Summary
这份报告描述了鞘内穿刺针用于siRNA在小鼠脊髓腰段下短持久的浅麻醉局部转染一个简单而快速的方法。
Abstract
这份报告描述了一步一步的指导，急性鞘内注射针在非侵入性的方式方法， 即导管植入独立的。这种手术方法的技术限制在于手中的技巧。注射速度快，特别是对于一个训练有素的实验者，由于这种技术的组织破坏是最小的，反复注射是可能的，而且免疫反应，国外的工具（ 如导尿管）不会发生，从而给人一种更好的和更具体的读出脊髓调制。因为该物质的应用主要限于脊髓的目标区域，药物不需要在大剂量要应用，以及其他的组织更重要的是不需要的效果，如用全身给药观察到的，可以规避1， 2。此外，我们结合该技术在体内转染核酸与polyethylenim的帮助鸟嘌呤（PEI）试剂3，这提供了巨大的灵活性对于通过递送药理学试剂以及基因，RNA和蛋白调节剂研究脊髓功能。
Introduction
脊髓是在多种关键生物学过程和生理功能，包括处理和疼痛（疼痛）投入4-7传输的一个非常重要的中心。各种实验技术已被开发，以促进脊髓，如鞘内导管8的慢性移植，脊髓显微注射，以及鞘内注射针9的药理调制。每种技术都有自己的优点和缺点，并根据实验范式一种技术可能比其他人更适合。而鞘内导管的慢性移植是容易可行的大鼠，这种方法是非常困难的小鼠，给定尺寸的限制。成功率非常低，运动障碍常因导管在鼠标的严重局限硬膜下腔笨重存在发生。此外，长期输送药物是由于频繁的凝血呈现的长期植入导管。最后，免疫反应是常见的。
这些问题可以用急性鞘内注射的方法， 通过在无预先植入的导管，使药物和试剂的快速和解剖学有限应用到小鼠的脊髓中的针来规避。该方法完全保留鞘内递送超过其他全身递送途径（ 如口服，静脉内，腹膜内等 ），如脊髓调制，这允许减少剂量和限制的副作用，以及交付能力的物质没有的特异性的好处通常不跨越血脑屏障，因为鞘内注射过程中，所述针被插入在硬膜和脊髓之间。但重要的是，相较于鞘内交付的其他方法，鞘内注射针方法是最侵入性，允许在多种应用没有造成任何可观的组织损伤或唤起因异物植入免疫反应相同的动物。然而，这需要技术技能的针，以允许效力的非常精确的定位。
在这里，我们直观地验证了该方法实现成功的最佳比率为专门针对腰脊髓。选择在这个实验是注射部位是L5和L6脊椎动物列，近的地方脊髓结束时，以减少损坏的脊椎的可能性之间的槽。此外，我们演示了如何使用这种技术击倒基因的siRNAs使用脊髓。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有动物使用的程序均符合当地管理机构（Regierungspräsidium卡尔斯鲁厄，卡尔斯鲁厄，德国）订下的道德准则。
1。 siRNA的/ PEI复合物的制备
所述siRNA / PEI复合物溶液是用制造商的指示如下制备：
- 溶液A：稀释的siRNA用无菌水所需的金额（如有必要）到一季度末容积，并用10％葡萄糖溶液直至年底的一半体积的进一步淡化这一点。涡轻轻或者上下吹打混匀。需要的siRNA的最佳用量应凭经验确定，但1微克的siRNA在10％的动物微升复杂的解决方案是一个很好的起点进行优化。
- 溶液B：稀释的PEI试剂用无菌水至四分之一结束体积所需要的体积，这进一步稀释，用10％葡萄糖溶液中的端体积的高达一半。 GE涡ntly或上下吹打混匀。
注意：PEI试剂的量决定了影响转染效率的复杂的离子平衡。同样的PEI溶液中的最佳量必须根据经验来确定。在我们的手中，最佳用量为0.12微升每1微克siRNA的PEI的解决方案。 - 混合溶液A与溶液B全部一次，涡平缓。
- 使用前孵育15分钟的混合溶液在室温下。此复合体是稳定2小时在室温和24小时，在4℃下
2。鞘内注射
- 麻醉小鼠，用3％异氟烷，直到它显示翻正反射消失的迹象。此外，检查尾部和/或爪子捏反射，以进一步确保麻醉的状态。
- 剃皮毛约2平方厘米的尾巴基地附近的动物的后端，以方便针插入过程中更好的视觉效果。
- 将鼠标在手术过程中一鼻锥的持续施用异氟烷，减少异氟烷1.5％，并覆盖小鼠眼润滑剂的眼睛。
- 准备就绪使用连接到一个30 G 0.5在针25微升Hamilton注射器使用的siRNA混合溶液。
- 找到L6的棘突，这应该是最突出的一个，并轻轻按下它围绕解决这方面的脊椎动物列。
- 小心地将L5和L6椎体的凹槽之间的针，并观察了甩尾，因为这标志指示针在硬膜内空间一个成功的项目。
提示：使用指甲，应该能够找到的槽为好。 - 一旦甩尾观察到，立刻，但是仔细，固定针的位置，用一只手和慢慢另一方面注入物质的所需量。
提示：5-10之间的容积微升是最佳的，因为体积小于5＆＃181，L是不可靠的，并具有音量大于10微升导致压力太大。 - 一旦喷射，移动鼠标回到笼子从麻醉中恢复。
- 重复此注射至少2次以上，每24小时以实现目标基因的最佳表达下调。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
为了说明一个成功的注入，我们使用坚牢绿FCF染料在成年C57BL6小鼠（8-10周龄）进行了这种技术。该动物被允许恢复为注射后几分钟，以提供足够的时间用于染料扩散，然后与CO 2的过量死亡。随后，脊椎动物柱解剖和脊髓露出。对应于所述扩散染料的蓝色泪点，标记为注射部位。损伤脊髓的迹象可以看出，证实了这种技术（ 图1A）的微创性质。从注射部位吻侧注入的染料扩散，达到高达脊髓，注射（ 图1B）之后，仅几分钟的胸部区域。而且成功输注在硬膜外腔的染料可以由脊髓的染色表面被证实，但不是内部（ 图1C）。
在体内转染到脊髓。之后的siRNA鞘内注射分娩（3次，连用24小时），目标蛋白（这里WAVE1）对从背L3-L5脊髓组织裂解而得的表达量下降到70％左右的蛋白质水平（ 图2A中，n = 20）以及在mRNA水平（ 图2B中，n = 6）。另外一个类似幅度的下调也可以看出，在腹侧部的溶胞产物（ 图2C中，n = 4）。有趣的是，即使是略微下调更强，也见于脊髓型颈椎病的裂解液（ 图2D中，n = 4）。但是，尽管类似的方法已用于下调基因中的脊髓10的外部组织的事实，在我们手中这下调不是在大脑中的裂解物中观察到的（ 图2E中，n = 4），也不是何GS（ 图2F中，n = 4）。
图1。脊髓以下的非侵入性的，急性鞘内注射固绿染色，在显微镜下解剖。 A，组织损伤没有明显的迹象可以看出，对注射部位，打上了染料泪点，B，切除的注射呈现在吻端方向的染料逐渐扩散后脊髓几分钟。白盒马克腰部区域，和星痕注射部位C，特异性染色脊髓（段L3-L5）的表面上，而不是在脊髓内部。 R =喙，C =尾椎，CC =中央管。 点击这里查看大图。
图2。 ，目标蛋白（这里WAVE1）在脊髓成功下调的siRNA鞘内注射分娩后小鼠鞘内注射或者与对照siRNA或siRNA靶向WAVE1与裴试剂，连续3次，每次24小时混合，此后，背，腹脊髓腰段（3-5段）第，颈脊髓，脑和背根节切除，裂解并进行Western印迹和实时定量RT-PCR AB，Western印迹法（N = 20）和定量RT-PCR（N = 6）从量化腰椎脊髓背部分裂解，从腹侧L3-L5脊髓，脊髓型颈椎病，脑和DRG respe的裂解CF免疫印迹定量沉着应对（N = 4）。分析由未成对学生的t检验（* P≤0.05，** P≤0.005）。 点击这里查看大图 。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
因此，鞘内注射针的上述技术是有效的，快速的，特别是局部化和非破坏性。从技术上讲，该过程的最重要的方面是点的针插入的插入槽。至关重要的是，这个过程是用很平静的双手和耐心完成。像许多外科手术，培训提高注射成功率。这也是很重要的，因为在实际的实验中，这种技术没有提供一个明显的指标，以直接地确认注射是否成功与否。正确的进针的唯一可见的指标是观察到的反射甩尾。
该方法完全保留鞘内递送超过其他systemical递送途径（ 如口服，静脉内，腹膜内等 ），如脊髓调制，这允许减少剂量和限制副作用的特异性的好处;皮毛了Thermore，鞘内注射使输送的是通常不跨血脑屏障自鞘内注射过程中，所述针被插入在硬膜和脊髓之间的物质。重要的是，然而，在比较鞘内递送的其他方法，鞘内注射针的方法是侵入性最小，从而允许在相同的动物中大量应用程序，而不会导致任何可观的组织损伤或唤起由于异物植入免疫反应。
总之，在本报告中，我们看到的不只是基本的一步一步的指导，急性鞘内注射针，同时也报道该技术，即兴的一个例子，在脊柱体内转染siRNA和特异性基因敲除电源线就可以实现。旁递送药理试剂和PEI-促进siRNA递送的，鞘内注射针的方法也可以用来促进加时她的类型的基因转移，如病毒介导的基因递送11。一旦有足够的专业知识已获得，也可以在不麻醉的清醒，nonanesthetized小鼠4,12执行此过程。这使得，例如，研究了在行为范式药剂提供小鼠preacclimatized，以防止过大的应力急性效应。
因此，急性鞘内注射构成对脊髓背角的研究和技术的多功能性使实验者定制和即兴发挥，以满足他们的目标非常有用的工具。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者宣称没有竞争的财务权益。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In Vivo-jetPEI | Polyplus | 201-10G | |
| WAVE1 siRNA | Santa Cruz | sc-36832 | |
| Control siRNA-A | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Anti-ß-Tubulin III antibody | Sigma | T2200 | |
| Anti-WAVE1 antibody | R&D Systems | AF5514 | |
| Fast green dye | Sigma | F-7252 | |
| Isoflurane | Baxter | ||
| Isoflurane setup | Dräger Lübeck | ||
| Shaver | Wella | ||
| Hamilton syringe Gastight 1702 | Hamilton | ||
| 30 G 1/2 in 13 mm Needle | BD Microlance | 304000 | |
| Microscope Leica MS5 | Leica | ||
| WAVE1 forward primer for qRT-PCR | Sigma | cacagagcctcaggacagg | |
| WAVE1 reversed primer for qRT-PCR | Sigma | cttttcaccaacggcatctt | |
| FastStart Essential DNA Green Master | Roche | 6402712001 |
References
- Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. Eur. J. Pharmacol. 67, 313-316 (1980).
- Stokes, J. A., Corr, M., Yaksh, T. L. Transient tactile allodynia following intrathecal puncture in mouse: contributions of Toll-like receptor signaling. Neurosci. Lett. 504, 215-218 (2011).
- Goula, D., et al. Polyethylenimine-based intravenous delivery of transgenes to mouse lung. Gene Ther. , 1291-1295 (1998).
- Fairbanks, C. A. Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia. Adv. Drug. Deliv. Rev. 55, 1007-1041 (2003).
- Hohmann, A. G., Tsou, K., Walker, J. M. Cannabinoid modulation of wide dynamic range neurons in the lumbar dorsal horn of the rat by spinally administered WIN55,212-2. Neurosci. Lett. 257, 119-122 (1998).
- Song, Z. H., Takemori, A. E. Involvement of spinal kappa opioid receptors in the antinociception produced by intrathecally administered corticotropin-releasing factor in mice. J. Pharmacol. Exp. Ther. 254, 363-368 (1990).
- Trang, T., Sutak, M., Jhamandas, K. Involvement of cannabinoid (CB1)-receptors in the development and maintenance of opioid tolerance. Neuroscience. , 1275-1288 (2007).
- Yaksh, T. L., Rudy, T. A. Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space. Physiol. Behav. 17, 1031-1036 (1976).
- Tappe, A., et al. Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain. Nat. Med. , 677-681 (2006).
- Bourinet, E., et al. Silencing of the Cav3.2 T-type calcium channel gene in sensory neurons demonstrates its major role in nociception. EMBO J. 24, 315-324 (2005).
- Wang, X., et al. Gene transfer to dorsal root ganglia by intrathecal injection: effects on regeneration of peripheral nerves. Mol. Ther. 12, 314-320 (2005).
- Wigdor, S., Wilcox, G. L. Central and systemic morphine-induced antinociception in mice: contribution of descending serotonergic and noradrenergic pathways. J. Pharmacol. Exp. Ther. 242, 90-95 (1987).
