Summary
这个工作描述了一种新颖的方法，用于选择性地靶向亚细胞器在植物中，使用BioRad公司基因枪进行测定。
Abstract
为了针对单一蛋白质多亚细胞器，植物通常复制有关的基因，并使用复杂的监管策略，包括不同的启动子和/或信号序列分别表达各自的基因。代谢工程和感兴趣的目标酶到特定的细胞器合成生物学家都面临着一个挑战：对于一种蛋白质，是被定位于一个以上的细胞器，工程师必须复制相同的基因多次。这项工作提出了解决这一策略：利用mRNA的选择性剪接。这项技术需要建立叶绿体和过氧化物酶体靶向序列的优势，将它们组合成一个单一的mRNA被选择性剪接。一些剪接变体将被发送到叶绿体，一些对过氧化物酶，以及一些到细胞质。这里该系统被设计用于多细胞器靶向与可变剪接。在这项工作中，GFP预计将EXPRessed在叶绿体，细胞质和过氧化物酶体通过一系列合理设计5'基因标签。这些标记必须减少当异源基因需要被表达于多种细胞内的细胞器需要克隆的量的电位。该构建体被设计成在先前的工作11，以及使用吉布森装配，不需要限制酶结扎独立克隆方法进行克隆。将得到的质粒导入本氏烟草叶表皮细胞与改性基因枪协议。最后，叶变换观察与激光共聚焦显微镜。
Introduction
这项工作是代谢工程/合成生物学项目，其中植物细胞工程表达报告蛋白在多种细胞器，但只有一个单一的DNA结构。
一种方法对目标蛋白以多个位置包括克隆多个基因拷贝，每个包含一个不同的本地化的肽。每个副本都必须通过连续的重转换被引入，或者，通过回交单转换1。这涉及到额外的克隆，并通过每总站1定位标记的限制。
另一种方式来定位一个蛋白到多个位置是通过选择性剪接2-5。 RNA是从一个单一的基因转录，但转录物的不同副本中每细胞多于一个的方式处理不同，往往。这可能会导致在从一个单一的基因转录的细胞多于一个信使RNA。这些不同的信使Ř的RNA可编码为同一蛋白质的不同的同种型，或在一个移码，不同的蛋白质完全的情况。虽然选择性剪接在文献中已经描述了许多年，操作和保守的供体和受体剪接位点的机制仅被阐明，最近6。由于这些网站都被更好地描述，他们打开了工程的机会。
在多个细胞器表达一种蛋白质，当植物代谢的工程师都面临着一个挑战。为一种蛋白质，是将其定位于一个以上的细胞器中，工程师必须克隆同一基因多次，每一个独立的信号序列，它引导到感兴趣的细胞器。在三个细胞器的单个基因，这简直就是三个基因。但是，对于一个六基因代谢途径，这种扩展到18个基因，一个显著克隆的努力。结合多种定位序列成一个单一的，或者拼接基因标志ificantly减少了这方面的努力。例如，重新设计光呼吸7,8和类异戊二烯合成9,10同时涉及叶绿体和过氧化物酶体。在我们的例子中，我们利用了剪接位点作为一个自然拟南芥系统观察前面所述6。我们合理地重新设计的mRNA序列而使天然剪接位点单，但放置顺序，将在交替剪接的内含子（ 图1）内的编码叶绿体或过氧化物酶体靶向标记。所表达的蛋白质可能有或可能没有一个标签，这取决于前体mRNA编码它是否被切除的内含子（ 图1g和1小时 ）。就在这项工作中提出的结构的设计的更多信息，请参阅本文的姊妹篇11。
因为这仍是一个显著克隆的努力，吉布森组装，克隆DNA结构的新方法，为used的建设。可以使用吉布森方法对于任何序列，无论限制性位点（ 图2）12-14。酶的特定组合允许单步，等温组件。在该方法中，一些双链线性DNA部分被设计为使得它们具有的〜50bp的重叠序列。吉布森组装酶混合物部分消化线性DNA部分，露出的单链同源序列。这些部分单链的序列被重新退火的反应混合物中，导致快速的一步，顺序无关的，结扎无亚克隆反应。
这项工作说明1）合理设计选择性剪接表达在植物叶绿体，过氧化物酶和细胞液的结构，2）他们的克隆使用吉布森组件的新结扎-free方法，3）其输送到烟叶细胞与基因枪，和4）结果显示细胞器的定位，与绿色荧光蛋白观察和共聚焦显微镜。
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Protocol
的或者拼接序列的多细胞器靶向1。设计
- 确定网站最终蛋白的表达。对于这项工作，兴趣是在瞄准的叶绿体，过氧化物酶体和细胞质。
- 使用该文献以确定已知的靶蛋白与感兴趣的细胞器的蛋白质和DNA序列。在这种情况下，叶绿体靶向序列来自拟南芥的L-isoaspartate甲基6,15，和来自拟南芥转甲状腺素状的S-尿囊素合酶16,17靶向序列的过氧化物酶进行测定。
- 找出一个替代剪接制度，应该感兴趣的蛋白定位到正确的细胞器。对于这项工作，剪接位点作为一个自然拟南芥系统6观察。 mRNA序列进行了重新设计留下天然剪接位点，但序列置于编码叶绿体或peroxis青梅靶向的交替剪接内含子内标签（ 图1）。
2，吉布森DNA的组装部件
参见图2。
吉布森组装方法在预制的组合，以1取决于几种酶的作用）部分地消化双链DNA的末端，使单链和2）退火免费碱基对的DNA邻近的部位。这允许DNA片段的克隆没有限制酶切位点的限制。
- 选择用于在该DNA的质粒构建体中的元素的顺序。作为一个例子TriTag-1具有的要素：a）一种质粒载体（孔，含有已知在植物中卡那霉素抗性标记的工作GFP的构建体，和复制的大肠杆菌和根癌土壤杆菌宿主），b）一种起源启动子序列，（P ENTCUP2，证明是组成型植物），三）靶向序列（CTS）的叶绿体，c）一种过氧化物酶体靶向序列（PTS），以及d）如前面6描述了一系列的剪接位点。
- 设计构建基为基带，在硅片设计软件。 APE是一个开放源码的免费软件包对这项工作非常有用。
注：TriTag-1，具有顺序为：质粒载体，启动子，ATG，剪接供体位点，叶绿体靶序列，剪接供体位点，中性的网站，剪接受体位点，过氧化物酶体靶序列，剪接受体位点，绿色荧光蛋白为包含在质粒载体。- 设计在硅片 DNA结构，使得订货引物进行PCR时，有每片之间有50 bp的重叠。它可以使用50个碱基的引物：25 bp的每个方向。
- 一定要保持每个序列块的起源轨道。它是为：质粒进行种植和微量制备;一个线性序列，可被用作PCR的模板;或一个序列，将需要合成的商业？有几家公司为片段<500 bp的提供低成本DNA合成服务。在这种情况下，TriTag本身是437碱基所以这是有利的，商业上订。
- 最好的结果会来，如果所有的片段的PCR扩增，并从它们的模板DNA进行纯化。抗性标记是一个好地方来划分这个大的DNA成两个较小的模板更容易PCR扩增的。
- 限制限制性内切酶切割DPNI甲基化DNA。如果PCR的模板是从E.一个小量制备大肠杆菌，DPNI处理将去除污染的DNA模板。
- 设计在硅片 DNA结构，使得订货引物进行PCR时，有每片之间有50 bp的重叠。它可以使用50个碱基的引物：25 bp的每个方向。
- 单独净化所有的DNA序列和洗脱水，TE或缓冲的EB。
- 孔载体部分1，〜3,000 bp的（绿色箭头）。 PCR扩增并进行DPNI处理。
- 孔载体部分2，〜3,000 bp的（黑色箭头）。 PCR扩增并进行DPNI处理。
- TriTag插入，437个基点（蓝色箭头）。商业订购。 Řesuspend在DDH 2 O。
- P ENTCUP子，〜750个基点（橙色箭头）。 PCR扩增，并进行DPNI处理。
- 测量各DNA片段的浓度。瞄准150纳克/微升向量件。
- 取吉布森组件组合的等分试样出冰箱和解冻冰上。这是市售的，而且简单，使在实验室12-14。
- 有两个步骤来此配方：一种粘稠的5倍预混液和15μl的反应大小的1.33倍等分。的5倍主混合物含有：3毫升的1M的Tris-HCl pH为7.5，加入300μl的1M MgCl 2的，每种dNTP各600微升的10mM，300微升的1M DTT，加入1.5g PEG-8000，20毫克NAD和双蒸0到6毫升准备320微升等分（18），并冻结所有，但一个在-20°C。该解决方案将非常粘稠。标注这些“5X等温线的缓冲区”
- 要剩下的一个（320微升），加1.2μLT5核酸外切酶，20微升的Phusion高-FIDelity DNA聚合酶，160微升的Taq DNA连接酶和700微升双蒸2 O。制备15微升等分试样（〜80），在冰上在PCR管中并储存于-20℃。
- 确定卷的每个片段的等摩尔量。有几个在线计算器，包括Gibthon.org。应该有一个总的5微升所有DNA碎片。将它们添加到15μL吉布森混合等分。如果这需要体积太小，移液管，稀释的DNA片段和/或使用一个以上的等分试样。
- 不要忘了准备单独的载体DNA的控制（ 如含有抗生素抗性标记的DNA的一部分），并与水的体积。
- 孵育在热循环仪的管在50-55℃30-60分钟。装上冰和转化为E。通过热休克化学感受态细胞大肠杆菌 。不要使用电感受态细胞。在高盐浓度和相对低的DNA浓度可能导致细胞电弧。
- 适用于所有20μl到一个商业的200微升氯化钙制备感受态大肠杆菌 。
在冰上孵育30分钟，热休克60秒，在42℃下 - 返回到冰2分钟，应用750微升SOC或LB培养基中，并回收摇动在微量离心管30分钟，在37℃下板放在LB +阚（或其它适当的抗生素）的混合物中，并适当稀释。这可能导致较高的背景（和一些非靶重组事件更高）比传统的结扎的克隆，但它是值得的，筛选大约10个菌落。
- 适用于所有20μl到一个商业的200微升氯化钙制备感受态大肠杆菌 。
- 通过序列确认克隆和存储的等分试样在-80℃下
3，基因枪法烟草的转染与基因枪
这是一种建立在朱庇特的18,19技术。关键步骤和差异如下所述。
- 增长50-100毫升大肠杆菌合作Li或200毫升农杆菌 。马克西 - 预习文化。约1500纳克/ A浓度微升才能继续。
- 制备基因枪子弹如前所述。它们加载到基因枪。
- 对于本氏烟烟叶表皮组织的转染，选择大叶近3个月的旧厂房的基础。小心切开它，并把它底部朝上湿纸巾15厘米的培养皿中。
- 的压力，他对基因枪设置为200-250磅。
- 仔细瞄准基因枪肋骨之间在叶的底部，约3-5厘米以上吧。释放安全和递送颗粒的叶。每个子弹在叶上的同一位置，可以使用两次。如果叶爆炸，丢弃，并开始新的一页，有叶韧性一些差异，由于生长条件如年龄，水分等。对于一个12厘米的叶片，期望以适合约6张。
- 存储叶子，覆盖着一顶培养皿在板凳上弱光2-3天。
- 检查配备了紫外荧光解剖显微镜的叶子，然后搜索表达GFP单个细胞。剖析叶5-10毫米的部分。
- 淹没在叶下〜200微升0.1％的Triton X-100深井显微镜幻灯片。洗涤剂有助于防止气泡的表面上形成，且深井泵显微镜载玻片允许更大的组织成像区域。
4，激光共聚焦转染组织的显微镜
这些指令各有不同，每一个仪器，所以它必须得到适当的培训。
- 用于荧光检测的实验中，激发激光器设置为489 nm，而设置在光电倍增管探测器500-569纳米的GFP荧光和630-700 nm的叶绿素自发荧光。用40倍水浸泡的目的细胞图像。
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Representative Results
设计工作是显著规划的结果。小说这个项目是利用选择性剪接来创建一个前体mRNA被翻译成差异表达蛋白。这些蛋白被表达在不同的细胞器，在这种情况下，叶绿体，过氧化物酶体和/或细胞质中。我们适于天然拟南芥基因被选择性剪接6，并置于已知叶绿体6和过氧化物酶体17定位在备用的外显子序列（TriTag-1和TriTag-2）。 TriTag-3由嵌入在叶绿体序列的低复杂性区域中的过氧化物酶体信号。这些被放置在帧与GFP（ 图1）。
在本研究中使用的质粒因而包含多个元素：从PIMT2基因6，叶绿体和过氧化物酶体靶向序列，GFP的天然剪接方案和质粒骨架。由于每个人都有非常规范IFIC所需的序列，一个序列无关的方法是必要的。吉布森组件协议12,13可以在任何序列中使用，只要该结构部件都设计有序列相似对方，并且不含有重复顺序。简言之，线性DNA片段构建（通过PCR扩增，商业合成，或预先制成的质粒的消化），使得它们具有〜50 bp的重叠序列同源的（ 图2）。等摩尔量的各DNA片段的结合在含有吉布森组件组合，孵育在50℃下进行1小时的单个管中，并转化到大肠杆菌大肠杆菌 。从吉布森组装协议而产生的质粒通过Sanger测序证实。
在这项研究中的三种不同的GFP细胞器靶向构建体相比，未标记的GFP和Rubisco酶标记的GFP。共聚焦显微镜方法检测GFP荧光的SIngle细胞瞬时转化。在对照实验中，观察到的瞬时表达与叶绿体中（通过叶绿素的红色自发荧光易于识别），细胞核（大细胞器，是不是叶绿体并且具有每个小区只有一个），和/或小的细胞器认为是过氧化物酶体。绿色（GFP）和红色（叶绿素自发荧光）通道进行叠加来研究细胞内定位（ 图3）。对于这些结果更完整的讨论，请参阅我们的同伴第11条。
据预测，在所有三个双靶向构建，绿色荧光蛋白在叶绿体中观察到（ 图4）覆盖共焦显微照片。 TriTag-1和TriTag-2靶在GFP也到细胞质和认为是过氧化物酶体（ 图4a和4b，分别），小细胞器。 TriTag-3的目标在GFP仅在叶绿体和过氧化物酶体，但不细胞质（ 图4c）。结果概要图解（ 图5）。
图1设计中的可变剪接的结构为在本氏烟微分表达的细胞器。通联（一）TriTag-1的图，（B）TriTag-2，及（c）TriTag-3表示的非靶向序列（灰色），叶绿体靶向序列（淡绿），过氧化物酶体靶向序列（橙色），并在瞬时表达实验中使用的绿色荧光蛋白编码序列。 TriTag-1和TriTag-2包括选择性剪接构建体; TriTag-3由嵌入在叶绿体序列的低复杂性区域中的过氧化物酶体信号。序列
图2原理图吉布森装配：。的新方法重叠的DNA片段组装的质粒构建12,13吉布森组装方法正在迅速取代传统的限制结扎克隆在许多实验室。本质上，可以设计，在硅片的构建体，包含感兴趣的DNA完全相同，不同来源的扩增的PCR产物的组成。设计引物是互补的对方，和PCR-扩增的每个片段与着色的引物。添加所有的作品与酶混合物单管，并转化大肠大肠杆菌感受态细胞。 点击这里查看升arger形象。
图3。控制治疗轰击成N。本塞姆氏叶表皮细胞（AC）未标记的GFP（一）绿色通道。未标记的GFP表达在细胞核和周围小区外围，对应于胞质溶胶，但没有液泡（B）红色叶绿体表明叶绿素的自发荧光（C）覆盖。在该构建体的荧光在细胞核和细胞质中仅观察到，但不是叶绿体（DF）叶绿体标记的GFP对照（D）绿色通道。绿色荧光蛋白表达在大细胞器，与细胞所概述。（五）红叶绿体表明氯碱自发荧光ophyll。（六）覆盖。在这种情况下，黄色叶绿体观察到，这表明GFP（绿色）被靶向叶绿体。经许可后转载11。 点击这里查看大图。
图4。三TAG-1，2，3标签的GFP融合图像（一）三Tag1中。在这种情况下，黄色叶绿体周围观察到，这表明GFP被靶向叶绿体。 GFP也观察到在细胞质以及小点状的细胞器，可能是过氧化物酶体（B）三Tag2的。在这种情况下，黄色叶绿体周围观察到，这表明GFP被定向到c hloroplast。 GFP也观察到在细胞质以及小点状的细胞器，可能是过氧化物酶体（C）三TAG3。在这种情况下，黄色叶绿体的观察，以及小点状的细胞器，可能是过氧化物酶。但绿色荧光蛋白中没有观察到胞质溶胶。经许可后转载11。 点击这里查看大图。
图5典型的烟草叶表皮细胞的舱室，在这里它们的相对尺寸和在细胞内的位置被示出，并且相对表达水平通过共聚焦显微镜观察。经许可后转载11。/ 51234/51234fig5highres.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。
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Discussion
在这项研究中，简单的策略描述了用于定位的单个转基因蛋白在植物中多种细胞区室。我们的目标是设计构造，它会表达一个单一的基因在烟草本塞姆氏多个细胞器。策略包括合理的设计基于GFP的DNA构建体，吉布森组装，交付质粒叶细胞与基因枪，并观察其结果与激光共聚焦显微镜。
三种不同的短，N-末端标签被设计为同时叶绿体，过氧化物酶体和胞质溶胶定位11。这些“TriTags”是通过组合编码可变剪接的mRNA，直接的编码蛋 白质或叶绿体加细胞质6或过氧化物酶体加细胞质17天然存在的DNA而设计的。 TriTag-3不依赖于选择性剪接，由叶绿体靶向序列，其中一个呐turally非结构化的部分已经被替换为过氧化物酶体靶向序列15,17。该TriTags函数体内针对GFP在本氏烟草叶表皮细胞（ 图5）。
共聚焦显微镜分析显示，TriTag-1和TriTag-2靶GFP叶绿体，过氧化物酶体和细胞质中有效，但与偏爱叶绿体和过氧化物酶体，分别为（ 图4a和4b）。 TriTag-3的目标仅GFP叶绿体和过氧化物酶，但不是细胞溶质中（ 图4c）。总之，这些标签可以减少时间和资源用在克隆植物代谢工程，专门为那些需要具体表现在叶绿体和过氧化物酶体。
修改和故障排除
作为目前构建的TriTags是相当静态的。然而，underlyinG技术的，可变剪接，让不同位置的特定标签翻译，是灵活的。现有的叶绿体和/或过氧化物酶体特定的标记可以用于任何其他细胞器的改变，无论是分泌途径中，线粒体，一个ER居住标签，液泡。这些也可以与组织特异性启动子， 例如用于种子，花，根，叶，茎等组合
对于一个项目，例如这一个，用于克隆的构建吉布森组装方法12-14是理想的。它是一个简单的，强大的工具来亚克隆的任何顺序，而无需限制酶切位点的限制。在单步反应中，吉布森装配迅速建立的构建体和对照带中克隆最少的努力。吉布森组装技术几乎是无限可修改为任何所希望的顺序，只要模板序列可以被PCR扩增。尽管在这个例子吉布森组件被示为具有消化的质粒PCR-扩增的载体往往工作比使用消化微量制备更好。
基因枪是一种快速，有效的方法，细胞的瞬时转染，如已成立由本日记18,19。 本生烟设有大，叶状叶表皮细胞，它们都是理想的转染与基因枪，也为观察与激光共聚焦显微镜。该协议使子弹是公认的。黄金一直被用作实验的大部分文献中的微载体迄今为止，但是钨微载体是最近获得的低成本。
该技术的局限性
吉布森方法的一个主要限制是重复序列的存在：较长的重叠区域是在较少的副产物的结果。 PCR产物与DPNI的消化应该去除污染的质粒模板;这通常是侧的源产品。酶从双链DNA消化的DNA片段为单链。重复序列的存在靠近DNA片段的末端（〜1 kb的）显著增加不当重组的可能性。同时，重复序列内也构成一种限制：它不是众所周知的，难以控制的T5核酸外切酶嚼多久以前的单链DNA。核酸外切酶的快速活动是由高反应温度（50-55℃）最终变性的酶，且粘度降低溶液中的整体运动锻炼。欲了解更多微调的反应步骤，顺序和结扎独立克隆（SLIC）的20是首选。
基因枪技术的一个主要限制是它仅产生每拍摄事件九时五十九瞬时转化的细胞的数量级。
相对于现有方法的意义
吉布森组装技术正享受着高速采纳其方便性，灵活性和适应性。它是一种更快的协议比传统的限制/克隆结扎，并且不需要特定的序列，如所要求的限制性消化。它并不限于两个或三个片段进行重组;原来的研究人员已经证明它成功地为最多10重量份，尽管有有限的效率。对于许多研究者吉布森装配使得阳性克隆一个更大的数字。
欲了解更多转化与基因枪技术，或为创造转化愈伤组织的，应当使用使用一个内阁式基因枪装置（ 如 BioRad公司的PDS-1000）。另一种方法是农杆菌浸润。
未来的应用
吉布森组件允许越来越大的DNA簇进行组装，以其中一个最大限制没有被观察到的点。原作者已经使用它来 组装几百个碱基的DNA 13。
选择性地靶向多种细胞器与单个基因构建体的能力有降低的基因需要被变换的数目的潜力。越来越大的DNA片段（因此更大的代谢途径）的交付是一个近期目标。类异戊二烯通路已交付的叶绿体通过基因枪方法;其他的基因簇，如替代碳固定途径是在地平线上。
关键步骤在议定书内。
在吉布森组装，确保模板序列不具有同源性，对方除了在目标重组位点。
在烟草植物基因枪转化，要注意保持基因枪约10-15厘米以上的叶子ND保持氦气压力在200-250磅。比更紧密，脆弱的叶子会爆炸，而且比他们不会得到很好的转化更远。转染后两天挫伤应该出现在叶，如果它是正确转化。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
作者要感谢马萨诸塞州总医院的仁为辛本氏烟苗的慷慨捐赠。仁布什帮助我们大大的意见，在植物生长，并设立一个生长室面积。韦斯研究所的汤姆·费兰特共聚焦显微镜提供了重要的帮助。作者要特别感谢波士顿儿童医院唐Ingber和威斯研究所基因枪和相关耗材的慷慨捐赠。资助这项计划是通过与能源高级研究计划署的署（ARPA-E奖＃DE-000079）为PAS，JCW，和MDM的合作协议规定，并通过Chimerion生物技术公司的MJV。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligonucleotide primers | IDT | (custom) | Design specifically for construct |
| GeneBlocks | IDT | (custom) | 500 bp oligonucleotides |
| ApE software | U Utah | (download) | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | Used to purify PCR products |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid |
| Phusion Master Mix with GC Buffer | NEB | M0532S | Used to PCR-amplify gene of interest |
| Gibson assembly reaction mix | NEB | E2611L | Master mix of the following 9 ingredients |
| 1 M Tris-HCl pH7.5 | Teknova | T1075 | Gibson assembly mix |
| 1 M MgCl2 | G Biosiences | 82023-086 | Gibson assembly mix |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | Gibson assembly mix |
| 1 M DTT | Fermentas | R0861 | Gibson assembly mix |
| PEG-8000 | Affymetrix | 19966 | Gibson assembly mix |
| NAD | Applichem | A1124,0005 | Gibson assembly mix |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | Gibson assembly mix |
| Phusion polymerase | NEB | F530S | Gibson assembly mix |
| Taq DNA ligase | NEB | M0208L | Gibson assembly mix |
| Gibthon.org | Website to simplify calculations | ||
| Plasmid PLUS Maxi kit | Qiagen | 12963 | Used to prepare DNA for gene gun bullets |
| Gene Gun system | BioRad | 165-2451 | Includes all parts necessary |
| Nicotania benthamiana | (n/a) | (n/a) | Gift of Jen Sheen, MGH |
| Confocal microscope | Leica | SP5 X MP | Imaging of resultant cells |
| Deep well slides | Electron Microscopy Sciences | 71561-01 | Used for confocal imaging |
| A Plasmid Editor (ApE) | University of Utah | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape | |
| Gibthon:Ligation calculator | http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/ |
References
- Que, Q., et al. Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities. GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).
- Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A. Deciphering the plant splicing code: experimental and computational approaches for predicting alternative splicing and splicing regulatory elements. Frontiers in Plant Science. 3 (18), (2012).
- Hickey, S. F., et al. Transgene regulation in plants by alternative splicing of a suicide exon. Nucleic Acids Research. 40 (10), 4701-4710 (2012).
- Syed, N. H., Kalyna, M., Marquez, Y., Barta, A., Brown, J. W. S. Alternative splicing in plants - coming of age. Trends in Plant Science. 17 (10), 616-623 (2012).
- Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annual Review of Biochemistry. 72, 291-336 (2003).
- Dinkins, R. D., et al. Changing transcriptional initiation sites and alternative 5'- and 3'-splice site selection of the first intron deploys Arabidopsis protein isoaspartyl methyltransferase2 variants to different subcellular compartments. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 55 (1), 1-13 (2008).
- Kebeish, R., et al. Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana. Nature Biotechnology. 25 (5), 593-599 (2007).
- Maier, A., et al. Transgenic Introduction of a Glycolate Oxidative Cycle into A. thaliana Chloroplasts Leads to Growth Improvement. Frontiers in Plant Science. 3 (38), 1-12 (2012).
- Kumar, S., et al. Remodeling the isoprenoid pathway in tobacco by expressing the cytoplasmic mevalonate pathway in chloroplasts. Metabolic Engineering. 14 (1), (2012).
- Sapir-Mir, M., et al. Peroxisomal localization of Arabidopsis isopentenyl diphosphate isomerases suggests that part of the plant isoprenoid mevalonic acid pathway is compartmentalized to peroxisomes. Plant Physiology. 148 (3), 1219-1228 (2008).
- Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C., Mattozzi, M. D. Targeting a heterologous protein to multiple plant organelles via rationally designed 5' mRNA tags. Journal of Biological Engineering. 7 (20), (2013).
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Lowenson, J. D., Clarke, S. Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis. The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).
- Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).
- Reumann, S., et al. Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms. The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Hollender, C. A., Liu, Z. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene. (40), (2010).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
