות מסחריות אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת צלחות בת 96 היטב עם תרכובות
- הזז צלחות אם 96 היטב המכילות 10 פתרונות מניות מ"מ של תרכובות כימיות בDMSO מ-20 ° C לטמפרטורת חדר. תרכובות לדלל 5x בDMSO להשיג צלחות דילול 96 היטב ביניים ב2 מ"מ. דילול מושגת על ידי pipetting 5 μl ל20 μl של DMSO וערבוב.
- פיפטה μl 1 מצלחות דילול לתוך בארות יבשות של צלחות 96 היטב תרבית רקמה לבנה, מסומן בבר. סט ראשון זה של צלחות בתו (D1) ישמש כדי להעריך את הרעילות של תרכובות בריכוז סופי של 20 מיקרומטר. צלחות בתו חנות ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
- לדלל תרכובות שוב 1:10 ידי pipetting 4 μl מצלחות דילול ל36 μl של DMSO וערבוב. μl פיפטה 1 לתוך בארות יבשות של חלק תחתון לבן, שטוח, תרבית רקמה המסומנת בשורת צלחות 96 בארות. סט שני זה של צלחות בתו (D2) ישמש כדי להעריך את העיכוב של replicatio MVn על ידי תרכובות בריכוז סופי של 2 מיקרומטר. צלחות בתו חנות ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
2. הכנת תא תרבויות לקביעת רעילות מתחם
- לגדל תאי HEK-293T ב 37 ° C ו 5% CO 2 במדיום של הנשר (DMEM) שונה Dulbecco עם L-גלוטמין התייצב ותוספת 10% בסרום עוברי עגל (FCS), סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מיליליטר) ופניצילין (100 IU / ml). תאי passaged ידי trypsinization כל 4-5 ימים, ובדילול מלא 01:10 לתוך בקבוק טרי. תאים צריכים להיות בשלב יומן לניסויים.
- ביום של הניסוי, לשחזר תאים על ידי trypsinization ולבצע ספירת תאים. גלולה תאים על ידי צנטריפוגה, וresuspend אותם ב3 x 10 5 תאים / מיליליטר במדיום התרבות. קח בחשבון ש12.5 מיליליטר של השעיה תא נדרשים לכל צלחת הקרנה.
- העברת תאים לשוקת, ולוותר על השעיה תא 100 μl בצלחות D1 מכילים compo הכימי ממוסמרunds. תא השעיה בתוך השוקת נסערת באופן קבוע, כדי למנוע שקיעה.
- ספייק שליטת בארות A1, C1, E1, G1, A12, C12, E12 וG12 עם μl 1 של DMSO. בארות מקבילים תשמש כנקודת התייחסות לתאי חיים (לא רעיל). ספייק B1 בארות שליטה, D1, F1, H1, B12, D12, F12 וH12 עם 1 μl של DMSO ו2.5 μl של פתרון IGEPAL 0.5% כדי להרוג תאים. בארות מקבילים תשמש כנקודת התייחסות לתאים מתים (רעילות גבוהה).
- דגירה תאים עבור 24 שעות על 37 ° C ו 5% CO 2.
3. הכנת תרביות תאים נגועות על ידי rMV2/Luc
- לצמוח ולהתאושש תאים כמתואר ב2.1 ו2.2. שוב, תאי resuspend ב3 x 10 5 תאים / מיליליטר במדיום התרבות. קח בחשבון ש12.5 מיליליטר של השעיה תא נדרשים לכל צלחת הקרנה.
- אופציונאלי: מדיום תרבות תוסף עם uridine ב20 מיקרוגרם / מיליליטר.
הערה: כאשר הקרנת ספריות כימיות לreplicatio ויראליn מעכבים, נראה כי תרכובות מיקוד שלבים מוקדמים של מסלול ביוסינתזה פירימידין לעתים קרובות מבודדים 13,16,27,28. התוספת של uridine למדיום התרבות משמשת לסינון מולקולות אנטי כזה. ואכן, זה ביעילות משחזר את השכפול נגיפי, כאשר אנזימים במעלה הזרם של מסלול ביוסינתזה פירימידין חסומים. - להציל 1:10 של השעיה תא לבארות שליטה עם תאים שאינם נגועים, ולהמשיך לזיהום עם נפח שנותר.
- להפשיר את הנפח המתאים של פתרון מניות rMV2/Luc. פתרונות מניות MV הם בדרך כלל ב10 6 -10 8 חלקיקים זיהומיות לכל מיליליטר. תרבות חייבת להיות נגועה ב0.1 חלקיקים זיהומיות של rMV2/Luc לתאי מטרה, אשר תואמים את 0.1 ריבוי של זיהום (משרד הפנים). הערה: rMV2/Luc נגזר מחיסון MV (זן שוורץ) והוא מניפולציה בסביבת BSL2.
- מוסיף את הווירוס להשעיה תא ומערבבים בעדינות. העבר את התאים נגועים לשוקת, ולוותר 100μl של השעיה תא נגועה בעמודות 2-11 של צלחות D2 המכילות תרכובות כימיות ממוסמר. תא השעיה בתוך השוקת היא מעורבת באופן קבוע בעדינות.
- בעמודות 1 ו 12, לוותר של תאים שאינם נגועים 100 μl גם על שניים. תאים נגועים הם ויתרו בבארות אחרות.
- דגירה תאים עבור 24 שעות על 37 ° C ו 5% CO 2.
4. מודד את פעילות בלוציפראז וניתוח נתונים
- הסר צלחות D1 מהחממה, ולקבוע כדאיות סלולריות על ידי הוספת 50 μl של מגיב כדאיות מבוסס לוציפראז ישירות לבארות תרבות. לערבב דגירה עבור 10 דקות בטמפרטורת חדר. קראו צלחות עם luminometer. זמן אינטגרציה מוגדר היטב לכל 100 אלפיות שניים.
- הסר צלחות D2 מהחממה, ולקבוע את פעילות על ידי הוספת לוציפראז 50 μl של מצע לוציפראז ישירות לבארות תרבות. דגירה במשך 6 דקות בטמפרטורת חדר, ולקרוא צלחות עם luminometer כdescriמיטה לעיל.
- חישוב גורם Z'לכל צלחת D1 של assay הרעילות כדי להצדיק את האיכות של המסך 29. Z '= 1-3 (σ + + σ-) / (μ + * - μ-), שבו μ + ו σ + מתאימות לאמצעי הארה וסטיות תקן לתאי HEK-293T עם DMSO לבד (לא רעיל), וμ-וσ-הוא אמצעי להארה וסטיות תקן לבארות התרבות טופלו IGEPAL כדי להרוג תאים. Z "צפוי להיות מעל 0.5, או הצלחת המקבילה נמחקת.
- הגדרת סף רעילות בμ + / 2. בטל תרכובות עם ערכי הארה להלן (איור 3 א) ניתוק זה.
- חישוב גורם Z'לכל צלחת D2 של assay אנטי. הנה, μ + ו σ + מתאימות לאמצעי הארה וסטיות תקן לתאים נגועים בתרבית עם DMSO לבד, וμ-וσ-הם אמצעי להארה וסטיות תקן לתאים שאינם נגועים. שוב, צלחות עם Z & #39; ערכים מתחת 0.5 מבוטלים.
- לחשב את העיכוב בשכפול נגיף כמו בצע: אחוז העיכוב = (μ + - פעילות לוציפראז לX מתחם) / (μ + - μ-) * 100. הגדרת סף עיכוב ב75%, ובחר תרכובות ששני להפחית ערכי הארה מתחת חתך זה (איור 3 ב) ואינן רעילים על פי קריטריונים שתוארו ב4.4.
5. מסך משני לרעיל וספקטרום הרחב אנטי פעילות
- ודאו 01:02 דילולים סידוריים עבור כל נפגעו מתחם בDMSO, החל מ500 מיקרומטר עד 4 מיקרומטר (8 דילולים). מלא צלחות הלבנות, המסומן בשורת רקמת תרבות עם 50 μl של מדיום התרבות. הוסף 1 μl של דילול כל מתחם בבארות תרבות. חזור פעמיים יש 3 צלחות תרבות עם דילולים סדרתי כפולים עבור כל מתחם להיט.
- הכן 37.5 מיליליטר של השעיה תא HEK-293T ב6 x 10 5 תאים / מיליליטר במדיום התרבות כפי שתוארו לעיל (ב2.1 ו22). לוותר 2x 12.5 מיליליטר בצינורות בז ולהדביק תאים עם או rMV2/Luc במשרד הפנים = 0.1 או CHIKV רקומביננטי להביע לוציפראז Renilla (CHIKV / רן) במשרד הפנים = 0.2. מערבבים על ידי היפוך.
הערה: CHIKV / רן נגזר מזן פראי סוג של CHIKV ולכן צריך לטפל בסביבת BSL3. ניתן להעביר צלחות מBSL3 לBSL1 פעם מצע Renilla נוספה בארות תרבות (ראה להלן). - לוותר 50 μl של תאים נגועים ב-רן נגוע, rMV2/Luc-infected, או CHIKV / בתרבות צלחות המכילות דילולים סדרתי של תרכובות להיט. דגירה 24 שעות על 37 ° C.
- הוסף 50 μl של מצע גחלילית בלוציפראז לקבוע פעילות גחלילית לוציפראז בבארות rMV2/Luc-infected. הוסף 50 μl של מצע לוציפראז Renilla לקבוע פעילות לוציפראז Renilla בCHIKV בארות / נגועים ברן. לבסוף, להוסיף 50 μl של מגיב assay הכדאיות מבוסס לוציפראז לתאים נגוע כדי לקבוע כדאיות סלולרית.
- נתונים עלילה (Figure 4) ולקבוע ריכוזי מתחם פגעו המעכבים MV ושכפול CHIKV ידי 50%. להתעלם מתחם מראה כמה רעילות בassay זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
צינור הקרנה זו נסמך ראשון על הבחירה של תרכובות המעכבות שכפול MV ולא מראה שום רעילות סלולרית משמעותית (איור 1, מסך ראשי). זה לוקח את יתרון של מבחני מבוססי לוציפראז כדי לקבוע רעילות סלולרית והעיכוב בשכפול נגיף. כל רכישת צעדי pipetting והנתונים יכולה להתבצע בהגדרת תפוקה גבוהה עם פלטפורמה רובוטית.
רעילות תאית של תרכובות נבחנת באמצעות assay כדאיות מבוסס לוציפראז שמעריך את מספר תאי חיים בתרבות המבוססת על כימות של הווה ATP, אשר תואם את תאים פעילים מטבולית. בגלל חמצון וציפרין ידי לוציפראז הוא ATP תלוי, אות הארה עומד ביחס ישר לATP הסלולרי המסופק על ידי תאי חיים. איור 3 א מציג תוצאות עבור צלחת הקרנת נציג אחד. כצפוי, ערכי פעילות לוציפראז מאוד ברורים היו measurאד בבארות שליטה שהכילו גם תאי חיים או תאים מתים נהרגו עם IGEPAL. סף מוגדר באופן אמפירי בμ + / 2 לסנן תרכובות מראה כמה רעילות סלולרית ובמקרה הנוכחי, 21 תרכובות מצלחת זו שהושלכו. במקביל, פעילות אנטי נמדדת באמצעות rMV2/Luc, זן רקומביננטי של בלוציפראז להביע MV (איור 2). HEK-293T אדם משמשים כי הם רגישים מאוד לזיהום MV. כתוצאה מכך, הפעילות בלוציפראז בבארות תרבות נגועות היא גבוהה מאוד (200-300 x 10 3 יחידות פעילות לוציפראז בבארות שליטה). זה מספק טווח דינמי גדול המאפשר הבחירה של מעכבי שכפול MV. איור 3 מראה תוצאות נציג שהתקבלו להקרנת צלחת אחת. ארבע תרכובות עכבות שכפול נגיפי על ידי יותר מ 75% בדוגמא זו ונבחרו.
לבסוף, תרכובות שאינן רעילים וכבשחיובי בassay השכפול הנגיפי נבחרו (איור 3 א ו 3 ב). ריכוזם המחצית המקסימאלי המעכב (IC50) נקבע בשני MV וCHIKV, שהם שני וירוסי RNA שאינם קשורים (איור 1, מסך משני). פעילות אנטי של תרכובות להיט נקבעה באמצעות שימוש בזני נגיף רקומביננטי להביע או גחלילית (rMV2/Luc) או לוציפראז Renilla (CHIKV / רן). איור 4 א ו -4 ב להראות עקומות עיכוב נציג לMV ושכפול CHIKV, בהתאמה. עקומות אלה משמשות כדי לקבוע IC50s של תרכובות להיט. במקביל, חוסר הרעילות תאית של תרכובות שנבחרו הוא אישר בניסוי מנת תגובה באמצעות assay הכדאיות מבוסס לוציפראז שתואר לעיל (איור 4C). טבלת 1 מראה ערכי IC50 לMV ושכפול CHIKV על סט של 13 שאינו רעילים תרכובות שזוהו מספרייה כימית של 10,000 מולקולות. compo אלהunds הוא רומן הן מבחינת מבנה כימי ופעילות ביולוגית. חלק מהמולקולות האלה משותפות דמיון מבני, ויכול להיות שנאספו לשלוש משפחות כימיות שונות. כנקודת התייחסות, ערכי IC50 שהושגו עם brequinar מוצגים גם בטבלה 1. Brequinar הוא מעכב של דהידרוגנז dihydroorotate, האנזים הרביעי של מסלול ביוסינתזה פירימידין, עם פעילות אנטי חזקה במבחנה 30,31. כאשר מסתכל על ערכי IC50, כדי פחות מגודל אחד הפריד בין מולקולת התייחסות זו מהלהיטים הפעילים ביותר שזוהו על ידי הקרנה. זה הקים את הפעילות אנטי החזקה של תרכובות שנבחרו.
פנל איור 1. סיכום של צינור ההקרנה. שמאל מראה pמסך rimary בי תרכובות נבחרות לחוסר רעילות והיכולת לחסום שכפול MV. פנל ימני מראה את המסך המשני שבו הפעילות אנטי של תרכובות שנבחרו הוא אישר, והיכולת שלהם לחסום שכפול CHIKV נקבעה. תרכובות שיעילות לחסום MV וCHIKV ללא רעילות משמעותית נחשבות כמעכבי ספקטרום רחב פוטנציאל של וירוסי RNA. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. ארגון הגנום של וירוסי RNA רקומביננטי הנושא את גן לוציפראז. () RMV2/Luc: הגנום RNA שלילי תחושת MV מוצג עם סיומו 3 'בצד השמאל, עם שישה גניםמצויינים באותיות גדולות ומתואר כמלבנים לבנים. קידוד יחידות תעתיק נוסף לגן הכתב מוכנס בין P וגני M ומתואר כמלבן צהוב (B) CHIKV / רן:. הגנום RNA חיובי תחושת CHIKV מוצג בסוף 5'הכתיר שלה בצד השמאל, עם מסגרת הקריאה הפתוחה קידוד ארבעה החלבונים הלא מבניים (nsP1-4). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. תוצאות עבור נציג אחד 96, גם הקרנת צלחת. (א) ערכי בלוציפראז שהושגו עם assay הכדאיות מבוסס לוציפראז. עמודות 1 ו 12 מתאימות לבקרות חלופיות עם DMSO לבד ("+"; לא רעיל) או IGEPAL ("-"; גבוה toxi עיר). צבע הכחול הוא הדגשת תרכובות שנחשבות לא רעיל פי ריכוזי ה-ATP שהתגלו בבארות תרבות, ואילו בארות הלבנות מתאימות לתרכובות רעילות (ערכי לוציפראז <12,203 x 10 3). (B) ערכי בלוציפראז שהושגו עם תאי rMV2/Luc-infected. עמודות 1 ו 12 מתאימות לבקרות חלופיות, HEK-293T שאינו נגוע, כלומר ("-") או בתאים שטופלו בrMV2/Luc-infected DMSO לבד ("+"). עבור כל מתחם שנבדק, הנתון מראה גם את אות הארה לוציפראז ואחוז עיכוב יחסי לשלוט בבארות. תרכובות עיכוב אות הארה על ידי יותר מ 75% מסומנים בצהוב או ירוק תלוי אם הם נחשבו לרעילים או לא כפי שנקבעו ב( א '). לכן, צבע ירוק מראה תרכובות להיט המעכבות שכפול MV ואינו משפיעים על כדאיות סלולרית.t = "_blank"> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 4. פעילות המנה תגובה אנטי ורעילות של תרכובות C864, C648 וC062. () HEK-293T היו נגוע בזן rMV2/Luc של MV להביע לוציפראז (משרד הפנים = 0.1), וטופחו עם מינונים הולך וגדל של C864, C648, C062 או DMSO לבד. לאחר 24 שעות, ביטוי בלוציפראז נקבע. * מציין כי עכבות לוציפראז שנצפו היו משמעותיות מבחינה סטטיסטית בכל שלוש התרכובות (p-הערכים <0.05). (ב) HEK-293T היו נגוע בזן CHIKV / רן של CHIKV להביע לוציפראז Renilla (משרד הפנים = 0.2), וטופחו עם הגדלת מינונים של C864, C648, C062 או DMSO לבד. לאחר 24 שעות, ביטוי בלוציפראז Renilla נקבע. * מציין statistiעכבות ומלקק משמעותיות עם כל שלוש התרכובות (p-הערכים <0.05). תאים (C) HEK-293T הודגרו עם מינונים הולך וגדל של C864, C648, C062 או DMSO לבד. כביקורת לרעילות, תרביות תאים נוספו עם 2.5 μl של פתרון IGEPAL 0.5%. לאחר 24 שעות, מספר תאי חיים נקבע באמצעות assay הכדאיות מבוסס לוציפראז. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
| משפחה כימית | תרכובת | MV (IC50 מיקרומטר) | CHIKV (IC50 מיקרומטר) | CC50 (מיקרומטר) |
| 1 | C864 | 0.6 | 0.6 | > 5 |
| 1 | C877 | 0.2 | 0.2 | > 5 |
| 1 | C957 | 1.2 | 1.2 | > 5 |
| 1 | C963 | 1.2 | 0.9 | > 5 |
| 1 | C967 | 1.7 | 1.6 | > 5 |
| 1 | C348 | 0.25 | 0.3 | > 5 |
| 1 | C265 | 0.25 | 0.3 | > 5 |
| 1 | C270 | 0.5 | 0.5 > 5 | |
| 1 | C350 | 0.4 | 0.5 | > 5 |
| 2 | C646 | 0.16 | 0.15 | > 5 |
| 2 | C814 | 1.9 | 1.1 | > 5 |
| 2 | C648 | 0.7 | 0.4 | > 5 |
| 3 | C062 | 1 | 1.2 | > 5 |
| Brequinar | 0.04 | 0.04 | > 5 |
1 פעילות שולחן. אנטי וcytotoxicity של 13תרכובות שנבחרו מהספרייה הכימית המקורית. התוצאות באות לידי ביטוי כערכי IC50 לעיכוב של MV או שכפול CHIKV. ערכי CC50 נמצאו> 5 מיקרומטר לכל התרכובות בניסויי מנת תגובה מהמסך המשני. אבל את סף סינון הניקוד לcytoxicity מהמסך הראשי מראה כי ערכי CC50 אפילו> 20 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
צינור ההקרנה המתואר כאן שואף בבחירת תרכובות עם פרופיל מתאים כמו מעכבי ספקטרום רחב של וירוסי RNA. כאשר ספרייה של 10,000 תרכובות הוקרן עם פרוטוקול זה וקריטריונים לסינון האמורים יושמו, כלומר עיכוב של שכפול MV מעולה ל75%, 40 תרכובות (0.4%) הבקיע חיובי. חוץ מזה, כמחצית מהם הראתה כמה רעילות בassay הכדאיות מבוססת לוציפראז, והיו התעלמות מסיבה זו. לבסוף, עשרות להיטים זמינים בכמות גדולה יותר היו להערכה מחדש. קבוצה קטנה זו להערכה מחדש בקלות לשתי רעילות סלולרית והעיכוב של שכפול נגיפי נגד MV וCHIKV בניסויי מנת תגובה (איור 4). הפעילות אנטי של כל התרכובות שנבחרו אושרה, ואחוזי הצלחת זיהוי כוללים לצינור הקרנה זו היו 1.3 ‰. ציון זה הוא דומה מאוד לתוצאות שהושגו על ידי קבוצות אחרות עם תפוקה גבוהה שונהמבחני מיון המבוסס על שכפול לantivirals 27,32, ונופל בטווח הצפוי למבחני פנוטיפי מבוססי תאים באופן כללי (1-5 ‰ 33). עם זאת, אחוזי הצלחה תלויה מאוד בשתי ספריית המתחם שהוקרנה וספי מסנן ניקוד, אשר יכולה להיות מותאמת בהתאם לפרופיל של הנתונים שנאספו. הנה, ספים נבחרו לעיכוב של שכפול MV ורעילות סלולרית נקבעו באופן אמפירי, ואת הסחר הוקם כדי לקבל מספר צייתן של להיטים, שניתן להערכה מחדש בקלות במסך המשני נגד CHIKV.
במסך הראשי, תרכובות נבדקו עבור שניהם היכולת שלהם לחסום שכפול MV וחוסר הרעילות סלולרית. פעילות אנטי נקבעה בריכוז של 2 מיקרומטר על תאי rMV2/Luc-infected ואילו רעילות סלולריות נקבעו ב20 מיקרומטר. הגדרות ניסיוניות אלה נמצאו יקרים כדי לבחור ישירות לתרכובות עם אנטי גבוהויראלי פעילות ביחס לרעילות סלולרית. בנוסף, המסך הראשוני בוצע בנוכחות uridine. ואכן, הפרסומים אחרונים מצביעים על כך שתרכובות מיקוד שלבים מוקדמים של מסלול ביוסינתזה פירימידין לעתים קרובות מבודדות כאשר מחפשים מעכבים של RNA וירוסי 13,16,27,28. בפרט, קבוצות מחקר מחפשים מולקולות אנטי מצאו מעכבים של דהידרוגנז dihydroorotate, האנזים הרביעי של מסלול מטבולים זה ביום 31. Uridine במדיום התרבות ביעילות טרנס משלים לעיכוב של אנזים זה, ובכך משחזר את שכפול נגיף. בדרך זו, תרכובות המונעות שכפול MV דרך עיכוב של מסלול ביוסינתזה פירימידין אינן נכללות ישירות מהלהיטים אנטי. לבסוף, Z'הגורם נמצא באופן שיטתי מעל 0.5, ובכך הוכיח את האיתנות הגבוהה ואיכות של assay.
במקביל, רעילות סלולרית נקבעה באמצעות גבוה throughpuassay מבוסס לוציפראז לא שקובע את מספר התאים הפעילים מטבולית בתרבות המבוססת על כימות של ה-ATP. בכל צלחת הקרנה, IGEPAL נוספה בבארות שליטה לרעילות. יש שאינו denaturing, חומרי ניקוי שאינו יוניים זה היתרון של להרוג ביעילות את כל סוגי התאים הלא ספציפי מבלי להשפיע על פעילות אנזים בלוציפראז. Z'הגורם היה באופן שיטתי מעל 0.5 מעל 125 צלחות, ובכך הוכיח את האיתנות הגבוהה ואיכות של assay. מגבלה אחת של assay הרעילות התאי זו היא העלות הגבוהה יחסית שלה. כassay חלופי כדי לקבוע כדאיות סלולרית, חלק מהקבוצות השתמשו בשורות תאי constitutively להביע לוציפראז מtransgene יציב 34. במבחנים כאלה, תרכובות רעילות צפויות לרדת או אפילו לדכא ביטוי לוציפראז כאשר המשפיעים על כדאיות סלולרית. לאחרונה פיתחו שורת תאים יציבה להביע לוציפראז על גירוי IFN-β 35, וקו תא זה משמש לבדיקת TRסט aining של 80 תרכובות רעילות סלולארי. באופן מפתיע, את מקדם המתאם (CC) בין assay זה וassay הכדאיות מבוסס לוציפראז שתואר לעיל היה נמוך יחסית (CC = 0.67). ואכן, כמה תרכובות לקויים ביטוי לוציפראז מtransgene, בעוד חילוף החומרים ATP לא נפגע. תרכובות אנטי כמה ספקטרום רחב עלולות להשפיע תפקודים תאיים כגון איתות תא, שעתוק הגנים או תרגום חלבון, שגם יפגע בביטוי גנים תאיים. למרות שאין מערכת סינון מושלמת לכדאיות סלולרית, הוא בסיכון שסינון תרכובות רעילות המבוססות על ביטוי גנים הסלולר יהיה פוטנציאל להוביל לאי הכללה של מולקולות אנטי בתום לב.
המסך המשני שמטרתה הקמת הפעילות אנטי של תרכובות שנבחרו נגד שני וירוסים RNA שאינם קשורים לחלוטין, תוך קביעה בדיוק IC50s. מעניין, יש לשים לב כי אנזים בלוציפראזמעכבים יכולים להיות הבקיע בטעות כחיובי בassay rMV2/Luc אך שווא חיובי כגון יסוננו החוצה על ידי המסך המשני שנבדקו בעת העיכוב של CHIKV / רן. ואכן, rMV2/Luc וCHIKV / רן להביע גחלילית ולוציפראז Renilla, בהתאמה, ושני אנזימים אלה אינם קשורים ולזרז תגובות כימיות שונות. תרכובות המעכבות כתב גחלילית לוציפראז מrMV2/Luc במסך הראשי לא מראות שום פעילות נגד CHIKV / רן ותיפסלנה, ובכך למנוע את הבחירה השגויה שלהם, כמו תרופות אנטי. באופן בלתי צפוי, כל 13 הלהיטים העיקריים חסימת שכפול MV גם עכבות CHIKV במסך משני זה. זה לא תמיד המקרה כפי כמה מעכבי MV-ספציפיים בודדו כאשר הקרנת ספריות אחרות (מידע לא מוצג). יתר על כן, תרכובות שנבחרו לשתף דמיון מבני וניתן לקבץ לשלוש משפחות כימיות (טבלה 1). תרכובות בתוך משפחה כימית כנראה יש את אותו מצב של acti ב, ולכן יכול להיחשב כתחליפים של אותה הישות הכימית. זה מעמיד בפרספקטיבה את העובדה שכל 13 התרכובות שנבחרו עכבות שני MV ושכפול CHIKV. אף על פי כן, תוצאות אלו יכולה גם מצביעות על כך שתרופות אנטי ספקטרום רחב לעתים קרובות יותר מאשר מעכבים זיהו וירוס ספציפי. הרציונל של השערה זו הוא כי, למרות ספציפיות מובן מאליו, את כל וירוסי RNA להסתמך על אותן הפונקציות בסיסיות הסלולר לשכפל, כגון מכונות ריבוזומלי, שלד תא או המיטוכונדריה כמקור לאנרגיה. מודולים פונקציונליים אלו הם מערכות מולקולריות מורכבות, המספקות פנל גדול יחסית של מטרות פוטנציאליות לתרופות אנטי ספקטרום רחב. לעומת זאת, יש רק קבוצה מצומצמת של גורמים נגיפיים או סלולריים המייצגים מטרות ראויות להעלות מעכבי וירוס ספציפי. בעתיד, פנלים חדשים של תרופות אנטי זוהו על ידי הקרנה פנוטיפי צריכים לספק הנתונים הדרושים כדי לאשר או לפסול את ההשערה הזאת.
s = "jove_content"> כתרכובות האמורות, מבודדות לו פרופיל מתאים למעכבי ספקטרום רחב של וירוסי RNA עם כמה מראים ערכי IC50 מתחת 1 מיקרומטר בשני MV ומבחני שכפול CHIKV. זה צריך להיות אישר עם מבחני יותר קונבנציונליים נגיפיים שכפול, ובכלל זה צעדים של צאצאים נגיפיים בsupernatants התרבות. גם פעילות אנטי של תרכובות שנבחרו תצטרך להיות מאושרת בפנל הרבה יותר גדול של וירוסי RNA. לסיכום, תרכובות אלה מייצגות נקודות התחלה מצוינות לפיתוח התרופות שלהם, עם ההפגנה של הפעילות אנטי במודלים של בעלי חיים זיהום כמטרה עיקרי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר איב L. יאנין על הערותיו הפורה והצעות. ברצוננו להודות לHH גד לChik / רן וג Combredet לתמיכה הטכנית שלה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון פסטר, המרכז הלאומי de la משוכלל ונדיר Scientifique (CNRS), המכון הלאומי דה לה סנטה et de la משוכלל ונדיר Médicale (INSERM), קרנו Institut - Infectieuses חוליי פסטר (סטינג התכנית לPOV וHM- L), Nationale סוכנות הידיעות לשפוך la משוכלל ונדיר (ANR-RPIB, תכנית סטינג 2.0 לPOV), ואת "Conseil d'האזורי Ile-de-צרפת" (כימי ספריית הפרויקט, מענקי N ° אני 06-222 / R ואני 09-1739 / R כדי HM-L.). העבודה על CHIKV / רן נתמכה על ידי ArbOAS הפרויקט (מענק ANR 2010-INTB-1601-1602).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freedom EVO platform | TECAN | Robotic platform | |
| 96-well polystyrene cell culture microplates, white | Greiner Bio One | 655083 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | Luciferase-based viability assay |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Reagent containing firefly luciferase substrate |
| Renilla-Glo luciferase Assay System | Promega | E2710 | Reagent containing Renilla luciferase substrate |
| Britelite plus Reporter Gene Assay System | Perkin-Elmer | 6016761 | Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity. |
References
- De Clercq, E. Antiviral drugs in current clinical use. J Clin Virol. 30, 115-133 (2004).
- Debing, Y., Jochmans, D., Neyts, J. Intervention strategies for emerging viruses: use of antivirals. Curr Opin Virol. , (2013).
- Leyssen, P., De Clercq, E., Neyts, J. Molecular strategies to inhibit the replication of RNA viruses. Antiviral Res. 78, 9-25 (2008).
- Leyssen, P., Balzarini, J., De Clercq, E., Neyts, J. The predominant mechanism by which ribavirin exerts its antiviral activity in vitro against flaviviruses and paramyxoviruses is mediated by inhibition of IMP dehydrogenase. J Virol. 79, 1943-1947 (2005).
- Wang, B. X., Fish, E. N. The yin and yang of viruses and interferons. Trends Immunol. 33, 190-197 (2012).
- Empey, K. M., Peebles, R. S., Kolls, J. K. Pharmacologic advances in the treatment and prevention of respiratory syncytial virus. Clin Infect Dis. 50, 1258-1267 (2010).
- Tan, S. L., Ganji, G., Paeper, B., Proll, S., Katze, M. G. Systems biology and the host response to viral infection. Nat Biotechnol. 25, 1383-1389 (2007).
- Prussia, A., Thepchatri, P., Snyder, J. P., Plemper, R. K. Systematic Approaches towards the Development of Host-Directed Antiviral Therapeutics. Int J Mol Sci. 12, 4027-4052 (2011).
- Connolly, D. J., O'Neill, L. A. New developments in Toll-like receptor targeted therapeutics. Curr Opin Pharmacol. , (2012).
- Thakur, C. S., et al. Small-molecule activators of RNase L with broad-spectrum antiviral activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9585-9590 (2007).
- Shoji-Kawata, S., et al. Identification of a candidate therapeutic autophagy-inducing peptide. Nature. 494, 201-206 (2013).
- Hoffman, E. S., Smith, R. E., Renaud, R. C. From the analyst's couch: TLR-targeted therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 4, 879-880 (2005).
- Bonavia, A., et al. Identification of broad-spectrum antiviral compounds and assessment of the druggability of their target for efficacy against respiratory syncytial virus (RSV). Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6739-6744 (2011).
- Rider, T. H., et al.
- Krumm, S. A., et al. Potent host-directed small-molecule inhibitors of myxovirus RNA-dependent RNA-polymerases. PLoS One. , (2011).
- Hoffmann, H. H., Kunz, A., Simon, V. A., Palese, P., Shaw, M. L. Broad-spectrum antiviral that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5777-5782 (2011).
- Harvey, R., et al. GSK983: a novel compound with broad-spectrum antiviral activity. Antiviral Res. 82, 1-11 (2009).
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nat Rev Drug Discov. 10, 507-519 (2011).
- Jochmans, D., Leyssen, P., Neyts, J. A novel method for high-throughput screening to quantify antiviral activity against viruses that induce limited CPE. J Virol Methods. 183, 176-179 (2012).
- Puig-Basagoiti, F., et al. High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery. Antimicrob Agents Chemother. 49, 4980-4988 (2005).
- Panchal, R. G., et al. Development of high-content imaging assays for lethal viral pathogens. J Biomol Screen. 15, 755-765 (2010).
- Pohjala, L., et al. Inhibitors of alphavirus entry and replication identified with a stable Chikungunya replicon cell line and virus-based assays. PLoS One. 6, (2011).
- Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening. Antiviral Res. 91, 11-19 (2011).
- Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem Biol. 17, 646-657 (2010).
- Komarova, A. V., et al. Proteomic analysis of virus-host interactions in an infectious context using recombinant viruses. Mol Cell Proteomics. , (2011).
- Henrik Gad, H., et al. The E2-E166K substitution restores Chikungunya virus growth in OAS3 expressing cells by acting on viral entry. Virology. 434, 27-37 (2012).
- Wang, Q. Y., et al. Inhibition of dengue virus through suppression of host pyrimidine biosynthesis. J Virol. 85, 6548-6556 (2011).
- Smee, D. F., Hurst, B. L., Day, C. W. D282, a non-nucleoside inhibitor of influenza virus infection that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis. Antivir Chem Chemother. 22, 263-272 (2012).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Qing, M., et al. Characterization of dengue virus resistance to brequinar in cell culture. Antimicrob Agents Chemother. 54, 3686-3695 (2010).
- Munier-Lehmann, H., Vidalain, P. O., Tangy, F., Janin, Y. L. On dihydroorotate dehydrogenases and their inhibitors and uses. J Med Chem. 56, 3148-3167 (2013).
- Yoon, J. J., et al. High-throughput screening-based identification of paramyxovirus inhibitors. J Biomol Screen. 13, 591-608 (2008).
- Maréchal, E., Roy, S., Lafanechère, L. Chemogenomics and Chemical Genetics: A User's Introduction for Biologists, Chemists and Informaticians. , Springer. (2011).
- Gentzsch, J., et al. Hepatitis C virus complete life cycle screen for identification of small molecules with pro- or antiviral activity. Antiviral Res. 89, 136-148 (2011).
- Caignard, G., et al. The V protein of Tioman virus is incapable of blocking type I interferon signaling in human cells. PLoS One. 8, (2013).
