Forbigående Gene Expression i Tobacco bruker Gibson forsamling og Gene Gun
Summary
Dette arbeid beskriver en ny fremgangsmåte for selektiv målretting subcellulære organeller i planter, analysert ved hjelp av BioRad Gene våpenet.
Abstract
For å målrette en enkelt protein på flere subcellulære organeller, planter vanligvis duplisere de aktuelle gener, og hver uttrykker genet for seg ved hjelp av kompliserte regulerings strategier inkludert differensial promotere og / eller signalsekvenser. Metabolske ingeniører og syntetiske biologer som er interessert i målretting enzymer til en bestemt organell står overfor en utfordring: for et protein som er til å være lokalisert til flere organelle, må ingeniøren å klone det samme genet flere ganger. Dette arbeidet presenterer en løsning på denne strategien: utnytte alternativ spleising av mRNA. Denne teknologien utnytter etablerte kloroplast og peroksisom målretting sekvenser og kombinerer dem til ett enkelt mRNA som er alternativt skjøtes. Noen spleisevarianter blir sendt til kloroplasten, noen av peroksisom, og noen til cytosol. Her systemet er beregnet for multiple-organelle målretting med alternativ spleising. I dette arbeidet ble GFP forventet å være uttressed i kloroplast, cytosol, og peroxisome av en rekke rasjonelt utformet 5 'mRNA koder. Disse kodene har potensial til å redusere mengden av klonings nødvendig når heterologe gener som skal uttrykkes i flere subcellulære organeller. De konstruksjoner som er utformet i tidligere arbeider 11, og ble klonet ved hjelp av Gibson montering, en ligering uavhengig kloningsmetode som ikke krever restriksjonsenzymer. De resulterende plasmider ble innført i Nicotiana benthamiana epidermal bladceller med en modifisert Gene Gun protokollen. Til slutt ble forvandlet blader observert med konfokalmikroskopi.
Introduction
Dette arbeidet er en metabolsk ingeniør / syntetisk biologi prosjekt der planteceller er konstruert for å uttrykke en reporter protein i flere organeller, men med bare en enkelt DNA-konstruksjon.
En tilnærming for å målrette proteiner til mer enn ett sted innebærer kloning flere genetiske eksemplarer, hvert inneholdende en annen lokalisering peptid. Hvert eksemplar må være introdusert av suksessive retransformation, eller alternativt, ved tilbakekryssing enkelt forvandler en. Dette innebærer ytterligere kloning, og er begrenset av en lokaliseringssignal per terminus.
En annen måte til å lokalisere et protein til flere steder er gjennom alternativ spleising 2-5. RNA blir transkribert fra et enkelt gen, men forskjellige eksemplarer av transkripsjon blir behandlet på en annen måte, ofte i mer enn en måte per celle. Dette kan resultere i mer enn en messenger-RNA i celler transkribert fra et enkelt gen. Disse forskjellige Messenger RNA kan kode for forskjellige isoformer av det samme protein, eller i tilfelle av en frameshift, en annen protein helt. Selv om alternative spleising er blitt beskrevet i litteraturen for mange år, er de virkningsmekanismer og konservert donor-og reseptor-spleisesetene bare blir belyst mer nylig 6. Ettersom disse nettstedene blir bedre beskrevet, de åpner opp muligheter for engineering.
Plant metabolske ingeniører står overfor en utfordring når de uttrykker et protein i flere organeller. For et protein som er til å være lokalisert til flere organelle, må ingeniøren å klone det samme genet flere ganger, hver med en egen signalsekvens dirigere det til organeller av interesse. For et enkelt gen i tre organeller, er dette bare tre gener. Men for en seks-genet metabolismevei, utvides dette til 18 gener, en betydelig kloning innsats. Kombinere flere lokaliserings sekvenser i en enkelt, alternativt-skjøtes genet tegnreduserer ificantly dette arbeidet. For eksempel, re-engineering fotorespirasjon 7,8 og isoprenoid syntese 9,10 innebærer både kloroplaster og peroxisomes. I vårt tilfelle tok vi nytte av skjøtesteder som observert i en naturlig Arabidopsis thaliana system beskrevet tidligere seks. Vi rasjonelt redesignet mRNA sekvens forlater de naturlige spleisesetene alene, men plassert sekvenser som ville koder kloroplast-eller peroksisom målretting koder innenfor alternativt-skjøtes introner (figur 1). Det uttrykte protein kan eller ikke kan ha en kode, avhengig av hvorvidt pre-mRNA som kodet for det ble skåret ut som et intron (figurene 1g og 1t). For mer informasjon om design av konstruksjoner som presenteres i dette arbeidet, kan du se den ledsagende artikkel 11.
Fordi dette er fortsatt en betydelig kloning innsats, Gibson forsamlingen, en ny metode for kloning av DNA-konstruksjoner, er used i konstruksjonen. Den Gibson metode kan anvendes for en hvilken som helst sekvens, uavhengig av restriksjonsseter (Figur 2) 12-14. Den spesifikke blandingen av enzymer som gjør det mulig for en ett-trinns, isotermisk montering. I denne metoden, blir flere dobbelt-strengede DNA-lineære deler utformet slik at de har overlappende sekvenser av ~ 50 bp. The Gibson forsamlingen enzym blanding delvis fordøyer de lineære DNA deler, utsette enkelt tråder av homologe sekvenser. Disse partielle enkelt-trådede sekvenser er re-glødet i reaksjonsblandingen, noe som resulterer i en hurtig, ett-trinns, sekvensuavhengig, ligering fritt subkloning reaksjon.
Dette arbeidet beskriver en) rasjonell utforming alternativt skjøtes konstruksjoner for uttrykk i plante kloroplaster, peroxisomes og cytosols, 2) deres kloning ved hjelp av den nye ligation-fri metode for Gibson montering, 3) deres leveranse i tobakk blad celler med Gene Gun, og 4) resultater som viser organelle målretting, som observert med GFPog konfokalmikroskopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne studien, er enkle strategier er beskrevet for å lokalisere en enkelt transgene proteiner til flere cellene i planter. Målet var å designe konstruksjon som ville uttrykke et enkelt gen i mer enn ett organelle i Nicotiana benthamiana. Strategier inkluderer rasjonell utforming av GFP-basert DNA-konstruksjoner, Gibson montering, levering av plasmidene til bladceller med Gene Gun, og observasjon av resultatene med konfokalmikroskopi.
Tre forskjellige korte, N-terminal kodene b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Jen Sheen of Massachusetts General Hospital for den generøse donasjonen av Nicotiana benthamiana frøplanter. Jen Bush hjalp oss sterkt i råd i voksende planter, og sette opp et vekstkammer området. Tom Ferrante av Wyss Institute tilbudt avgjørende hjelp med konfokalmikroskopi. Forfatterne ønsker spesielt å takke Don Ingber av Children Hospital Boston og Wyss Institutt for sjenerøs donasjon av en Gene Gun og tilhørende utstyr. Midler til dette prosjektet ble gitt gjennom en samarbeidsavtale med Department of Energy Advanced Research Projects Agency (ARPA-E Award # DE-000079) for PAS, JCW, og MdM, og gjennom Chimerion Bioteknologi, Inc. for MJV.
Materials
| Oligonucleotide primers | IDT | (custom) | Design specifically for construct |
| GeneBlocks | IDT | (custom) | 500 bp oligonucleotides |
| ApE software | U Utah | (download) | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | Used to purify PCR products |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid |
| Phusion Master Mix with GC Buffer | NEB | M0532S | Used to PCR-amplify gene of interest |
| Gibson assembly reaction mix | NEB | E2611L | Master mix of the following 9 ingredients |
| 1 M Tris-HCl pH7.5 | Teknova | T1075 | Gibson assembly mix |
| 1 M MgCl2 | G Biosiences | 82023-086 | Gibson assembly mix |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | Gibson assembly mix |
| 1 M DTT | Fermentas | R0861 | Gibson assembly mix |
| PEG-8000 | Affymetrix | 19966 | Gibson assembly mix |
| NAD | Applichem | A1124,0005 | Gibson assembly mix |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | Gibson assembly mix |
| Phusion polymerase | NEB | F530S | Gibson assembly mix |
| Taq DNA ligase | NEB | M0208L | Gibson assembly mix |
| Gibthon.org | Website to simplify calculations | ||
| Plasmid PLUS Maxi kit | Qiagen | 12963 | Used to prepare DNA for gene gun bullets |
| Gene Gun system | BioRad | 165-2451 | Includes all parts necessary |
| Nicotania benthamiana | (n/a) | (n/a) | Gift of Jen Sheen, MGH |
| Confocal microscope | Leica | SP5 X MP | Imaging of resultant cells |
| Deep well slides | Electron Microscopy Sciences | 71561-01 | Used for confocal imaging |
| A Plasmid Editor (ApE) | University of Utah | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape | |
| Gibthon:Ligation calculator | http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/ |
References
- Que, Q., et al. Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities. GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).
- Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A. Deciphering the plant splicing code: experimental and computational approaches for predicting alternative splicing and splicing regulatory elements. Frontiers in Plant Science. 3 (18), (2012).
- Hickey, S. F., et al. Transgene regulation in plants by alternative splicing of a suicide exon. Nucleic Acids Research. 40 (10), 4701-4710 (2012).
- Syed, N. H., Kalyna, M., Marquez, Y., Barta, A., Brown, J. W. S. Alternative splicing in plants – coming of age. Trends in Plant Science. 17 (10), 616-623 (2012).
- Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annual Review of Biochemistry. 72, 291-336 (2003).
- Dinkins, R. D., et al. Changing transcriptional initiation sites and alternative 5′- and 3′-splice site selection of the first intron deploys Arabidopsis protein isoaspartyl methyltransferase2 variants to different subcellular compartments. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 55 (1), 1-13 (2008).
- Kebeish, R., et al. Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana. Nature Biotechnology. 25 (5), 593-599 (2007).
- Maier, A., et al. Transgenic Introduction of a Glycolate Oxidative Cycle into A. thaliana Chloroplasts Leads to Growth Improvement. Frontiers in Plant Science. 3 (38), 1-12 (2012).
- Kumar, S., et al. Remodeling the isoprenoid pathway in tobacco by expressing the cytoplasmic mevalonate pathway in chloroplasts. Metabolic Engineering. 14 (1), (2012).
- Sapir-Mir, M., et al. Peroxisomal localization of Arabidopsis isopentenyl diphosphate isomerases suggests that part of the plant isoprenoid mevalonic acid pathway is compartmentalized to peroxisomes. Plant Physiology. 148 (3), 1219-1228 (2008).
- Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C., Mattozzi, M. D. Targeting a heterologous protein to multiple plant organelles via rationally designed 5′ mRNA tags. Journal of Biological Engineering. 7 (20), (2013).
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Lowenson, J. D., Clarke, S. Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis. The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).
- Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).
- Reumann, S., et al. Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms. The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Hollender, C. A., Liu, Z. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene. (40), (2010).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
