Summary
В пробирке тесты для измерения репликацию вируса были значительно улучшены по разработке рекомбинантных РНК-содержащих вирусов, экспрессирующих люциферазы или другие ферменты, способные биолюминесценции. Здесь мы подробно на высокопроизводительного скрининга трубопровод, который сочетает в себе такие рекомбинантных штаммов кори и Чикунгунья вирусов изолировать противовирусные препараты широкого спектра действия из химических библиотек.
Abstract
РНК-вирусы несут ответственность за крупных заболеваний человека, таких как грипп, бронхит, лихорадка денге, гепатит С или кори. Они также представляющих собой растущую угрозу из-за увеличения мировых биржах и человеческих популяций, проникающих все больше и больше природных экосистем. Хорошим примером такого складывающейся ситуации является вирус чикунгунья эпидемии 2005-2006 в Индийском океане. Последние достижения в понимании клеточных путей, контролирующих репликацию вируса предполагают, что соединения, нацеленные функции клетки-хозяина, а не сам вирус, может ингибировать большой панель РНК-содержащих вирусов. Некоторые широкого спектра противовирусных соединений были идентифицированы с принимающими целевых анализов. Однако измерения ингибирования репликации вируса в клеточных культурах, используя снижение цитопатического эффекта в качестве отсчета все еще представляет первостепенную стратегию скрининга. Такие функциональные экраны были значительно улучшены по разработке рекомбинантных вирусов, экспрессирующих ферментами-репортерами окpable биолюминесценции, таких как люциферазы. В настоящем докладе мы подробно на высокопроизводительного скрининга трубопровода, который сочетает в себе рекомбинантные кори и Чикунгунья вирусы с сотовой жизнеспособность анализов, для идентификации соединений с широким спектром противовирусной профиля.
Introduction
РНК-вирусы несут ответственность за большое разнообразие человеческих инфекций, и имеют огромное влияние на популяции во всем мире как с точки зрения общественного здравоохранения и экономичной цене. Эффективные вакцины были разработаны против нескольких вирусов человеческого РНК, и широко используются в качестве профилактического лечения. Тем не менее, все еще существует критическая нехватка лекарственных препаратов против вирусных РНК инфекций. Действительно, эффективные вакцины не доступны по отношению к основным человеческих патогенов, таких как вирус денге, вирус гепатита С или вируса человеческого респираторного синцитиального (РСВЧ). Кроме того, РНК-вирусы несут ответственность за большинством возникающих болезней, которые увеличили частоты из-за глобальных обменов и антропогенного воздействия на экологические системы. Против этой угрозы, которые представляют РНК-содержащих вирусов, наш терапевтический арсенал крайне ограничен и относительно неэффективны 1-3. Современные методы терапии в основном на основе рекомбинантного типа I интерферонов (ИФН-α / β), чтобы стимулировать врожденный иммунитет,или администрация рибавирином. Хотя механизм действия этого рибонуклеозид аналоговых является спорным и, вероятно, используются различные механизмы, ингибирование клеточного IMPDH (инозинмонофосфатдегидрогеназы), который истощает внутриклеточные бассейны GTP, явно необходимы 4. Рибавирин, в сочетании с пегилированного интерферона-α, является основным лекарственным средством против вируса гепатита С.. Тем не менее, ИФН-α / β и рибавирина процедуры относительно плохой эффективности в естественных условиях по отношению к большинству РНК-содержащих вирусов, поскольку они эффективно тупые ИФН-α / β сигналов через выражение факторов вирулентности 5 и часто избежать рибавирин 3. Это добавило к тому, что лечение рибавирин повышение важные вопросы, связанные с токсичностью, хотя был недавно одобрен против тяжелой болезни РСВЧ с спорные преимущества 6. В последнее время некоторые вирус-специфических методов лечения, поступающие в продажу, в частности, против вируса гриппа с разработкой Oе ингибиторы нейраминидазы 3. Тем не менее, большая разнообразие и постоянное появление РНК-содержащих вирусов препятствует развитию конкретных обработок против каждого из них в относительно недалеком будущем. В целом, это подчеркивает необходимость эффективных стратегий для определения и разработки мощных противовирусных молекул в ближайшем будущем.
Это тривиально, чтобы сказать, что ингибитор широкого спектра активен в отношении большого панели РНК-содержащих вирусов бы решить эту проблему. Хотя такая молекула-прежнему мечта вирусолог, наша лучшее понимание клеточных защитных механизмов и врожденной иммунной системы предполагают, что некоторые возможности существуют 7,8. Несколько академических и промышленных лабораторий в настоящее время ищет молекулы, которые стимулируют конкретные аспекты сотовой защитных механизмов или метаболических путей притупить репликацию вируса. Хотя такие соединения, вероятно, покажут значительные побочные эффекты, лечения от острых вирусных инфекций будет Администрированиеред в течение относительно короткого времени, что делает их приемлемыми, несмотря на некоторые потенциальной токсичности на долгосрочной перспективе. Различные стратегии были разработаны для выявления таких широкого спектра противовирусных молекул. Некоторые исследовательские программы направлены на поиск молекул, которые ориентированы на конкретные оборонные или метаболических путей. Это включает в себя, например, рецепторы распознавания патогена, чтобы вызвать экспрессию гена противовирусного 9 и активируют противовирусные такие факторы, как RNaseL 10, аутофагии машин для содействия деградации вирусного 11, нуклеозид синтез дорожками 12,13, или апоптоза каскадов, чтобы осадить гибель инфицированных вирусом клеток 14. Другие группы разработали фенотипические экраны, которые не являются целевыми, основанные 13,15-17. В этом случае, противовирусные молекулы просто идентифицировать по их способности блокировать вирусную репликацию в данной сотовой системой. Общее предположение, что соединение, ингибирующее 2-3 несвязанных вирусов РНК будет иметь подходящий профиль для широкого-SPectrum противовирусной молекуле. Механизм действия хит соединений, выбранных с таким эмпирического подхода определяется только во второй раз и в конце концов, может привести к идентификации новых клеточных мишеней для противовирусных препаратов. Интересно, что ретроспективный анализ новых лекарств, одобренных в США продуктов питания и медикаментов в период между 1999 и 2008 показал, что в общем, такие фенотипические показы, как правило, работают лучше, чем целевых подходов, чтобы обнаружить первый в своем классе низкомолекулярные препараты 18 .
Репликация вируса в клеточной основе анализов высокой пропускной обычно определяется от вирусных цитопатических эффектов. Клетки инфицируют и культивировали в 96 - или 384-луночных планшетах в присутствии тестируемых соединений. После нескольких дней, клеточные слои фиксировали и окрашивали красителей, таких как кристаллическим фиолетовым. Наконец, поглощение определяется с читатель пластины и соединения, ингибирующие репликацию вируса идентифицируются по их способности хранить клеточные слои сюдам вирус-индуцированной цитопатического эффекта. Кроме того, вирусно-опосредованного цитопатические эффекты оценивали с использованием стандартных анализов жизнеспособности таких как снижение МТС. Такие анализы очень сговорчивым и экономически эффективным, но страдают от трех основных ограничений. Во-первых, они требуют сочетания вирус-клеток, где вирусной репликации цитопатический всего несколько дней, но это не всегда возможно, тем самым призывая к альтернативных подходов 19. Во-вторых, они плохо количественный, так как они основаны на косвенной мерой репликации вируса. Наконец, токсичных соединений может быть оценивали как положительные ударов, и, следовательно, должны быть устранены с противоположным экране измерения жизнеспособности клеток. Для преодоления некоторых из этих препятствий, рекомбинантные вирусы или репликоны были разработаны методом обратной генетики выразить репортерных белков, таких как EGFP или люциферазы, от дополнительного блока транскрипции или в рамке с вирусных генов белка (Несколько примеров 20-23). Когда эти репликации вирусов, репортер пр.oteins производятся вместе с самими вирусных белков. Это обеспечивает очень количественного анализа для измерения вирусной репликации и оценки ингибирующей активности молекул-кандидатов. Это особенно верно для рекомбинантных вирусов, экспрессирующих люциферазы (или другие ферменты, способные биолюминесценции), поскольку это репортер система демонстрирует широкий динамический диапазон с высокой чувствительностью и практически без фона. Кроме того, нет никакого источника света возбуждения, тем самым предотвращая помехи с соединением флуоресценции 24.
Здесь мы подробно протокол высокой пропускной экранировать химические библиотеки для ингибиторов широкого спектра действия из РНК-содержащих вирусов. Соединения проверяются сначала на клетках человека, инфицированных рекомбинантным вирусом кори (MV), выражающей люциферазы светляков 25 (rMV2/Luc, рисунок 1, основной экран). М.В. принадлежит Mononegavirales заказ, и часто рассматривается как прототип члена отрицательной нить РНК вирусаэс. Таким образом, MV геном использовали в качестве матрицы с помощью вирусной полимеразы синтезировать мРНК, кодирующих вирусные белки. В рекомбинантного MV деформации под названием rMV2/Luc, люциферазы выражение выражается от дополнительного блока транскрипции вставленной между Р и М генов (рис. 2А). Параллельно соединения тестировали на их токсичности на клетках человека с помощью коммерческого люциферазы на основе реагента, который оценивает, АТФ количественного количество метаболически активных клеток в культуре (рис. 1, первичный экран). Целые химические библиотеки могут быть легко скринировали с этих двух анализах с целью выбора соединений, которые не токсичны и эффективно блокируют репликацию MV. Затем хиты повторно для ингибирования доза-реакция М.В. репликации, отсутствие токсичности, а также для их способности ухудшать вирус чикунгунья (CHIKV) репликации (рис. 1, среднее экрана). CHIKV является членом Togaviridae семьи и ее геном апOsitive однонитевую молекулу РНК. Как таковая, она не имеет никакого отношения к кори и соединений, ингибирующих и М.В. и CHIKV стоять большой шанс ингибировать большой панель РНК-содержащих вирусов. CHIKV неструктурные белки непосредственно в переводе с вирусного генома, тогда как структурные белки кодируются транскрипции и трансляции в субгеномной молекулы мРНК. Наша Анализ in vitro репликации для CHIKV основана на рекомбинантного штамма называемой CHIKV / Ren, выражающего фермента люциферазы Renilla как расщепленной части неструктурного полипротеина посредством введения гена-репортера между nsP3 и NSP4 последовательностей 26 (фиг. 2B). Мерой активности люциферазы Renilla позволяет контролировать вирусной репликации на ранней стадии CHIKV жизненного цикла.
Этот протокол высокой пропускной был использован для быстрой идентификации соединений с подходящим профилем для противовирусных препаратов широкого спектра действия в коммерческом библиотеке 10000 MolecULES обогащенные для химической разнообразия. Соединения существу, следуя правилу Липинский в пяти, с молекулярной массой от 250 до 600 дальтон и регистрации значений D ниже 5. Большинство из этих молекул были новые химические соединения, недоступные в других коммерческих библиотек.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка Плиты Дочерние 96-а с соединений
- Перемещение матери 96-луночных планшетах, содержащих 10 мМ исходные растворы химических соединений в ДМСО от -20 ° С до комнатной температуры. Разреженного соединения 5x в ДМСО для получения промежуточных пластин разбавления 96-а при 2 мм. Разбавление достигается с помощью пипетки 5 мкл в 20 мкл ДМСО и смешивания.
- Внесите 1 мкл от разбавления пластин в сухие лунки белый, со штрих-кодом для культивирования тканей 96-луночных планшетах. Этот первый набор дочерних пластинок (D1) будет использоваться для оценки токсичности соединений в конечной концентрации 20 мкМ. Магазин дочерних планшетах при -20 ° С до использования.
- Развести соединений снова 1:10 с помощью пипетки 4 мкл разведений из пластин в 36 мкл ДМСО и смешивания. Внесите 1 мкл в сухие лунки белый, плоским дном, штрих-кодом культуре ткани 96-луночных планшетах. Это второй набор дочерних пластинок (D2) будет использоваться для оценки ингибирования М.В. replicatioн соединениями при конечной концентрации 2 мкМ. Магазин дочерних планшетах при -20 ° С до использования.
2. Подготовка клеточных культур, чтобы определить соединение Токсичность
- Grow НЕК-293Т при 37 ° С и 5% СО 2 в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с стабилизированной L-глутамина и дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS), стрептомицин (100 мкг / мл) и пенициллин (100 МЕ / мл). Клетки пассируют обработкой трипсином каждые 4-5 дней, и разводили 1:10 в свежем колбу. Клетки должны быть в логарифмической фазе для экспериментов.
- В день эксперимента, восстановить клетки путем обработки трипсином и выполнять подсчет клеток. Гранул клетки центрифугированием и ресуспендируют их в 3 х 10 5 клеток / мл в культуральной среде. Учтите, что 12,5 мл клеточной суспензии требуются для каждого скрининга пластины.
- Передача клетки корыте, и 100 мкл клеточной суспензии в D1 пластины, содержащие шипами химический компоunds. Сотовый подвеска в корыто регулярно перемешивают, чтобы избежать оседания.
- Spike Контрольные лунки A1, C1, E1, G1, A12, C12, E12 и G12 с 1 мкл ДМСО. Соответствующие скважины будет использоваться в качестве ссылки для живых клеток (без токсичности). Spike Контрольные лунки B1, D1, F1, H1, B12, D12, F12 и H12 с 1 мкл ДМСО и 2,5 мкл 0,5% раствора IGEPAL, чтобы убить клетки. Соответствующие скважины будут использоваться в качестве основы для мертвых клеток (высокая токсичность).
- Инкубируйте клетки в течение 24 ч при 37 ° С и 5% СО 2.
3. Подготовка клеточных культур, зараженных rMV2/Luc
- Расти и восстановить клетки, как описано в 2.1 и 2.2. Опять же, ресуспендирования клеток на 3 х 10 5 клеток / мл в культуральной среде. Учтите, что 12,5 мл клеточной суспензии требуются для каждого скрининга пластины.
- Дополнительно: добавка культуральной среды с уридина при 20 мкг / мл.
Примечание: При скрининге химические библиотеки для вирусной replicatioн ингибиторы, кажется, что соединения, направленные на ранние этапы пиримидинового биосинтеза часто изолированы 13,16,27,28. Добавление уридина в культуральной среде используется, чтобы отфильтровать такие противовирусные молекулы. В самом деле, это эффективно восстанавливает репликацию вируса, когда вверх по течению ферменты пиримидинового биосинтеза заблокированы. - Сохранить 1:10 клеточной суспензии для контроля скважин с неинфицированных клеток, и перейти к инфекции с остального объема.
- Оттепель соответствующий объем rMV2/Luc маточного раствора. Растворы MV, как правило, на 10 6 -10 8 инфекционных частиц на мл. Культура должна быть инфицированы 0,1 инфекционных частиц rMV2/Luc в клетках-мишенях, что соответствует 0,1 множественности инфекции (MOI). Примечание: rMV2/Luc происходит от MV вакцины (штамм Schwarz) и манипулируют в среде BSL2.
- Добавить вирус клеточной суспензии и аккуратно перемешать. Трансфер инфицированные клетки к корыту, и обойтись 100мкл зараженной клеточной суспензии в колонках 2 до 11 из D2 пластины, содержащие шипами химических соединений. Сотовый подвеска в корыто регулярно осторожно перемешивают.
- В колонках 1 и 12, 100 мкл неинфицированных клеток а на два. Зараженные клетки распределяют в другие скважин.
- Инкубируйте клетки в течение 24 ч при 37 ° С и 5% СО 2.
4. Меры активность люциферазы и анализа данных
- Удалить D1 пластины из инкубатора, и определить жизнеспособность клеток путем добавления 50 мкл люциферазы основе жизнеспособности реагента непосредственно в культуральных лунок. Перемешать, инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре. Читайте таблички с люминометре. Время интегрирования установлена на уровне 100 мс на лунку.
- Удалить D2 пластины из инкубатора, и определить активность люциферазы добавлением 50 мкл субстрата люциферазы непосредственно в культуральных лунок. Инкубировать в течение 6 мин при комнатной температуре, и читать пластины с помощью люминометра, как descriкровать выше.
- Вычисление Z 'фактор для каждого D1 пластины токсичности анализа, чтобы гарантировать качество экрана 29. Z '= 1-3 * (σ + + σ-) / (μ + - μ-), где μ + и σ + соответствуют помощью люминесценции и стандартных отклонений для НЕК-293Т с только ДМСО (без токсичности), и μ-и σ-это средства люминесценции и стандартных отклонений для культуры скважин, обработанных Igepal убить клетки. Z 'как ожидается, будет выше 0,5, или из соответствующего пластина отбрасывается.
- Установить порог токсичности при μ + / 2. Откажитесь соединения со значениями люминесценции ниже этой отсечки (рис. 3А).
- Вычислить Z 'фактор для каждого D2 пластины противовирусного анализа. Здесь μ + и σ + соответствуют помощью люминесценции и стандартные отклонения для инфицированных клеток, культивированных с одним только ДМСО, и μ-и σ-являются средством люминесценции и стандартные отклонения для неинфицированных клеток. Опять же, плиты с Z & #39; значения ниже 0,5 отбрасываются.
- Рассчитайте ингибирование вирусной репликации следующим образом: процент ингибирования = (μ + - активность люциферазы для соединения X) / (μ + - μ-) * 100. Установить порог ингибирования на 75%, и выберите соединения, которые как сокращают значения люминесценции ниже этого отключения (рис. 3В) и не являются токсичными в соответствии с критериями, описанными в 4.4.
5. Вторичный экран для токсичности и широкого спектра противовирусной активности
- Убедитесь, 1:02 серийные разведения для каждого удара соединения в ДМСО, начиная с 500 мкм до 4 мкм (8 разведений). Заполните белый, планшеты для тканевых культур штрих-кодом с 50 мкл культуральной среды. Добавить 1 мкл каждого разведения соединения в культуре скважин. Повторите дважды, чтобы иметь 3 культуру, живущую с одинаковыми серийными разведениями для каждого хита соединения.
- Подготовка 37,5 мл клеточной суспензии НЕК-293T в 6 х 10 5 клеток / мл в культуральной среде, как описано выше (в 2,1 и 20,2). Внесите 2x 12,5 мл в сокола труб и инфицировать клетки либо rMV2/Luc в МВД = 0,1 или рекомбинантный CHIKV выражая Renilla люциферазу (CHIKV / Ren) в МВД = 0,2. Смешайте путем обращения.
Примечание: CHIKV / Ren происходит от дикого типа штамма CHIKV и, следовательно, должны манипулировать в среде BSL3. Пластины могут быть перемещены из BSL3 в BSL1 раз Renilla подложка была добавлена к культуре скважины (см. ниже). - Внесите 50 мкл неинфицированных, rMV2/Luc-infected или CHIKV / Рен-инфицированных клеток в культуре пластины, содержащие серийные разведения хит соединений. Выдержите 24 ч при 37 ° С
- Добавить 50 мкл светлячка субстрата люциферазы определить светлячка активность люциферазы в rMV2/Luc-infected скважин. Добавить 50 мкл Renilla субстрата люциферазы для определения активности люциферазы Renilla в CHIKV / Рен-инфицированных скважин. Наконец, добавить 50 мкл люциферазы основе анализа жизнеспособности реагента в неинфицированных клетках, чтобы определить клеточную жизнеспособность.
- Данные земля (FiGure 4) и определить, пострадавших концентрации составных, которые препятствуют MV и CHIKV репликации на 50%. Не обращайте внимания соединение, отображающее некоторую токсичность в этом анализе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот скрининг трубопровода зависит в первую очередь от выбора соединений, которые ингибируют MV репликацию и не показывают существенного клеточную токсичность (рис. 1, основным экраном). Он использует люциферазной основе анализов, чтобы определить клеточную токсичность и ингибирование репликации вируса. Все шаги пипетки и сбор данных может быть выполнена в условиях высокой пропускной с роботизированной платформы.
Сотовый токсичность соединений оценивали с использованием люциферазы на основе анализа жизнеспособности, который оценивает количество живых клеток в культуре на основе количественного анализа АТФ настоящее, что соответствует метаболически активных клетках. Поскольку окисление люциферазы люциферин на АТФ зависит, люминесценция сигнала прямо пропорциональна сотовой АТФ, представленной живых клеток. Фиг.3А показывает результаты для одного представителя скрининга пластины. Как и ожидалось, очень различные значения активности люциферазы были измеримоеред в контрольных лунках, содержащих либо живые клетки или мертвые клетки, погибших с Igepal. Порог эмпирически установлено на μ + / 2, чтобы отфильтровать соединений показаны некоторые клеточную токсичность и в данном случае, 21 соединения из этой пластинки отбрасывают. Параллельно противовирусная активность измеряется с помощью rMV2/Luc, рекомбинантный штамм В. выражающей люциферазы (рис. 2). Клетки НЕК-293Т человека используются потому, что они очень чувствительны к MV-инфекции. В результате активность люциферазы в инфицированных культуральных лунок, очень высока (от 200 до 300 х 10 3 единицы активности люциферазы в контрольных лунках). Это обеспечивает большой динамический диапазон, который облегчает выбор ингибиторов репликации мВ. Фиг.3В показывает репрезентативные результаты, полученные в течение одного скрининга пластины. Четыре соединения ингибируют репликацию вируса более чем на 75% в этом примере и были выбраны.
Наконец, соединения, которые не токсичны и забилиположительное в вирусном анализе репликации выбираются (рис. 3A и 3B). Их половина максимальная ингибирующая концентрация (IC 50) определяется как на MV и CHIKV, которые являются два несвязанных РНК-вирусы (рис. 1, среднее экран). Противовирусная активность хит соединений определяется с помощью рекомбинантных штаммов вируса выражения либо светлячка (rMV2/Luc) или Renilla (CHIKV / Рен) люциферазы. 4А и 4В показывают репрезентативные кривые ингибирования для MV и CHIKV репликации, соответственно. Эти кривые используются для определения IC50s попадания соединений. Параллельно, отсутствие клеточной токсичности выбранных соединений подтверждена в эксперименте доза-ответ с использованием люциферазы основе жизнеспособности описанного выше анализа (фиг.4С). Таблица 1 показывает IC50 для MV и CHIKV репликации на множестве 13 Расходы -токсичные соединения, выявленные из химической библиотеки 10000 молекул. Эти компоunds являются новыми как с точки зрения химической структуре и биологической активности. Некоторые из этих молекул совместно структурные сходства, и может быть собрана в трех различных химических семейств. В качестве эталона, величины IC50, полученные с бреквинар также показаны в таблице 1. Бреквинар является ингибитором дигидрооротатдегидрогеназы, четвертого фермента биосинтеза пиримидина, с мощным противовирусной активности в пробирке 30,31. При взгляде на значения IC50, меньше на порядок разделены этот опорный молекулы из наиболее активных хитов выявленных при скрининге. Это установило сильную противовирусную активность выбранных соединений.
Рисунок 1. Краткое описание скрининга трубопровода. Левая панель показывает на стр.rimary экран, на котором выбираются соединения за отсутствие токсичности и способности блокировать MV репликацию. Правая панель показывает вторичный экран, где противовирусная активность выбранных соединений подтверждается, и их способность блокировать CHIKV репликации определяется. Соединения, которые эффективно блокируют MV и CHIKV без каких-либо значительных токсичности рассматриваются как потенциальные ингибиторы широкого спектра действия из РНК-содержащих вирусов. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 2. Геномная организация рекомбинантных РНК-содержащих вирусов, несущих гена люциферазы. (А) rMV2/Luc: М.В. отрицательной смысловой РНК геном отображается с его 3 'конце слева, с шести геновуказано прописными буквами и изображали в виде белых прямоугольников. Дополнительное кодирование транскрипционные единицы для репортерного гена вставлена между Р и М генов и изображены в виде желтого прямоугольника (B) CHIKV / Ren. CHIKV положительной смысловой РНК генома отображается с его 5'-конце ограничен слева, с открытой рамки считывания, кодирующей четыре неструктурных белков (NSP1-4). Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 3. Представитель результаты один 96-а скрининг пластины. (A) люциферазы значения, полученные с люциферазы основе жизнеспособности анализа. Колонны 1 и 12 соответствуют альтернативных управления с только ДМСО ("+"; отсутствие токсичности) или IGEPAL ("-"; высокая Toxi город). Синий цвет выделяет соединения, которые считаются не токсичными в соответствии с концентрацией АТФ, обнаруженных в культуре скважин, в то время как белые скважины соответствуют токсичных соединений (ценностей люциферазы <12203 х 10 3). (B) люциферазы значения получены при rMV2/Luc-infected клеток. Колонки 1 и 12 соответствуют альтернативных управления, т.е. неинфицированных клеток НЕК-293Т ("-") или rMV2/Luc-infected клетках, обработанных только DMSO ("+"). Для каждого тестируемого соединения, фигура показывает как сигнал люциферазы люминесценции и процент ингибирования по сравнению с контрольными скважин. Соединения, ингибирующие люминесценции сигнал более чем на 75% выделены желтым или зеленым в зависимости, если они были считаются токсичными или нет, как это определено в (А). Таким образом, зеленый цвет показывает хит соединения, которые ингибируют MV репликацию и не влияют на клеточную жизнеспособность.т = "_blank"> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 4. Противовирусная активность доза-ответ и токсичность соединений C864, C648 и C062. (A) НЕК-293Т клетки инфицировали штаммом rMV2/Luc MV экспрессирующих люциферазы (MOI = 0,1) и инкубировали с возрастающими дозами C864, C648, C062 или только ДМСО. Через 24 ч экспрессии люциферазы был определен. * Указывает, что наблюдаемые люциферазы запреты были статистически значимыми с всех трех соединений (р-значения <0,05). (B) НЕК-293Т клетки были инфицированы CHIKV / детей штамма CHIKV экспрессирующих люциферазы Renilla (MOI = 0,2) и инкубировали с возрастающими дозы, C864 C648 C062, или только ДМСО. Через 24 ч выражение люциферазы Renilla была определена. * Указывает статистическически значимых запреты со всеми тремя соединений (р-значения <0,05). (С) НЕК-293T клетки инкубировали с увеличением дозы C864, C648, C062 или только ДМСО. В качестве контроля для токсичности, клеточные культуры с добавлением 2,5 мкл 0,5% раствора IGEPAL. После 24 часов, количество живых клеток определяли с помощью люциферазы основе жизнеспособности анализа. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
| Химическая группа | Соединение | М.В. (IC 50 мкМ) | CHIKV (IC 50 мкМ) | CC50 (мкМ) |
| 1 | C864 | 0,6 | 0,6 | > 5 |
| 1 | C877 | 0,2 | 0,2 | > 5 |
| 1 | C957 | 1.2 | 1.2 | > 5 |
| 1 | C963 | 1.2 | 0.9 | > 5 |
| 1 | C967 | 1.7 | 1.6 | > 5 |
| 1 | C348 | 0.25 | 0.3 | > 5 |
| 1 | C265 | 0.25 | 0.3 | > 5 |
| 1 | C270 | 0.5 | 0.5 > 5 | |
| 1 | C350 | 0,4 | 0.5 | > 5 |
| 2 | C646 | 0.16 | 0.15 | > 5 |
| 2 | C814 | 1.9 | 1.1 | > 5 |
| 2 | C648 | 0.7 | 0,4 | > 5 |
| 3 | C062 | 1 | 1.2 | > 5 |
| Бреквинар | 0.04 | 0.04 | > 5 |
Таблица 1. Антивирусная активность и цитотоксичность 13соединений, выбранных из исходного химического библиотеки. Результаты выражены в виде значений IC50 для ингибирования мВ или CHIKV репликации. Значения CC50 были обнаружены> 5 мкм для всех соединений в экспериментах доза-ответ из вторичного экрана. Но фильтр порог баллов для цитотоксичности от основного экрана показывают, что значения CC50 даже> 20 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Скрининг трубопровода описано здесь направлена на выборе соединения с подходящим профилем в качестве ингибиторов широкого спектра действия из РНК-содержащих вирусов. Когда библиотека 10000 соединений был показан с этим протоколом и вышеупомянутые критерии фильтрации были применены, то есть ингибирование М.В. репликации превосходит 75%, 40 соединений (0,4%) набрал положительным. Кроме того, около половины из них показали некоторое токсичность в люциферазы основе жизнеспособности анализа, и были проигнорированы по этой причине. Наконец, с десяток хитов легкодоступных в большем количестве были повторно. Этот небольшой набор был легко повторно как для клеточной токсичности и ингибирования репликации вируса против М.В. и CHIKV в экспериментах доза-реакция (рис. 4). Противовирусная активность всех выбранных соединений была подтверждена, и общий уровень идентификации хитом для этого скрининга трубопровода составила 1,3 ‰. Эта оценка очень похож на результаты, полученные другими группами с различными высокой пропускнойрепликации на основе скрининговых исследований противовирусных препаратов 27,32 и попадает в ожидаемый диапазон для сотовых основе анализов фенотипических в целом (1-5 ‰ 33). Однако скорость попадание в значительной степени зависит как от соединения библиотеки, которую просеивают и порогов скоринг фильтр, который можно регулировать в зависимости от профиля собранных данных. Здесь, выбранные пороговые значения для ингибирования репликации и В. клеточной токсичности были определены эмпирически, и компромисс был установлен, чтобы получить сговорчивым количество обращений, которые могут быть легко вновь подвергались воздействию на вторичном экране против CHIKV.
На первичном экране, соединения испытывали как для их способности блокировать MV репликацию и отсутствие клеточной токсичности. Противовирусная активность определяли при концентрации 2 мкМ по rMV2/Luc-infected клеток, тогда как клеточную токсичность была определена в 20 мкм. Эти экспериментальные установки были найдены ценным для прямого выбора для соединений с высокой антивирусной активности по отношению к клеточной токсичности. Кроме того, первичный экран был выполнен в присутствии уридина. Действительно, недавние публикации показывают, что соединения, направленные на ранние этапы пиримидинового биосинтеза часто изолированы при поиске ингибиторов РНК-содержащих вирусов 13,16,27,28. В частности, исследовательские группы, ищущие противовирусных молекул нашли ингибиторы дигидрооротатдегидрогеназы, четвертый фермент этого метаболического пути 31. Уридин в культуральной среде эффективно транс-дополнений для ингибирования этого фермента, и, таким образом, восстанавливает репликацию вируса. Таким образом, соединения, которые предотвращают MV репликацию через ингибирование биосинтеза пиримидинов непосредственно исключены из противовирусных ударов. Наконец, Z 'фактор было установлено, что систематически выше 0,5, что свидетельствует о высокой надежности и качества анализа.
Параллельно клеточную токсичность была определена с использованием высокого throughpuт люциферазы основе анализа, который определяет количество метаболически активных клеток в культуре на основе количественной оценки СПС. В каждой пластине скрининга, IGEPAL был добавлен в контрольных лунках для токсичности. Это неденатурирующем, неионогенный детергент имеет то преимущество, убивая эффективно все типы клеток неспецифически, не затрагивая люциферазы активность фермента. Z 'фактор систематически выше 0,5 более чем 125 пластин, тем самым демонстрируя высокий надежность и качество анализа. Одним из ограничений этом клеточном анализе токсичности является его относительно высокой стоимости. В качестве альтернативного анализа, чтобы определить клеточную жизнеспособность, некоторые группы использовали клеточные линии конститутивно экспрессирующих люциферазы из стабильного трансгена 34. В таких анализов, как ожидается, уменьшить или даже подавлять люциферазы выражение, когда влияя сотовой жизнеспособность токсичные соединения. Мы недавно разработали стабильной клеточной линии, выразив люциферазу на ИФН-β стимуляции 35, и эта клеточная линия использовалась для проверки ТРAining набор из 80 соединений для клеточной токсичности. Неожиданно оказалось, что коэффициент корреляции (CC) между данном анализе и на основе люциферазы жизнеспособности анализе, описанном выше была относительно низкой (CC = 0,67). Действительно, несколько соединений нарушена экспрессия люциферазы от трансгенов, в то время как обмен веществ АТФ не пострадал. Некоторые широкого спектра противовирусных соединений могут повлиять на клеточные функции, такие как клеточной сигнализации, генной транскрипции или трансляции белка, который также будет ухудшать выражение клеточного гена. Хотя не существует идеального система скрининга для жизнеспособности клеток, он находится в опасности, что фильтрация токсичных соединений на основе выражения сотовой гена потенциально привести к исключить добросовестных противовирусные молекулы.
Дополнительный экран направлен на создание противовирусную активность выбранных соединений против двух совершенно не связанных между собой РНК-содержащих вирусов, при определении именно их IC50s. Интересно, следует отметить, что фермент люциферазыингибиторы могут быть ошибочно оценивали как положительные при анализе rMV2/Luc но такие ложных срабатываний будут фильтроваться выезда на вторичном экране при испытании для ингибирования CHIKV / детей. Действительно, rMV2/Luc и CHIKV / Рен выразить светлячка и Renilla люциферазы, соответственно, и эти два фермента не имеют отношения и активизировать различные химические реакции. Соединения, которые ингибируют люциферазы светляков репортеру rMV2/Luc на первичном экране не будет отображаться какой-либо деятельности против CHIKV / Рен и будет отменен, таким образом предотвращая их ошибочное выделение, как противовирусных препаратов. Неожиданно все 13 первичных хитов блокирующие MV репликацию также ингибирует CHIKV в этом вторичном экране. Это не всегда так, как несколько MV-специфические ингибиторы были изолированы при отборе другие библиотеки (данные не представлены). Кроме того, выбранные соединения поделиться структурные сходства и могут быть сгруппированы в только три химических семей (табл. 1). Соединения, химической семье, вероятно, имеют те же режим актина и, следовательно, можно рассматривать как аналоги и того же химического объекта. Это ставит в перспективе тот факт, что все 13 выбранные соединения ингибируют MV и CHIKV репликацию. Тем не менее, эти результаты также может предположить, что противовирусные широкого спектра чаще, чем определены ингибиторов вирус-специфических. Рациональное позади этой гипотезы является то, что, несмотря на очевидные особенностей, все РНК-вирусы полагаться на тех же основных клеточных функций для репликации, таких как рибосомальной машин, цитоскелета или митохондрий в качестве источника энергии. Эти функциональные модули представляют собой сложные молекулярные системы, которые обеспечивают сравнительно большую группу потенциальных мишеней для противовирусных препаратов широкого спектра действия. Напротив, есть только ограниченный набор вирусных или клеточных факторов, которые представляют соответствующие цели по повышению ингибиторы вирус-специфических. В будущем новые панели из противовирусных препаратов, определенных фенотипической скрининга должна обеспечивать необходимые данные, чтобы подтвердить или аннулировать эту гипотезу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора Ива Л. Янин за его ценные замечания и предложения. Мы хотели бы поблагодарить HH Гада для чик / Рен и С. Combredet для ее технической поддержки. Эта работа была поддержана Институтом Пастера, Национальный центр де ла Научных Исследований (CNRS), Национального Института де ла Здоровье и де ла Recherche Medicale (INSERM), Института Карно - Пастера болезней Infectieuses (Программа Стинг POV и HM- л), Национальное агентство по Pour La Recherche (ANR-RPIB, Программа STING 2,0 до POV), и "Conseil региональных d'Иль-де-Франс» (проект Химическая библиотека, гранты N ° I 06-222 / R и я 09-1739 / R для HM-L.). Работа по CHIKV / Рен поддержали проекта ArbOAS (ANR грант 2010-INTB-1601-02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freedom EVO platform | TECAN | Robotic platform | |
| 96-well polystyrene cell culture microplates, white | Greiner Bio One | 655083 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | Luciferase-based viability assay |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Reagent containing firefly luciferase substrate |
| Renilla-Glo luciferase Assay System | Promega | E2710 | Reagent containing Renilla luciferase substrate |
| Britelite plus Reporter Gene Assay System | Perkin-Elmer | 6016761 | Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity. |
References
- De Clercq, E. Antiviral drugs in current clinical use. J Clin Virol. 30, 115-133 (2004).
- Debing, Y., Jochmans, D., Neyts, J. Intervention strategies for emerging viruses: use of antivirals. Curr Opin Virol. , (2013).
- Leyssen, P., De Clercq, E., Neyts, J. Molecular strategies to inhibit the replication of RNA viruses. Antiviral Res. 78, 9-25 (2008).
- Leyssen, P., Balzarini, J., De Clercq, E., Neyts, J. The predominant mechanism by which ribavirin exerts its antiviral activity in vitro against flaviviruses and paramyxoviruses is mediated by inhibition of IMP dehydrogenase. J Virol. 79, 1943-1947 (2005).
- Wang, B. X., Fish, E. N. The yin and yang of viruses and interferons. Trends Immunol. 33, 190-197 (2012).
- Empey, K. M., Peebles, R. S., Kolls, J. K. Pharmacologic advances in the treatment and prevention of respiratory syncytial virus. Clin Infect Dis. 50, 1258-1267 (2010).
- Tan, S. L., Ganji, G., Paeper, B., Proll, S., Katze, M. G. Systems biology and the host response to viral infection. Nat Biotechnol. 25, 1383-1389 (2007).
- Prussia, A., Thepchatri, P., Snyder, J. P., Plemper, R. K. Systematic Approaches towards the Development of Host-Directed Antiviral Therapeutics. Int J Mol Sci. 12, 4027-4052 (2011).
- Connolly, D. J., O'Neill, L. A. New developments in Toll-like receptor targeted therapeutics. Curr Opin Pharmacol. , (2012).
- Thakur, C. S., et al. Small-molecule activators of RNase L with broad-spectrum antiviral activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9585-9590 (2007).
- Shoji-Kawata, S., et al. Identification of a candidate therapeutic autophagy-inducing peptide. Nature. 494, 201-206 (2013).
- Hoffman, E. S., Smith, R. E., Renaud, R. C. From the analyst's couch: TLR-targeted therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 4, 879-880 (2005).
- Bonavia, A., et al. Identification of broad-spectrum antiviral compounds and assessment of the druggability of their target for efficacy against respiratory syncytial virus (RSV). Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6739-6744 (2011).
- Rider, T. H., et al. Broad-spectrum antiviral therapeutics. PLoS One. 6, (2011).
- Krumm, S. A., et al. Potent host-directed small-molecule inhibitors of myxovirus RNA-dependent RNA-polymerases. PLoS One. , (2011).
- Hoffmann, H. H., Kunz, A., Simon, V. A., Palese, P., Shaw, M. L. Broad-spectrum antiviral that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5777-5782 (2011).
- Harvey, R., et al. GSK983: a novel compound with broad-spectrum antiviral activity. Antiviral Res. 82, 1-11 (2009).
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nat Rev Drug Discov. 10, 507-519 (2011).
- Jochmans, D., Leyssen, P., Neyts, J. A novel method for high-throughput screening to quantify antiviral activity against viruses that induce limited CPE. J Virol Methods. 183, 176-179 (2012).
- Puig-Basagoiti, F., et al. High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery. Antimicrob Agents Chemother. 49, 4980-4988 (2005).
- Panchal, R. G., et al. Development of high-content imaging assays for lethal viral pathogens. J Biomol Screen. 15, 755-765 (2010).
- Pohjala, L., et al. Inhibitors of alphavirus entry and replication identified with a stable Chikungunya replicon cell line and virus-based assays. PLoS One. 6, (2011).
- Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening. Antiviral Res. 91, 11-19 (2011).
- Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem Biol. 17, 646-657 (2010).
- Komarova, A. V., et al. Proteomic analysis of virus-host interactions in an infectious context using recombinant viruses. Mol Cell Proteomics. , (2011).
- Henrik Gad, H., et al. The E2-E166K substitution restores Chikungunya virus growth in OAS3 expressing cells by acting on viral entry. Virology. 434, 27-37 (2012).
- Wang, Q. Y., et al. Inhibition of dengue virus through suppression of host pyrimidine biosynthesis. J Virol. 85, 6548-6556 (2011).
- Smee, D. F., Hurst, B. L., Day, C. W. D282, a non-nucleoside inhibitor of influenza virus infection that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis. Antivir Chem Chemother. 22, 263-272 (2012).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Qing, M., et al. Characterization of dengue virus resistance to brequinar in cell culture. Antimicrob Agents Chemother. 54, 3686-3695 (2010).
- Munier-Lehmann, H., Vidalain, P. O., Tangy, F., Janin, Y. L. On dihydroorotate dehydrogenases and their inhibitors and uses. J Med Chem. 56, 3148-3167 (2013).
- Yoon, J. J., et al. High-throughput screening-based identification of paramyxovirus inhibitors. J Biomol Screen. 13, 591-608 (2008).
- Maréchal, E., Roy, S., Lafanechère, L. Chemogenomics and Chemical Genetics: A User's Introduction for Biologists, Chemists and Informaticians. , Springer. (2011).
- Gentzsch, J., et al. Hepatitis C virus complete life cycle screen for identification of small molecules with pro- or antiviral activity. Antiviral Res. 89, 136-148 (2011).
- Caignard, G., et al. The V protein of Tioman virus is incapable of blocking type I interferon signaling in human cells. PLoS One. 8, (2013).
