Summary
ウイルス複製を測定するためのインビトロアッセイにおいて大きくルシフェラーゼまたは生物発光が可能な他の酵素を発現する組換えRNAウイルスの開発により改善されてきた。ここでは、詳細な化学ライブラリーから広域スペクトルの抗ウイルス剤を単離するために麻疹およびチクングニアウイルスのような組換え菌株を組み合わせたハイスループットスクリーニングパイプライン。
Abstract
RNAウイルスは、インフルエンザ、気管支炎、デング熱、C型肝炎やはしかなどの主要なヒト疾患の原因である。彼らはまたので、より多くの自然の生態系を貫く増加世界的な交流や人間集団の新たな脅威を表しています。このような新興状況の良い例は、インド洋での2005から2006のチクングニヤウイルスの流行である。ウイルス複製を制御する細胞経路についての我々の理解における最近の進歩は、宿主細胞の機能を標的とする化合物ではなく、ウイルス自体は、RNAウイルスの大きなパネルを阻害し得ることを示唆している。いくつかの広域スペクトル抗ウイルス化合物は、宿主標的指向アッセイで同定されている。読み出しは依然として最も重要スクリーニング戦略を表すしかしながら、細胞変性効果の低減を用いて細胞培養物におけるウイルス複製の阻害を測定する。このような機能の画面が大幅にレポーターを発現する組換えウイルスの開発によって改善されているCA酵素ルシフェラーゼなどの生物発光のpable。本報告では、我々の詳細を広域スペクトル抗ウイルス性プロファイルを有する化合物を同定するために、組換え麻疹および細胞生存率アッセイとチクングニアウイルスを組み合わせたハイスループットスクリーニングパイプラインを、。
Introduction
RNAウイルスはヒト感染の多種多様のために責任があり、両方の公衆衛生および経済的なコストの面で世界的に個体数に大きな影響を与える。効率的なワクチンは、いくつかのヒトRNAウイルスに対して開発され、広く予防的処置として使用される。しかしながら、RNAウイルス感染症に対する治療薬の重大な欠如が依然として存在する。確かに、効率的なワクチンは、デング熱ウイルス、C型肝炎ウイルスやヒトRSウイルス（はhRSV）などの主要なヒト病原体に対して使用できません。また、RNAウイルスは世界的な取引所や生態系に対する人間の影響の頻度が増加している新興疾患の大部分を担当している。 RNAウイルスを表し、この脅威に対して、我々の治療の武器は非常に限られており、1月3日は比較的非効率的である。現在の治療法は、基本的に、自然免疫を刺激するため、組換えI型インターフェロン（IFN-α/β）に基づいていますまたはリバビリンを投与する。このリボアナログの作用機序は、議論の余地がある、おそらくさまざまなメカニズムに依存していますが、細胞内のGTPプールを枯渇携帯IMPDH（イノシン一リン酸脱水素酵素）の阻害は、4明らかに必要不可欠である。リバビリンは、ペグ化IFN-αと組み合わせて、C型肝炎ウイルスに対する主な治療法である。彼らは効率的に鈍い、IFN-α/βは5因子の毒性の発現を介したシグナル伝達と、多くの場合、リバビリン3をエスケープしかし、IFN-α/βとリバビリンの治療は、ほとんどのRNAウイルスに対する生体内で比較的乏しい有効性のある。それが最近、論争のメリット6で重度のはhRSVの疾患に対して承認されたが、これは、リバビリン治療が重要な毒性の問題を発生させているという事実に追加しました。より最近では、いくつかのウイルス特異的治療が開発oでインフルエンザウイルスに対して特に市販されているFノイラミニダーゼ阻害薬3。しかしながら、大きな多様性RNAウイルスの永続的な出現は、比較的近い将来、それらの各々に対する特異的治療の開発を妨げる。全体として、これは近い将来に強力な抗ウイルス分子を同定し、開発するための効率的な戦略の必要性を強調している。
これは、RNAウイルスの大きなパネルに対して活性広域スペクトル阻害剤は、この問題を解決するだろうと言うことは自明である。このような分子は、まだウイルス学者の夢ではあるが、細胞防御メカニズムと自然免疫系の我々のより良い理解は、いくつかの可能性が7,8存在することを示唆している。いくつかの学術および産業の研究室は現在、ウイルスの複製を鈍らせる細胞防御メカニズムや代謝経路の特定の側面を刺激する分子を求めている。このような化合物は、おそらく重大な副作用が表示されますが、急性ウイルス感染に対する治療はの管理となります長期的にいくつかの潜在的な毒性にもかかわらず、それらを許容すること、比較的短時間のED。様々な戦略は、例えば、広域スペクトル抗ウイルス分子を同定するために開発されてきた。いくつかの研究プログラムは、特定の防御または代謝経路を標的とする分子を発見することを目的としている。これには、は、例えば、ウイルス遺伝子発現9を誘発し、そのようなRNASEL 10、ウィルス分解11を促進するためにオートファジー機械などの抗ウイルス因子を活性化する病原体認識受容体は、ヌクレオシドの合成は、ウイルス感染細胞の死を沈殿させ12,13、またはアポトーシスカスケードをパスウェイ14。他のグループは、ターゲットベースではない13,15-17表現型スクリーンを開発しました。その場合には、抗ウイルス分子は、単に所与の細胞系においてウイルス複製をブロックするそれらの能力によって同定される。一般的な仮定は2-3無関係のRNAウイルスを阻害する化合物は、広い種に適したプロファイルを有するであろうということである抗ウイルス分子をectrum。そのような経験的アプローチを選択したヒット化合物の作用のモードは、第即座に決定され、最終的には、抗ウイルス剤のための新規細胞標的の同定につながる可能性がある。興味深いことに、1999年から2008年の間に米国食品医薬品局（FDA）によって承認された新薬のレトロスペクティブ分析では、一般的に、このような表現型の上映は、ファースト·イン·クラスの低分子薬18を発見するために、ターゲットベースのアプローチよりも良いを実行する傾向があることが示されている。
ハイスループット細胞ベースのアッセイでのウイルス複製は、通常、ウイルス細胞変性効果から決定される。試験化合物の存在下で、または384ウェルプレート - 細胞を96で感染させ、培養する。数日後、細胞層は、例えば、クリスタルバイオレットなどの染料で固定し、染色する。最後に、吸光度をプレートリーダーで測定すると、ウイルス複製を阻害する化合物は、あちこちに細胞層を維持する能力によって同定されるm個のウイルス誘導細胞変性効果。あるいは、ウイルス媒介性細胞変性効果は、MTS還元などの標準的な生存率アッセイを用いて評価される。このようなアッセイは、非常に扱いやすく、コスト効果的であるが、3つの主要な制限を受ける。第一に、彼らはこのように19に近づくの代替を求めて、ウイルス複製がわずか数日で細胞変性であるが、これは必ずしも可能ではないウイルス-細胞の組み合わせを必要とする。第二に、それらは、ウイルス複製の間接的な測定に基づいているため難定量的である。最後に、毒性化合物は、陽性ヒットとしてスコアすることができるので、細胞生存率を測定するカウンタースクリーンで除去されなければならない。これらの障害のいくつかを克服するために、組換えウイルス又はレプリコンは、追加の転写単位から、またはウイルスタンパク質遺伝子（いくつかの例は20〜23である）とインフレームで、例えば、EGFP又はルシフェラーゼのようなレポータータンパク質を発現するために逆遺伝学によって操作されている。これらのウイルスは複製し、レポーターPRoteinsは、ウイルスタンパク質自体と一緒に生産されています。これは、ウイルス複製を測定し、候補分子の阻害活性を評価するための非常に定量的なアッセイを提供する。これは、このレポーターシステムは、高感度、事実上の背景を持つ広いダイナミックレンジを発揮するため、ルシフェラーゼ（または生物発光が可能な他の酵素）を発現する組換えウイルスに特に当てはまります。また、全く励起光源は、このように、化合物24の蛍光の干渉を防止する、存在しない。
ここでは、詳細なハイスループットプロトコルは、RNAウイルスの広域スペクトル阻害剤の化学ライブラリーをスクリーニングする。化合物は、ホタルルシフェラーゼ25（rMV2/Luc、 図1、一次スクリーニング）を発現する組換え麻疹ウイルス（MV）に感染したヒト細胞で最初にテストされています。 MVは、注文をモノネガウイルス目に属する、多くの場合、マイナス鎖RNAウイルスの原型メンバーとして考えられているES。このように、MVゲノムはウイルスタンパク質をコードするmRNA分子を合成するために、ウイルスポリメラーゼにより鋳型として使用する。 rMV2/Luc呼ばれる組換えMV株におけるルシフェラーゼ発現は、PとM遺伝子（ 図2A）との間に挿入された追加の転写単位から発現される。並行して、化合物は、ATPの定量によって、培養物中の代謝活性のある細胞（ 図1、一次スクリーニング）の数を評価する商業ルシフェラーゼベースの試薬 を用いてヒト細胞に対するそれらの毒性について試験する。全体の化学ライブラリーを容易に有毒ではなく、効率的にMV複製を遮断する化合物を選択するために、これら2つのアッセイを用いてスクリーニングすることができる。その後、ヒットはチクングニヤウイルス（CHIKV）の複製（ 図1、二次スクリーニング）を損なうする能力についての用量反応MV複製の阻害、毒性がないだけでなく、について再試験されています。 CHIKVはトガウイルス科のメンバーであり、そのゲノムは、APであるositive一本鎖RNA分子。このように、それははしかとMVとCHIKVの両方がRNAウイルスの大きなパネルを阻害する大きなチャンスが阻害化合物とは全く無関係である。構造タンパク質は、サブゲノムmRNA分子の転写および翻訳によってコードされているのに対し、CHIKV非構造タンパク質を直接、ウイルスゲノムから翻訳されています。 CHIKVのための私たちのin vitroでの複製アッセイは、NSP3とのnsP4シーケンス26（ 図2B）との間にレポーター遺伝子を挿入することによって非構造ポリタンパク質の切断された部分としてウミシイタケルシフェラーゼ酵素を発現CHIKV /漣と呼ばれる組換え株に基づいています。ウミシイタケルシフェラーゼ活性の測定は、CHIKVのライフサイクルの初期段階においてウイルス複製の監視を可能にする。
このハイスループットプロトコルを迅速万molecの市販のライブラリーにおいて、広域スペクトル抗ウイルス剤に適したプロファイルを有する化合物を同定するために使用された化学的多様性について濃縮ULES。化合物は、基本的には250〜600ダルトンの範囲の分子量で、5のリピンスキーのルールを次の、そして5以下のD値を記録した。これらの分子のほとんどは、他の商用ライブラリで利用可能な新しい化学物質ではなかった。
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Protocol
化合物を用いた96ウェル娘プレートの1。準備
- 室温-20℃からDMSO中の化学化合物の10mMストック溶液を含む96ウェルの母プレートを移動させる。 2mMの中間の96ウェル希釈プレートを得るためにDMSO中の化合物5倍に希釈する。希釈のDMSO 20μLに5μlのピペットで混合することによって達成される。
- ピペットホワイト、バーコード化された組織培養96ウェルプレートのドライウェルに希釈プレートから1μL。娘プレート（D1）のこの最初のセットは、20μMの最終濃度で化合物の毒性を評価するために使用される。使用するまで-20℃で娘プレートを保管してください。
- DMSOおよび混合の36μLに希釈プレートから4μLをピペットで再び1:10に化合物を希釈する。ホワイト、平底、バーコード化された組織培養96ウェルプレートのドライウェルにピペット1μL。娘プレート（D2）は、この第2のセットは、MV replicatioの阻害を評価するために使用される2μmの最終濃度での化合物によるN。使用するまで-20℃で娘プレートを保管してください。
2。細胞培養の調製化合物の毒性を調べる方法
- 37℃で、HEK-293T細胞を成長させ、5％CO 2ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で安定化されたL-グルタミンおよび10％ウシ胎児血清（FCS）、ストレプトマイシン（100μg/ ml）を、およびペニシリン（100でIU / ml）を。細胞は、4〜5日毎にトリプシン処理により継代し、新鮮なフラスコに1:10に希釈されています。細胞は実験のために対数期にあるべきである。
- 実験の日に、トリプシン処理により細胞を回収し、細胞計数を行う。ペレットを遠心分離により細胞を、培養培地中に3×10 5細胞/ mlで再懸濁。細胞懸濁液を12.5ミリリットルを各スクリーニングプレートに必要であることを考慮してください。
- 転送トラフに細胞、およびスパイク化学部品を含むD1のプレートに細胞懸濁液100μlを分注unds。トラフ内の細胞懸濁液を定期的に沈降を避けるために攪拌される。
- DMSOを1μlの対照ウェルA1、C1、E1、G1、A12、C12、E12とし、G12スパイク。対応するウェルは、生細胞のための基準（非毒性）として使用される。細胞を殺すために、DMSOの1μL及び0.5％IGEPAL溶液を2.5μlの対照ウェルB1は、D1、F1、H1、B12、D12、F12キーおよびH12スパイク。対応するウェルを、死細胞（高毒性）のための基準として使用される。
- 37℃で24時間、細胞をインキュベートし、5％CO 2。
rMV2/Lucによって感染細胞培養の3。準備
- 成長し、2.1と2.2で説明したように細胞を回収する。再度、培養培地中の3×10 5細胞/ mlで再懸濁細胞。細胞懸濁液を12.5ミリリットルを各スクリーニングプレートに必要であることを考慮してください。
- オプション：20μg/ mlのでウリジンとサプリメントの培地。
注意：ウイルスreplicatioための化学ライブラリーをスクリーニングする場合N阻害剤は、ピリミジン生合成経路の初期段階を対象とした化合物が頻繁に13,16,27,28が隔離されているようです。培養培地へのウリジンの添加は、そのような抗ウイルス分子を除去するために使用される。確かに、これは効率的に、ピリミジン生合成経路の上流の酵素がブロックされているウイルスの複製を復元します。 - 非感染細胞と対照ウェルのために細胞懸濁液の1:10に保存し、残りの容量の感染に進みます。
- rMV2/Luc原液の適切なボリュームを解凍する。 MVストック溶液、1mlあたり10 6〜10 8感染粒子で、通常です。文化は、感染の0.1多重度（MOI）に対応して、標的細胞あたりのrMV2/Lucの0.1感染性粒子に感染している必要があります。注：rMV2/LucはMVワクチン（Schwarz株）に由来し、BSL2環境で操作される。
- 細胞懸濁液にウイルスを追加し、穏やかに混合する。トラフに感染した細胞を移し、そして100を分配スパイクされた化学化合物を含有D2プレートの列2〜11中の感染細胞懸濁液の液。トラフ内の細胞懸濁液を定期的に穏やかに混合する。
- 列1および12では、100の非感染細胞の液Aよく上の2を分配する。感染した細胞は、他のウェル中に分配される。
- 37℃で24時間、細胞をインキュベートし、5％CO 2。
4。ルシフェラーゼ活性を測定し、データ解析
- インキュベーターからD1プレートを外し、直接培養ウェルにルシフェラーゼに基づく生存能力試薬50μLを追加することによって、細胞の生存率を決定。混合し、室温で10分間インキュベートする。ルミノメーターでプレートを読んでください。積分時間は、ウェルあたり100ミリ秒に設定されている。
- インキュベーターからD2のプレートを外し、直接培養ウェルにルシフェラーゼ基質50μlのを追加して、ルシフェラーゼ活性を測定。室温で6分間インキュベートし、descriなどのルミノメーターでプレートを読む上記ベッド。
- 画面29の品質を保証するために、毒性アッセイの各D1のプレートのためのZ '因子を計算します。 Z '= 1-3 *（σ+σ-）/（μ+ - μ-）、μ+とσ+がDMSO単独（無毒性）で発光する手段およびHEK-293T細胞の標準偏差に対応している場合、およびμ-と発光して細胞を殺すためにIGEPALで処理された培養ウェルの標準偏差を用いてσ-です。 Z 'は0.5以上であることが期待される、または対応するプレートは廃棄される。
- μ+ / 2で毒性閾値を設定します。このカットオフ（ 図3A）以下の発光値を有する化合物を捨てる。
- 抗ウイルスアッセイの各D2のプレートのためのZ '因子を計算します。ここで、μ+とσ+発光とDMSOのみとともに培養し、感染した細胞のための標準偏差の手段に相当し、μ-、発光と非感染細胞の標準偏差を用いてσ-です。 Z＆＃で再度、プレート39; 0.5未満の値は破棄されます。
- - /（μ+ - μ-）* 100 =（化合物Xのためのルシフェラーゼ活性μ+）阻害の割合：以下のようにウイルス複製の阻害を計算します。 75パーセントの阻害のしきい値を設定し、両方がこのカットオフ以下の発光値（ 図3B）を低減し、4.4で説明した基準に従って毒性ではない化合物を選択。
毒性および広域スペクトル抗ウイルス活性5。二次スクリーニング
- それぞれに1:2連続希釈を500〜4μmで（8希釈液）から開始し、DMSOに化合物を打っていることを確認します。培養液50μlと白、バーコード化された組織培養プレートを埋める。培養ウェル中の各化合物希釈液1を添加する。各ヒット化合物の重複連続希釈物と3培養プレートを持っている二回繰り返します。
- 上記のように2.1及び2で（培養培地中6×10 5細胞/ mlのHEK-293T細胞懸濁液を37.5mlの調製0.2）。ファルコンチューブに2X 12.5ミリリットルを分配し、MOI = 0.2でのウミシイタケルシフェラーゼ（CHIKV /レン）を発現し、MOI = 0.1または組換えCHIKVでrMV2/Lucのいずれかで細胞に感染。転倒混和する。
注：CHIKV /漣はCHIKVの野生型株に由来するため、BSL3環境で操作する必要があります。ウミシイタケ基質が培養ウェルに添加された後、プレートを（下記参照）BSL1にBSL3から移動させることができる。 - 50感染していない、rMV2/Luc-infectedμlの、又は、ヒット化合物の連続希釈液を含有する培養プレート中CHIKV /レン感染細胞を分注する。 37℃で24時間インキュベートする
- rMV2/Luc-infectedウェル中のホタルルシフェラーゼ活性を測定し、ホタルルシフェラーゼ基質50μlを加える。 CHIKV /漣感染ウェル内のウミシイタケルシフェラーゼ活性を決定するために、ウミシイタケルシフェラーゼ基質50μlを加える。最後に、細胞の生存率を決定するために非感染細胞にルシフェラーゼに基づく生存率アッセイ試薬50μlを加える。
- プロットデータ（FIグレ4）および50％MVとCHIKV複製を阻害ヒット化合物の濃度を決定する。このアッセイにおいて、いくつかの毒性を示す化合物は無視してください。
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Representative Results
このスクリーニングパイプラインは、MV複製を阻害する化合物の選択に依存しており、最初の重大な細胞毒性（ 図1、一次スクリーニング）を示していない。それは、細胞毒性およびウイルス複製の阻害を決定するために、ルシフェラーゼに基づくアッセイを利用する。全てのピペッティング工程およびデータ取得は、ロボットプラットフォームでハイスループット設定で行うことができる。
化合物の細胞毒性は、代謝活性のある細胞に対応するATPの存在の定量に基づく培養中の生細胞数を評価し、ルシフェラーゼに基づく生存性アッセイを用いて評価される。ルシフェラーゼによるルシフェリンの酸化はATP依存性であるので、発光シグナルは、生細胞によって提供される細胞のATPに正比例する。 図3Aは一つの代表的なスクリーニングプレートについての結果を示している。予想されるように、非常に明確なルシフェラーゼ活性値はmeasurであったIGEPALで殺さ生細胞または死細胞のどちらかを含んでいた対照ウェル中のED。閾値は、経験的に、いくつかの細胞毒性を示す化合物を除外するμ+ / 2に設定し、本発明の場合には、このプレートからの21化合物を捨てた。並行して、抗ウイルス活性をrMV2/Luc、MV発現するルシフェラーゼの組換え株（ 図2）を用いて測定される。それらはMV感染に対して非常に敏感であるため、ヒトHEK-293T細胞が使用される。その結果、感染した培養ウェル中のルシフェラーゼ活性（コントロールウェル中の200×10 3〜300のルシフェラーゼ活性単位から）非常に高い。これは、MV複製阻害剤の選択を容易にする大きなダイナミックレンジを提供する。 図3B一スクリーニングプレートについて得られた代表的な結果を示している。 4つの化合物は、この例では75％以上、ウイルス複製を阻害し、選択した。
最後に、毒性はなく、化合物が得点ウイルス複製アッセイにおいて陽性（ 図3Aおよび3B）を選択する。その半最大阻害濃度（IC50）は、2つの無関係なRNAウイルス（ 図1、二次スクリーニング）がMVとCHIKV、両方で決定されます。ヒット化合物の抗ウイルス活性は、ホタル（rMV2/Luc）又はウミシイタケ（CHIKV /レン）ルシフェラーゼのいずれかを発現する組換えウイルス株を用いて決定される。 図4A及び図4Bはそれぞれ、MVおよびCHIKV複製のための代表的な阻害曲線を示している。これらの曲線は、ヒット化合物のIC50を決定するために使用される。並行して、選択された化合物の細胞毒性の欠如は、上述のルシフェラーゼに基づく生存率アッセイ（ 図4C）を用いて用量反応実験において確認されている。 表1は、13以外のセットにMVおよびCHIKV複製のためのIC50値を示している万分子の化学ライブラリーから同定毒性の化合物。これらのコンポundsは、両方の化学構造および生物学的活性の点で新規である。これらの分子のいくつかは、構造的類似性を共有し、そして三つの異なる化学ファミリーに集めることができる。参照として、ブレキナールで得られたIC50値を表1に示す。ブレキナール30,31は、 インビトロで強力な抗ウイルス活性を有するジヒドロデヒドロゲナーゼの阻害剤、ピリミジン生合成経路の第四の酵素である。 IC50値を見ると、1桁未満のスクリーニングによって同定された最も活性のヒットからこの参照分子を分離した。これは選択された化合物の強い抗ウイルス活性を設立しました。
図1。スクリーニングパイプラインの概要。左パネルには、Pを見せている化合物は毒性や、MVの複製を阻止する能力の欠如のために選択するrimary画面。右のパネルは、選択された化合物の抗ウイルス活性が確認され、CHIKV複製をブロックする能力が決定される二次スクリーニングを示している。効率的に重大な毒性を伴わずにMVとCHIKVを遮断する化合物は、RNAウイルスの潜在的な広域スペクトルの阻害剤として考えられている。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。ルシフェラーゼ遺伝子を有する組換えRNAウイルスのゲノム構成。 （A）rMV2/Luc：MVネガティブセンスRNAゲノムは左にその3 '末端で表示され、6つの遺伝子を有する大文字で表記し、白い長方形として描か。レポーター遺伝子のための付加的な転写単位の符号化は、PとM遺伝子の間に挿入され、黄色の矩形として描かれている（B）CHIKV /レン：。CHIKVプラスセンスRNAゲノムは左側にその5 '末端キャップされて表示され、 4つの非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームと（NSP1-4）。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
【図3】1枚の96ウェルプレートをスクリーニングするための代表的な結果。 （A）ルシフェラーゼに基づく生存率アッセイで得られたルシフェラーゼ値。列1および12はDMSOのみで代替コントロールに対応する（「+」、無毒性）またはイゲパール（ " - ";高toxi都市）。白いウェルは毒性化合物（ルシフェラーゼ値<12203×10 3）（B）rMV2/Luc-infected細胞を用いて得られたルシフェラーゼの値に対応し、一方、青色は、培養ウェルで検出されたATP濃度に応じて毒性がないと考えられている化合物を強調している。 （「 - 」）またはDMSO単独で処理したrMV2/Luc-infected細胞（「+」）列1および12は、代替コントロール、 すなわち非感染HEK-293T細胞に対応する。各テスト化合物について、図は、ルシフェラーゼ発光信号や井戸を制御する阻害の相対的な割合の両方を見せている。これらは、（A）のように決定有毒かと考えられていた場合には75％以上で発光シグナルを阻害する化合物は、黄色や依存緑色で強調表示されます。 このように、緑色は、MV複製を阻害し、細胞生存率には影響しませんヒット化合物を示している。Tは= "_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図4。用量-反応抗ウイルス活性および化合物C864、C648およびC062の毒性。 （A）HEK-293T細胞を、ルシフェラーゼを発現するMVのrMV2/Luc株に（MOI = 0.1）に感染させ、単独C864、C648、C062又はDMSOの漸増用量と共にインキュベートした。 24時間後、ルシフェラーゼ発現を測定した。 *観測されたルシフェラーゼな阻害は、すべての3つの化合物（p値<0.05）と統計学的に有意であったことを示している。（B）HEK-293T細胞をウミシイタケルシフェラーゼ（MOI = 0.2）を発現するCHIKVのCHIKV /漣株に感染し、増加とインキュベートしたC864、C648、C062、またはDMSOのみの投与量。 24時間後、ウミシイタケルシフェラーゼ発現を測定した。 *統計的に示しているすべての3つの化合物（p値<0.05）と有意な阻害的には、（C）HEK-293T細胞を、単独で、C864、C648、C062又はDMSOの漸増用量と共にインキュベートした。毒性のコントロールとして、細胞培養物を、0.5％IGEPAL溶液2.5μlを補充した。 24時間後、生きている細胞の数は、ルシフェラーゼに基づく生存率アッセイを用いて測定した。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
| 化学族 | 化合物 | MV（IC 50μM） | CHIKV（IC 50μM） | CC50（μM） |
| 1 | C864 | 0.6 | 0.6 | > 5 |
| 1 | C877 | 0.2 | 0.2 | > 5 |
| 1 | C957 | 1.2 | 1.2 | > 5 |
| 1 | C963 | 1.2 | 0.9 | > 5 |
| 1 | C967 | 1.7 | 1.6 | > 5 |
| 1 | C348 | 0.25 | 0.3 | > 5 |
| 1 | C265 | 0.25 | 0.3 | > 5 |
| 1 | C270 | 0.5 | 0.5 > 5 | |
| 1 | C350 | 0.4 | 0.5 | > 5 |
| 2 | C646 | 0.16 | 0.15 | > 5 |
| 2 | C814 | 1.9 | 1.1 | > 5 |
| 2 | C648 | 0.7 | 0.4 | > 5 |
| 3 | C062 | 1 | 1.2 | > 5 |
| ブレキナール | 0.04 | 0.04 | > 5 |
表1。13の抗ウイルス活性と細胞毒性元の化学ライブラリーから選択される化合物。結果は、MVの阻害またはCHIKV複製のためのIC50値として表される。 CC50値は、二次スクリーニングからの用量応答実験におけるすべての化合物について> 5μM見出された。しかし、一次スクリーニングからの細胞毒性のためのスコアリングフィルタしきい値はCC50の値があっても>20μMであることを示唆している。
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Discussion
ここに記載のスクリーニングパイプラインは、RNAウイルスの広域スペクトル阻害剤として適切なプロファイルを有する化合物を選択することを目的とする。万化合物のライブラリーは、このプロトコルでスクリーニングし、前述のフィルタリング基準が適用された場合には、75パーセントよりも優れたMV複製の阻害、 すなわち 40の化合物（0.4％）が陽性と。加えて、それらの約半分はルシフェラーゼに基づく生存率アッセイにおいていくらかの毒性を示し、この理由のために無視した。最後に、多量に容易に利用可能なヒットのダースは、再試験した。この小さなセットは、容易に細胞毒性および用量応答実験におけるMVおよびCHIKVに対するウイルス複製の阻害（ 図4）の両方について再試験した。すべての選択された化合物の抗ウイルス活性を確認し、このスクリーニングのためのパイプライン全体識別ヒット率は1.3‰であった。このスコアは、異なる高スループットで、他のグループによって得られた結果と非常によく似てい抗ウイルス剤27,32のレプリケーションに基づくスクリーニングアッセイ、および一般的なセルベースの表現型アッセイ（1-5‰33）に期待される範囲内にある。しかしながら、ヒット率がスクリーニングされる化合物ライブラリー、収集したデータのプロファイルに応じて調整することができるスコアリング·フィルタのしきい値の両方に大きく依存する。ここでは、MVの複製および細胞毒性を阻害するための選択されたしきい値は、経験的に決定した、と貿易はオフを簡単CHIKVに対する二次スクリーニングで再テストすることができますヒットの扱いやすい番号を取得するように設定した。
一次スクリーニングにおいて、化合物は、MV複製および細胞毒性の欠如の両方を遮断するそれらの能力について試験した。細胞毒性を20μmで測定したのに対し、抗ウイルス活性をrMV2/Luc-infected細胞に210μMの濃度で測定した。これらの実験の設定は、直接高い抗有する化合物を選択するために貴重な発見された細胞毒性の相対ウイルス活性。また、一次スクリーンは、ウリジンの存在下で行った。実際、最近の出版物は、RNAウイルス13,16,27,28の阻害剤を探すときに、ピリミジン生合成経路の初期段階を対象とした化合物が頻繁に隔離されていることを示唆している。特に、抗ウイルス分子を探している研究グループがジヒドロデヒドロゲナーゼの阻害剤、この代謝経路31の第四の酵素を発見した。この酵素を阻害するための培養液中のウリジン効率的にトランス補完するものであり、そのためには、ウイルスの複製を復元します。このようにして、ピリミジン生合成経路の阻害を介してMV複製を防ぐ化合物は、直接の抗ウイルスヒットから除外される。最後に、Z'-因子は、従って、アッセイのロバスト性及び高品質を実証し、体系的に0.5以上であることが見出された。
並行して、細胞毒性は、高throughpuを用いて決定したATPの定量に基づく培養物中の代謝活性のある細胞の数を決定するのtルシフェラーゼに基づくアッセイ。各スクリーニングプレートにおいて、IGEPALは、毒性の対照ウェルに添加した。この非変性、非イオン性界面活性剤は、ルシフェラーゼ酵素活性に影響を与えることなく、非特異的に効率的にすべての細胞型を死滅させるという利点を有する。 Z '因子は、このようにアッセイの高い堅牢性と品質を実証し、体系的に0.5 125以上の板を超えていた。この細胞毒性アッセイの1つの制限は、そのコストが比較的高いです。細胞の生存率を決定するための代替アッセイとして、いくつかのグループは、構成的に安定した導入遺伝子34からルシフェラーゼを発現する細胞株を使用している。このようなアッセイにおいて、毒性化合物が細胞生存率に影響を与えるときに、ルシフェラーゼ発現を減少あるいは抑制することが期待される。我々は最近、IFN-β刺激の35時のルシフェラーゼを発現する安定な細胞株を開発し、この細胞株は、trのをテストするために使用された細胞毒性のために80の化合物のセットをaining。驚くべきことに、このアッセイは、上記のルシフェラーゼに基づく生存率アッセイ間の相関係数（CC）は比較的低かった（CC = 0.67）。 ATPの代謝は影響を受けなかったのに対し、実際のところ、いくつかの化合物は、導入遺伝子からのルシフェラーゼ発現を損なう。いくつかの広域スペクトル抗ウイルス化合物はまた、細胞の遺伝子発現を損なうであろう、そのような細胞シグナル伝達、遺伝子転写又はタンパク質翻訳のような細胞機能に影響する可能性がある。細胞生存のための完璧なスクリーニングシステムがありませんが、それは細胞の遺伝子発現に基づいた毒性化合物をろ過することは、潜在的に善意の抗ウイルス分子を排除につながる危険性がある。
二次スクリーニングは、正確に自分のIC50を決定しながら、2完全に無関係のRNAウイルスに対する選択された化合物の抗ウイルス活性を確立することを目指しています。興味深いことに、それは注目されるべきであるルシフェラーゼ酵素阻害剤は、誤ってrMV2/Lucアッセイで陽性として採点することができたが、このような偽陽性をろ過アウトされる二次スクリーニングによってCHIKV /漣の阻害について試験したとき。実際に、rMV2/LucおよびCHIKV /レンは、ホタル発現し、ウミシイタケルシフェラーゼ、それぞれ、これら二つの酵素は無関係であり、異なる化学反応を触媒する。一次スクリーニングでrMV2/Lucからホタルルシフェラーゼレポーターを阻害する化合物は、CHIKV /漣に対するすべてのアクティビティが表示されませんので、抗ウイルス剤としての誤選択を防止し、破棄されます。意外にも、MV複製を遮断するすべての13の一次ヒットにも、この二次スクリーニングでCHIKVを阻害した。他のライブラリ（データは示さず）をスクリーニングする場合、いくつかのMV特異的阻害剤は、単離されたので、これは常にそうであるわけではない。さらに、選択された化合物は、構造的類似性を共有し、3つだけ化学族（ 表1）に分類することができる。化学科内の化合物は、おそらくACTIの同じモードを持っている上で、したがって同じ化学物質の類似体とみなすことができる。これは大局的に、すべての13選択された化合物は、MVとCHIKV複製の両方を阻害しているという事実を置きます。それにもかかわらず、これらの結果はまた、広域スペクトルの抗ウイルス剤は、より頻繁に、ウイルス特異的阻害剤も同定されていることを示唆している可能性がある。この仮説の背後にある合理的な、明らかな特異性にもかかわらず、全てのRNAウイルスは、このようなエネルギー源としてリボソーム機械、細胞骨格やミトコンドリアなど複製する同じ基本的な細胞機能に依存している、ということです。これらの機能モジュールは、広域スペクトル抗ウイルス剤のための潜在的標的の比較的大きなパネルを提供する複雑な分子システムである。これとは対照的に、ウイルス特異的阻害剤を調達するための適切な標的を示すウイルスまたは細胞因子の限られたセットがあります。将来的には、表現型スクリーニングによって同定抗ウイルス剤の新たなパネルは、この仮説を確認するか、または無効にするために必要なデータを提供すべきである。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
我々は彼の実りのコメントや提案のために博士イヴ·L·ジャニンに感謝します。私たちは彼女の技術的なサポートのために、CHIK /漣とC CombredetためHHガドに感謝したいと思います。パスツールの病気Infectieuses（POVへのプログラムのSTINGとHM- - この作品は、パスツール研究所、センター国立·デ·ラ·ルシェルシュ科学研究（CNRS）、研究所国立·デ·ラ·サンテエトデ·ラ·ルシェルシュMédicale（INSERM）、研究所カルノーによってサポートされていましたL）を、通信社国立）がPOVにLAルシェルシュ（ANR-RPIB、プログラムSTING 2.0を注ぎ、そして「Conseilの地域D'イルドフランス」（ケミカルライブラリプロジェクト、助成N°06から222のI / RとI HM-Lに対して09から1739 / R）。 CHIKV /漣上の作業は、プロジェクトArbOAS（ANR助成金2010-INTB-1601-02）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freedom EVO platform | TECAN | Robotic platform | |
| 96-well polystyrene cell culture microplates, white | Greiner Bio One | 655083 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | Luciferase-based viability assay |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Reagent containing firefly luciferase substrate |
| Renilla-Glo luciferase Assay System | Promega | E2710 | Reagent containing Renilla luciferase substrate |
| Britelite plus Reporter Gene Assay System | Perkin-Elmer | 6016761 | Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity. |
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