Summary
In vitro assays for å måle virusreplikasjon er blitt betydelig forbedret ved utvikling av rekombinante RNA-virus som uttrykker luciferase, eller andre enzymer som er i stand til bioluminesens. Her vi detalj en high-throughput screening rørledning som kombinerer slike rekombinante stammer av meslinger og chikungunya virus å isolere bredspektret antivirale midler fra kjemiske biblioteker.
Abstract
RNA-virus er ansvarlig for store menneskelige sykdommer som influensa, bronkitt, dengue, hepatitt C eller meslinger. De representerer også en voksende trussel på grunn av økt over hele verden børser og befolkningstrengende flere og flere naturlige økosystemer. Et godt eksempel på en slik voksende situasjon er chikungunya virusepidemier av 2005-2006 i Det indiske hav. Nyere utvikler i vår forståelse av mobilnettet veier kontrollerende virusreplikasjon tyder på at forbindelser rettet vertscellefunksjonene, snarere enn selve viruset, kan hemme et stort panel av RNA-virus. Noen bredspektret antivirale forbindelser er identifisert med verts målrettede analyser. Imidlertid måle hemming av viral replikasjon i cellekulturer ved hjelp av reduksjon av cytopatiske virkninger som en avlesning representerer fortsatt et overordnet screeningstrategi. Slike funksjonelle skjermer har blitt kraftig forbedret med utviklingen av rekombinante virus uttrykker reporter enzymer caPable av bioluminescence som luciferase. I den foreliggende rapporten, vi detalj en high-throughput screening rørledningen, som kombinerer rekombinante meslinger og chikungunya virus med mobilnettet levedyktighet analyser, for å identifisere forbindelser med et bredspektret antiviral profil.
Introduction
RNA-virus er ansvarlig for et stort utvalg av menneskelige infeksjoner, og har en stor innvirkning på bestander over hele verden både når det gjelder folkehelse og økonomisk kostnad. Effektive vaksiner er blitt utviklet mot flere human RNA-virus, og er mye brukt som profylaktiske behandlinger. Det er imidlertid fremdeles en kritisk mangel på terapeutiske midler mot RNA virus infeksjoner. Faktisk, effektive vaksiner ikke er tilgjengelige mot humane patogener som dengue-virus, hepatitt C-virus eller humant respiratorisk syncytielt virus (HRSV). Dessuten RNA virus er ansvarlig for et flertall av nye sykdommer, som har økt i frekvens på grunn av globale børser og menneskelig påvirkning på økologiske systemer. Mot denne trusselen som representerer RNA virus, er vår terapeutiske arsenal ekstremt begrenset og relativt ineffektiv 1-3. Nåværende behandlingsformer er i hovedsak basert på rekombinant type I interferoner (IFN-α / β) for å stimulere medfødt immunitet,eller behandling med ribavirin. Selv om modusen for handling av denne ribonukleosid analog er kontroversielt og sannsynligvis er avhengig av ulike mekanismer, hemming av celle IMPDH (inosinmonofosfatdehydrogenase), som utarmer intracellulære GTP, er helt klart avgjørende fire. Ribavirin, i kombinasjon med pegylert IFN-α, er hoved behandling mot Hepatitt C-virus. Men, IFN-α / β og ribavirin behandlinger er av relativt dårlig effekt in vivo mot de fleste RNA-virus som de effektivt sløv IFN-α / β signalering gjennom uttrykk for virulens faktorer fem og ofte flykte ribavirin tre. Dette tilsettes til det faktum at ribavirin er å skaffe viktige toksisitetsproblemer, selv om det ble nylig godkjent mot HRSV alvorlig sykdom med kontroversielle fordeler 6.. I den senere tid har enkelte virus-spesifikke behandlinger blitt markedsført, i særdeleshet mot influensavirus med utviklingen of neuraminidasehemmere tre. Imidlertid, den store mangfold og permanent veksten av RNA virus utelukker utvikling av spesifikke behandlinger mot hver og en av dem i en forholdsvis nær fremtid. Til sammen understreker dette behovet for effektive strategier for å identifisere og utvikle potente antivirale molekyler i nær fremtid.
Det er trivielt å si at en bredspektret hemmer aktiv mot et stort panel av RNA-virus ville løse dette problemet. Selv om en slik molekyl er fortsatt en virolog drøm, vår bedre forståelse av cellulære forsvarsmekanismer og medfødte immunsystemet tyder på at noen muligheter finnes 7,8. Flere akademiske og industrielle laboratorier er nå søker molekyler som stimulerer bestemte fasetter av mobilnettet forsvarsmekanismer eller metabolske veier til demper virusreplikasjon. Selv om slike forbindelser vil sannsynligvis vise betydelige bivirkninger, vil behandlinger mot akutte virusinfeksjoner er administrereed i en relativt kort tid, noe som gjør dem akseptable tross for en viss potensiell toksisitet på lang sikt. Ulike strategier har blitt utviklet for å identifisere slike bredspektret antivirale molekyler. Noen forskningsprogrammer tar sikte på å finne molekyler som er rettet mot spesifikke forsvars eller stoffskifte. Dette omfatter, for eksempel, patogen gjenkjennings reseptorer for å fremkalle antiviral genekspresjon 9 og aktiverer antivirale faktorer som RnaseL 10, autophagy maskineri for å fremme virusforringelse 11, trasé nukleosidsyntese 12,13 eller apoptotiske kaskader for å utfelle døden av virus-infiserte celler 14. Andre grupper har utviklet fenotypiske skjermer som ikke målrette-baserte 13,15-17. I dette tilfellet blir antivirale molekyler ganske enkelt identifiseres ved deres evne til å blokkere viral replikasjon i en gitt mobilsystemet. Den generelle antagelse er at en forbindelse som hemmer 2-3 ubeslektede RNA virus ville ha en egnet profil for et bred spectrum antiviral molekyl. Virkningsmekanismen av hit-forbindelser valgt med en slik empirisk tilnærming er kun bestemt i en andre gang og til slutt kan føre til identifisering av nye cellulære mål for antivirale midler. Interessant nok har en retrospektiv analyse av nye medikamenter godkjent av US Food and Drug Administration mellom 1999 og 2008 vist at generelt slike fenotypiske screenings tendens til å prestere bedre enn målet baserte tilnærminger for å oppdage første-i-klassen små-molekyl narkotika 18 .
Virusreplikasjon i high-throughput celle-baserte analyser er vanligvis bestemmes fra virus cytopathic effekter. Celler infisert og dyrket i 96 - eller 384-brønners plater i nærvær av testede forbindelser. Etter noen dager, er mobilnettet lag faste og farget med fargestoffer som krystallfiolett. Til slutt blir absorbans bestemmes med en plate-leser og forbindelser som hemmer viral replikasjon er identifisert ved deres evne til å bevare cellulære lag from virus-indusert cytopatisk effekt. Alternativt blir viralt-medierte cytopatiske virkninger vurderes ved bruk av standard levedyktighet assays slik som MTS reduksjon. Slike analyser er svært medgjørlig og kostnadseffektiv, men lider av tre store begrensninger. For det første krever de en virus-cellekombinasjon hvor viral replikasjon er cytopatisk på bare noen få dager, men dette er ikke alltid mulig, og dermed ringer for alternative tilnærminger 19.. For det andre, er de dårlig kvantitativ siden de er basert på et indirekte mål for viral replikasjon. Endelig kan giftige forbindelser scores som positive treff, og må derfor være eliminert med en teller skjerm som måler cellular levedyktighet. For å overvinne noen av disse hindringer har rekombinante virus eller replikoner er konstruert ved revers genetikk for å uttrykke rapportør proteiner, slik som EGFP eller luciferase, fra en ytterligere transkripsjonsenhet eller i ramme med virale proteingener (Noen eksempler er 20 til 23). Når disse virusene replikere, reporter proteins er produsert sammen med viral proteiner selv. Dette gir en meget kvantitativ analyse for å måle viral replikasjon og evaluere hemmende aktivitet av kandidatmolekyler. Dette er spesielt sant for rekombinante virus uttrykker luciferase (eller andre enzymer som kan bioluminescence) siden dette reporter systemet viser et bredt dynamisk område med høy følsomhet og nesten ingen bakgrunn. Videre er det ingen magnetisering lyskilde, og dermed hindre interferens med forbindelsen fluorescens 24..
Her, til vi detalj en høy gjennomstrømming protokollen screene kjemiske biblioteker for bredspektret hemmere av RNA-virus. Forbindelser blir testet først på menneskelige celler infisert med et rekombinant meslinger virus (MV) uttrykker ildflueluciferase 25 (rMV2/Luc, Figur 1, primære skjermen). MV tilhører Mononegavirales orden, og er ofte betraktet som en prototypisk medlem av negativ-RNA-viruses. Som sådan er MV genom brukes som en mal av viral polymerase for å syntetisere mRNA-molekyler som koder for virale proteiner. I rekombinant MV stamme som heter rMV2/Luc, er luciferase uttrykk uttrykt fra en ekstra transkripsjon enhet som settes inn mellom P og M gener (Figur 2A). Parallelt med dette blir forbindelsene testet for deres toksisitet på humane celler ved hjelp av et kommersielt luciferase-baserte reagens som evalueres, med ATP kvantifisering, antallet metabolsk aktive celler i kultur (figur 1, primær screen). Hele kjemiske biblioteker kan lett screenes med disse to assays for å velge forbindelser som ikke er toksisk og effektivt blokkere MV replikasjon. Deretter blir treff testet på nytt for dose-respons-inhibering av MV-replikasjon, mangel på toksisitet, så vel som for deres evne til å svekke chikungunya virus (CHIKV) replikasjon (Figur 1, sekundær skjerm). CHIKV er medlem av Togaviridae familien og dens genom er apositive single-strand RNA molekyl. Som sådan, er det fullstendig irrelevant for meslinger og forbindelser som hemmer både MV og CHIKV stå en god sjanse til å hemme et stort panel av RNA-virus. CHIKV nonstructural proteiner er direkte oversatt fra det virale genom, mens strukturelle proteiner blir kodet av transkripsjon og translasjon av et mRNA-molekyl subgenome. Våre in vitro assay for replikering CHIKV er basert på en rekombinant stamme kalt CHIKV / Ren, som uttrykker Renilla-luciferase enzym som en spaltet del av nonstructural polyprotein gjennom en innsetting av reporter-genet mellom nsP3 og nsP4 sekvenser 26 (figur 2B). Målestokken for Renilla-luciferase-aktivitet tillater overvåking av viral replikasjon i den tidlige fasen av CHIKV livssyklus.
Denne high-throughput protokollen ble brukt til å raskt identifisere forbindelser med en passende profil for bredspektret antivirale midler i en kommersiell bibliotek med 10000 Molecmodulene beriket for kjemisk mangfold. Forbindelser ble i hovedsak følgende Lipinski styre på fem, med molekylvekt på mellom 250-600 dalton, og logge D-verdier under fem. Fleste av disse molekylene var nye virkestoffer som ikke finnes i andre kommersielle biblioteker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Utarbeidelse av 96-brønns Daughter Plater med forbindelser
- Beveg 96-brønners plater inneholdende moder 10 mM stamløsninger av kjemiske forbindelser i DMSO fra -20 ° C til romtemperatur. Fortynn forbindelser 5 ganger i DMSO for å oppnå mellomliggende 96-brønners plater ved fortynning 2 mM. Fortynning er oppnådd ved å pipettere 5 pl til 20 pl DMSO og blanding.
- Pipetter 1 mL fra fortynning plater til tørre brønner av hvitt, bar-kodet vevskulturstudier 96-brønners plater. Det første sett av datterplater (D1) vil bli brukt til å vurdere toksisiteten til forbindelsene ved en sluttkonsentrasjon på 20 uM. Oppbevar datter plater ved -20 ° C inntil bruk.
- Fortynne forbindelser igjen 1:10 ved å pipettere 4 mL fra fortynning plater i 36 mL av DMSO og miksing. Pipetter 1 mL til tørre brønner av hvit, flat bunn, bar-kodet vevskultur 96-brønner plater. Dette andre sett av datterplater (D2) blir brukt til å vurdere inhibisjon av MV replication av forbindelsene ved en endelig konsentrasjon på 2 uM. Oppbevar datter plater ved -20 ° C inntil bruk.
2. Utarbeidelse av cellekulturer for å Bestem Compound Toxicity
- Dyrk HEK-293T-celler ved 37 ° C og 5% CO2 i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med stabilisert L-glutamin, og supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS), streptomycin (100 pg / ml) og penicillin (100 IE / ml). Celler blir passaged ved trypsinering hver 4-5 dager, og fortynnet 1:10 i et friskt kolbe. Cellene bør være i log-fasen for eksperimenter.
- På dagen for eksperimentet, gjenopprette celler ved trypsinering og utføre celletelling. Pellet-celler ved sentrifugering, og resuspendere dem ved 3 x 10 5 celler / ml i kulturmedium. Betrakt at 12,5 ml av cellesuspensjonen er nødvendig for hver screening plate.
- Overfør cellene til et trau, og dispensere 100 ul av cellesuspensjonen i D1-plater inneholdende pigg kjemiske kompounds. Cellesuspensjon i trau regelmessig opphisset å unngå sedimentering.
- Spike kontroll brønner A1, C1, E1, G1, A12, C12, E12 og G12 med 1 mL av DMSO. Tilsvarende brønner vil bli brukt som referanse for levende celler (ingen toksisitet). Spike kontrollbrønner B1, D1, F1, H1, B12, D12, F12 og H12 med en ul av DMSO og 2,5 mL av en 0,5% IGEPAL løsning for å drepe celler. Tilsvarende brønner vil bli brukt som en referanse for døde celler (høy giftighet).
- Inkuber cellene i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
Tre. Utarbeidelse av cellekulturer infisert av rMV2/Luc
- Dyrk og gjenopprette celler som beskrevet i 2.1 og 2.2. Igjen, resuspender cellene ved 3 x 10 5 celler / ml i kulturmedium. Betrakt at 12,5 ml av cellesuspensjonen er nødvendig for hver screening plate.
- Valgfritt: supplement kulturmedium med uridin ved 20 pg / ml.
Merk: Når screening kjemiske biblioteker for viral replication hemmere, virker det som forbindelser rettet mot tidlige trinn av pyrimidin biosyntesen sti er ofte isolert 13,16,27,28. Tilsetningen av uridin til dyrkningsmediet blir brukt til å filtrere ut slikt antivirale molekyler. Faktisk, dette gjenoppretter effektivt virusreplikasjon når oppstrøms enzymer av pyrimidin biosyntesen veien blokkeres. - Lagre 1:10 cellesuspensjon for kontrollbrønner med ikke-infiserte celler, og videre til infeksjon med gjenværende volum.
- Tine det passende volumet av rMV2/Luc stamløsning. MV stamløsninger er vanligvis på 10 6 -10 8 infeksiøse partikler per ml. Kultur må være infisert med 0,1 infeksiøse partikler av rMV2/Luc pr målceller, noe som tilsvarer 0,1 multiplisitet for infeksjon (MOI). Merk: rMV2/Luc er avledet fra MV-vaksine (Schwarz-stamme) og manipuleres på en BSL2 miljø.
- Legg viruset til cellesuspensjonen, og bland forsiktig. Overfør-infiserte celler i et trau, og dispenser 100mL av infiserte cellesuspensjon i kolonne 2 til 11 av D2 plater inneholdende tilsatte kjemiske forbindelser. Cellesuspensjon i trau er regelmessig blandes forsiktig.
- I kolonne 1 og 12, dispensere 100 pl av ikke-infiserte celler et brønn på to. Infiserte celler blir utlevert i de andre brønnene.
- Inkuber cellene i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
4. Luciferase aktivitetstiltak og dataanalyse
- Fjern D1 plater fra inkubatoren, og bestemme cellulær levedyktighet ved å tilsette 50 ul av luciferase-baserte levedyktighet reagenset direkte til kulturbrønnene. Bland og inkuber i 10 min ved romtemperatur. Les plater med en luminometer. Integrasjonstiden settes til 100 ms pr brønn.
- Fjern D2 plater fra inkubatoren, og bestemme luciferase-aktivitet ved å tilsette 50 pl av luciferase substrat direkte til kulturbrønnene. Inkuber i 6 min ved romtemperatur og les plater med et luminometer som descriseng over.
- Beregn en Z'-faktor for hver D1 plate av toksisiteten assay for å garantere kvaliteten av skjermen 29.. Z '= 1-3 * (σ + + σ-) / (μ + - μ-), der μ + og σ + tilsvarer hjelp av luminescens og standardavvik for HEK-293T celler med DMSO alene (ingen toksisitet), og μ-og σ-er middel for luminescens og standardavvik for brønner kultur behandlet med IGEPAL å drepe celler. Z 'er forventet å være over 0,5, eller i den tilsvarende plate blir forkastet.
- Sett toksisitet terskel på μ + / 2. Kast forbindelser med luminescens verdier under denne cut-off (figur 3A).
- Beregn en Z'-faktor for hver D2 plate av den antivirale assay. Her μ + og σ + tilsvarer hjelp av luminescens og standardavvik for infiserte celler dyrket med DMSO alene, og μ-og σ-er midler for luminescens og standardavvik for ikke-infiserte celler. Igjen, plater med Z & #39; verdier under 0,5 blir forkastet.
- Beregn inhibering av virusreplikasjon som følger: Prosent hemming = (μ + - luciferase-aktivitet for forbindelse X) / (μ + - μ-) * 100. Sett hemming terskelen på 75%, og velg forbindelser som både reduserer luminescens verdier under denne cut-off (Figur 3B) og er ikke giftig i henhold til kriterier som er beskrevet i 4.4.
5. Sekundær skjerm for toksisitet og Bredspektret Antiviral aktivitet
- Kontroller 01:02 seriefortynning for hvert hit forbindelsen i DMSO, fra 500 uM til 4 um (8 fortynninger). Fyll hvite, strekkodet vevskulturplater med 50 mL av kultur medium. Legg 1 mL av hver forbindelse fortynning i kulturbrønner. Gjenta to ganger for å ha tre petriskåler med dupliserte seriefortynning for hvert treff sammensatte.
- Forbered 37,5 ml av en HEK-293T cellesuspensjon ved 6 x 10 5 celler / ml i kulturmedium, som beskrevet ovenfor (i 2,1 og 20,2). Tilsett 2x 12,5 ml i Falconrør og infisere celler med enten rMV2/Luc på MOI = 0,1 eller rekombinant CHIKV uttrykker Renilla luciferase (CHIKV / Ren) på MOI = 0,2. Bland ved å snu.
Merk: CHIKV / Ren er avledet fra en villtype stamme av CHIKV og derfor bør bli manipulert i en BSL3 miljø. Plater kan flyttes fra BSL3 til BSL1 gang Renilla underlaget er lagt til kultur brønner (se nedenfor). - Tilsett 50 mL av friske, rMV2/Luc-infected, eller CHIKV / Ren-infiserte celler i kultur plater som inneholder serielle fortynninger av hit-forbindelser. Inkuber i 24 timer ved 37 ° C.
- Tilsett 50 pl av ildflue luciferase substrat for å fastslå ildflue luciferase-aktivitet i rMV2/Luc-infected brønner. Tilsett 50 mL av Renilla luciferase substrat å bestemme Renilla luciferase aktivitet i CHIKV / Ren-infiserte brønner. Til slutt, tilsett 50 pl av luciferase-baserte levedyktighet assay-reagens til ikke-infiserte celler for å bestemme cellulær levedyktighet.
- Plot data (Figure 4) og bestemme rammet sammensatte konsentrasjoner som hemmer MV og CHIKV replikering med 50%. Se bort fra forbindelsen viser noen toksisitet i denne analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette screening rørledningen er avhengig først på valg av forbindelser som hemmer MV replikering og ikke viser noen betydelig cellulær toksisitet (Figur 1, primære skjermen). Den tar fordel av luciferase-baserte analyser for å bestemme cellulær toksisitet og inhibering av viral replikasjon. Alle pipetteringstrinn og datainnsamling kan utføres i en high-throughput-innstillingen med en robot-plattform.
Cellulær toksisitet av forbindelsene ble vurdert ved hjelp av et luciferase-assay basert levedyktighet som evaluerer antallet levende celler i kultur basert på kvantifisering av ATP til stede, noe som tilsvarer metabolsk aktive celler. Fordi luciferin oksydasjon av luciferase er ATP-avhengig, er luminescens signal direkte proporsjonalt med cellulære ATP gis av levende celler. Figur 3A viser resultatene for en representativ screening plate. Som forventet, svært distinkte luciferase aktivitet verdier var måleed i kontrollbrønner som inneholdt enten levende celler eller døde celler drept med IGEPAL. Terskel er empirisk satt til μ + / 2 til å filtrere ut forbindelser som viser noen cellulær toksisitet og i denne saken, ble 21 forbindelser fra denne platen forkastet. Parallelt blir antiviral aktivitet målt ved hjelp av rMV2/Luc, en rekombinant stamme av MV uttrykker luciferase (figur 2). Menneske HEK-293T celler brukes fordi de er svært sensitive for MV infeksjon. Som et resultat, er luciferase-aktivitet i infiserte kulturbrønner meget høy (200 til 300 x 10 3 luciferase aktivitetsenheter i kontrollbrønner). Dette gir et stort dynamisk område som muliggjør valg av MV replikering inhibitorer. Figur 3B viser representative resultater oppnådd for en screening plate. Fire forbindelser en hemming av viral replikasjon ved mer enn 75% i dette eksempel, og ble tatt ut.
Til slutt, forbindelser som ikke er giftige og scoretpositiv i virusreplikasjon assay blir valgt (figur 3A og 3B). Deres halvdel maksimal hemmende konsentrasjon (IC50) bestemmes både MV-og CHIKV, som er to ikke-relaterte RNA-virus (figur 1, sekundær skjerm). Antiviral aktivitet hit-forbindelser bestemmes ved hjelp av rekombinante virusstammer uttrykker enten firefly (rMV2/Luc) eller Renilla (CHIKV / Ren) luciferase. Figur 4A og 4B viser representative inhiberingskurver for MV og CHIKV replikering, henholdsvis. Disse kurvene er benyttet for å bestemme IC50s av hit forbindelser. Parallelt blir mangel på cellulær toksisitet av utvalgte forbindelser bekreftet i en dose-respons eksperiment ved hjelp av luciferase-baserte levedyktighet analysen beskrevet ovenfor (figur 4C). Tabell 1 viser IC50-verdiene for MV-og CHIKV replikering på et sett av 13 non -giftige forbindelser identifisert fra en kjemisk bibliotek på 10.000 molekyler. Disse compounds er romanen både når det gjelder kjemisk struktur og biologisk aktivitet. Noen av disse molekylene felles strukturelle likheter, og kan samles opp i tre distinkte kjemiske familier. Som en referanse, er IC50-verdiene som ble oppnådd med brequinar også vist i tabell 1.. Brequinar er en hemmer av dihydroorotate dehydrogenase, den fjerde enzym av pyrimidine biosynthesis pathway, med et potent antiviral aktivitet in vitro 30,31. Når man ser på IC50-verdier, mindre enn én størrelsesorden separert denne referansemolekylet fra de mest aktive treff identifisert ved screening. Dette etablerte den sterke antivirale aktiviteten til utvalgte forbindelser.
Figur 1. Oppsummering av screening rørledningen. Venstre panel viser at primary skjermen der forbindelser er valgt for den manglende giftighet og kapasitet til å blokkere MV replikering. Høyre panel viser den sekundære skjermen der den antivirale aktiviteten til utvalgte forbindelser er bekreftet, og deres evne til å blokkere CHIKV replikering bestemmes. Forbindelser som effektivt blokkerer MV og CHIKV uten betydelig toksisitet anses som potensielle bredspekt hemmere av RNA-virus. Klikk her for å se større bilde .
Figur 2. Genomisk organisering av rekombinante RNA virus bærer luciferase genet. (A) rMV2/Luc: MV negativ forstand RNA genom vises med sin 3 'enden på venstre side, med de seks generangitt med store bokstaver og avbildet som hvite rektangler. Den ekstra transcriptional enheter koding for reporteren genet er satt inn mellom P og M gener og avbildet som en gul rektangel (B) CHIKV / Ren:. Det CHIKV positiv forstand RNA genom vises med sin 5'-capped enden på venstre side, med den åpne leseramme som koder for de fire ikke-strukturelle proteiner (nsP1-4). for å vise større bilde .
Fig. 3. Representative resultater for en 96-brønns plate screening. (A) luciferase-verdiene oppnådd med luciferase-assay basert levedyktighet. Kolonner 1 og 12 tilsvarer alternative kontroller med DMSO alene ("+"; ingen toksisitet) eller IGEPAL ("-"; høy toxi by). Blå farge er å fremheve forbindelser som anses ikke giftig i henhold til ATP konsentrasjoner påvist i kulturbrønner, mens hvite brønner tilsvarer giftige forbindelser (luciferase verdier <12 203 x 10 3). (B) luciferase verdier oppnådd med rMV2/Luc-infected celler. Kolonne 1 og 12 tilsvarer alternative kontroller, det vil si ikke-infiserte HEK-293T celler ("-") eller rMV2/Luc-infected celler behandlet med DMSO alene ("+"). For hver testet forbindelse, er figuren viser både luciferase luminescens-signalet, og andelen av hemming i forhold til kontrollbrønner. Forbindelser som hemmer luminescence signal med mer enn 75% er merket med gult eller grønt, avhengig om de ble ansett som giftig eller ikke som bestemmes i (A). Dermed er grønn farge viser hit forbindelser som hemmer MV replikering og ikke påvirker cellulær levedyktighet.t = "_blank"> Klikk her for å se større bilde.
Figur 4. Dose-respons antiviral aktivitet og toksisitet av forbindelser C864, C648 og C062. (A) HEK-293T celler ble infisert med rMV2/Luc stamme av MV uttrykke luciferase (MOI = 0,1), og inkubert med økende doser av C864, C648, C062 eller DMSO alene. Etter 24 timer ble luciferase ekspresjon bestemmes. * Angir at de observerte luciferase hemninger var statistisk signifikant med alle tre forbindelser (p-verdi <0,05). (B) HEK-293T-celler ble infisert med CHIKV / Ren stamme av CHIKV uttrykker Renilla-luciferase (MOI = 0,2), og inkubert med økende doser av C864, C648, C062 eller DMSO alene. Etter 24 timer ble Renilla luciferase uttrykk bestemmes. * Indikerer statistisktisk signifikante hemninger med alle tre forbindelser (p-verdi <0,05). (C) HEK-293T-celler ble inkubert med økende doser av C864, C648, C062 eller DMSO alene. Som en kontroll for toksisitet, ble cellekulturer supplert med 2,5 pl av en 0,5% IGEPAL løsning. Etter 24 timer ble antall levende celler bestemmes ved hjelp av luciferase-basert levedyktighet analysen. Klikk her for å se større bilde .
| Kjemisk familie | Compound | MV (IC50 mikrometer) | CHIKV (IC50 mikrometer) | CC50 (mikrometer) |
| 1 | C864 | 0.6 | 0.6 | > 5 |
| 1 | C877 | 0,2 | 0,2 | > 5 |
| 1 | C957 | 1.2 | 1.2 | > 5 |
| 1 | C963 | 1.2 | 0,9 | > 5 |
| 1 | C967 | 1.7 | 1.6 | > 5 |
| 1 | C348 | 0,25 | 0,3 | > 5 |
| 1 | C265 | 0,25 | 0,3 | > 5 |
| 1 | C270 | 0,5 | 0,5 > 5 | |
| 1 | C350 | 0,4 | 0,5 | > 5 |
| 2 | C646 | 0,16 | 0,15 | > 5 |
| 2 | C814 | 1.9 | 1.1 | > 5 |
| 2 | C648 | 0,7 | 0,4 | > 5 |
| 3 | C062 | 1 | 1.2 | > 5 |
| Brequinar | 0,04 | 0,04 | > 5 |
Tabell 1.. Antiviral aktivitet og cytotoksisitet til 13forbindelser valgt fra den opprinnelige kjemiske bibliotek. Resultatene er uttrykt som IC50-verdier for inhibering av MV-eller CHIKV replikasjon. CC50-verdier ble funnet> 5 uM for alle forbindelser i dose-responsforsøk fra den sekundære skjermen. Men poengfilterterskelen for cytoxicity fra primærskjerm antyder at CC50-verdier er også> 20 uM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den screening rørledning beskrevet her tar sikte på å velge forbindelser med en egnet profil som bredspektret hemmere av RNA-virus. Når et bibliotek på 10.000 forbindelser ble screenet med denne protokollen og nevnte filtreringskriterier ble benyttet, dvs. hemming av MV replikering overlegen til 75%, 40 forbindelser (0,4%) scoret positive. Dessuten, om lag halvparten av dem viste noen toksisitet i luciferase-basert levedyktighet analysen, og ble ignorert av den grunn. Til slutt ble det et dusin av treff lett tilgjengelig i større mengde testes på nytt. Denne lille settet var lett testes for både cellulær toksisitet og inhibering av viral replikasjon mot MV og CHIKV i dose-respons-forsøk (figur 4). Den antivirale aktiviteten av alle valgte forbindelser ble bekreftet, og den samlede identifikasjon hit rate for dette screening rørledningen var 1,3 ‰. Denne poengsummen er svært lik resultatene oppnådd av andre grupper med forskjellig høy gjennomstrømmingreplikasjons-basert screening-analyser for antivirale 27,32, og faller i det forventede område for cellebaserte assays fenotypiske generelt (1-5 ‰ 33). Imidlertid er en treffhastighet sterkt avhengig av både det sammensatte bibliotek som er vist og de scoring filter terskler, som kan justeres avhengig av profilen av innsamlede data. Her ble valgt terskler for hemming av MV replikering og cellulær toksisitet empirisk bestemt, og trade off ble satt til å få en medgjørlig antall treff som lett kan testes på nytt i den sekundære skjermen mot CHIKV.
I den primære skjerm, ble forbindelsene testet med hensyn til både deres evne til å blokkere MV replikasjon og mangel på cellulær toksisitet. Antiviral aktivitet ble bestemt ved en konsentrasjon på 2 mM for rMV2/Luc-infected celler mens cellulær toksisitet ble bestemt på 20 uM. Disse eksperimentelle innstillinger ble funnet verdifullt å velge direkte for forbindelser med høy antiviral aktivitet i forhold til cellulær toksisitet. I tillegg ble den primære skjermen utføres i nærvær av uridin. Faktisk, nyere publikasjoner tyder på at forbindelser rettet tidlige trinn av pyrimidin biosyntesen sti er ofte isolert når vi leter etter hemmere av RNA virus 13,16,27,28. Spesielt har forskningsgrupper på jakt etter antivirale molekyler funnet hemmere av dihydroorotate dehydrogenase, den fjerde enzymet av denne metabolismen 31. Uridin i kulturmedium effektivt trans-komplementer for inhiberingen av dette enzymet, og derved gjenoppretter viral replikasjon. På denne måten fremstilles forbindelser som hindrer MV replikasjon ved hemming av pyrimidine biosynthesis pathway direkte ekskludert fra de antivirale treff. Til slutt ble Z'-faktoren funnet å være systematisk over 0,5, og dermed demonstrere høy robusthet og kvaliteten av analysen.
Parallelt ble cellulær toksisitet bestemmes ved hjelp av en high-throughput luciferase-basert assay som bestemmer antallet av metabolsk aktive celler i kultur basert på kvantifisering av ATP. I hver screening plate, ble IGEPAL lagt i kontrollbrønner for toksisitet. Denne ikke-denaturerende, ikke-ioniske vaskemiddel har fordelen av å drepe effektivt alle celletyper ikke-spesifikt uten å påvirke enzymaktivitet luciferase. Z'-faktor var systematisk over 0,5 over 125 plater, noe som viser høy robusthet og kvaliteten av analysen. En begrensning av denne cellulære toksisitetsanalyse er dets relativt høye kostnad. Som et alternativ analyse for å bestemme cellulær levedyktighet, har enkelte grupper anvendes cellelinjer som konstitutivt uttrykker luciferase fra et stabilt transgen 34.. I slike analyser, er giftige forbindelser forventes å redusere eller til og med undertrykke luciferase ekspresjon ved å påvirke cellulær levedyktighet. Vi har nylig utviklet en stabil cellelinje som uttrykker luciferase ved IFN-β stimulering 35, og denne cellelinje ble benyttet for å teste en training sett av 80 forbindelser for cellulær toksisitet. Overraskende, korrelasjonskoeffisienten (CC) mellom denne analysen, og luciferase-baserte levedyktighet analysen beskrevet ovenfor var forholdsvis lav (CC = 0,67). Faktisk flere forbindelser svekket luciferase uttrykk fra transgenet, mens ATP stoffskiftet var upåvirket. Noen bredspektret antivirale forbindelser er sannsynlig å påvirke cellulære funksjoner som cellesignalisering, gentranskripsjon eller protein oversettelse, som også vil svekke cellular genuttrykk. Selv om det ikke er perfekt screening system for mobilnettet levedyktighet, er det risiko for at filtrering giftige forbindelser basert på mobilnettet genuttrykk vil potensielt føre til utelukke bona fide antivirale molekyler.
Den sekundære skjermen tar sikte på å etablere den antivirale aktiviteten til utvalgte forbindelser mot to helt urelaterte RNA virus, mens bestemme nettopp deres IC50s. Interessant nok, bør det bli lagt merke til at enzymet luciferaseinhibitorer kan bli feilaktig scoret som positive i rMV2/Luc assay, men slike falske positiver vil bli filtrert ut av det sekundære skjermen når de ble testet for inhibering av CHIKV / Ren. Faktisk rMV2/Luc og CHIKV / Ren uttrykke ildflue og Renilla luciferase, henholdsvis, og disse to enzymene er irrelevant og katalysere ulike kjemiske reaksjoner. Forbindelser som hemmer ildflueluciferase reporter fra rMV2/Luc i den primære skjermen vil ikke vise noen aktivitet mot CHIKV / Ren og vil bli forkastet, og dermed hindre deres feilaktige valg som antivirale midler. Uventet, alle 13 primær treff blokkerer MV replikering også hemmet CHIKV i denne sekundære skjermen. Dette er ikke alltid tilfelle så få MV-spesifikke hemmere ble isolert når screening andre bibliotek (data ikke vist). Videre utvalgte forbindelser dele strukturelle likheter og kan grupperes i bare tre kjemiske familier (Tabell 1). Forbindelser innen en kjemisk familie sannsynligvis har samme virknings aktivion, og derfor kan betraktes som analoger av samme kjemiske enhet. Dette setter i perspektiv det faktum at alle 13 utvalgte forbindelser hemmet både MV og CHIKV replikering. Likevel kan disse resultatene tyder også på at bredspektret antivirale midler er oftere identifisert enn virus-spesifikke hemmere. Den rasjonelle bak denne hypotesen er at, til tross for åpenbare særegen, alle RNA-virus er avhengige av de samme grunnleggende cellulære funksjoner for å gjenskape, for eksempel ribosomal maskiner, cytoskjelettet eller mitokondrier som en kilde til energi. Disse funksjonelle moduler er komplekse molekylære systemer, som gir et relativt stort panel av potensielle mål for bredspektret antivirale midler. I motsetning til dette er det bare et begrenset sett med virale eller cellulære faktorer som representerer hensiktsmessige mål å øke virus-spesifikke inhibitorer. I fremtiden bør nye paneler av antivirale identifisert av fenotypisk screening gi nødvendige data for å bekrefte eller avkrefte denne hypotesen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Yves L. Janin for hans fruktbare kommentarer og forslag. Vi vil gjerne takke HH Gad for Chik / Ren og C. Combredet for hennes teknisk support. Dette arbeidet ble støttet av Institut Pasteur, den Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Institut National de la Santé et de la Recherche MEDICALE (INSERM), Institut Carnot - Pasteur sykdommer Infectieuses (Programme STING til POV og HM- L), Agence Nationale pour la Recherche (ANR-RPIB, Programme STING 2,0 til POV), og "Conseil Régional d'Ile-de-France" (Chemical bibliotekprosjektet, tilskudd n ° jeg 06-222 / R og jeg 09-1739 / R til HM-L.). Arbeidet med CHIKV / Ren ble støttet av prosjekt ArbOAS (ANR stipend 2010-INTB-1601-1602).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freedom EVO platform | TECAN | Robotic platform | |
| 96-well polystyrene cell culture microplates, white | Greiner Bio One | 655083 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | Luciferase-based viability assay |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Reagent containing firefly luciferase substrate |
| Renilla-Glo luciferase Assay System | Promega | E2710 | Reagent containing Renilla luciferase substrate |
| Britelite plus Reporter Gene Assay System | Perkin-Elmer | 6016761 | Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity. |
References
- De Clercq, E. Antiviral drugs in current clinical use. J Clin Virol. 30, 115-133 (2004).
- Debing, Y., Jochmans, D., Neyts, J. Intervention strategies for emerging viruses: use of antivirals. Curr Opin Virol. , (2013).
- Leyssen, P., De Clercq, E., Neyts, J. Molecular strategies to inhibit the replication of RNA viruses. Antiviral Res. 78, 9-25 (2008).
- Leyssen, P., Balzarini, J., De Clercq, E., Neyts, J. The predominant mechanism by which ribavirin exerts its antiviral activity in vitro against flaviviruses and paramyxoviruses is mediated by inhibition of IMP dehydrogenase. J Virol. 79, 1943-1947 (2005).
- Wang, B. X., Fish, E. N. The yin and yang of viruses and interferons. Trends Immunol. 33, 190-197 (2012).
- Empey, K. M., Peebles, R. S., Kolls, J. K. Pharmacologic advances in the treatment and prevention of respiratory syncytial virus. Clin Infect Dis. 50, 1258-1267 (2010).
- Tan, S. L., Ganji, G., Paeper, B., Proll, S., Katze, M. G. Systems biology and the host response to viral infection. Nat Biotechnol. 25, 1383-1389 (2007).
- Prussia, A., Thepchatri, P., Snyder, J. P., Plemper, R. K. Systematic Approaches towards the Development of Host-Directed Antiviral Therapeutics. Int J Mol Sci. 12, 4027-4052 (2011).
- Connolly, D. J., O'Neill, L. A. New developments in Toll-like receptor targeted therapeutics. Curr Opin Pharmacol. , (2012).
- Thakur, C. S., et al. Small-molecule activators of RNase L with broad-spectrum antiviral activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9585-9590 (2007).
- Shoji-Kawata, S., et al. Identification of a candidate therapeutic autophagy-inducing peptide. Nature. 494, 201-206 (2013).
- Hoffman, E. S., Smith, R. E., Renaud, R. C. From the analyst's couch: TLR-targeted therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 4, 879-880 (2005).
- Bonavia, A., et al. Identification of broad-spectrum antiviral compounds and assessment of the druggability of their target for efficacy against respiratory syncytial virus (RSV). Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6739-6744 (2011).
- Rider, T. H., et al.
- Krumm, S. A., et al. Potent host-directed small-molecule inhibitors of myxovirus RNA-dependent RNA-polymerases. PLoS One. , (2011).
- Hoffmann, H. H., Kunz, A., Simon, V. A., Palese, P., Shaw, M. L. Broad-spectrum antiviral that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5777-5782 (2011).
- Harvey, R., et al. GSK983: a novel compound with broad-spectrum antiviral activity. Antiviral Res. 82, 1-11 (2009).
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nat Rev Drug Discov. 10, 507-519 (2011).
- Jochmans, D., Leyssen, P., Neyts, J. A novel method for high-throughput screening to quantify antiviral activity against viruses that induce limited CPE. J Virol Methods. 183, 176-179 (2012).
- Puig-Basagoiti, F., et al. High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery. Antimicrob Agents Chemother. 49, 4980-4988 (2005).
- Panchal, R. G., et al. Development of high-content imaging assays for lethal viral pathogens. J Biomol Screen. 15, 755-765 (2010).
- Pohjala, L., et al. Inhibitors of alphavirus entry and replication identified with a stable Chikungunya replicon cell line and virus-based assays. PLoS One. 6, (2011).
- Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening. Antiviral Res. 91, 11-19 (2011).
- Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem Biol. 17, 646-657 (2010).
- Komarova, A. V., et al. Proteomic analysis of virus-host interactions in an infectious context using recombinant viruses. Mol Cell Proteomics. , (2011).
- Henrik Gad, H., et al. The E2-E166K substitution restores Chikungunya virus growth in OAS3 expressing cells by acting on viral entry. Virology. 434, 27-37 (2012).
- Wang, Q. Y., et al. Inhibition of dengue virus through suppression of host pyrimidine biosynthesis. J Virol. 85, 6548-6556 (2011).
- Smee, D. F., Hurst, B. L., Day, C. W. D282, a non-nucleoside inhibitor of influenza virus infection that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis. Antivir Chem Chemother. 22, 263-272 (2012).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Qing, M., et al. Characterization of dengue virus resistance to brequinar in cell culture. Antimicrob Agents Chemother. 54, 3686-3695 (2010).
- Munier-Lehmann, H., Vidalain, P. O., Tangy, F., Janin, Y. L. On dihydroorotate dehydrogenases and their inhibitors and uses. J Med Chem. 56, 3148-3167 (2013).
- Yoon, J. J., et al. High-throughput screening-based identification of paramyxovirus inhibitors. J Biomol Screen. 13, 591-608 (2008).
- Maréchal, E., Roy, S., Lafanechère, L. Chemogenomics and Chemical Genetics: A User's Introduction for Biologists, Chemists and Informaticians. , Springer. (2011).
- Gentzsch, J., et al. Hepatitis C virus complete life cycle screen for identification of small molecules with pro- or antiviral activity. Antiviral Res. 89, 136-148 (2011).
- Caignard, G., et al. The V protein of Tioman virus is incapable of blocking type I interferon signaling in human cells. PLoS One. 8, (2013).
