Summary
Les essais in vitro pour mesurer la réplication du virus a été grandement améliorée par la mise au point de virus à ARN recombinants exprimant la luciférase ou d'autres enzymes capables de bioluminescence. Ici, nous détaillons un pipeline de criblage à haut débit qui combine ces souches recombinantes de la rougeole et les virus de chikungunya à isoler antiviraux à large spectre de bibliothèques chimiques.
Abstract
virus à ARN sont responsables de maladies humaines majeures telles que la grippe, la bronchite, la dengue, l'hépatite C ou la rougeole. Ils représentent aussi une menace émergente en raison de l'augmentation des échanges à travers le monde et les populations humaines pénétrant écosystèmes de plus en plus naturelles. Un bon exemple d'une telle situation émergente est épidémies de virus du chikungunya de 2005-2006 dans l'océan Indien. Les progrès récents dans notre compréhension des voies cellulaires contrôlant la réplication virale suggèrent que des composés ciblant les fonctions de la cellule hôte, plutôt que le virus lui-même, pourraient inhiber un large panel de virus à ARN. Certains composés antiviraux à large spectre ont été identifiés avec accueil tests et ciblées. Toutefois, la mesure de l'inhibition de la réplication virale dans des cultures de cellules en utilisant la réduction de l'effet cytopathogène comme une visualisation représente encore une stratégie de dépistage primordiale. Ces écrans fonctionnels ont été grandement améliorées par le développement des virus recombinants exprimant journaliste enzymes capable de bioluminescence tel que la luciférase. Dans le présent rapport, nous détaillons un pipeline de criblage à haut débit, qui combine recombinant de la rougeole et les virus de chikungunya avec des tests de viabilité cellulaire, pour identifier des composés avec un profil antivirale à large spectre.
Introduction
virus à ARN sont responsables d'une grande variété d'infections humaines, et avoir un impact énorme sur les populations à travers le monde à la fois en termes de santé publique et de coût économique. Vaccins efficaces ont été mis au point contre plusieurs virus à ARN humain, et sont largement utilisés comme traitements prophylactiques. Cependant, il ya encore un manque crucial de médicaments thérapeutiques contre les infections de virus à ARN. En effet, les vaccins efficaces ne sont pas disponibles par rapport aux principales agents pathogènes humains tels que le virus de la dengue, virus de l'hépatite C ou le virus respiratoire syncytial humain (hRSV). En outre, des virus à ARN sont responsables de la majorité des maladies émergentes, qui ont augmenté en fréquence en raison des échanges mondiaux et l'impact humain sur les systèmes écologiques. Contre cette menace que représentent les virus à ARN, notre arsenal thérapeutique est très limitée et relativement inefficace 1-3. Les traitements actuels sont essentiellement basés sur le type recombinant des interférons (IFN-α / β) pour stimuler l'immunité innée,ou l'administration de la ribavirine. Bien que le mode d'action de cette ribonucléoside analogique est controversée et s'appuie sur divers mécanismes probablement, l'inhibition de l'IMPDH cellulaire (inosine monophosphate déshydrogénase), qui épuise les pools intracellulaires de GTP, 4 est évidemment essentiel. La ribavirine, en combinaison avec PEG-IFN-α, est le principal traitement contre le virus de l'hépatite C. Cependant, les traitements IFN-α / β et ribavirine sont relativement pauvres efficacité in vivo contre la plupart des virus à ARN comme ils efficacement émoussé IFN-α / β de signalisation à travers l'expression de facteurs de virulence 5 et échappent souvent à la ribavirine 3. Ceci ajouté au fait que le traitement de la ribavirine soulève des questions de toxicité importants, mais il a récemment été approuvé contre la maladie de hRSV sévère avec avantages controversés 6. Plus récemment, certains traitements spécifiques du virus ont été commercialisés, en particulier contre le virus de la grippe avec le développement odes inhibiteurs de la neuraminidase f 3. Cependant, la grande diversité et l'émergence permanente de virus à ARN empêche le développement de traitements spécifiques contre chacun d'eux dans un avenir relativement proche. Au total, ce insiste sur la nécessité de stratégies efficaces pour identifier et développer des molécules antivirales puissantes dans un proche avenir.
Il est trivial de dire que un inhibiteur à large spectre actif contre un large panel de virus à ARN permettrait de résoudre ce problème. Même si une telle molécule est toujours le rêve d'un virologue, notre meilleure compréhension des mécanismes de défense cellulaire et le système immunitaire inné suggèrent que des possibilités existent 7,8. Plusieurs laboratoires académiques et industriels cherchent maintenant des molécules qui stimulent des aspects spécifiques des mécanismes de défense cellulaire ou des voies métaboliques à émousser la réplication virale. Bien que ces composés seront probablement montrer des effets secondaires importants, les traitements contre les infections virales aiguës seront administrered pour un temps relativement court, ce qui les rend acceptable malgré une certaine toxicité potentielle sur le long terme. Diverses stratégies ont été développées pour identifier ces large spectre des molécules antivirales. Certains programmes de recherche visent à trouver des molécules qui ciblent les voies spécifiques de la défense ou métaboliques. Cela comprend, par exemple, récepteurs de reconnaissance de l'agent pathogène à susciter l'expression des gènes antiviraux 9 et activer des facteurs antiviraux tels que RNaseL 10, les machines de autophagy pour promouvoir la dégradation des virus 11, à la synthèse de nucléoside parcours d'accompagnement 12,13, ou cascades apoptotiques pour précipiter la mort de cellules infectées par des virus 14. D'autres groupes ont développé des écrans phénotypiques qui ne sont pas fondées, cibler 13,15-17. Dans ce cas, des molécules antivirales sont simplement identifiés par leur capacité à bloquer la replication virale dans un système cellulaire donné. L'hypothèse générale est que un composé inhibant 2-3 virus à ARN indépendants aurait un profil adapté pour un large spectrum molécule antivirale. Le mode d'action des composés de vie choisis avec une telle approche empirique n'est déterminé dans un second temps et finalement, peut conduire à l'identification de cibles cellulaires nouvelles d'antiviraux. Fait intéressant, une analyse rétrospective des nouveaux médicaments approuvés par la US Food and Drug Administration entre 1999 et 2008 a montré que, en général, ces projections phénotypiques ont tendance à mieux performer que les approches fondées sur des objectifs à découvrir des médicaments à petites molécules de première en classe 18 .
La réplication virale dans les tests cellulaires à haut débit est généralement déterminée à partir de virus effets cytopathiques. Les cellules sont infectées et cultivées dans des 96 - ou des plaques à 384 puits en présence des composés testés. Après quelques jours, les couches cellulaires sont fixées et colorées avec des colorants tels que le violet de cristal. Enfin, l'absorbance est mesurée avec un lecteur de plaques et de composés inhibiteurs de la replication virale sont identifiés par leur capacité à conserver des couches cellulaires from induite par le virus effet cytopathique. Alternativement, un effet cytopathogène viral-médiation sont évalués en utilisant des analyses de viabilité standard telles que la réduction MTS. De tels dosages sont très maniable et rentable, mais souffrent de trois limites majeures. D'abord, ils exigent une combinaison virus-cellule, la réplication virale est cytopathique en seulement quelques jours, mais ce n'est pas toujours possible, appelant ainsi à 19 autres approches. Deuxièmement, ils sont mal quantitative car elles sont fondées sur une mesure indirecte de la réplication virale. Enfin, les composés toxiques peuvent être marqués comme résultats positifs, et doivent donc être éliminées avec un écran de mesure contre la viabilité cellulaire. Pour surmonter certains de ces obstacles, des virus ou des réplicons recombinants ont été conçus par génétique inverse pour exprimer des protéines rapporteurs, tels que la EGFP ou la luciférase, à partir d'une unité de transcription supplémentaire ou dans le cadre avec des gènes de protéines virales (quelques exemples 20-23). Lorsque ces virus se répliquent, journaliste proteins sont produites conjointement avec des protéines virales eux-mêmes. Ceci permet d'obtenir un dosage très quantitative pour mesurer la replication virale et à évaluer l'activité inhibitrice des molécules candidates. Cela est particulièrement vrai pour les virus recombinants exprimant la luciférase (ou d'autres enzymes capables de bioluminescence) puisque ce système rapporteur présente une large gamme dynamique avec une haute sensibilité et pratiquement pas de fond. En outre, il n'y a pas de source de lumière d'excitation, empêchant ainsi l'interférence avec le composé 24 fluorescence.
Ici, nous détaillons un protocole haut débit pour cribler des bibliothèques chimiques pour les inhibiteurs à large spectre de virus à ARN. Les composés sont testés en premier sur les cellules humaines infectées par un virus recombinant de la rougeole (MV) exprimant la luciférase de luciole 25 (rMV2/Luc, figure 1, l'écran primaire). MV appartient à Mononegavirales ordre, et est souvent considéré comme un membre prototypique de virus à ARN négatifes. En tant que tel, génome MV est utilisée comme matrice par la polymerase virale de synthétiser des molécules d'ARNm codant pour les protéines virales. Dans la souche MV recombinant appelé rMV2/Luc, expression de la luciférase est exprimée à partir d'une unité de transcription additionnelle insérée entre les gènes P et M (figure 2A). En parallèle, les composés sont testés pour leur toxicité sur des cellules humaines en utilisant un réactif à base de luciférase-commercial qui évalue, par quantification de l'ATP, le nombre de cellules métaboliquement actives en culture (figure 1, l'écran primaire). Bibliothèques chimiques entiers peuvent être facilement sélectionnés avec ces deux tests afin de sélectionner des composés qui ne sont pas toxiques et qui bloquent efficacement la réplication MV. Ensuite, les coups sont à nouveau testés pour l'inhibition dose-réponse de la réplication MV, l'absence de toxicité ainsi que pour leur capacité à nuire à virus chikungunya (CHIKV) réplication (figure 1, l'écran secondaire). CHIKV est un membre de la famille des Togaviridae, et son génome est apositive molécule d'ARN simple brin. En tant que tel, il est complètement étranger à la rougeole et des composés inhibant la fois MV et CHIKV une grande chance pour inhiber un large panel de virus à ARN. Les protéines non structurales CHIKV sont directement traduits à partir du génome viral, alors que les protéines structurales sont codées par transcription et traduction d'une molécule d'ARNm sub-génomique. Notre test in vitro de la réplication de CHIKV est basé sur une souche recombinante appelée CHIKV / Ren, qui exprime la luciférase de Renilla enzyme comme une partie séparée par clivage de la polyprotéine non structurale par le biais d'une insertion du gène rapporteur entre nsP3 et séquences nsP4 26 (figure 2B). La mesure de l'activité de la luciférase de Renilla permet le contrôle de la réplication virale, au stade précoce du cycle de vie CHIKV.
Ce protocole à haut débit a été utilisé pour identifier rapidement des composés avec un profil adapté pour antiviraux à large spectre dans une bibliothèque commerciale de 10 000 molecdules enrichie de la diversité chimique. Les composés ont été essentiellement suivent la règle de Lipinski de cinq ans, avec des poids moléculaires allant de 250 à 600 daltons, et valeurs du log D en dessous de 5. Plupart de ces molécules sont de nouvelles entités chimiques ne sont pas disponibles dans d'autres bibliothèques commerciales.
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Protocol
1. Préparation de 96 puits fille plaques avec les composés
- Déplacer plaques mères à 96 puits contenant 10 mM de solutions de composés chimiques dans le DMSO à partir de -20 ° C à la température ambiante. Diluer composés 5x dans le DMSO pour obtenir des plaques de dilution 96 puits intermédiaires à 2 mM. La dilution est réalisée par pipetage de 5 ul dans 20 ul de DMSO et de mélange.
- 1 ul de plaques de dilution dans les puits sec de blanc, de culture de tissu à code à barres des plaques 96 puits. Ce premier ensemble de plaques-filles (D1) seront utilisées pour évaluer la toxicité des composés à une concentration finale de 20 uM. Magasin fille plaques à -20 ° C jusqu'à utilisation.
- Diluer composés encore 1h10 par pipetage 4 pi à partir de plaques de dilution dans 36 ul de DMSO et le mixage. 1 ul dans les puits à sec de blanc, à fond plat, la culture de tissus code à barres 96 puits plaques. Ce second ensemble de plaques-filles (D2) sera utilisé pour évaluer l'inhibition de la MV replication par les composés à une concentration finale de 2 pM. Magasin fille plaques à -20 ° C jusqu'à utilisation.
2. Préparation de cultures cellulaires pour déterminer la toxicité de composés
- Cultiver des cellules HEK-293T à 37 ° C et 5% de CO2 dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec stabilisation de L-glutamine et supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (FCS), de la streptomycine (100 ug / ml) et de la pénicilline (100 UI / ml). Les cellules sont repiquées par traitement à la trypsine tous les 4-5 jours, et dilués 01h10 dans un nouveau flacon. Les cellules doivent être en phase de journal pour des expériences.
- Le jour de l'expérience, de récupérer les cellules par traitement à la trypsine et d'effectuer le comptage des cellules. Pellet cellules par centrifugation et les remettre en suspension à 3 x 10 5 cellules / ml dans du milieu de culture. Considèrent que 12,5 ml de suspension de cellules sont nécessaires pour chaque plaque de blindage.
- cellules de transfert à un creux, et distribuer 100 pi de suspension cellulaire dans des plaques contenant D1 pointes compo chimiqueonds. Suspension cellulaire à l'intérieur de l'auge est régulièrement agité pour éviter la sédimentation.
- De Spike contrôle puits A1, C1, E1, G1, A12, C12, E12 et G12 avec 1 ul de DMSO. Puits correspondants seront utilisés comme référence pour les cellules vivantes (pas de toxicité). Spike contrôle puits B1, D1, F1, H1, B12, D12, F12 et H12 avec 1 ul de DMSO et 2,5 ul d'une solution d'IGEPAL à 0,5% pour tuer les cellules. Puits correspondants seront utilisés comme référence pour les cellules mortes (forte toxicité).
- Incuber les cellules pendant 24 heures à 37 ° C et 5% de CO 2.
3. Préparation de cultures de cellules infectées par rMV2/Luc
- Développer et récupérer les cellules comme décrit dans 2.1 et 2.2. Encore une fois, remettre les cellules à 3 x 10 5 cellules / ml dans du milieu de culture. Considèrent que 12,5 ml de suspension de cellules sont nécessaires pour chaque plaque de blindage.
- En option: supplément de milieu de culture avec l'uridine à 20 pg / ml.
Remarque: Lors de criblage de banques chimiques pour replicatio viralen inhibiteurs, il semble que les composés ciblant les étapes précoces de la voie de biosynthèse de la pyrimidine sont fréquemment isolés 13,16,27,28. L'ajout d'uridine au milieu de culture est utilisé pour filtrer de telles molécules antivirales. En effet, cette restaure efficacement la réplication virale lors enzymes amont de voie de biosynthèse de la pyrimidine sont bloqués. - Enregistrer 1:10 de suspension de cellules dans les puits de contrôle avec des cellules non infectées, et procéder à l'infection par le volume restant.
- Décongeler le volume approprié de rMV2/Luc solution stock. Solutions mères MT sont généralement à 10 6 -10 8 particules infectieuses par ml. La culture doit être infectée par des particules infectieuses de 0,1 rMV2/Luc par des cellules cibles, ce qui correspond à 0,1 multiplicité d'infection (MOI). Remarque: rMV2/Luc est dérivé du vaccin MV (souche Schwarz) et est manipulé dans un environnement de BSL2.
- Ajouter le virus de la suspension cellulaire et mélanger doucement. Transférer les cellules infectées à un creux, et verser 100pl de suspension cellulaire infectée dans les colonnes 2 à 11 de D2 plaques contenant des composés chimiques dopés. La suspension cellulaire dans l'auge est régulièrement mélangé doucement.
- Dans les colonnes 1 et 12, passer de 100 pi de cellules non infectées et un sur deux. Les cellules infectées sont distribués dans les autres puits.
- Incuber les cellules pendant 24 heures à 37 ° C et 5% de CO 2.
4. Mesures d'activité de la luciférase et l'analyse des données
- Retirer les plaques de l'incubateur D1, et déterminer la viabilité cellulaire en ajoutant 50 ul de réactif à base de luciférase-viabilité directement à des puits de culture. Mélanger et incuber pendant 10 min à température ambiante. Lire les plaques d'un luminomètre. Le temps d'intégration est fixé à 100 ms par puits.
- Retirer les plaques de l'incubateur D2, et déterminer l'activité de la luciférase en ajoutant 50 pl de substrat de la luciférase directement aux puits de culture. Incuber pendant 6 min à température ambiante, et lire les plaques avec un luminomètre que descriLit ci-dessus.
- Calculer un facteur Z'-D1 pour chaque plaque de l'essai de toxicité pour justifier la qualité de l'écran 29. Z '= 1-3 * (σ + + σ-) / (μ + - μ-), où μ + et σ + correspondent à des moyens de luminescence et écarts-types pour les cellules HEK-293T avec DMSO seul (pas de toxicité), et μ et σ-sont des moyens de luminescence et écarts-types pour les puits de culture traités avec IGEPAL pour tuer les cellules. Z 'est prévu au-dessus de 0,5, ou la plaque correspondante est éliminée.
- Régler le seuil de toxicité à μ + / 2. Jeter composés avec des valeurs de luminescence en dessous de ce seuil (figure 3A).
- Calculer un facteur Z 'pour chaque plaque D2 de l'analyse antivirale. Ici, μ + et σ + correspondent à des moyens de luminescence et écarts-types pour les cellules infectées en culture avec du DMSO seul, et μ et σ-sont des moyens de luminescence et écarts-types pour les cellules non infectées. Encore une fois, avec plaques Z & #39; des valeurs inférieures à 0,5 sont éliminés.
- Calcul de l'inhibition de la réplication virale de la manière suivante: pourcentage d'inhibition = (μ + - activité de la luciférase pour le composé X) / (μ + - μ-) * 100. Régler le seuil d'inhibition à 75%, et sélectionner des composés qui à la fois réduisent les valeurs de luminescence en dessous de ce seuil (figure 3B) et ne sont pas toxiques, selon les critères décrits dans la section 4.4.
5. L'écran secondaire de la toxicité et à large spectre d'activité antivirale
- Assurez-01h02 dilutions en série pour chaque frappé composé dans le DMSO, à partir de 500 um à 4 um (8 dilutions). Remplir blancs, des plaques de culture tissulaire à code à barres avec 50 ul de milieu de culture. Ajouter 1 pi de chaque dilution de composé dans des puits de culture. Répéter deux fois pour avoir 3 plaques de culture avec des dilutions en série en double pour chaque composé de succès.
- Préparer 37,5 ml d'une suspension de cellules HEK-293T à 6 x 10 5 cellules / ml dans un milieu de culture tel que décrit ci-dessus (en 2.1 et 20,2). Distribuer 2x 12,5 ml dans des tubes Falcon et infecter les cellules avec soit rMV2/Luc à MOI = 0,1 ou CHIKV recombinant exprimant la luciférase de Renilla (CHIKV / s) à une MOI = 0,2. Mélanger par inversion.
Remarque: CHIKV / Ren est dérivé d'une souche sauvage de CHIKV et doit donc être manipulé dans un environnement BSL3. Les plaques peuvent être déplacés d'BSL3 à BSL1 fois substrat Renilla a été ajouté au puits de culture (voir ci-dessous). - Distribuer 50 ul de cellules non infectées, rMV2/Luc-infected, ou CHIKV / Ren-infectés dans des plaques de culture contenant des dilutions en série de composés de vie. Incuber 24 heures à 37 ° C.
- Ajouter 50 ul de substrat de la luciférase de luciole pour déterminer l'activité luciférase de luciole dans des puits rMV2/Luc-infected. Ajouter 50 ul de substrat de la luciférase de Renilla pour déterminer l'activité de la luciférase de Renilla dans CHIKV / puits Ren-infectées. Enfin, ajouter 50 ul de réactif de dosage de la viabilité en fonction de la luciférase de cellules non infectées, pour déterminer la viabilité cellulaire.
- Tracer les données (Figure 4) et déterminer les concentrations de composés qui inhibent touchés MV et la réplication de CHIKV de 50%. Ne tenez pas compte composé présentant une certaine toxicité dans cet essai.
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Representative Results
Ce pipeline de dépistage repose d'abord sur la sélection de composés qui inhibent la réplication MV et ne présentent pas de toxicité cellulaire significative (figure 1, l'écran principal). Il tire parti des dosages à base de luciférase pour déterminer la toxicité cellulaire et l'inhibition de la réplication virale. Toutes les étapes de pipetage et d'acquisition des données peut être effectué dans un cadre de haut-débit avec une plate-forme robotique.
La toxicité cellulaire des composés est évaluée en utilisant un dosage de viabilité en fonction de la luciférase qui évalue le nombre de cellules vivantes dans la culture sur la base de la quantification de l'ATP présent, ce qui correspond à des cellules métaboliquement actives. Parce que l'oxydation de la luciférine par la luciférase est dépendante de l'ATP, le signal de luminescence est directement proportionnelle à l'ATP cellulaire fourni par les cellules vivantes. Figure 3A montre les résultats pour une plaque d'écran représentant. Comme prévu, les valeurs d'activité de la luciférase très distinctes étaient mesurableed dans les puits de contrôle qui contenaient soit des cellules vivantes ou des cellules mortes tuées avec IGEPAL. Le seuil est empiriquement fixé à μ + / 2 pour filtrer les composés présentant une certaine toxicité cellulaire et dans le cas présent, 21 composés de cette plaque ont été rejetées. En parallèle, l'activité antivirale est mesurée en utilisant rMV2/Luc, une souche recombinante exprimant la luciférase de MV (figure 2). Cellules HEK-293T humains sont utilisés parce qu'ils sont très sensibles à l'infection MV. En conséquence, l'activité de la luciférase dans des puits de culture infectées est très élevé (de 200 à 300 x 10 3 unités d'activité de la luciférase dans les puits témoins). Ceci permet d'obtenir une grande plage dynamique qui facilite la sélection des inhibiteurs de la réplication MT. Figure 3B montre des résultats représentatifs obtenus pour une plaque de blindage. Quatre composés inhibent la replication virale de plus de 75% dans cet exemple, et ont été sélectionnés.
Enfin, les composés qui ne sont pas toxiques et a reçupositif dans le dosage de la replication virale sont sélectionnées (figure 3A et 3B). Leur concentration inhibitrice à demi maximale (IC50) est déterminée à la fois sur et MV CHIKV, qui sont deux virus à ARN non apparentées (figure 1, l'écran secondaire). L'activité antivirale des composés de vie est déterminée en utilisant des souches de virus recombinants exprimant soit luciole (rMV2/Luc) ou de Renilla (CHIKV / Ren) la luciférase. Figure 4A et 4B représentent des courbes d'inhibition représentatifs des MV et la réplication de CHIKV, respectivement. Ces courbes sont utilisées pour déterminer la CI50 des composés de vie. Parallèlement, l'absence de toxicité cellulaire des composés choisis est confirmée dans une expérience de dose-réponse en utilisant le dosage de viabilité à base de luciférase-décrit ci-dessus (Figure 4C). Tableau 1 montre les valeurs de CI50 pour les MV et la réplication de CHIKV sur un ensemble de 13 non -toxiques des composés identifiés à partir d'une banque chimique de 10 000 molécules. Ces composantsonds sont nouveaux à la fois en termes de structure chimique et l'activité biologique. Certaines de ces molécules partagent des similarités structurales et peuvent être rassemblés en trois familles chimiques distinctes. A titre de référence, les valeurs de CI50 obtenues avec le bréquinar sont également présentés dans le tableau 1. Bréquinar est un inhibiteur de la dihydro-orotate déshydrogénase, la quatrième enzyme de la voie de biosynthèse de la pyrimidine, avec une puissante activité antivirale in vitro 30,31. Lorsque l'on regarde les valeurs de CI50, moins d'un ordre de grandeur sépare cette molécule de référence de hits les plus actifs identifiés par le dépistage. Cet établi la forte activité antivirale des composés sélectionnés.
Figure 1. Résumé de la canalisation de dépistage. Gauche panneau montre le pNSEIGNEMENT écran où les composés sont choisis pour l'absence de toxicité et la capacité à bloquer la replication MV. Panneau de droite montre l'écran secondaire où l'activité antivirale des composés sélectionnés est confirmée, et leur capacité à bloquer la réplication du CHIKV est déterminée. Composés qui bloquent efficacement MV et CHIKV sans toxicité significative sont considérées comme des inhibiteurs potentiels à large spectre de virus à ARN. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 2. D'organisation génomique de virus à ARN recombinants portant le gène de la luciférase. (A) rMV2/Luc: le sens négatif de l'ARN du génome MV est affiché avec son extrémité 3 'sur la gauche, avec les six gènesindiqué en lettres majuscules et représentée par des rectangles blancs. Le codage des unités de transcription supplémentaires pour le gène rapporteur est inséré entre les gènes P et M et représenté comme un rectangle jaune (B) CHIKV / Ren:. Du sens positif de l'ARN du génome CHIKV est affiché avec son extrémité 5'-couvert sur la gauche, avec le cadre de lecture ouvert codant pour les quatre protéines non structurales (nsP1-4). Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 3. Des résultats représentatifs pour un 96 puits de dépistage plaque. (A) les valeurs de luciférase obtenues avec le dosage de la viabilité en fonction de la luciférase. Colonnes 1 et 12 correspondent à des contrôles alternent avec DMSO seul ("+"; aucune toxicité) ou IGEPAL ("-"; haute toxi ville). La couleur bleue met en évidence des composés qui ne sont pas considérés toxiques, selon les concentrations d'ATP détectées dans des puits de culture, alors que les puits blancs correspondent à des composés toxiques (valeurs de luciférase <12 203 x 10 3). (B) les valeurs de luciférase obtenus avec des cellules rMV2/Luc-infected. Les colonnes 1 et 12 correspondent à des commandes alternées, c'est à dire des cellules HEK-293T non-infectées ("-") ou des cellules rMV2/Luc-infected traitées avec du DMSO seul ("+"). Pour chaque composé testé, la figure montre à la fois le signal de luminescence de la luciférase et le pourcentage d'inhibition par rapport aux puits témoins. Les composés inhibant signal de luminescence de plus de 75% sont mis en évidence en fonction en jaune ou en vert si elles ont été considérées comme toxiques ou non, tel que déterminé en (A). Ainsi, la couleur verte montre composés de vie qui inhibent la réplication MV et n'affectent pas la viabilité cellulaire.t = "_blank"> Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 4. Activité antivirale dose-réponse et la toxicité des composés C864, C648 et C062. (A) des cellules HEK-293T ont été infectés avec la souche rMV2/Luc de MV exprimant la luciférase (MOI = 0,1), et incubées avec des doses croissantes de C864, C648, C062 ou DMSO seul. Après 24 heures, expression de la luciférase a été déterminée. * Indique que les inhibitions luciférase observées étaient statistiquement significatives avec les trois composés (valeurs de P <0,05). (B) des cellules HEK-293T ont été infectés avec la souche CHIKV / Ren de CHIKV exprimer Renilla (MOI = 0,2), et incubées avec de plus en plus doses de C864, C648, C062 ou le DMSO seul. Après 24 h, Renilla expression a été déterminée. * Indique statistiquementinhibitions quement significatifs avec les trois composés (les valeurs p <0,05). cellules (C) des cellules HEK-293T ont été incubées avec des doses croissantes de C864, C648, C062 ou le DMSO seul. En tant que contrôle de la toxicité, les cultures de cellules ont été complétées avec 2,5 ul d'une solution d'IGEPAL à 0,5%. Après 24 heures, le nombre de cellules vivantes a été déterminée en utilisant le test de la viabilité en fonction de la luciférase. Cliquez ici pour agrandir l'image .
| Famille chimique | Composé | MV (IC50 uM) | CHIKV (IC50 uM) | CC50 (uM) |
| 1 | C864 | 0,6 | 0,6 | > 5 |
| 1 | C877 | 0,2 | 0,2 | > 5 |
| 1 | C957 | 1.2 | 1.2 | > 5 |
| 1 | C963 | 1.2 | 0,9 | > 5 |
| 1 | C967 | 1.7 | 1.6 | > 5 |
| 1 | C348 | 0,25 | 0,3 | > 5 |
| 1 | C265 | 0,25 | 0,3 | > 5 |
| 1 | C270 | 0,5 | 0,5 > 5 | |
| 1 | C350 | 0,4 | 0,5 | > 5 |
| 2 | C646 | 0,16 | 0,15 | > 5 |
| 2 | C814 | 1.9 | 1.1 | > 5 |
| 2 | C648 | 0,7 | 0,4 | > 5 |
| 3 | C062 | 1 | 1.2 | > 5 |
| Bréquinar | 0,04 | 0,04 | > 5 |
Tableau 1. L'activité antivirale et la cytotoxicité de la 13des composés choisis dans la bibliothèque d'origine chimique. résultats sont exprimés en valeurs de CI50 pour l'inhibition de la réplication de MV ou CHIKV. Valeurs CC50 ont été trouvés> 5 uM pour tous les composés dans des expériences de l'écran secondaire dose-réponse. Mais le seuil de filtration de notation pour la cytotoxicité de l'écran principal suggère que les valeurs CC50 sont même> 20 uM.
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Discussion
Le pipeline de criblage décrit ici vise à sélectionner des composés avec un profil adapté comme inhibiteurs à large spectre de virus à ARN. Quand une bibliothèque de 10 000 composés a été criblée avec ce protocole et les critères de filtrage ci-dessus ont été appliquées, à savoir l'inhibition de la réplication MV supérieur à 75%, 40 composés (0,4%) a reçu positif. En outre, environ la moitié d'entre eux ont montré une toxicité sur dans le test de la viabilité en fonction de la luciférase, et ont été pris en considération pour cette raison. Enfin, une douzaine de hits facilement disponibles en grande quantité ont été retesté. Ce petit jeu a été testé à nouveau facilement pour la toxicité cellulaire et l'inhibition de la réplication virale contre MV et CHIKV dans des expériences dose-réponse (Figure 4). L'activité antivirale de tous les composés sélectionnés a été confirmée, et le taux global d'identification de succès pour ce gazoduc de dépistage était de 1,3 ‰. Ce score est très similaire aux résultats obtenus par d'autres groupes de différentes à haut débitdes essais de criblage basées sur la réplication pour les antiviraux 27,32, et tombe dans la fourchette prévue pour les tests phénotypiques cellulaires en général (1-5 ‰ 33). Cependant, un taux de succès dépend fortement à la fois sur la bibliothèque de composés qui est tamisé et les seuils de filtre de ballon, qui peut être ajusté en fonction du profil des données recueillies. Ici, les seuils retenus pour l'inhibition de la réplication MV et la toxicité cellulaire ont été déterminées empiriquement, et hors commerce a été créé pour obtenir un nombre de hits traitable qui peut être facilement retestés dans l'écran secondaire contre CHIKV.
Dans le criblage primaire, les composés ont été testés à la fois pour leur capacité à bloquer la replication MV et l'absence de toxicité cellulaire. L'activité antivirale a été déterminée à une concentration de 2 uM sur des cellules rMV2/Luc-infected tandis que la toxicité cellulaire a été déterminée à 20 uM. Ces paramètres expérimentaux ont été trouvés utiles pour sélectionner directement pour des composés ayant une forte activité antiactivité virale par rapport à la toxicité cellulaire. En outre, l'écran primaire a été réalisée en présence d'uridine. En effet, des publications récentes suggèrent que les composés ciblant les étapes précoces de la voie de biosynthèse de la pyrimidine sont fréquemment isolés lors de la recherche d'inhibiteurs de l'ARN des virus 13,16,27,28. En particulier, les groupes de recherche à la recherche de molécules antivirales ont trouvé des inhibiteurs de la dihydroorotate déshydrogénase, la quatrième enzyme de cette voie métabolique 31. L'uridine dans le milieu de culture de manière efficace trans compléments pour l'inhibition de cette enzyme, et donc de restaurer la réplication virale. De cette manière, les composés qui empêchent la replication MV par inhibition de la voie de biosynthèse de la pyrimidine sont directement exclus des résultats antiviraux. Enfin, le facteur Z 's'est avérée être systématiquement supérieur à 0,5, ce qui démontre la robustesse et la haute qualité du dosage.
En parallèle, la toxicité cellulaire a été déterminée en utilisant un haut-throughpudosage à base de luciférase-t qui détermine le nombre de cellules métaboliquement actives dans la culture sur la base de la quantification de l'ATP. Dans chaque plaque de blindage, IGEPAL a été ajouté dans les puits témoins de toxicité. Cette non-dénaturant, un détergent non-ionique présente l'avantage de tuer de manière efficace tous les types de cellules non spécifique sans affecter l'activité de l'enzyme luciférase. Z 'facteur est systématiquement supérieure à 0,5 plus de 125 plaques, démontrant ainsi la grande robustesse et la qualité de l'analyse. Une limitation de ce test de toxicité cellulaire est son coût relativement élevé. A titre d'essai alternatif pour déterminer la viabilité cellulaire, certains groupes ont utilisé des lignées cellulaires exprimant de manière constitutive de la luciférase à partir d'un transgène stable 34. Dans ces essais, les composés toxiques devraient diminuer ou même supprimer l'expression de la luciférase quand affecter la viabilité cellulaire. Nous avons récemment développé une lignée cellulaire stable exprimant la luciférase lors de la stimulation de l'IFN-β 35, et cette lignée cellulaire a été utilisé pour tester un trensemble aining de 80 composés de toxicité cellulaire. De manière surprenante, le coefficient de corrélation (CC) entre cet essai et le dosage de la viabilité à base de luciférase-décrit ci-dessus est relativement faible (CC = 0,67). En effet, plusieurs composés altérées expression de la luciférase à partir du transgène, alors que le métabolisme de l'ATP n'a pas été affectée. Certains composés antiviraux à large spectre sont susceptibles d'affecter les fonctions cellulaires telles que la signalisation cellulaire, la transcription ou la traduction du gène de la protéine, qui sera également altérer l'expression du gène cellulaire. Bien qu'il n'y ait pas de système de dépistage parfait pour la viabilité cellulaire, il est à risque que le filtrage des composés toxiques sur la base de l'expression du gène cellulaire sera potentiellement conduire à exclure les molécules antivirales de bonne foi.
L'écran secondaire vise à établir l'activité antivirale des composés sélectionnés contre deux virus à ARN complètement indépendants, tout en déterminant précisément leurs CI50. Fait intéressant, il faut remarquer que l'enzyme luciféraseinhibiteurs pourraient être mal notés comme positifs dans le dosage rMV2/Luc mais ces faux positifs seront filtrés-par l'écran secondaire lorsqu'il est testé pour l'inhibition de CHIKV / Ren. En effet, rMV2/Luc CHIKV et / Ren expriment de luciole et la luciférase de Renilla, respectivement, et ces deux enzymes ne sont pas liés et catalysent des réactions chimiques différentes. Les composés qui inhibent reporter luciférase de luciole de rMV2/Luc dans l'écran principal ne seront pas montrer toute activité contre CHIKV / Ren et seront mis au rebut, empêchant ainsi leur sélection erronée antiviraux. De façon inattendue, tous les 13 résultats primaires de blocage réplication MV ont aussi inhibé CHIKV dans cet écran secondaire. Ce n'est pas toujours le cas comme quelques inhibiteurs MV-spécifiques ont été isolés lors de la sélection d'autres bibliothèques (données non présentées). En outre, des composés choisis part similarités structurales et peuvent être regroupées en trois familles seulement chimiques (tableau 1). Les composés dans une famille chimique ont probablement le même mode d'actisur, et par conséquent peuvent être considérés comme des analogues de la même entité chimique. Cela met en perspective le fait que les 13 composés choisis ont inhibé la fois MV et la réplication de CHIKV. Néanmoins, ces résultats pourraient également suggérer que les antiviraux à large spectre sont plus souvent identifiés que les inhibiteurs spécifiques du virus. La raison de cette hypothèse est que, en dépit des spécificités évidentes, tous les virus à ARN reposent sur les mêmes fonctions cellulaires de base à reproduire, comme les machines ribosomique, cytosquelette ou les mitochondries comme source d'énergie. Ces modules fonctionnels sont des systèmes moléculaires complexes, qui constituent un panneau relativement importante de cibles potentielles pour des médicaments antiviraux à large spectre. En revanche, il ya seulement un nombre limité de facteurs viraux ou cellulaires qui représentent des cibles appropriées pour sensibiliser les inhibiteurs spécifiques du virus. Dans l'avenir, de nouveaux panneaux d'antiviraux identifiés par criblage phénotypique devraient fournir les données nécessaires pour confirmer ou infirmer cette hypothèse.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Yves L. Janin pour ses commentaires et suggestions fructueuses. Nous tenons à remercier HH Gad pour CHIK / Ren et C. Combredet pour son soutien technique. Ce travail a été soutenu par l'Institut Pasteur, le Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), l'Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale (INSERM), l'Institut Carnot - Pasteur Maladies Infectieuses (Programme STING à POV et HM- L), l'Agence Nationale pour la Recherche (ANR-DGITRN, Programme STING 2.0 pour POV), et le "Conseil Régional d'Ile-de-France" (projet de bibliothèque chimique, les subventions n ° 06-222 je / R et I 09-1739 / R pour HM-L.). Le travail sur CHIKV / Ren a été soutenue par les ArbOAS de projets (ANR subvention 2010-INTB-1601-02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freedom EVO platform | TECAN | Robotic platform | |
| 96-well polystyrene cell culture microplates, white | Greiner Bio One | 655083 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | Luciferase-based viability assay |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Reagent containing firefly luciferase substrate |
| Renilla-Glo luciferase Assay System | Promega | E2710 | Reagent containing Renilla luciferase substrate |
| Britelite plus Reporter Gene Assay System | Perkin-Elmer | 6016761 | Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity. |
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