Summary
वायरस प्रतिकृति को मापने के लिए इन विट्रो assays में बहुत luciferase या bioluminescence में सक्षम अन्य एंजाइमों व्यक्त पुनः संयोजक आरएनए वायरस के विकास से सुधार किया गया है. यहाँ हम विस्तार से खसरा और रासायनिक पुस्तकालयों से व्यापक स्पेक्ट्रम antivirals अलग करने के लिए चिकनगुनिया वायरस के ऐसे पुनः संयोजक उपभेदों जोड़ती है एक उच्च throughput स्क्रीनिंग पाइपलाइन.
Abstract
आरएनए वायरस फ्लू, ब्रोंकाइटिस, डेंगू, हेपेटाइटिस सी या खसरा के रूप में प्रमुख मानव रोगों के लिए जिम्मेदार हैं. उन्होंने यह भी है क्योंकि अधिक से अधिक प्राकृतिक पारिस्थितिक तंत्र मर्मज्ञ बढ़ दुनिया भर में बाजारों और मानव आबादी के एक उभरते खतरे का प्रतिनिधित्व करते हैं. इस तरह एक उभरती हुई स्थिति का एक अच्छा उदाहरण हिंद महासागर में 2005-2006 के चिकनगुनिया वायरस महामारी है. वायरल प्रतिकृति को नियंत्रित सेलुलर रास्ते के बारे में हमारी समझ में हाल की प्रगति मेजबान सेल कार्यों को लक्षित यौगिकों, बल्कि वायरस खुद से, आरएनए वायरस की एक बड़ी पैनल बाधित हो सकता है. कुछ व्यापक स्पेक्ट्रम antiviral यौगिकों मेजबान लक्ष्य उन्मुख assays के साथ पहचान की गई है. हालांकि, सेल संस्कृतियों में वायरल प्रतिकृति के निषेध को मापने के एक readout के रूप में कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव की कमी का उपयोग अभी भी एक सर्वोपरि स्क्रीनिंग रणनीति का प्रतिनिधित्व करता है. इस तरह कार्यात्मक स्क्रीन बहुत संवाददाता व्यक्त पुनः संयोजक वायरस के विकास से सुधार किया गया है सीए एंजाइमोंऐसे luciferase रूप bioluminescence की पाब्ले. वर्तमान रिपोर्ट में, हम विस्तार से एक व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीवायरल प्रोफाइल के साथ यौगिकों की पहचान करने के लिए, पुनः संयोजक खसरा और सेलुलर व्यवहार्यता assays के साथ चिकनगुनिया वायरस को जोड़ती है जो एक उच्च throughput स्क्रीनिंग पाइपलाइन,.
Introduction
आरएनए वायरस मानव में संक्रमण की एक विशाल विविधता के लिए जिम्मेदार हैं, और दोनों सार्वजनिक स्वास्थ्य और किफायती लागत के मामले में दुनिया भर में आबादी पर एक बहुत बड़ा प्रभाव पड़ता है. कुशल टीके कई मानव आरएनए वायरस के खिलाफ विकसित किया गया है, और व्यापक रूप से रोगनिरोधी उपचार के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं. हालांकि, आरएनए वायरस के संक्रमण के खिलाफ चिकित्सीय औषधियों का एक महत्वपूर्ण कमी अभी भी वहाँ है. दरअसल, कुशल टीके ऐसे डेंगू वायरस, हेपेटाइटिस सी वायरस या मानव श्वसन syncytial वायरस (hRSV) के रूप में प्रमुख मानव रोगजनकों के खिलाफ उपलब्ध नहीं हैं. इसके अलावा, आरएनए वायरस की वजह से वैश्विक बाजारों और पारिस्थितिकी प्रणालियों पर मानव प्रभाव की आवृत्ति में वृद्धि हुई है, जो उभरते रोगों, के बहुमत के लिए जिम्मेदार हैं. आरएनए वायरस का प्रतिनिधित्व करते हैं कि इस खतरे के खिलाफ, हमारे चिकित्सीय शस्त्रागार अत्यंत सीमित और 1-3 अपेक्षाकृत अक्षम है. वर्तमान उपचार के अनिवार्य रूप से, जन्मजात उन्मुक्ति को प्रोत्साहित करने के लिए पुनः संयोजक प्रकार मैं इंटरफेरॉन (IFN-α / β) पर आधारित हैंया ribavirin का प्रशासन. इस ribonucleoside अनुरूप की कार्रवाई की विधा विवादास्पद है और शायद विभिन्न तंत्र पर निर्भर करता है, intracellular जीटीपी पूल depletes जो सेलुलर IMPDH (आइनोसीन मोनोफास्फेट डिहाइड्रोजनेज), के निषेध, 4 स्पष्ट रूप से आवश्यक है. Ribavirin, pegylated IFN-α के साथ संयोजन में, हेपेटाइटिस सी वायरस के खिलाफ मुख्य इलाज है. वे कुशलता से कुंद IFN-α / β 5 कारकों डाह की अभिव्यक्ति के माध्यम से संकेत और अक्सर ribavirin 3 भागने के रूप में हालांकि, IFN-α / β और ribavirin उपचार सबसे आरएनए वायरस के खिलाफ vivo में अपेक्षाकृत गरीब प्रभावकारिता के हैं. यह हाल ही में विवादास्पद लाभ 6 के साथ गंभीर hRSV रोग के खिलाफ अनुमोदित किया गया था, हालांकि यह ribavirin उपचार महत्वपूर्ण विषाक्तता मुद्दों को उठा रहा है कि इस तथ्य की गयी. हाल ही में, कुछ वायरस विशेष उपचार विकास ओ के साथ इन्फ्लूएंजा वायरस के खिलाफ विशेष रूप से, विपणन किया गया हैच neuraminidase inhibitors 3. हालांकि, बड़ी विविधता और आरएनए वायरस की स्थायी उद्भव एक अपेक्षाकृत करीब भविष्य में उनमें से हर एक के खिलाफ विशिष्ट उपचार के विकास के अलग करता है. कुल मिलाकर, यह निकट भविष्य में शक्तिशाली antiviral अणुओं की पहचान करने और विकसित करने के लिए कुशल रणनीति के लिए जरूरत पर जोर दिया.
यह आरएनए वायरस की एक बड़ी पैनल के खिलाफ सक्रिय एक व्यापक स्पेक्ट्रम अवरोध करनेवाला इस समस्या का समाधान होगा कि कहने के लिए तुच्छ है. इस तरह के एक अणु अभी भी एक virologist का सपना है, सेलुलर रक्षा तंत्र और सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के बारे में हमारी बेहतर समझ कुछ संभावनाओं 7,8 मौजूद सुझाव है कि. कई शैक्षणिक और औद्योगिक प्रयोगशालाओं अब सेलुलर सुरक्षा तंत्र या वायरल प्रतिकृति को कुंद करने के लिए चयापचय मार्ग के विशिष्ट पहलुओं को उत्तेजित अणुओं है कि मांग कर रहे हैं. ऐसे यौगिकों शायद महत्वपूर्ण दुष्प्रभाव दिखाई देगा हालांकि, तीव्र वायरल संक्रमण के खिलाफ उपचार प्रशासन होगालंबी अवधि के बारे में कुछ संभावित विषाक्तता के बावजूद उन्हें स्वीकार्य बना रही है, एक अपेक्षाकृत कम समय के लिए एड. विभिन्न रणनीतियों ऐसे व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीवायरल अणुओं की पहचान करने के लिए विकसित किया गया है. कुछ शोध कार्यक्रमों के विशिष्ट रक्षा या चयापचय मार्ग है कि लक्ष्य अणुओं को खोजने का उद्देश्य. यह शामिल है, उदाहरण के लिए, विषाणु जीन अभिव्यक्ति 9 बटोर और ऐसे RNaseL 10, वायरस गिरावट 11 को बढ़ावा देने के भोजी मशीनरी के रूप में एंटीवायरल कारकों को सक्रिय करने के लिए रोगज़नक़ मान्यता रिसेप्टर्स, न्यूक्लीओसाइड संश्लेषण वायरस से संक्रमित कोशिकाओं की मौत वेग 12,13, या apoptotic Cascades रास्ते 14. अन्य समूहों 13,15-17 को लक्ष्य आधारित नहीं कर रहे हैं कि प्ररूपी स्क्रीन विकसित किया है. उस मामले में, एंटीवायरल अणुओं बस एक दिया सेलुलर प्रणाली में वायरल प्रतिकृति ब्लॉक उनकी क्षमता से पहचाने जाते हैं. आम धारणा 2-3 असंबंधित आरएनए वायरस बाधा एक परिसर में एक व्यापक सपा के लिए एक उपयुक्त प्रोफ़ाइल होता हैएंटीवायरल अणु ectrum. इस तरह के एक अनुभवजन्य दृष्टिकोण के साथ चयनित हिट यौगिकों की कार्रवाई की विधा केवल एक दूसरी बार में निर्धारित किया जाता है और अंत में, antivirals के लिए उपन्यास सेलुलर लक्ष्यों की पहचान करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. दिलचस्प है, 1999 और 2008 के बीच अमेरिका के खाद्य एवं औषधि प्रशासन द्वारा अनुमोदित नई दवाओं की एक पूर्वव्यापी विश्लेषण सामान्य रूप में, इस तरह के प्ररूपी चोकर प्रथम श्रेणी में छोटे अणु दवाओं 18 को खोजने के लिए लक्ष्य आधारित दृष्टिकोण की तुलना में बेहतर प्रदर्शन करते हैं पता चला है कि .
उच्च throughput सेल आधारित assays में वायरल प्रतिकृति आमतौर पर वायरस कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव से निर्धारित होता है. कोशिकाओं को संक्रमित और सुसंस्कृत 96 में कर रहे हैं - या परीक्षण यौगिकों की उपस्थिति में 384 अच्छी तरह प्लेटें. कुछ दिनों के बाद, सेलुलर परतों तय कर रहे हैं और इस तरह के क्रिस्टल बैंगनी के रूप में रंगों के साथ दाग. अंत में, absorbance एक प्लेट रीडर और वायरल प्रतिकृति बाधा यौगिकों fro सेलुलर परतों को संरक्षित करने के लिए उनकी क्षमता से पहचाना जाता है के साथ निर्धारित किया जाता हैएम वायरस प्रेरित कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव. वैकल्पिक रूप से, virally की मध्यस्थता कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव इस तरह एमटीएस कमी के रूप में मानक व्यवहार्यता assays का उपयोग मूल्यांकन कर रहे हैं. ऐसे assays अत्यधिक विनयशील और लागत प्रभावी रहे हैं, लेकिन तीन प्रमुख सीमाओं से ग्रस्त हैं. पहला, वे इस प्रकार 19 दृष्टिकोण विकल्प के लिए बुला, वायरल प्रतिकृति केवल कुछ ही दिनों में कोशिकाविकृति संबंधी है, लेकिन यह हमेशा संभव नहीं है, जहां एक वायरस सेल संयोजन की आवश्यकता होती है. दूसरा, वे वायरल प्रतिकृति के एक अप्रत्यक्ष उपाय पर आधारित होते हैं के बाद से खराब मात्रात्मक हैं. अंत में, विषाक्त यौगिकों सकारात्मक हिट के रूप में रन बनाए जा सकते हैं, और इसलिए सेलुलर व्यवहार्यता को मापने के लिए एक काउंटर स्क्रीन के साथ समाप्त किया जाना चाहिए. इन बाधाओं के कुछ काबू पाने के लिए, पुनः संयोजक वायरस या replicons एक अतिरिक्त प्रतिलेखन इकाई से या वायरल प्रोटीन जीन (कुछ उदाहरण 20-23 कर रहे हैं) के साथ फ्रेम में, इस तरह के EGFP या luciferase रूप संवाददाता प्रोटीन, व्यक्त करने के लिए रिवर्स आनुवंशिकी द्वारा अंजाम दिया गया है. इन वायरस को दोहराने जब, संवाददाता जनसंपर्कoteins वायरल प्रोटीन के साथ खुद को एक साथ उत्पादन कर रहे हैं. इस वायरल प्रतिकृति को मापने और उम्मीदवार अणुओं की निरोधात्मक गतिविधियों का मूल्यांकन करने के लिए एक बहुत मात्रात्मक परख प्रदान करता है. यह इस संवाददाता प्रणाली एक उच्च संवेदनशीलता और वास्तव में कोई पृष्ठभूमि के साथ एक व्यापक गतिशील रेंज दर्शाती के बाद luciferase (या bioluminescence में सक्षम अन्य एंजाइमों) व्यक्त पुनः संयोजक वायरस के लिए विशेष रूप से सच है. इसके अलावा, कोई उत्तेजना प्रकाश स्रोत इस प्रकार यौगिक प्रतिदीप्ति 24 के साथ हस्तक्षेप को रोकने है.
यहाँ, हम विस्तार एक उच्च throughput प्रोटोकॉल आरएनए वायरस की व्यापक स्पेक्ट्रम inhibitors के लिए रासायनिक पुस्तकालयों स्क्रीन करने के लिए. यौगिकों जुगनू luciferase 25 (rMV2/Luc, चित्रा 1, प्राथमिक स्क्रीन) व्यक्त एक पुनः संयोजक खसरा वायरस (एमवी) से संक्रमित मानव कोशिकाओं पर पहले जांच की जाती है. एमवी क्रम Mononegavirales के अंतर्गत आता है, और अक्सर नकारात्मक कतरा आरएनए वायरस का एक प्रोटोटाइप सदस्य के रूप में माना जाता हैतों. जैसे, एमवी जीनोम वायरल प्रोटीन के लिए एन्कोडिंग mRNA अणुओं synthesize करने के लिए वायरल पोलीमर्स द्वारा टेम्पलेट के रूप में प्रयोग किया जाता है. RMV2/Luc बुलाया पुनः संयोजक एम वी तनाव में, luciferase अभिव्यक्ति पी और एम जीन (2A चित्रा) के बीच डाला एक अतिरिक्त प्रतिलेखन इकाई से व्यक्त किया है. समानांतर में, यौगिकों एटीपी मात्रा का ठहराव से, मूल्यांकन करता है कि एक वाणिज्यिक luciferase आधारित अभिकर्मक का उपयोग मानव कोशिकाओं पर उनकी विषाक्तता के लिए परीक्षण कर रहे हैं, संस्कृति में metabolically सक्रिय कोशिकाओं की संख्या (चित्रा 1, प्राथमिक स्क्रीन). पूरे रासायनिक पुस्तकालयों आसानी से विषाक्त नहीं हैं और कुशलतापूर्वक एमवी प्रतिकृति ब्लॉक कि यौगिकों का चयन करने के क्रम में इन दो assays के साथ जांच की जा सकती है. फिर, हिट चिकनगुनिया वायरस (CHIKV) प्रतिकृति (चित्रा 1, माध्यमिक स्क्रीन) ख़राब उनकी क्षमता के लिए खुराक प्रतिक्रिया एमवी प्रतिकृति का निषेध, विषाक्तता की कमी के साथ ही के लिए पुनर्परीक्षण कर रहे हैं. CHIKV Togaviridae परिवार का एक सदस्य है और उसके जीनोम एपी हैositive एकल कतरा शाही सेना अणु. जैसे, यह खसरा और एमवी और CHIKV दोनों आरएनए वायरस की एक बड़ी पैनल को बाधित करने के लिए एक बहुत अच्छा मौका खड़े बाधा यौगिकों के लिए पूरी तरह से असंबद्ध है. संरचनात्मक प्रोटीन प्रतिलेखन और एक subgenomic mRNA अणु का अनुवाद द्वारा इनकोडिंग हैं जबकि CHIKV nonstructural प्रोटीन सीधे, वायरल जीनोम से अनुवाद कर रहे हैं. CHIKV के लिए हमारे में इन विट्रो प्रतिकृति परख nsP3 और NSP4 दृश्यों 26 (चित्रा 2 बी) के बीच रिपोर्टर जीन की एक प्रविष्टि के माध्यम से nonstructural polyprotein की एक cleaved भाग के रूप में Renilla luciferase एंजाइम व्यक्त करता है जो CHIKV / रेन नामक एक पुनः संयोजक तनाव, पर आधारित है. Renilla luciferase गतिविधि के उपाय CHIKV जीवन चक्र के प्रारंभिक चरण में वायरल प्रतिकृति की निगरानी की अनुमति देता है.
इस उच्च throughput प्रोटोकॉल जल्दी से 10,000 molec के एक वाणिज्यिक पुस्तकालय में व्यापक स्पेक्ट्रम antivirals के लिए एक उपयुक्त प्रोफाइल के साथ यौगिकों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया थाules रासायनिक विविधता के लिए समृद्ध. यौगिकों अनिवार्य रूप से 250 से 600 डाल्टन को लेकर आणविक वजन के साथ, पांच की Lipinski के नियम का पालन, और नीचे 5 डी मूल्यों लॉग इन कर रहे थे. इन अणुओं के अधिकांश अन्य वाणिज्यिक पुस्तकालयों में उपलब्ध नहीं नए रासायनिक संस्थाओं थे.
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Protocol
यौगिकों के साथ 96 अच्छी तरह बेटी प्लेट्स के 1. तैयारी
- कमरे के तापमान -20 डिग्री सेल्सियस से DMSO में रासायनिक यौगिकों के 10 मिमी शेयर समाधान से युक्त 96 अच्छी तरह से माँ प्लेटें ले जाएँ. पतला यौगिकों 2 मिमी मध्यवर्ती 96 अच्छी तरह से कमजोर पड़ने प्लेटें प्राप्त करने के लिए DMSO में 5x. कमजोर पड़ने DMSO के 20 μl में 5 μl pipetting और मिश्रण से प्राप्त किया जाता है.
- पिपेट सफेद, बार कोड टिशू कल्चर 96 अच्छी तरह से प्लेटों के सूखे कुओं में कमजोर पड़ने प्लेटों से 1 μl. बेटी प्लेट (डी 1) का यह पहला सेट 20 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता में यौगिकों की विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. -20 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक पर स्टोर बेटी प्लेटें.
- DMSO और मिश्रण के 36 μl में कमजोर पड़ने प्लेटों से 4 μl pipetting द्वारा फिर से 1:10 यौगिकों पतला. सफेद, फ्लैट नीचे, बार कोड टिशू कल्चर 96 कुओं प्लेटों के सूखे कुओं में पिपेट 1 μl. बेटी प्लेट (डी 2) के इस दूसरे सेट एमवी replicatio के निषेध का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा2 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता में यौगिकों के एन. -20 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक पर स्टोर बेटी प्लेटें.
2. सेल संस्कृति की तैयारी यौगिक विषाक्तता का निर्धारण करने के लिए
- 37 डिग्री सेल्सियस पर HEK-293T कोशिकाओं के विकास और 5% सीओ 2 Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में स्थिर एल glutamine और 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस), स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 माइक्रोग्राम / एमएल) और एक प्रकार की दवा के साथ पूरक (100 साथ आइयू / एमएल). कोशिकाओं हर 4-5 दिनों trypsinization द्वारा passaged, और एक ताजा फ्लास्क में 1:10 पतला कर रहे हैं. कोशिकाओं के प्रयोगों के लिए लॉग चरण में होना चाहिए.
- प्रयोग के दिन, trypsinization द्वारा कोशिकाओं को ठीक और सेल गिनती करते हैं. गोली centrifugation द्वारा कोशिकाओं, और संस्कृति के माध्यम में 3 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल पर उन्हें resuspend. सेल निलंबन के 12.5 मिलीलीटर प्रत्येक स्क्रीनिंग थाली के लिए आवश्यक हैं पर विचार करें.
- स्थानांतरण एक गर्त में कोशिकाओं, और नुकीला रासायनिक कम्पो युक्त डी 1 प्लेटों में सेल निलंबन के 100 μl बग़ैरunds. गर्त भीतर सेल निलंबन नियमित रूप से अवसादन से बचने के लिए उत्तेजित किया जाता है.
- DMSO के 1 μl के साथ नियंत्रण कुओं A1, सी 1, E1, G1, A12, C12, E12 और G12 स्पाइक. इसी कुओं जीवित कोशिकाओं के लिए संदर्भ (कोई विषाक्तता) के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा. नियंत्रण कुओं बी 1 कील, डी 1, एफ 1, एच 1, DMSO के 1 μl और कोशिकाओं को मारने के लिए एक 0.5% IGEPAL समाधान के 2.5 μl के साथ बी 12, डी 12, F12 और H12. इसी कुओं मृत कोशिकाओं के लिए एक संदर्भ (उच्च विषाक्तता) के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा.
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं और 5% सीओ 2.
RMV2/Luc से संक्रमित सेल संस्कृतियों के 3. तैयारी
- आगे बढ़ें और 2.1 और 2.2 में वर्णित के रूप में कोशिकाओं को ठीक. फिर, संस्कृति के माध्यम में 3 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल Resuspend कोशिकाओं. सेल निलंबन के 12.5 मिलीलीटर प्रत्येक स्क्रीनिंग थाली के लिए आवश्यक हैं पर विचार करें.
- वैकल्पिक: 20 माइक्रोग्राम / एमएल uridine साथ पूरक मध्यम संस्कृति.
नोट: वायरल replicatio के लिए रासायनिक पुस्तकालयों स्क्रीनिंग जबn निरोधक, यह pyrimidine biosynthesis मार्ग के प्रारंभिक चरणों को लक्षित यौगिकों अक्सर 13,16,27,28 अलग कर रहे हैं कि लगता है. संस्कृति के माध्यम से uridine के अलावा इस तरह के एंटीवायरल अणुओं बाहर फिल्टर करने के लिए प्रयोग किया जाता है. दरअसल, इस कुशलता pyrimidine biosynthesis मार्ग के ऊपर एंजाइमों अवरुद्ध कर रहे हैं जब वायरल प्रतिकृति पुनर्स्थापित करता है. - गैर संक्रमित कोशिकाओं के साथ नियंत्रण कुओं के लिए सेल निलंबन के 01:10 सहेजें, और शेष मात्रा के साथ संक्रमण के लिए आगे बढ़ें.
- RMV2/Luc शेयर समाधान का उचित मात्रा पिघलना. एमवी स्टॉक समाधान मिलीग्राम प्रति 10 6 -10 8 संक्रामक कणों पर आम तौर पर कर रहे हैं. संस्कृति के संक्रमण (MOI) के 0.1 बहुलता से मेल खाती है जो लक्ष्य कोशिकाओं प्रति rMV2/Luc की 0.1 संक्रामक कणों से संक्रमित किया जाना चाहिए. नोट: rMV2/Luc एमवी वैक्सीन (श्वार्ज तनाव) से ली गई है और एक BSL2 वातावरण में हेरफेर किया गया है.
- सेल निलंबन को वायरस जोड़ें और धीरे मिश्रण. एक गर्त में संक्रमित कोशिकाओं स्थानांतरण, और 100 बांटनाकॉलम 2 नुकीला रासायनिक यौगिकों से युक्त डी 2 प्लेटों के 11 में संक्रमित कोशिका निलंबन के μl. गर्त भीतर सेल निलंबन नियमित रूप से धीरे मिलाया जाता है.
- कॉलम 1 और 12 में, 100 गैर संक्रमित कोशिकाओं की μl एक अच्छी तरह पर दो बांटना. संक्रमित कोशिकाओं को दूसरों के कुओं में तिरस्कृत कर रहे हैं.
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं और 5% सीओ 2.
4. Luciferase गतिविधि के उपाय और डेटा विश्लेषण
- इनक्यूबेटर से डी 1 प्लेटें निकालें, और सीधे संस्कृति वेल्स को luciferase आधारित व्यवहार्यता अभिकर्मक के 50 μl जोड़कर सेलुलर व्यवहार्यता का निर्धारण. मिक्स और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं. एक luminometer साथ प्लेटें पढ़ें. एकीकरण का समय अच्छी तरह से प्रति 100 मिसे में सेट है.
- इनक्यूबेटर से डी 2 प्लेटें निकालें, और सीधे संस्कृति वेल्स को luciferase सब्सट्रेट के 50 μl जोड़कर luciferase गतिविधि का निर्धारण. कमरे के तापमान पर 6 मिनट के लिए सेते हैं, और descri के रूप में एक luminometer के साथ प्लेट पढ़नेऊपर बिस्तर.
- स्क्रीन 29 की गुणवत्ता वारंट विषाक्तता परख की प्रत्येक डी 1 प्लेट के लिए एक Z'कारक की गणना. Μ + और σ + अकेले DMSO के साथ HEK-293T कोशिकाओं के लिए luminescence और मानक विचलन (कोई विषाक्तता) के साधन के अनुरूप जहां - (μ-,, जेड '= 1-3 * (σ + + σ-) / μ +) और μ और luminescence और कोशिकाओं को मारने के लिए IGEPAL के साथ इलाज संस्कृति कुओं के लिए मानक विचलन का साधन σ हैं. जेड '0.5 से ऊपर होने की उम्मीद है, या इसी थाली खारिज कर दिया है.
- Μ + / 2 में विषाक्तता सीमा निर्धारित करें. इस कट ऑफ (चित्रा 3) के नीचे luminescence मूल्यों के साथ यौगिकों त्यागें.
- एंटीवायरल परख की प्रत्येक डी 2 थाली के लिए एक Z'कारक की गणना. इधर, μ + और σ + अकेले DMSO के साथ सुसंस्कृत संक्रमित कोशिकाओं के लिए luminescence और मानक विचलन के साधन के अनुरूप है, और μ और गैर संक्रमित कोशिकाओं के लिए luminescence और मानक विचलन का साधन σ हैं. फिर, जेड और # साथ प्लेटें39; 0.5 नीचे मूल्यों खारिज कर रहे हैं.
- - / (Μ + - μ-) * 100 = (मिश्रित एक्स के लिए luciferase गतिविधि μ +) अवरोध का प्रतिशत: पालन के रूप में वायरल प्रतिकृति के निषेध की गणना. 75% से कम निषेध सीमा निर्धारित करें, और दोनों इस कट ऑफ (3B चित्रा) से नीचे luminescence मूल्यों को कम करने और 4.4 में वर्णित मापदंड के अनुसार विषाक्त नहीं हैं कि यौगिकों का चयन करें.
विषाक्तता और व्यापक स्पेक्ट्रम antiviral गतिविधि के लिए 5. माध्यमिक स्क्रीन
- प्रत्येक के लिए 1:02 धारावाहिक dilutions 500 माइक्रोन तक 4 माइक्रोन (8 dilutions) से शुरू DMSO में मिश्रित हिट बना. संस्कृति के माध्यम से 50 μl के साथ सफेद, बार कोड टिशू कल्चर प्लेटें भरें. संस्कृति कुओं में प्रत्येक परिसर कमजोर पड़ने की 1 μl जोड़ें. प्रत्येक हिट परिसर के लिए डुप्लिकेट धारावाहिक dilutions के साथ 3 संस्कृति प्लेटों है करने के लिए दो बार दोहराएँ.
- (जैसा कि ऊपर वर्णित संस्कृति के माध्यम में 6 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल पर एक HEK-293T सेल निलंबन के 37.5 मिलीलीटर की तैयारी 2.1 और 2 में.2). फाल्कन ट्यूबों में 2x 12.5 मिलीलीटर बांटना और MOI में rMV2/Luc के साथ या तो कोशिकाओं को संक्रमित = 0.1 या MOI में Renilla luciferase (CHIKV / ren) व्यक्त पुनः संयोजक CHIKV 0.2 =. Inverting द्वारा मिक्स.
नोट: CHIKV / रेन CHIKV की एक जंगली प्रकार के तनाव से प्राप्त होता है और इसलिए एक BSL3 वातावरण में चालाकी से किया जाना चाहिए. Renilla सब्सट्रेट संस्कृति वेल्स को जोड़े जाने के बाद प्लेट्स (नीचे देखें) BSL1 को BSL3 से ले जाया जा सकता है. - हिट यौगिकों के धारावाहिक dilutions युक्त संस्कृति प्लेटों में, असंक्रमित rMV2/Luc-infected, या CHIKV / रेन संक्रमित कोशिकाओं के 50 μl बांटना. 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटा सेते
- RMV2/Luc-infected कुओं में जुगनू luciferase गतिविधि का निर्धारण करने के लिए जुगनू luciferase सब्सट्रेट के 50 μl जोड़ें. CHIKV / रेन संक्रमित कुओं में Renilla luciferase गतिविधि निर्धारित करने के लिए Renilla luciferase सब्सट्रेट के 50 μl जोड़ें. अंत में, सेलुलर व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए असंक्रमित कोशिकाओं को luciferase आधारित व्यवहार्यता परख अभिकर्मक के 50 μl जोड़ें.
- प्लॉट डेटा (फाईgure 4) और 50% द्वारा एमवी और CHIKV नकल रोकना मारा कि यौगिक सांद्रता निर्धारित करते हैं. इस परख में कुछ विषाक्तता दिखा यौगिक उपेक्षा.
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Representative Results
इस स्क्रीनिंग पाइपलाइन एमवी नकल रोकना कि यौगिकों के चयन पर पहली निर्भर करता है और किसी भी महत्वपूर्ण सेलुलर विषाक्तता (चित्रा 1, प्राथमिक स्क्रीन) नहीं दिखा है. यह सेलुलर विषाक्तता और वायरल प्रतिकृति का निषेध निर्धारित करने के लिए luciferase आधारित assays का फायदा उठाते हैं. सभी pipetting कदम और डाटा अधिग्रहण एक रोबोट मंच के साथ एक उच्च throughput सेटिंग में प्रदर्शन किया जा सकता है.
यौगिकों के सेलुलर विषाक्तता metabolically सक्रिय कोशिकाओं से मेल खाती है जो एटीपी मौजूद है, की मात्रा का ठहराव के आधार पर संस्कृति में जीवित कोशिकाओं की संख्या का मूल्यांकन करता है कि एक luciferase आधारित व्यवहार्यता परख का उपयोग मूल्यांकन किया है. Luciferase द्वारा luciferin ऑक्सीकरण एटीपी निर्भर है, luminescence संकेत. चित्रा 3A एक प्रतिनिधि स्क्रीनिंग थाली के लिए परिणाम दिखा रहा है जीवित कोशिकाओं द्वारा प्रदान सेलुलर एटीपी के लिए आनुपातिक है. जैसी कि उम्मीद थी, बहुत अलग luciferase गतिविधि मूल्यों measur थेIGEPAL साथ मारे गए जीवित कोशिकाओं या मृत कोशिकाओं को या तो निहित है कि नियंत्रण कुओं में एड. थ्रेसहोल्ड अनुभव से कुछ सेलुलर विषाक्तता दिखा यौगिकों बाहर फिल्टर करने के लिए μ + / 2 पर सेट है और वर्तमान मामले में, इस थाली से 21 यौगिकों निकाल दिया गया. समानांतर में, antiviral गतिविधि rMV2/Luc, एमवी व्यक्त luciferase की एक पुनः संयोजक तनाव (चित्रा 2) का उपयोग कर मापा जाता है. वे एमवी संक्रमण को अत्यधिक संवेदनशील हैं क्योंकि मानव HEK-293T कोशिकाओं का इस्तेमाल कर रहे हैं. नतीजतन, संक्रमित संस्कृति कुओं में luciferase गतिविधि (नियंत्रण कुओं में 200-300 x 10 3 luciferase गतिविधि इकाइयों) बहुत अधिक है. यह. चित्रा 3B एक स्क्रीनिंग थाली के लिए प्राप्त प्रतिनिधि परिणाम दिखा रहा है एमवी प्रतिकृति inhibitors के चयन की सुविधा है कि एक बड़ी गतिशील रेंज प्रदान करता है. चार यौगिकों इस उदाहरण में 75% से अधिक द्वारा वायरल प्रतिकृति हिचकते हैं और चयन किया गया था.
अंत में, विषाक्त नहीं हैं और यौगिकों कि रन बनाएवायरल प्रतिकृति परख में सकारात्मक (चित्रा 3 ए और 3 बी) का चयन कर रहे हैं. उनका आधा अधिक से अधिक निरोधात्मक एकाग्रता (IC50) दो असंबंधित आरएनए वायरस (चित्रा 1, माध्यमिक स्क्रीन) हैं जो एमवी और CHIKV, दोनों पर निर्धारित किया जाता है. हिट यौगिकों के antiviral गतिविधि (rMV2/Luc) या Renilla (CHIKV / ren) luciferase जुगनू या तो व्यक्त पुनः संयोजक वायरस उपभेदों का उपयोग कर निर्धारित किया जाता है. चित्रा -4 ए और 4 बी क्रमशः एमवी और CHIKV प्रतिकृति, के लिए प्रतिनिधि निषेध घटता दिखा. इन घटता हिट यौगिकों के IC50s निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है. समानांतर में, चयनित यौगिकों के सेलुलर विषाक्तता की कमी ऊपर वर्णित luciferase आधारित व्यवहार्यता परख (चित्रा 4C) का उपयोग कर एक खुराक प्रतिक्रिया प्रयोग में पुष्टि की है. तालिका 1 13 गैर का एक सेट पर एमवी और CHIKV प्रतिकृति के लिए IC50 मूल्यों दिखा रहा है 10,000 अणुओं के एक रासायनिक पुस्तकालय से पहचान विषैले यौगिकों. ये कम्पोunds दोनों रासायनिक संरचना और जैविक गतिविधि के मामले में उपन्यास कर रहे हैं. इन अणुओं के कुछ संरचनात्मक समानता साझा, और तीन अलग रासायनिक परिवारों में इकट्ठा किया जा सकता है. एक संदर्भ के रूप में, brequinar साथ प्राप्त IC50 मान भी. Brequinar विट्रो 30,31 में एक शक्तिशाली antiviral गतिविधि के साथ dihydroorotate डिहाइड्रोजनेज के एक अवरोध, pyrimidine biosynthesis मार्ग की चौथी एंजाइम है तालिका 1 में दिखाया गया. IC50 मूल्यों को देख, परिमाण के कम से कम एक आदेश स्क्रीनिंग द्वारा की पहचान सबसे ज्यादा चर्चित हिट से इस संदर्भ अणु अलग कर दिया. यह चयनित यौगिकों के मजबूत antiviral गतिविधि की स्थापना की.
स्क्रीनिंग पाइपलाइन के चित्रा 1. सारांश. बाएं पैनल पी दिखा रहा हैयौगिकों विषाक्तता और एमवी प्रतिकृति ब्लॉक करने की क्षमता की कमी के लिए चुने गए हैं, जहां rimary स्क्रीन. राइट पैनल चयनित यौगिकों के antiviral गतिविधि की पुष्टि की है, जहां माध्यमिक स्क्रीन दिखा रहा है, और CHIKV प्रतिकृति ब्लॉक करने की क्षमता निर्धारित की जाती है. कुशलता से किसी भी महत्वपूर्ण विषाक्तता के बिना एमवी और CHIKV कि ब्लॉक यौगिकों आरएनए वायरस के संभावित व्यापक स्पेक्ट्रम inhibitors के रूप में माना जाता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. Luciferase जीन ले पुनः संयोजक आरएनए वायरस के जीनोमिक संगठन. (ए) rMV2/Luc: एमवी नकारात्मक भावना आरएनए जीनोम छह जीनों के साथ, बाईं तरफ अपनी 3 'अंत के साथ प्रदर्शित किया जाता हैराजधानी पत्र में संकेत दिया और सफेद आयत के रूप में दर्शाया गया है. पत्रकार जीन के लिए अतिरिक्त ट्रांसक्रिप्शनल इकाइयों एन्कोडिंग पी और एम जीन के बीच डाला और एक पीले रंग की आयत के रूप में दिखाया गया है (बी) CHIKV / रेन:. CHIKV सकारात्मक भावना आरएनए जीनोम बाईं तरफ अपनी 5'से ढकी अंत के साथ प्रदर्शित किया जाता है, चार गैर संरचनात्मक प्रोटीन एन्कोडिंग खुला पढ़ने फ्रेम के साथ (nsP1 -4). बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3. एक 96 अच्छी तरह से थाली स्क्रीनिंग के लिए प्रतिनिधि परिणाम है. (ए) luciferase आधारित व्यवहार्यता परख के साथ प्राप्त luciferase मूल्यों. स्तंभ 1 और 12 अकेले DMSO के साथ वैकल्पिक नियंत्रण के अनुरूप ("+", कोई विषाक्तता) या IGEPAL ("-", उच्च toxi शहर). सफेद कुओं जहरीले यौगिकों (luciferase मूल्यों <12,203 x 10 3). (बी) rMV2/Luc-infected कोशिकाओं के साथ प्राप्त luciferase मूल्यों के अनुरूप जबकि ब्लू रंग, संस्कृति कुओं में पाया एटीपी सांद्रता के अनुसार विषाक्त नहीं माना जाता है कि यौगिकों पर प्रकाश डाला है. ("-") या अकेले DMSO के साथ इलाज rMV2/Luc-infected कोशिकाओं ("") स्तंभ 1 और 12 वैकल्पिक नियंत्रण, यानी गैर संक्रमित HEK-293T कोशिकाओं के अनुरूप हैं. प्रत्येक परीक्षण परिसर के लिए, चित्रा luciferase luminescence संकेत और कुओं को नियंत्रित करने के लिए निषेध रिश्तेदार का प्रतिशत दोनों दिखा रहा है. 75% से अधिक द्वारा luminescence संकेत बाधा यौगिकों वे (ए) में निर्धारित के रूप में विषाक्त या नहीं माना जाता था, तो पीले या हरे रंग के आधार में डाला जाता है. इस प्रकार, हरे रंग एमवी नकल रोकना और सेलुलर व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करते कि हिट यौगिकों दिखा रहा है.टी = "_blank"> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
यौगिकों C864, C648 और C062 के चित्रा 4. खुराक प्रतिक्रिया antiviral गतिविधि और विषाक्तता. (ए) HEK-293T कोशिकाओं luciferase व्यक्त एमवी का rMV2/Luc तनाव के साथ (MOI = 0.1) से संक्रमित है, और अकेले C864, C648, C062 या DMSO की बढ़ती खुराक के साथ incubated रहे थे. 24 घंटे के बाद, luciferase अभिव्यक्ति निर्धारित किया गया था. * मनाया luciferase संकोच सभी तीन यौगिकों (P-मानों <0.05) के साथ सांख्यिकीय महत्वपूर्ण थे कि इंगित करता है. (बी) HEK-293T कोशिकाओं Renilla luciferase (MOI = 0.2) व्यक्त CHIKV की CHIKV / रेन तनाव से संक्रमित है, और बढ़ाने के साथ incubated रहे थे अकेले C864, C648, C062 या DMSO की खुराक. 24 घंटे के बाद, Renilla luciferase अभिव्यक्ति निर्धारित किया गया था. * Statisti इंगित करता हैसभी तीन यौगिकों (P-मानों <0.05) के साथ बड़ी सफाई महत्वपूर्ण संकोच. (सी) HEK-293T कोशिकाओं अकेले C864, C648, C062 या DMSO की बढ़ती खुराक के साथ incubated रहे थे. विषाक्तता के लिए एक नियंत्रण के रूप में, सेल संस्कृतियों एक 0.5% IGEPAL समाधान के 2.5 μl के साथ पूरक थे. 24 घंटे के बाद, जीवित कोशिकाओं की संख्या luciferase आधारित व्यवहार्यता परख का उपयोग निर्धारित किया गया था. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
| रासायनिक परिवार | यौगिक | एमवी (IC50 माइक्रोन) | CHIKV (IC50 माइक्रोन) | CC50 (माइक्रोन) |
| 1 | C864 | 0.6 | 0.6 | > 5 |
| 1 | C877 | 0.2 | 0.2 | > 5 |
| 1 | C957 | 1.2 | 1.2 | > 5 |
| 1 | C963 | 1.2 | 0.9 | > 5 |
| 1 | C967 | 1.7 | 1.6 | > 5 |
| 1 | C348 | 0.25 | 0.3 | > 5 |
| 1 | C265 | 0.25 | 0.3 | > 5 |
| 1 | C270 | 0.5 | 0.5 > 5 | |
| 1 | C350 | 0.4 | 0.5 | > 5 |
| 2 | C646 | 0.16 | 0.15 | > 5 |
| 2 | C814 | 1.9 | 1.1 | > 5 |
| 2 | C648 | 0.7 | 0.4 | > 5 |
| 3 | C062 | 1 | 1.2 | > 5 |
| Brequinar | 0.04 | 0.04 | > 5 |
13 की तालिका 1. Antiviral गतिविधि और cytotoxicityमूल रासायनिक पुस्तकालय से चयनित यौगिकों. परिणाम एमवी का निषेध या CHIKV प्रतिकृति के लिए IC50 मूल्यों के रूप में व्यक्त कर रहे हैं. CC50 मूल्यों माध्यमिक स्क्रीन से खुराक प्रतिक्रिया प्रयोगों में सभी यौगिकों के लिए> 5 माइक्रोन पाए गए. लेकिन प्राथमिक स्क्रीन से cytoxicity के लिए स्कोरिंग फिल्टर सीमा CC50 मानों भी> 20 माइक्रोन का सुझाव है कि.
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Discussion
यहाँ वर्णित स्क्रीनिंग पाइपलाइन आरएनए वायरस की व्यापक स्पेक्ट्रम inhibitors के रूप में एक उपयुक्त प्रोफाइल के साथ यौगिकों का चयन करना है. 10,000 यौगिकों का एक पुस्तकालय इस प्रोटोकॉल और aforementioned फ़िल्टरिंग मापदंड लागू किया गया के साथ जांच की गई थी, 75%, 40 यौगिकों (0.4%) से बेहतर एमवी प्रतिकृति यानी निषेध सकारात्मक बने. इसके अलावा, उनमें से लगभग आधे luciferase आधारित व्यवहार्यता परख में कुछ विषाक्तता से पता चला है, और इस कारण से अवहेलना कर रहे थे. अंत में, बड़ा राशि में आसानी से उपलब्ध हिट की एक दर्जन retested थे. इस छोटे से सेट आसानी से दोनों सेलुलर विषाक्तता और खुराक प्रतिक्रिया प्रयोगों में एमवी और CHIKV के खिलाफ वायरल प्रतिकृति का निषेध (चित्रा 4) के लिए पुनर्परीक्षण किया गया था. सभी चयनित यौगिकों के antiviral गतिविधि की पुष्टि की है, और इस स्क्रीनिंग पाइपलाइन के लिए समग्र पहचान हिट दर 1.3 ‰ था. इस स्कोर विभिन्न उच्च throughput के साथ अन्य समूहों से प्राप्त परिणामों के समान हैantivirals 27,32, और (1-5 ‰ 33) सामान्य में सेल आधारित प्ररूपी assays के लिए अपेक्षित श्रेणी में गिर जाता है के लिए प्रतिकृति आधारित स्क्रीनिंग assays. हालांकि, एक हिट दर एकत्र आंकड़ों के प्रोफाइल के आधार पर समायोजित किया जा सकता है, जो जांच की है कि परिसर के पुस्तकालय और स्कोरिंग फिल्टर थ्रेसहोल्ड दोनों पर निर्भर है. इधर, एमवी प्रतिकृति और सेलुलर विषाक्तता के निषेध के लिए चयनित थ्रेसहोल्ड अनुभव से निर्धारित किया गया है, और व्यापार बंद आसानी CHIKV के खिलाफ माध्यमिक स्क्रीन में पुनर्परीक्षण किया जा सकता है कि हिट की एक विनयशील संख्या प्राप्त करने के लिए स्थापित किया गया था.
प्राथमिक स्क्रीन में, यौगिकों एमवी प्रतिकृति और सेलुलर विषाक्तता की कमी को ब्लॉक करने के लिए दोनों अपनी क्षमता के लिए परीक्षण किया गया. सेलुलर विषाक्तता 20 माइक्रोन से कम निर्धारित किया गया था, जबकि antiviral गतिविधि rMV2/Luc-infected कोशिकाओं पर 2 माइक्रोन की एकाग्रता में निर्धारित किया गया था. इन प्रयोगात्मक सेटिंग्स सीधे एक उच्च विरोधी के साथ यौगिकों के लिए चयन करने के लिए मूल्यवान पाया गयासेलुलर विषाक्तता को वायरल गतिविधि रिश्तेदार. इसके अलावा, प्राथमिक स्क्रीन uridine की उपस्थिति में किया गया था. दरअसल, हाल के प्रकाशनों आरएनए वायरस 13,16,27,28 के inhibitors की तलाश में जब pyrimidine biosynthesis मार्ग के प्रारंभिक चरणों को लक्षित यौगिकों अक्सर अलग कर रहे हैं कि सुझाव देते हैं. विशेष रूप से, एंटीवायरल अणुओं की तलाश में अनुसंधान समूहों dihydroorotate डिहाइड्रोजनेज की inhibitors, यह चयापचय मार्ग 31 की चौथी एंजाइम पाया है. इस प्रकार इस एंजाइम के निषेध के लिए संस्कृति के माध्यम कुशलतापूर्वक पार पूरक में uridine, और वायरल प्रतिकृति पुनर्स्थापित करता है. इस तरह, pyrimidine biosynthesis मार्ग के अवरोध के माध्यम से एमवी नकल रोकने यौगिकों कि सीधे एंटीवायरल हिट से बाहर रखा गया है. अंत में, Z'कारक इस प्रकार परख की उच्च मजबूती और गुणवत्ता का प्रदर्शन, व्यवस्थित 0.5 से ऊपर हो पाया था.
समानांतर में, सेलुलर विषाक्तता एक उच्च throughpu का उपयोग निर्धारित किया गया थाएटीपी की मात्रा का ठहराव के आधार पर संस्कृति में metabolically सक्रिय कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करता है कि टी luciferase आधारित परख. प्रत्येक स्क्रीनिंग थाली में, IGEPAL विषाक्तता के लिए नियंत्रण कुओं में जोड़ा गया है. यह गैर denaturing, गैर ईओण डिटर्जेंट luciferase एंजाइम की गतिविधि को प्रभावित किए बिना गैर विशेष रूप से कुशलतापूर्वक सभी प्रकार की कोशिकाओं को मारने का लाभ दिया है. Z'कारक इस प्रकार परख की उच्च मजबूती और गुणवत्ता का प्रदर्शन, व्यवस्थित 0.5 125 से अधिक प्लेटों के ऊपर था. इस सेलुलर विषाक्तता परख की एक सीमा अपने अपेक्षाकृत उच्च लागत है. सेलुलर व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए एक वैकल्पिक परख के रूप में, कुछ समूहों अनिवार्यता से एक स्थिर transgene 34 से luciferase व्यक्त सेल लाइनों का इस्तेमाल किया है. ऐसे assays में विषाक्त यौगिकों सेलुलर व्यवहार्यता को प्रभावित करने जब luciferase अभिव्यक्ति में कमी या भी दबाने की उम्मीद कर रहे हैं. हमने हाल ही में IFN-β उत्तेजना 35 पर luciferase व्यक्त एक स्थिर सेल लाइन विकसित की है, और इस सेल लाइन एक tr परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया थासेलुलर विषाक्तता के लिए 80 यौगिकों के aining सेट. हैरानी की बात है, इस परख और ऊपर वर्णित luciferase आधारित व्यवहार्यता परख के बीच सहसंबंध गुणांक (सीसी) अपेक्षाकृत कम था (सीसी = 0.67). एटीपी चयापचय अप्रभावित रहा था, जबकि वास्तव में, कई यौगिकों, transgene से luciferase अभिव्यक्ति बिगड़ा. कुछ व्यापक स्पेक्ट्रम antiviral यौगिकों ऐसे भी सेलुलर जीन अभिव्यक्ति क्षीण होगा जो सेल संकेतन, जीन प्रतिलेखन या प्रोटीन अनुवाद, के रूप में सेलुलर कार्यों को प्रभावित करने की संभावना है. सेलुलर व्यवहार्यता के लिए कोई सही स्क्रीनिंग प्रणाली नहीं है, यह सेलुलर जीन अभिव्यक्ति पर आधारित जहरीले यौगिकों छानने संभावित सदाशयी एंटीवायरल अणुओं को बाहर करने के लिए नेतृत्व करेंगे कि खतरे में है.
माध्यमिक स्क्रीन ठीक उनके IC50s का निर्धारण, जबकि दो पूरी तरह से असंबंधित आरएनए वायरस के खिलाफ चयनित यौगिकों के antiviral गतिविधि की स्थापना करना है. दिलचस्प है, यह देखा जाना चाहिए कि luciferase एंजाइमinhibitors गलत rMV2/Luc परख में सकारात्मक रूप से रन बनाए जा सकते हैं, लेकिन ऐसी झूठी सकारात्मक फ़िल्टर्ड से बाहर कर दिया जाएगा माध्यमिक स्क्रीन से CHIKV / बच्चों के निषेध के लिए परीक्षण किया है. दरअसल, rMV2/Luc और CHIKV / रेन क्रमशः, जुगनू और Renilla luciferase व्यक्त, और इन दो एंजाइमों असंबंधित हैं और विभिन्न रासायनिक प्रतिक्रियाओं को उत्प्रेरित. प्राथमिक स्क्रीन में rMV2/Luc से जुगनू luciferase संवाददाता बाधित यौगिकों कि CHIKV / बच्चों के खिलाफ किसी भी गतिविधि दिखाई नहीं देंगे और इस तरह antivirals के रूप में उनकी गलत चयन को रोकने खारिज कर दिया जाएगा. अप्रत्याशित रूप से, एमवी प्रतिकृति अवरुद्ध सभी 13 प्राथमिक हिट भी इस माध्यमिक स्क्रीन में CHIKV हिचकते. यह हमेशा अन्य पुस्तकालयों (डेटा) नहीं दिखाया स्क्रीनिंग जब कुछ एमवी विशिष्ट inhibitors अलग थे के रूप में ऐसा नहीं है. इसके अलावा, चयनित यौगिकों संरचनात्मक समानता का हिस्सा है और केवल तीन रासायनिक परिवार (1 टेबल) में बांटा जा सकता है. अगर एक रसायन के परिवार के भीतर यौगिकों शायद acti का एक ही तरीका हैपर, और इसलिए एक ही रासायनिक इकाई की analogs के रूप में माना जा सकता है. इस परिप्रेक्ष्य में सभी 13 चयनित यौगिकों एमवी और CHIKV प्रतिकृति दोनों हिचकते तथ्य यह है कि डालता है. फिर भी, इन परिणामों को भी व्यापक स्पेक्ट्रम antivirals अधिक बार वायरस विशेष inhibitors से पहचान कर रहे हैं सुझाव है कि सकता है. इस परिकल्पना के पीछे तर्कसंगत स्पष्ट specificities के बावजूद, सभी आरएनए वायरस ऐसे ribosomal मशीनरी, cytoskeleton या ऊर्जा के स्रोत के रूप में mitochondria के रूप में दोहराने के लिए एक ही मूल सेलुलर कार्यों, पर भरोसा करते हैं, कि है. इन कार्यात्मक मॉड्यूल व्यापक स्पेक्ट्रम antivirals के लिए संभावित ठिकानों की एक अपेक्षाकृत बड़े पैनल प्रदान जो जटिल आणविक प्रणाली, कर रहे हैं. इसके विपरीत, वायरस विशेष inhibitors बढ़ाने के लिए उपयुक्त लक्ष्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं कि वायरल या सेलुलर कारकों की एक सीमित सेट ही नहीं है. भविष्य में, प्ररूपी स्क्रीनिंग द्वारा की पहचान antivirals के नए पैनल इस परिकल्पना की पुष्टि करने या रद्द करने के लिए आवश्यक डेटा प्रदान करना चाहिए.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
हम अपने उपयोगी टिप्पणियों और सुझावों के लिए डॉ. यवेस एल Janin धन्यवाद. हम उसे तकनीकी समर्थन के लिए CHIK / रेन और सी. Combredet के लिए एच एच गाद को धन्यवाद देना चाहूंगा. पाश्चर बुराइयों Infectieuses (पीओवी के लिए कार्यक्रम डंक और एचएम - यह काम Institut पाश्चर, केंद्र में राष्ट्रीय डी ला Recherche Scientifique (CNRS) Institut राष्ट्रीय डे ला Sante एट डी ला Recherche médicale (INSERM), Institut कार्नोट द्वारा समर्थित किया गया एल), एजेंस नेशनल ला Recherche पीओवी के लिए (ANR-RPIB, कार्यक्रम डंक 2.0), और "Conseil क्षेत्रीय डी 'Ile-de-फ्रांस" (रासायनिक लाइब्रेरी प्रोजेक्ट डालना, अनुदान n मैं 06-222 / आर ° और मैं एचएम-एल 09-1739 / आर.). CHIKV / रेन पर काम परियोजना ArbOAS द्वारा समर्थित किया गया (ANR अनुदान 2010-INTB-1601-02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freedom EVO platform | TECAN | Robotic platform | |
| 96-well polystyrene cell culture microplates, white | Greiner Bio One | 655083 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | Luciferase-based viability assay |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Reagent containing firefly luciferase substrate |
| Renilla-Glo luciferase Assay System | Promega | E2710 | Reagent containing Renilla luciferase substrate |
| Britelite plus Reporter Gene Assay System | Perkin-Elmer | 6016761 | Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity. |
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